Ausarbeitung von Julia Majer

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1 Ausarbeitung von Julia Majer Einleitung Die Familie der Cytochrom P450 Proteine (CYPs), sind essentielle Enzyme die an ca. 75 % der metabolischen Reaktionen beteiligt sind. Zu ihren Substraten zählen sowohl körpereigene Stoffe, wie z.b. Fett-, Gallensäure oder Steroide, als auch körperfremde Stoffe, wie Arzneimittel. CYPs sind ubiquitär auf der Erde verteilt. Beim Menschen wurden bis jetzt 57 verschiedene CYPs gefunden. Dort sind sie in der Lunge, dem Darm, aber vor allem in der Leber anzutreffen. Man findet sie in den Hepatozyten, im Inneren des Endoplasmatischen Retikulums auf der Plasmamembran wieder, wo sie stark in den hepatischen Metabolismus involviert sind. Sie nehmen Substanzen wie z.b. Arzneistoffe aus dem Blut auf und wandeln diese in ihre reaktiven Metabolite um. Denn nur die aktiven Metabolite der Arzneistoffe können ihre Wirkung am Zielort im Körper ausüben. Morphologisch gesehen handelt es sich bei den CYPs um Hämproteine. Diese Proteine besitzen eine Häme als prosthetische Gruppe und enthalten im aktiven Zentrum ein zentrales Eisen-Ion. Cytochrom P450 Enzyme gehören zur Klasse der Oxidoreduktasen, genauer gesagt zur Unterklasse der Monooxygenasen. Dabei übertragen sie ein Sauerstoffatom des molekularen Sauerstoff auf ein Substrat. Als häufigste Reaktion wird dabei die sogenannte Hydroxylierung durchgeführt: R H + O2 + NADPH + H+ R OH + H2O + NADP+ Die Sauerstoffübertragung findet in der Hämdomäne am Eisenatom statt. Da es sich bei dem CYPs um Oxidoreduktasen handelt, sind sie auf Reduktionsmittel angewiesen. Die häufigsten Reduktionsmittel sind NADH/NADPH, Flavin/Flavoproteine oder Ferredoxin. In dieser Studie wurde mit dem bakteriellen Enzym P450 BM3 (CYP102A1) aus Bacillus megaterium gearbeitet, das 1982 von Fulco s Group UCLA identifiziert wurde. Es ist nicht membrangebunden (löslich) und identisch zur eukaryotischen CYP4A Familie, eine Enzymfamilie, die hauptsächlich Fettsäure hydroxylieren, weshalb zu den natürlichen Substanzen der CYP102A1 auch langkettige Fettsäuren zu zählen sind. Aufgebaut sind die CYP102A1 aus einer Häm(-Oxygenase)domäne (HämD) sowie den beiden C-terminalen Flavinadenindinukleotid (FAD)- und Flavinmononukleotid (FMN) Domänen mit der NADPH-Cytochrom P450 Reduktase (ReduktaseD). Funktionelle gesehen transportiert die FMN Domäne zum einen den Flavin Cofaktor von der FAD Domäne zu der HämD und zum anderen die Elektronen, welche durch die NADPH Oxidation entstanden sind. Zusätzlich ist

2 noch die Linker Region zu erwähnen, die eine erleichterte Bewegung der FMN Domäne ermöglicht. Die CYP102A1 wurden ausgewählt, da sie die Höchste katalytische Aktivität bei P450 Monooxygenasen bisher aufgezeigt haben. Ziel der Studie war es, den Einfluss der Reduktasedomäne auf die katalytische Aktivität der Hämdomäne zu erforschen. Dabei sollten zusätzlich mögliche Perspektiven und Anwendungen, der mittels Protein Engineering veränderten CYP102A1, vor allem in der Arzneimittelentwicklung untersucht werden. 2. Methode Es wurde ein Domain Swapping, ein Austausch der ReduktaseD von zwei CYP102A1 Mutanten durchgeführt. Die eine Mutante war eine katalytisch hoch aktive CYP102A1 HämD Mutanten (M13, M15, M16 und M17). Diese zeigen hohe Aktivitäten gegenüber Lovastatin, 7-EC und Phenacetin. Bei der zweiten Mutante handelte es sich um CYP102A1.2 (= V2), eine natürliche Variante mit 20 Mutationen in der ReduktaseD. V2 zeigt hohe Aktivitäten gegenüber Reduktase Substarten wie Ferricyanide und Cytochrom C. Die Mutanten wurden durch direkte Evolution und Rationales Design hergestellt und in E. coli DH5αF -IQ Zellen in einem pcwori Vektor exprimiert. Durch die Kombination der beiden Domänen wurden CYP102A1 Chimäras erzeugt. Anschließend wurde mittels Aktivität Assays gegenüber verschiedenen humanen P450 Substarten aktive Chimäras ausgewählt (M13V2, M15V2, M16V2 und M17V2). Es wurden Bibliotheken der Chimäras angelegt, indem eine Random Mutagenesis durchgeführt wurde. Dazu wurden die Hämdomänen mittels Error- Prone PCR amplifiziert. Es folgte eine Klonierung der amplifizierten Fragmente in den pcwbm3v2bamhi/saci Vektor sowie die Transformation in E. coli DH5αF -IQ Zellen. Insgesamt wurden 5,6 Mutationen pro bp geschaffen und eine Mutanten Bibliothek der Größe von 1,4 x 10 6 hergestellt. Die chimären Mutanten, mit denen weitergearbeitet wurde, entstammten dem Chimära M16V2. Des Weiteren wurde mit der Bibliothek ein Whole-cell Assay mittels High Throughput Screening durchgeführt. Die E. coli Zellen durchliefen dabei mehrere Wasch- und Inkubationsschritte in 96-Wellplatten. Die eigentliche Enzymreaktion wird durch Zugabe von p- Nitrophenol als Substrat gestartet. Das Signal wird als Änderung der Farbintensität bei 510 nm durch einen Microplate Reader photometrisch gemessen. Zum Schluss wurden 19 hoch aktive chimäre Mutanten ausgewählt und mittels katalytischen Aktivität Assays getestet. Die Ergebnisse wurden mit HPLC bestimmt und als Total Turnover Number (min -1 ) wiedergegeben.

3 3. Ergebnisse 3.1. Katalytische Aktivität Assays mit humanen P450 Substraten Zuerst wurde die katalytische Aktivität der ausgewählten HämD Mutanten, Chimäras und chimären M16V2 Mutanten gegenüber 5 verschiedenen Arzneistoffen bestimmt. Die Ergebnisse der HPLC sowie die Strukturformeln sind in Abbildung 1 (siehe Anhang) gezeigt. Phenacetin (Abb. 1a) lässt sich zu Acetaminophen mittels O-Deethylierung umwandeln. Bei diesem Substrat zeigt die M16V2 Mutanten eine 2-fach höhere Aktivität als die Chimäras und HämD Mutanten. 7-Ethoxy-4- Trifluoromethylcoumarin (Abb. 1c), ein fluorogenes Substrat, wird zum Metaboliten 7-Hydroxy-4-FC (O-Deethylierung) umgewandelt. Dabei zeigen die HämD Mutanten und Chimäras ein identisches Verhalten (0,07-4,5 min -1 ), wohingegen D12 eine 70-fache Erhöhung der Enzymaktivität aufweist. Der in Abbildung 1d dargestellte Arzneistoff, Chlorozoxazon, hydroxyliert zu 6β-OH Chlorzoxazon. Von allen Enzymen hat B10 die höchste katalytische Aktivität. Als letztes wird p-nitrophenol getestet (Abb. 1e), das zu p-nitrocatechol metabolisiert wird. Hier haben fast alle chimäre Mutanten eine Aktivität von ca. 140 min -1. Der WT zeigt keine katalytische Aktivität gegenüber allen Substarten (< 0.1 min -1 ) Katalytische Aktivität Assays mittels Statine Statine werden zur Behandlung von Hyperlipidämie bzw. Hypercholesterinämie eingesetzt. Sie sinken den Cholesterinspiegel im Blut, indem sie die HMG CoA-Reduktase inhibieren. Die HMG CoA- Reduktase reduziert 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzym A (HMG CoA) zu Mevalonsäure, einem wichtigen Zwischenprodukt in der Cholesterinbiosynthese. Im menschlichen Körper werden Statine von humanen CYP3A4 Enzymen oxidiert. In Abbildung 2 (siehe Anhang) sind die HPLC Ergebnisse dargestellt. Auffallend ist auch hier wieder, dass der WT keine katalytischen Aktivitäten zeigt. Die Ergebnisse von Simvastatin und Lovastatin hingegen sind identisch, da beide als Hauptmetabolit 6 β- OH Statine produzieren. Zudem zeigen alle chimären Mutanten hohe Aktivitäten. Vergleicht man die TTNs mit denen vom humanen CYP3A4, so liegt diese von Simvastatin bei nur 8,3/min. Fluvastatin hydroxyliert zwei Hauptmetabolite. Zum einen 5-OH Fluvastatin, bei dem D12 die höchste Aktivität zeigt (23,2 min -1 ), und zum anderen 6-OH Fluvastatin mit G1 (13,2 min -1 ) als stärkste Mutante. Beim Metabolit 4-OH Atorvastatin sind viele Mutanten und Chimäre inaktiv. Nur G1 und M17V2 zeigen eine erhöhte TTN. Anschließend wurde mittels der TTN und der Michaeliskonstante die katalytische Effizienz der Enzyme bestimmt. Verdeutlicht wurden die zwei Extrema mit M16 und der chimären Mutante G1. G1 zeigt immer die höchste katalytische Aktivität, aber gleichzeitig auch die niedrigste Affinität vom Enzym zum Substrat. Dadurch kann man immer nur eine minimal höhere katalytische Effizienz im Gegensatz zu M16 ausmachen. Eine Ausnahme stellt Lovastatin da, bei dem M16 als weniger aktives Enzym die höhere Effizienz erzielt.

4 3.3 HMG CoA-Reduktase Inhibitionsassay Des Weiteren wurde ein Inhibitionsassy mittels der HMD CoA-Reduktase durchgeführt. Aufgrund der hemmenden Wirkung der Statine auf die HMG CoA-Reduktase, konnte die Aktivität der Reduktase bzw. die Inhibitionssträrke der Statine und deren Metabolite bestimmt werden. Dabei zeigten die hydroxylierten Metabolite eine mit ihren Parent Drugs vergleichbare inhibitorische Wirkung, wie Abbildung 3 (siehe Anhang) verdeutlicht wird. Eine inhibitorische Wirkung von 85% zeigt Atorvastatin bei einer Konzentration von 1 µm. Simvastatin schneidet mit einer Konzentration von 6 µm und einer Reduktion der Reduktase Aktivität um 25% am schlechtesten ab. 3.4 Fettsäure Hydroxylierung Zum Schluss wurde noch die Fettsäure Hydroxylierung ermittelt. Dabei wurden die Tests mit drei verschiedenen Fettsäuren, die sowohl in tierischen als auch in pflanzlichen Fetten zu finden sind, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 4 (siehe Anhang) abgebildet. Die Hydroxylierung von CYP102A1 findet immer am ω-1, ω-2 und ω-3 Kohlenstoff statt. Für Laurinsäure zeigt M15V2 die höchsten Hydroxylierungs Aktivitäten, während bei Myristin- und Palmitinsäure M13V2 die höchsten Umsätze erzielt. Alle M16V2 Mutanten zeigen im Vergleich zum Wildtyp niedrige katalytische Aktivitäten. 4. Zusammenfassung Das Domain Swapping war in einigen Fällen nützlich, um erhöhte Enzymaktivitäten hervorzurufe. Zusätzlich konnte belegt werden, dass die Reduktasedomäne essentiell für die katalytische Aktivität der CYP102A1 Hämdomäne ist. Während der Wildtyp durchgehend bei allen Tests kaum katalytische Aktivitäten zeigte, wurde die chimäre M16V2 Mutante aufgrund der erhöhten Aktivität gegenüber humanen P450 Substraten für weitere Arbeiten ausgewählt. Mittels Random Mutagenesis konnten 19 chimäre M16V2 Mutanten erzeugt werden. Vor allem G1 und H1 zeigten bei fast allen katalytischen Aktivität Assays eine erhöhte Aktivität. Bei der Hydroxylierung von Fettsäuren waren die Chimära M13V2 und M15V2 am effektivsten. Somit könnten nach weiteren Optimierungen die mutierten CYPs als industrielle Biokatalysatoren zur Produktion von Arzneistoffen und Metaboliten eingesetzt werden. Die Statin Metabolite könnten bei der Behandlung von Störungen des Lipoproteinstoffwechsels zukünftig eine große Rolle spielen.

5 5. Literaturquellen Fura A Role of pharmacologically active metabolites in drug discovery and development. Drug Discov Today 11: Guengerich FP Cytochrome P450 enzymes in the generation of commercial products. Nat Rev Drug Discov 1: Guengerich FP Cytochrome P450s and other enzymes in drug metabolism and toxicity. AAPS J 8:E101 E111. Guengerich FP Introduction: Human metabolites in safety testing (MIST) issue. Chem Res Toxicol 22: Kang JY, Kim SY, KimD, Kim DH, Shin SM, Park SH, Kim KH, Jung HC, PanJG, Joung YH, Chi YT, Chae HZ, Ahn T, Yun CH Characterization of diverse natural variants of CYP102A1 found within a species of Bacillus megaterium. AMB Express 1:1 Landwehr M, Carbone M, Otey CR, Li Y, Arnold FH Diversification of catalytic function in a synthetic family of chimeric cytochrome P450s. Chem Biol 14: Munro AW, Leys DG, McLean KJ, Marshall KR, Ost TW, Daff S, Miles CS, Chapman SK, Lysek DA, Moser CC, Page CC, Dutton PL P450 BM3: The very model of a modern flavocytochrome. Trends Biochem Sci 27: Otey CR, Landwehr M, Endelman JB, Hiraga K, Bloom JD, Arnold FH Structure-guided recombination creates an artificial family of cytochromes P450. PLoS Biol 4:e112.

6 6. Anhang Abbildung 1: Katalytische Aktivität der CYP102A1 Mutanten und Chimäras gegenüber humanen P450 Substraten. Abbildung 2: Katalytische Aktivität der CYP102A1 Mutanten und Chimäras gegenüber Statine. Abbildung 3: Inhibitorische Wirkung der Statine und ihrer Metabolite. Abbildung 4: Fettsäure Hydroxylierung der der CYP102A1 Mutanten und Chimäras.