α,β-ungesättigte Carbonyle als Substrate für asymmetrische C-C-Additionen mit Thiamindiphosphat (ThDP)-abhängigen Enzymen

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1 α,β-ungesättigte Carbonyle als Substrate für asymmetrische C-C-Additionen mit Thiamindiphosphat (ThDP)-abhängigen Enzymen Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.) der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg vorgelegt von Carola Maria Dresen aus Viernheim Freiburg, Januar 2008

2 Erklärung iermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und nur unter Verwendung der angegebenen Literatur und ilfsmittel angefertigt sowie Zitate kenntlich gemacht habe. Vorsitzender des Promotionsausschusses: Dekan: Referent: Koreferent: Prof. Dr. Rolf Schubert Prof. Dr. Andreas Bechthold Prof. Dr. Michael Müller Prof. Dr. Thorsten Friedrich Tag der Bekanntgabe des Prüfungsergebnisses: 08. Mai 2008

3 Danksagungen Prof. Dr. Michael Müller danke ich für die Übernahme des Referats. Vor allem jedoch, für die Überlassung des spannenden Themas, die ausgezeichnete wissenschaftliche Betreuung und die sehr guten Arbeitsbedingungen. Für die Übernahme des Korreferats möchte ich mich bei Prof. Dr. Thorsten Friedrich bedanken. Prof. Dr. Georg Fuchs danke ich für die Mitwirkung bei der Promotionsprüfung. Prof. Dr. Georg Sprenger danke ich für den inweis auf den Biosyntheseweg von Prodigiosin. Dr. Michael Richter sei gedankt für die Einführung und Zusammenarbeit im molekularbioliogischen Arbeitsbereich. Bei Dr. Anabel Cosp bedanke ich mich für die guten Vorarbeiten auf diesem Themengebiet und Dr. Pascal Dünkelmann und Lydia Walter für die hilfsbereite und nette Einarbeitung. Frau Dr. Martina Pohl und ihrem ThDP-Team danke ich für die sehr gute Kooperation. Volker Brecht hat Dank verdient für zahlreiche NMR-Messungen und cleveres LC-MS-MS "trouble-shooting". Prof. Dr. Caroline Röhr möchte ich für die Röntgenstrukturanalyse, Dr. Thomas Jank für die MALDI-TF-MS Messung und Dr. Steffen Lüdeke für die ilfe bei der Drehwertberechnung danken. Elke Breitling danke ich für die durchgeführten Synthesen und meinen iwis Andreas Praeg und Katharina esselbach für die ilfe im Labor. Ich danke Patrizia Lehwald, Dr. Katja Gauchenova, Lydia Walter und Dr. Michael Richter für die aufmerksame Durchsicht des Manuskripts. An meine Familie und Freunde: Danke! Für die für geduldige seelische und moralische Unterstützung. Last but not least. Ganz wichtig ist mir der Dank an meine lieben Kollegen, die zu Freunden geworden sind und deren Verdienst es ist, dass die letzten drei Jahre eine tolle Zeit waren!

4 Veröffentlichungen aus dieser Arbeit A. Cosp *, C. Dresen *, M. Pohl, L. Walter, C. Röhr, M. Müller, α,β-unsaturated aldehydes as substrates for asymmetric C-C bond forming reactions with thiamin diphosphate (ThDP)- dependent enzymes, Adv. Synth. Catal. 2008, Manuskript im Druck. DI: /adsc * Die Autoren trugen zu gleichem Teil zu dieser Veröffentlichung bei. Patent Anmeldung: M. Müller, C. Dresen, M. Richter (2007) "Verwendung des PigD-Proteins zur Katalyse von 1,4-Additionen von 2-xoalkanoaten an α,β-ungesättigte Ketone." weitere Veröffentlichung: M. Wendorff, T. Eggert, M. Pohl, C. Dresen, M. Müller and K. E. Jaeger, Evolving the substrate specificity of benzoylformate decarboxylase from Pseudomonas putida. In: Asymmetric synthesis with chemical and biological methods. D. Enders and K. E. Jaeger (eds.) Wiley-VC, Weinheim, Konferenzbeiträge (Poster): C. Dresen, M. Richter, M. Müller, Asymmetric intermolecular Stetter reaction catalysed by the enzyme PigD, 4 th Status Seminar Chemical Biology, Chem Bio Net, November 2007, Frankfurt. C. Dresen, M. Richter, M. Müller, α,β-unsaturated carbonyls as substrates for asymmetric C-C bond forming reactions with thiamin diphosphate (ThDP)-dependent enzymes, Day of science, July 2007, Freiburg. C. Dresen, A. Cosp, L. Walter, M. Wendorff, M. Pohl, M. Müller, α,β-unsaturated aldehydes as substrates for asymmetric C-C bond forming reactions with thiamine diphosphate (ThDP)- dependent enzymes, Mini-Symposium, Biogene Arzneistoffe, ctober 2006, Freiburg. C. Dresen, A. Cosp, L. Walter, M. Wendorff, M. Pohl, M. Müller, α,β-unsaturated aldehydes as substrates for asymmetric C-C bond forming reactions with thiamine diphosphate (ThDP)- dependent enzymes, 3 th Summer School Medicinal Chemistry 2006, September 2006, Regensburg. C. Dresen, A. Cosp, L. Walter, M. Wendorff, M. Pohl, M. Müller, α,β-unsaturated aldehydes as substrates for asymmetric C-C bond forming reactions with thiamine diphosphate (ThDP)- dependent enzymes, 26 th REGI-Symposium for rganic and Bioorganic Chemistry, September 2006, Rheinfelden. C. Dresen, A. Cosp, L. Walter, D. Gocke, M. Wendorff, M. Pohl, M. Müller, α,β-unsaturated aldehydes as substrates for asymmetric C-C bond forming reactions with thiamine diphosphate (ThDP)-dependent biocatalysts, 9. Symposium of the SFB380, ktober 2005, Aachen. M. Wendorff, C. Dresen, D. Gocke,. enning, K.E. Jaeger, S. Kühl, S. Lütz, M. Müller, M. Pohl, T. Eggert, Benzoylformate decarboxylase from Pseudomonas putida: improvement of substrate specificity by directed evolution. 9. Symposium of the SFB380, ktober 2005, Aachen.

5 Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung Allgemeiner Teil Biokatalysatoren in der organischen Synthese Thiamindiphosphat-abhängige Enzyme Die Decarboxylierung Die Carboligation Vier mögliche C-C-Additionen α,β-ungesättigter Aldehyde Ungesättigte ydroxyketone Chemische Synthese Enzymkatalyse Stetter-Reaktion Prodigiosin aus Serratia marcescens Prodigiosin-Biosyntheseweg Aufgabenstellung Spezieller Teil Vier mögliche C-C-Additionen α,β-ungesättigter Carbonyle Reaktionsweg A Synthese von ydroxyketonen Acetaldehyd als Akzeptor Nicht-enzymatische C-C-Bindungsknüpfung BAL und BFD als Katalysatoren Aromatische Aldehyde als Akzeptoren mit BAL als Katalysator Reaktionsweg C Synthese von ydroxyketonen BAL als Katalysator PDC als Katalysator Zusammenfassung Reaktionsweg A und C Reaktionsweg D Synthese von 1,4-Diketonen Gewinnung des Katalysators PigD Klonierung Expression der PigD Varianten Protein-Reinigung PigD Aminosäure-Sequenz Decarboxylaseaktivität von PigD Charakterisierung des Substratspektrums von PigD... 42

6 PigD 1,2-Carboligaseaktivität Suche nach 1,4-Carboligaseaktivität PigD 1,4-Carboligaseaktivität Vergleich der Katalyseaktivitäten von ZmPDC, ApPDC und PigD Negativkontrolle mit Expressionsvektor ohne pigd-gen Einflussparameter auf die PigD-Carboligaseaktivität Asymmetrische PigD-katalysierte Stetter-Reaktion Enantioselektivität - racemisches 3-Pentanylhexan-2,5-dion Geringste Detektion mittels GC an chiraler Phase Enantiomerenüberschuss Isolierung und Charakterisierung der 1,4-Carboligationsprodukte Die absolute Konfiguration der chiralen 1,4-Diketone Zwei PigD-katalysierte Wege zum (R)-3-Phenylhexan-2,5-dion Schlussfolgerung und Ausblick Schlussfolgerung Ausblick Experimenteller Teil Verzeichnis der Substanzen Analytik Materialien für die biochemischen Arbeiten Molekularbiologische Methoden Transformation von Bakterienzellen mit Plasmid-DNA Nährmedien Kultivierung und Lagerung von Bakterien Proteinbiochemische Methoden Nachweis und Bestimmung von Enzymaktivitäten Enzymatische Reaktionen und Synthesen Charakterisierung des Substratspektrums von PigD Reaktionen mit α,β-ungesättigten Carbonylverbindungen Chemische Synthesen Abkürzungsverzeichnis Verzeichnisse der Tabellen und der Abbildungen Literatur und Anmerkungen Anhang

7 ZUSAMMENFASSUNG 1 1 Zusammenfassung Für die Entwicklung biologisch aktiver Substanzen ist die asymmetrische Synthese von großer Bedeutung. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die Enzyme Benzaldehydlyase (BAL) aus Pseudomonas fluorescens, Benzoylformat Decarboxylase (BFD) aus Pseudomonas putida, verschiedene Pyruvatdecarboxylasen (PDC) und PigD aus Serratia marcescens unterschiedliche Möglichkeiten (A, C, D) der asymmetrischen C-C-Addition von α,β-ungesättigten Carbonylen mit aliphatischen und aromatischen Carbonylverbindungen bieten. R 1 R 3 Enzym R 2 (ThDP) R 1 * R 4 R 1 R 4 + R 2 R R 4 2 R 3 A C D Abb. 1: Die C-C-Additionen A, C und D α,β-ungesättigter Carbonyle. * R 2 R 4 * * R 1 Stetter Produkt R 3 Es wurden sowohl Substrate für PigD - α,β-ungesättigte Carbonyle - als auch Referenzen für die asymmetrischen C-C-Additionen mit BAL, BFD, PDC und PigD - ein racemisches ydroxyketon und racemische beziehungsweise Enantiomeren-angereicherte 1,4-Diketone - synthetisiert. PigD wurde für Expression und Proteinreinigung gentechnisch manipuliert, um systematische Studien in der Biokatalyse zu betreiben. Für den ersten Schritt des Biosyntheseweges von Prodigiosin aus Serratia marcescens wird hier ein Coenzym A-Thioester als Substrat postuliert. Die Strukturen der enzymatisch und chemisch synthetisierten Verbindungen wurden mittels GC-MS, GC an chiraler Phase, PLC-DAD beziehungsweise PLC-MS-MS an chiraler Phase, NMR, Kristallstrukturanalyse und CD-Spektroskopie aufgeklärt und ihre absolute Konfiguration bestimmt. Durch die Wahl der entsprechenden Enzyme in Kombination mit den geeigneten Substraten werden hier selektive 1,2-Reaktivitäten für je ein einzelnes Isomer (A) mit bis zu > 98% ee erhalten. Dies lässt sich gezielt beeinflussen, denn mittels Variation der Enzyme oder Substrate werden die regioisomeren ydroxyenone (C) mit bis zu > 99% ee gewonnen. Mit dem Enzym PigD aus Serratia marcescens wird in dieser Arbeit selektive 1,4-Reaktivität (D) mit > 99% ee erzielt und somit das erste Beispiel einer katalytischen asymmetrischen Stetter-Reaktion beschrieben.

8 2 ALLGEMEINER TEIL 2 Allgemeiner Teil 2.1 Biokatalysatoren in der organischen Synthese Biotransformation Biokatalysatoren, wie zum Beispiel efen, wurden schon vor 8000 Jahren bei der erstellung von Brot und Bier genutzt. Erst ab dem 19. Jahrhundert jedoch erkannten Wissenschaftler wie Louis Pasteur, dass Mikroorganismen für eine Vielzahl der genutzten Stoffumwandlungen verantwortlich sind. Neuberg und irsch entdeckten die efe-katalysierte Kondensations- Reaktion von Pyruvat und Benzaldehyd zu (R)-Phenylacetylcarbinol ((R)-PAC). [1] Diese Reaktion wurde 1930 als Vorstufe zur Synthese des Antihistaminikums L-Ephedrin im industriellen Maßstab von der Knoll AG, Ludwigshafen, durchgeführt. [2] Seit den 1990er Jahren ist die Biotransformation in der Chemie- und Pharmaindustrie als Synthesetechnologie in Form von Ganz-Zell-Systemen und Katalysen mit isolierten Enzymen fest etabliert. Enzyme Enzyme sind natürliche Katalysatoren, die chemische Reaktionen in biologischen Systemen beschleunigen und auch außerhalb der lebenden Zelle aktiv sein können. Fast alle bekannten natürlichen Katalysatoren sind Proteine. Erst in den 1980er Jahren wurden katalytisch aktive RNA-Moleküle, die Ribozyme entdeckt, aber auch Antikörper, Abzyme, oder DNA- Moleküle, Deoxyribozyme, können katalytische Wirkung zeigen. [3] Enzyme sind sehr effektive Katalysatoren, die eine Reaktion um den Faktor 10 7 bis beschleunigen können, wobei mol% benötigt werden. [4] Ihr evolutionär oft an das physiologische Substrat angepasstes Reaktions- und Substrat-Spektrum korreliert mit einer hohen Chemo- und Regioselektivität. Enzyme entfalten ihre optimale Aktivität in der Regel in wässrigem Medium, so dass der Einsatz von hydrophoben Substraten problematisch sein kann. [5] Sie arbeiten unter milden Reaktionsbedingungen und beschleunigen die von ihnen katalysierte Reaktion schon in einem Temperaturbereich von 20 C bis 40 C, bei annähernd neutralen p-werten und unter atmosphärischem Druck, wodurch unerwünschte Nebenreaktionen wie Umlagerung, Isomerisierung oder Zersetzung der Edukte beziehungsweise Produkte vermindert werden.

9 ALLGEMEINER TEIL 3 Enantioselektivität Ein Enzym besteht aus Polypeptidketten, die sich aus Copolymeren von Aminosäuren gleicher absoluter Konfiguration zusammensetzen. Sie sind also enantiomerenreine Makromoleküle, die, je nach Reaktionstyp, ihre chirale Information während der Reaktion übertragen. Die öhe der Differenz der Aktivierungsenergie beider Reaktionsrichtungen ist entscheidend für die Enantioselektivität der katalysierten Reaktion. Die entstehenden Enantiomere können unterschiedliche Eigenschaften besitzen, so schmeckt (S)-Asparagin bitter, (R)-Asparagin jedoch süß. Vor allem für die Entwicklung pharmakologisch aktiver Substanzen, ist die asymmetrische Synthese von großer Bedeutung. [6] Bei Methyldopa zeigt zum Beispiel nur das (S)-Enantiomer eine blutdrucksenkende Wirkung, (R)-Thalidomid (Contergan ) wirkt sedativ, das (S)-Enantiomer ist jedoch teratogen (Abb. 2). C 2 N N N (S)-Methyldopa (R)-Thalidomid Abb. 2: Pharmakologisch aktive chirale Substanzen. 2.2 Thiamindiphosphat-abhängige Enzyme Struktur Die bisher bekannten ThDP-abhängigen Pyruvatdecarboxylasen aus Saccharomyces cerevisiae (ScPDC) [7] und Zymomonas mobilis (ZmPDC), [8] die Benzaldehydlyase aus Pseudomonas fluorescens (BAL), [9] die Benzoylformiatdecarboxylase aus Pseudomonas putida [10, 11] und die Pyruvatoxidase [12] sind alle omotetramere. Eine Einteilung der genannten Proteine aufgrund ihrer Strukturübereinstimmung in eine gemeinsame Gruppe innerhalb der ThDP-abhängigen Enzyme wurde 2005 von Mosbacher et al., [9] sowie 2006 von Duggleby [13] vorgeschlagen. Eine Untereinheit ist in α-, β- und γ-domäne gegliedert. Die α- und γ-domänen sind topologisch gleichartig, die β-domäne weist eine leicht abweichende Faltung auf. Es gibt vier aktive Zentren im omotetramer, die jeweils zwischen zwei Untereinheiten gebildet werden. Dabei interagiert die α-domäne (N-terminal) eines Monomers mit der γ-domäne (C-terminal) einer benachbarten Untereinheit und sie binden dabei kooperativ den Cofaktor ThDP. Den intermolekularen Kontakt zwischen solchen zwei Dimeren zum omotetramer gewährleistet hauptsächlich die β-domäne. Die Übereinstimmungen in der Tertiärstruktur sind vor allem

10 4 ALLGEMEINER TEIL deshalb interessant, da für ScPDC, ZmPDC, BAL und BFD die Ähnlichkeit der Primärstruktur nur bei etwa 25% liegt. [14] Im aktiven Zentrum liegt der Cofaktor ThDP koordinativ über seinen Diphosphatrest mit einem zweiwertigen Metallion (Mg 2+ ) gebunden vor. Die Aminosäuren, GDG, der γ-domäne, die an der Bindung des Metallions beteiligt sind, sind hoch konserviert und bilden gemeinsam mit der oft ebenfalls stark konservierten Sequenz, (GDG) X8 E X4 A X5 P X6 NN, das für ThDP-abhängige Enzyme charakteristische Motiv. [15] Abb. 3: BAL als omotetramer. [9] Abb. 4: ThDP-Bindung in der BAL. [9]

11 ALLGEMEINER TEIL 5 ThDP Für ihre katalytische Aktivität benötigen viele Enzyme einen fest gebundenen Cofaktor, welcher ein Metallion oder ein organisches Molekül sein kann, wie zum Beispiel Thiamindiphosphat (ThDP, Abb. 5). Die Biosynthese von Thiamin in Mikroorganismen wurde gut untersucht. [16] Thiamin (Vitamin B 1 ) ist für den Menschen essentiell und ThDP wird unter ATP-Verbrauch durch das Enzym Thiamin-Diphosphokinase gebildet. [17] Der Cofaktor ist in der so genannten V-Konformation [18] über den Pyrimidinring und den über ein zweiwertiges Metall-Ion koordinierten Diphosphat-Rest im Enzym verankert (Abb. 4). [12] Die V-Konformation des ThDP gehört zu den konservierten Merkmalen der Gruppe ThDP- [19, 20] abhängiger Enzyme. Schon 1943 veröffentlichten Ugai et al., [21] dass das natürliche ThDP die Selbstkondensation von Benzaldehyd (3) zu Benzoin (3E3) katalysiert. Breslow führte die katalytische Aktivität des Thiamins, beziehungsweise der Thiazoliumsubstruktur auf die Bildung eines Zwitterions mit negativer Ladung am C2-Atom zurück. [22] Tatsächlich geht die Reaktivität des Thiamindiphosphats vom C2-Atom des Thiazoliumrings aus, da dieses als Carbanion nukleophil den Carbonyl-Kohlenstoff des jeweiligen Substrats angreifen kann (Abb. 5). Die Wechselwirkung eines konservierten Glutamat-Restes mit dem an der 1 -Position befindlichen Proton des Pyrimidinrings bewirkt die Aktivierung der Aminogruppe am C4 -Atom des Pyrimidinrings, die als effizienter Akzeptor für das Proton des reaktiven C2-Atoms fungieren kann (Abb. 5). [23] P P S C N 2 N 4' N N 1' P P S C N 2 N N 4' 1' N Glu Glu Abb. 5: Aktivierung von Thiamindiphosphat innerhalb eines Enzyms.

12 6 ALLGEMEINER TEIL Reaktion Substrate der Form R-C-X' werden durch das ThDP umgepolt. Die Abgangsgruppe X wird durch den Akzeptor Y, zum Beispiel ein Proton (bei Decarboxylasen und Benzaldehydlyase), eine Carbonylfunktion (bei Transketolase und Acetolactatsyntase) oder ein Liponamid (2-Ketosäuredehydrogenase Komplexe), ersetzt (Abb. 6). X' R ThDP R'' N X' S R R' X R'' N S R R' R'' N S R R' Y -ThDP R Y' Abb. 6: Verallgemeinertes Reaktionsschema ThDP-abhängiger Enzymreaktionen. Vorkommen und Reaktionen einiger ThDP-abhängiger Enzyme Thiamindiphosphat-abhängige Enzyme können sowohl die Spaltung als auch die Bildung von C-C-Bindungen katalysieren [19, 24, 25] und kommen somit in den unterschiedlichsten rganismen und Stoffwechselwegen vor (Tab. 1). Enzym [E.C.-Nummer] Pyruvatdecarboxylase [ ] X Y Stoffwechselweg Referenz C 2 + Alkoholische Gärung König, 1998 [26] Benzoylformiatdecarboxylase [ ] Indolpyruvatdecarboxylase [ ] Acetohydroxysäuresynthetase [ ] Transketolase [ ] C 2 + Mandelsäureabbau C 2 + Phytohormonsynthese C 2 CC 2 - Synthese verzweigtkettiger Aminosäuren R 1 C R 2 C Pentosephosphatweg Polovnikova et al., 2003 [11] Schütz et al., 2003 [27] Duggleby et al., 2003 [28] Schörken & Sprenger, 1998 [29] Pyruvatoxidase [ ] C 2 P 4 3- Atmungskette Tittmann et al., 2000 [30] Benzaldehydlyase [ ] PhC + unbekannt Mosbacher et al., 2005 [9] Pyruvatdehydrogenase [ ] Tab. 1: Vorkommen und Reaktionen einiger ThDP-abhängiger Enzyme. C 2 Liponamid Citratzyklus Jordan, 2003 [19]

13 ALLGEMEINER TEIL Die Decarboxylierung Die auptreaktion von PDC und BFD ist die Decarboxylierung einer 2-Ketocarbonsäure zu einem Aldehyd unter Abspaltung von Kohlendioxid (X = C 2 ) (Abb. 6). Der Reaktionsmechanismus von ThDP im freien und enzymgebundenen Zustand wurde für die PDC intensiv untersucht. [19, 31] Für die BFD ist dieser noch nicht analysiert worden, jedoch können analoge Schritte angenommen werden. [32] Der Reaktionszyklus beginnt mit der Deprotonierung des C2-Atoms durch die N4 -Iminogruppe des ThDPs (Abb. 5). Das erste Zwischenprodukt, Lactyl- beziehungsweise Mandelyl-ThDP, wird durch den Angriff des C2- Ylids auf die Carbonylfunktion des Substrates (Pyruvat/ Benzoylformiat) gebildet. Durch die folgende Decarboxylierung des Lactyl- beziehungsweise Mandelyl-ThDP entsteht das zweite Intermediat: der aktivierte Aldehyd, [33] auch als Enamin bezeichnet. Durch Protonierung (Y = + ) wird der Aldehyd freigesetzt (Abb. 6) Die Carboligation PDC und BFD PDC [34] und BFD [35] katalysieren als Nebenreaktion die Acyloinkondensation, eine C-C-Bindungsknüpfung zwischen Aldehyden (Abb. 6). ier ist der Akzeptor Y kein Proton, sondern ein aliphatischer oder aromatischer Aldehyd und es entstehen chirale 2-ydroxyketone. Das hierzu bekannteste Beispiel ist die PDC-katalysierte Synthese von (R)-Phenylacetylcarbinol ((R)-PAC) als chirale Vorstufe zum L-Ephedrin. Die Bildung von (S)-2-ydroxypropiophenon ((S)-2-PP) bei der Decarboxylierung von Benzoylformiat unter Anwesenheit von Acetaldehyd in Pseudomonas putida Rohextrakten wurde erstmals 1992 beobachtet. [35] Seitdem wurden die von der PpBFD-katalysierten Carboligationen intensiv untersucht. [36-38] Auch freie Aldehyde können an das aktive Zentrum von PDC und BFD binden und den reaktiven "aktiven Aldehyd" bilden. [37] BAL BAL, isoliert aus Pseudomonas fluorescens, wurde 1989 als Enzym identifiziert, welches die Acyloin-Bindung von (R)-Benzoinen zu spalten vermag (Lyase-Aktivität). [39] In diesem Falle ist die Abgangsgruppe X Benzaldehyd und der Akzeptor Y ein Proton (Abb. 6). Diese Reaktion ist reversibel und BAL katalysiert auch die Carboligation von zwei Molekülen eines Benzaldehyd-Derivats zum entsprechenden (R)-Benzoin. BAL und BFD setzen beide eine

14 8 ALLGEMEINER TEIL hohe Bandbreite aromatischer Aldehyde mit sehr guten Ausbeuten und exzellenten Enantiomerenüberschüssen zu den entsprechenden (R)-Benzoinen um. In der Racematspaltung wird die Lyase und Ligase-Aktivität der BAL für (R)-Benzoin ausgenutzt. Aus racemischem Benzoin wird selektiv (R)-Benzoin gespalten, Benzaldehyd (X) durch Ligation mit einem aliphatischen Akzeptor-Aldehyd (Y) dem System entzogen und [40, 41] (S)-Benzoin reichert sich an. Des Weiteren lassen sich über BAL-Katalyse auch unsymmetrische (R)-Benzoine enantiomerenrein gewinnen. [38] Chirale ydroxyketone Betrachtet man die beiden Decarboxylasen BFD und PDC bezüglich ihrer gebildeten Produkte aus Benzaldehyd-Derivaten und aliphatischem Aldehyd, so fällt auf, dass sie die Entstehung zueinander isomerer ydroxyketone mit entgegengesetzter Enantioselektivität katalysieren. BAL ergänzt dieses Produktspektrum und bildet das zur BFD enantiokomplementäre ydroxyketon in (R)-Konfiguration. [41] Dies erklärt sich durch die Substratspezifität und den Reaktionsmechanismus der Enzyme. Ein Aldehyd wird an ThDP gebunden, bildet die enzymatisch umgepolte Spezies, den "aktiven Aldehyd", und reagiert als Donor. Der freie Aldehyd kann nun als Elektronen Akzeptor vom "aktiven Aldehyd" angegriffen werden (Abb. 7). So ermöglichen BFD, PDC und BAL zusammen den Zugang zu einer Vielzahl komplementärer ydroxyketone. [42] R 1 + R 2 R'' N S R 1 R' R 1 R'' N S + R' R 2 + R'' N S R 2 R' R'' N S R' R 1 * R 2 2-ydroxyketon R 1 * R 2 Abb. 7: ThDP-abhängige Reaktion zweier Aldehyde zu ydroxyketon-derivaten.

15 ALLGEMEINER TEIL Vier mögliche C-C-Additionen α,β-ungesättigter Aldehyde Betrachtet man α,β-ungesättigte Aldehyde als Substrate für C-C-Bindungsknüpfungs- Reaktionen, so erweitert sich das Feld der Reaktionsmöglichkeiten von zwei auf vier. α,β-ungesättigte Aldehyde können als Donoren und Akzeptoren für die 1,2-Addition (A, C) und die 1,4-Addition (B, D) fungieren (Abb. 8). In Reaktionen nach Gleichung 1 werden die α,β-ungesättigten Aldehyde an ThDP gebunden und umgepolt. Sie regieren als Donoren zu α,β-ungesättigten 2-ydroxyketonen (A) oder α,β-ungesättigten 4-ydroxyaldehyden (B). In Reaktionen entsprechend Gleichung 2 wird der freie α,β-ungesättigte Aldehyd von einem aktiven Aldehyd angegriffen und fungiert als Akzeptor. Es entstehen β,γ-ungesättigte ydroxyketone (C) oder 1,4-Diketone (D) als Additionsprodukte. Gleichung 1 R'' N S R 1 R 2 Donor R' + R 3 Akzeptor 1,2 1,4 R 1 * R 2 R 3 R 3 * R 1 R 2 A B R 1 R + 3 R 2 + R'' N S R' Gleichung 2 R'' N + R 1 S R' R 3 R 2 Donor Akzeptor 1,2 1,4 R 3 R 2 * R 1 R 2 R 3 * * R 1 C D Abb. 8: Vier Reaktionsmöglichkeiten α,β-ungesättigter Aldehyde.

16 10 ALLGEMEINER TEIL 2.4 Ungesättigte ydroxyketone Chirale ungesättigte ydroxyketone (A und C) sind Struktureinheiten in verschiedenen Naturstoffen [43, 44] und wertvolle Bausteine für die organische Synthese. [45, 46] Darüber hinaus werden einfach weitere Verbindungsklassen zugänglich, wie zum Beispiel durch Reaktionen an der Ketofunktion: Reduktion [47, 48] oder nukleophile Addition [49] beziehungsweise an der Doppelbindung: Addition [48, 50] oder oxidative Spaltung. [47, 48] Die asymmetrische Synthese der anti-(2r,3r)- und syn-(2r,3s)-2,3-diaminobuttersäure von Ichikawa et al. sei hier als Beispiel herausgegriffen (Abb. 9). [48] PMB 1. Stereoselektive Reduktion 2. Allylcyanat-zu-Isocyanat-Umlagerung PMB-: p-metoxybenzoyl- N 2 N 2 C oder N 2 N 2 C Abb. 9: Asymmetrische Synthese von Diaminobuttersäure. [48] Chemische Synthese Die chemische Synthese von chiralen ungesättigten ydroxyketonen (A und C) ist eine erausforderung und mit hohem Aufwand verbunden. Sie wurden bisher zum Beispiel durch direkte ydroxylierung von Dienolaten, jedoch mit geringer Stereoinduktion, [43, 51] über Ylid Reaktion eines (S)-Milchsäure Derivates, [50] über Behandlung von chiralen ydroxysäuren mit Vinyl Lithium Reagenz [52] oder Addition von 1-Lithio-1-methoxyallen an chirale Ketone gefolgt von ydrolyse, [53] synthetisiert. Noch aktuellere Methoden sind die Reaktion von geschützten chiralen ydroxyketophosphonaten mit Aldehyden [48] oder die Aldolreaktion zwischen Aldehyden und geschützten ydroxyketonen in Anwesenheit von Natriumhydrid und tertiär-butanol. [54] Die Konjugation der Doppelbindung in ungesättigten ydroxyketonen (A und C) [55, 56] kann Probleme in der Regioselektivität der Synthese und der Stabilität der Produkte verursachen. So stellen sowohl Regio-, als auch Enantioselektivität Schwierigkeiten in der chemischen Synthese chiraler ungesättigter ydroxyketone (A und C) dar.

17 ALLGEMEINER TEIL 11 Umpolung Die Umkehr der natürlichen Reaktivität eines gegebenen Reaktionszentrums wird mit dem Begriff Umpolung beschrieben. [57] Die normale Reaktivität eines Alkylhalogenids ist die Elektrophilie, wohingegen nach dem Brom-Lithiumaustausch das Molekülfragment Nucleophil ist (Abb. 10). δ+ BuLi δ R Br R Li Abb. 10: Umpolung eines Alkylbromides durch alogen-lithiumaustausch. Eine bekannte Möglichkeit der Umpolung ist der eteroatomaustausch von Carbonylen zu Dithioacetalen. Durch die zweifache Substitution mit Schwefel ist der ursprüngliche Carbonylkohlenstoff leicht zu deprotonieren und stellt als Nucleophil Elektronen zum Aufbau von beispielsweise C-C Bindungen zu Verfügung. Wird ein zusätzlich funktionalisiertes Kohlenstoffatom (CX, Abb. 11) spezifisch zur Reaktivitätsumpolung in einen Reaktionspartner eingeführt, entspricht dies einer omologisierung. Im Folgenden wird der Begriff omologisierung unter dieser Definition [57, 58] verwendet. ierzu ein bekanntes Beispiel ist die Benzoinkondensation (3E3) (Abb. 11). R X 1 + CX Ar + CN R X 1 X R X 1 X Ar CN Ar Ar CN Ar - CN Ar Ar Abb. 11: Umpolung durch omologisierung; Benzoinkondensation. In der Natur verläuft die nucleophile Acylierung über eine katalytische Umpolung mit ThDP (siehe 2.2 Thiamindiphosphat-abhängige Enzyme). Analog wurden synthetische Thiazoliumsalze beziehungsweise N-heterocyclische Carbene als Umpolungskatalysatoren [21, 59, 60] genutzt. So konnte die Benzoinkondensation mit aliphatischen Aldehyden, [61] jedoch mit geringer Enantioselektivität, [62] und später die asymmetrische Benzoinkondensation mit guten Enantiomerenüberschüssen und akzeptablen Ausbeuten, [63, 64] wie auch die intramolekulare asymmetrische gekreuzte Benzoinkondensation eines Aldehyds mit einem Keton [65, 66] durchgeführt werden.

18 12 ALLGEMEINER TEIL [67, 68] eute existiert eine Vielzahl nucleophiler Carbene als Umpolungsreagenzien. In C-C-Additionen mit eteroazoliumsalzen werden mol% benötigt, dies lässt auf deutlich effizientere Katalysatoren hoffen. [69] Umpolung α,β-ungesättigter Aldehyde Auch ungesättigte ydroxyketone (A und C) wurden in der nicht-enzymatischen Synthese durch Methoden der Umpolungsreaktivität synthetisiert. ier bereiten jedoch sowohl die Stereo-, als auch die Regioselektivität Schwierigkeiten, denn die Umpolung beider Aldehyde könnte zu einer Vielzahl verschiedener Produkte führen (Abb. 12). R 1 R 2 + R 3 Stetter Produkte Lactone Kreuzkondensations- R 1 R 3 R 3 R 2 R 2 Produkte R 2 R 1 R 2 R 3 R 3 Umpolungs- R 1 R 2 R 1 R 1 Katalysator R 3 A B C D I Selbstkondensations- Produkte R 3 R 3 R 1 R 1 R 2 R 2 R 2 R 1 R 2 R 1 R 1 R 2 E F G J R 1 R 2 R 2 R 1 R 2 R 1 Abb. 12: Produktspektrum α,β-ungesättigter Aldehyde in der rganokatalyse. Ausschnitt aus dem möglichen Produktspektrum der organokatalysierten Umsetzung eines α,β-ungesättigten Aldehyds mit einem weiteren Aldehyd. Verändert und ergänzt nach Glorius et al. [70] Ungesättigte ydroxyketone über 1,2-Addition α,β-ungesättigte ydroxyketone der isomeren Form A wurden über die Addition von α,β-ungesättigten Acylanionen an Aldehyde synthetisiert. Die Umpolung wurde über eteroatomaustausch von Carbonylen zu Dithioacetalen [56, 71, 72] oder über omologisierung mit Trimetylsilylcyanid zu Sauerstoff geschützten Cyanhydrinen [55, 73-75] durchgeführt (siehe Nicht-enzymatische C-C-Bindungsknüpfung). Durch den Einsatz von Lithium 1-(p-Toluylsulfonyl)-2-alkenylcarbamaten in der nucleophilen Alkenoylierung von chiralen Aldehyden konnte die Bildung von ausschließlich einem Diastereomer bewirkt werden. [76] Es gibt nur wenige Synthesewege zu α-ydroxyenonen über die Reaktion eines "nicht-" [77] beziehungsweise "unmaskierten" [78] Acylanions mit Carbonylverbindungen, wie die durch milde Lewis-Säure-katalysierte Umsetzung von Acylzirconocenchlorid-Komplexen mit Aldehyden [77] oder α,β-ungesättigten Ketonen mit minimaler Stereoinduktion. [78]

19 ALLGEMEINER TEIL 13 Die Addition von metallischen β,γ-ungesättigten α-aminonitrilen an Aldehyde ist eine effiziente Methode regioselektiv α,β-ungesättigte ydroxyketone der Form A zu synthetisieren. [79] Über die Cyanid-katalysierte Kreuz-Silyl-Benzoin Reaktion können β,γ-ungesättigte ydroxyketone der Form C regio-, jedoch nicht stereokontrolliert erhalten werden. [80] Enzymkatalyse Auch die Biokatalyse wurde für die Synthese von ungesättigten ydroxyketonen (A und C) genutzt. Die isomere Form A wurde zum Beispiel durch Lipase-katalysierte Racemat- Spaltung von α,β-ungesättigten α -Acetoxyketonen mit guten Enantiomerenüberschüssen erhalten. [81] Über Ganzzelltransformationen mit Bäckerhefe wurde Pyruvat an α,β-ungesättigte Aldehyde addiert und in der Regel zwei Fälle beobachtet. Im einen Fall wurden die ydroxyketone in situ von in der efe enthaltenen Alkoholdehydrogenasen [25, 82-84] reduziert und die α,β-ungesättigten Diole mit guter Diastereoselektivität synthetisiert. Auf diese Weise konnte auch ein ungesättigtes ydroxyketon der isomeren Form A, jedoch mit unbekannter Stereoselektivität isoliert werden. [85] Im anderen Fall wurden ungesättigte ydroxyketone der isomeren Form A und C nicht regioselektiv mit mittelmäßiger bis guter Stereoselektivität erhalten. [86] Somit ist es nach wie vor eine lohnenswerte ungelöste Aufgabe regio- und enantioselektive 1,2-Reaktivitäten zur Gewinnung ungesättigter ydroxyketone (A, C) zu erzielen.

20 14 ALLGEMEINER TEIL 2.5 Stetter-Reaktion Reaktion D Die Stetter-Reaktion ist die 1,4-Addition von Aldehyden an α,β-ungesättigte [87, 88] Carbonylverbindungen. Auch hier wird ein Aldehyd durch einen nucleophilen Katalysator umgepolt. Als Elektrophil dient in diesem Fall aber nicht die Carbonylfunktion eines anderen Aldehyds, sondern eine elektronenarme Doppelbindung (Abb. 13). R 3 X R 3 X + R 1 X 1 R 2 R 1 X 1 R 2 X R 3 R 1 X 1 R 2 X R 3 R 1 X 1 R 2 - CX R 3 R 1 X 1 R 2 Abb. 13: Stetter-Reaktion. Mit Cyanid-Ionen als Katalysator lassen sich aromatische und heterocyclische Aldehyde an α,β-ungesättigte Ketone, Ester und Nitrile addieren. Auch Thiazoliumsalze eignen sich als Katalysatoren, mit ihnen gelingt zusätzlich die Addition aliphatischer Aldehyde. [87] Asymmetrische Stetter-Reaktion Mit dem Ziel, die Stetter-Reaktion asymmetrisch durchzuführen, wurden in den vergangenen vier Jahrzehnten verschiedene chirale Katalysatoren entwickelt. [67, 69, 89] Die intramolekulare, [65, 66, 90] aber vor allem die intermolekulare [64, 91] asymmetrische Stetter- Reaktion stellt eine große erausforderung dar. Bisher ist es mit rganokatalysatoren möglich die intermolekulare 1,4-Addition mit 4% Ausbeute und einem Enantiomerenüberschuss von 39% durchzuführen (Abb. 14). [60, 92] Eine nach Enders et al. denkbare Erklärung warum die 1,4-Reaktivität immer gering bleibt, ist die Tatsache, dass Thiazoliumsalz und Substrat hier stabile Additionsprodukte bilden. [93] + Ph Ph Butanal (52) (E)-Chalkon (43) Cl 20 mol% N S 4 % Ar K 2 C 3, CCl 3, 2 Ph 39 % ee * Ph 1,3-Diphenylheptan-1,4-dion (43D52) Abb. 14: Erste Versuche zur intermolekularen asymmetrischen Stetter-Reaktion. [60]

21 ALLGEMEINER TEIL 15 Die in der Stetter-Reaktion erhaltenen 1,4-Dicarbonylverbindungen sind ideale Substrate für die Paal-Knorr-Reaktion zur Synthese hoch substituierter Furane und Pyrrole. [94] Es gibt bisher wenige Anwendungen der intermolekularen Stetter-Reaktion in der Naturstoffsynthese, da sie bisher noch nicht asymmetrisch möglich ist. [95] arrington et al. haben eine diastereoselektive Variante und eine Ringschlussmetathese als Schlüsselschritte in ihrer eleganten Synthese von Roseophilin verwendet. [96] Die 1,4-Dicarbonylfunktion dient als Vorstufe für die zentrale Pyrrol-Einheit des Naturstoffs. [69] Sobald die intermolekulare Stetter- Reaktion in asymmetrischer Form möglich ist, wird sie nicht nur für die Naturstoffsynthese, sondern auch für die Synthese chiraler Bausteine biologisch und pharmakologisch wirksamer Substanzen von großem Interesse sein. 2.6 Prodigiosin aus Serratia marcescens Zur Art Serratia marcescens gehören gramnegative, fakultativ anaerobe, nicht Sporen bildende, sich aktiv mit peritrich angeordneten Geisseln bewegende, stäbchenförmige Bakterien. Sie zählen zur Familie der Enterobacteriaceae. Serratia marcescens Bakterien kommen überall im Boden, Wasser, auf Tieren und Pflanzen vor und bilden in der Regel ein rotes, antibiotisch wirksames Pyrrolalkaloid (Prodigiosin), wodurch die Kolonien rot gefärbt sind (Abb. 15). Prodigiosin ist ein typischer Sekundärmetabolit, der erst in späteren Stadien des bakteriellen Wachstums produziert wird. [97] Abb. 15: Agarplatte mit Kolonien von Serratia marcescens. [98] In historischer Literatur finden sich einige Beispiele für das Bluten von Brot und anderen Lebensmitteln wie zum Beispiel das Wunder von Bolsena, das sich 1263 in der Kirche der eiligen Christina in Bolsena ereignet hat. [98] Ein von Zweifeln am Dogma der Transsubstantion geplagter Priester soll beim Brechen des Brotes für die Kommunion

22 16 ALLGEMEINER TEIL Blutstropfen darauf entdeckt haben. Die Bevölkerung veranstaltete eine Prozession mit ostien nach rvieto zu Papst Urban IV. Dieser führte daraufhin das Fronleichnamsfest (Processione del Corpus Domini) ein und ließ den Dom zu rvieto errichten. eute nimmt man an, dass die "Blutstropfen" durch Prodigiosin rot gefärbte Kolonien von Serratia marcescens waren Prodigiosin-Biosyntheseweg Williamson et al. beschreiben den Biosyntheseweg des Sekundärmetaboliten Prodigiosin in Serratia marcescens (Ausschnitt: Abb. 16). Sie konnten zeigen, dass eine "In-frame"- Deletionsmutante von PigD im Prodigiosin-Synthesecluster mit weißem Phänotyp durch Fütterung von chemisch synthetisiertem 3-Acetyloctanal das Pigment Prodigiosin produziert. In Kombination mit weiteren Fütterungs-Experimenten von "In-frame"-Deletionsmutanten konnten Williamson et al. zeigen, dass PigD für die Synthese von 3-Acetyloctanal verantwortlich sein muss. Nach Sequenzanalyse und Vergleich mit anderen ThDP-abhängigen Enzymen enthält PigD ein Thiamindiphosphat-Bindungsmotiv (GDG X19 P, siehe unter 9.2 Aminosäure-Sequenz von PigD aus dieser Arbeit, rot markiert), wobei der Sequenzbereich nicht so hochkonserviert ist, wie in anderen ThDP-abhängigen Enzymen (GDG X8 E X4 A X5 P X6 NN). [15] Es ist somit wahrscheinlich, dass ThDP am katalytischen Prozess beteiligt ist. Mit diesen Informationen postulierten sie den ersten Schritt der Prodigiosin-Synthese, als die durch PigD-katalysierte Decarboxylierung von Pyruvat (2) und die Addition des aktivierten C 2 -Fragmentes an die Doppelbindung von (E)-ct-2-enal (16) (Abb. 16). [97] C PigD (ThDP) 2 - C PigE (Pyridoxal Phosphat, Aminosäure) C D2 N N 4-Methoxy-2,2'- bi(1'-pyrrole)- 5-carbaldehyd N N PigB (FAD, 2 ) N PigC (ATP) N N C Methyl-4-pentyl- 3,4-dihydro-2-pyrrol C Methyl-3-pentyl- 1-pyrrole C 5 11 Prodigiosin Abb. 16: Ausschnitt aus dem von Williamson et al. postulierten Prodigiosin-Biosyntheseweg. [97]

23 ALLGEMEINER TEIL Aufgabenstellung In der hier vorliegenden Arbeit soll die Regio- und Stereospezifität ThDP-abhängiger Enzyme als Katalysatoren in Reaktionen mit α,β-ungesättigten Carbonylen beurteilt werden. Sowohl für die nicht enzymatische Synthese, als auch für die Biokatalyse ist es eine grosse erausforderung regio- und enantioselektive Methoden der C-C-Bindungsknüpfung zu den möglichen ydroxyenonen (A, C) beziehungsweise 1,4-Diketonen (D) (Abb. 1) zu finden. Mit α,β-ungesättigten Carbonylen als Substrate sollen unter der Nutzung verschiedener ThDP-abhängiger Enzyme sowohl chemo-, als auch stereoselektiv 1,2-Additions- (A, C) und 1,4-Additionsprodukte (D) generiert werden. Durch die Enzyme Benzaldehydelyase (BAL) aus Pseudomonas fluorescens, Benzoylformat Decarboxylase (BFD) aus Pseudomonas putida und die Pyruvatdecarboxylasen (PDC) aus Saccharomyces cerevisiae beziehungsweise Acetobacter pasteurianus sollten die Reaktionswege A und C möglich werden. Der Katalysator PigD sollte den Reaktionsweg D eröffnen und somit die intermolekulare asymmetrische Stetter-Reaktion zugänglich machen.

24 18 SPEZIELLER TEIL 3 Spezieller Teil 3.1 Vier mögliche C-C-Additionen α,β-ungesättigter Carbonyle α,β-ungesättigte Carbonyle als Substrate für C-C-Bindungsknüpfungsreaktionen können theoretisch als Donoren und Akzeptoren für die 1,2-Addition (A, C) und die 1,4-Addition (B, D) fungieren (Abb. 8, Abb. 17, Abb. 18). α,β-ungesättigte Aldehyde können theoretisch alle vier Reaktionswege eingehen. α,β-ungesättigte Carbonyle ohne Aldehydproton können nur als Akzeptoren in 1,2-Additionen nach Reaktionsweg C und in 1,4-Additionsreaktionen nach Reaktionsweg D reagieren. In Reaktionen nach Abb. 17 werden die α,β-ungesättigten Aldehyde an ThDP gebunden und umgepolt. Sie reagieren als Donoren zu chiralen α,β-ungesättigten 2-ydroxyketonen (A) oder α,β-ungesättigten 4-ydroxyaldehyden (B). R 1 R 2 Enzym + R 3 R'' N S R 1 R 2 R' + R 3 1,2 1,4 R 3 R'' R 3 N S R' R 1 * R 3 R 1 R 2 R 2 R'' N S R' R 1 R 2 R 3 * R 1 R 2 A B Abb. 17: ThDP-abhängige Reaktion α,β-ungesättigter Aldehyde als Donoren. In Reaktionen wie in Abb. 18 dargestellt, wird das freie α,β-ungesättigte Carbonyl von einem aktivierten Aldehyd angegriffen und fungiert als Akzeptor. Es entstehen chirale β,γ-ungesättigte ydroxyketone (C) oder 1,4-Diketone (D) als Additionsprodukte. Für D können im Falle der α-substitution Diastereomere gebildet werden. R 1 R 2 + R 3 R 4 Enzym R 3 R'' N S R' + R 1 R 4 1,2 1,4 R 2 R 3 R 2 R 1 R 3 R 2 R'' N R 4 S R'' N S R 1 R' R' R 3 R4 * R 3 * * R 1 R 2 R 1 R 2 R 4 C D R 4 Abb. 18: ThDP-abhängige Reaktion α,β-ungesättigter Carbonyle als Akzeptoren.

25 SPEZIELLER TEIL Reaktionsweg A Synthese von ydroxyketonen Für die 1,2-Addition mit α,β-ungesättigten Aldehyden als Donoren nach Reaktionsweg A wurden die Enzyme BAL, BFDwt und die Mutante BFD281A, [11] welche in früheren Untersuchungen eine im Vergleich zu BFDwt größere Substratspanne zeigte, eingesetzt Acetaldehyd als Akzeptor Nicht-enzymatische C-C-Bindungsknüpfung Als Referenz für die Enzymkatalyse zum chiralen (E)-2-ydroxy-5-phenylpent-4-en-3-on (22A1), wurde die C-C-Bindungsknüpfung von (E)-Zimtaldehyd (22) und Acetaldehyd (1) zum racemischen rac-22a1 auf zwei verschiedenen chemischen Synthesewegen durchgeführt (Abb. 19). Im Ramen dieser Arbeit wurde nach ünig et al. [55, 73, 74] (E)-Zimtaldehyd (22) mit Trimethylsilylcyanid umgepolt und an Acetaldehyd addiert (omologisierung [57] ). Dies lieferte rac-22a1 in einer Ausbeute von 6% über drei Stufen. Von A. Cosp wurde nach Patrocinio et al., [71] Fang et al. [56] und Rock et al. [72] rac-22a1 durch Thioacetalbildung über (E)-2-Styryl-1,3-dithian hergestellt (eteroatomaustausch [57] ). An and der beiden nicht enzymatischen Synthesen wird der größere Aufwand im Vergleich zur enzymatischen Synthese deutlich, obwohl erstere noch nicht einmal stereoselektiv verlaufen. ünig et al. TMSCN 1. LDA, TF Si ZnI 2 (kat.) 2. Acetaldehyd (1) CN (1) (2) 1+ 2: 7% 22 rac-22a1.1 Si rac-22a1.2 (3) 89% Cl, Me rac-22a1 Patrocinio et al., Fang et al. und Rock et al S S C 2 Cl 2-2 S S n-buli Acetaldehyd (1) (TF) S gcl 4 S + BF 3 Et 2 (E)-2-Styryl-1,3-dithian (E)-1-(2-Styryl-1,3- dithian-2-yl)ethanol Abb. 19: Synthese des racemischen (E)-2-ydroxy-5-phenylpent-4-en-3-ons (rac-22a1).

26 20 SPEZIELLER TEIL Erläuterung zur Nummerierung der Substanzen: Die Nummerierung ergibt sich aus den Reaktionsmöglichkeiten. Die eingesetzten Substrate sind von 1-53 durchnummeriert (siehe 5.1 Verzeichnis der Substanzen). Der Buchstabe beschreibt die erste Zahl der Nummernkombination. Diese ist somit: A, Donor in einer 1,2-Addition; C, Akzeptor in einer 1,2-Addition; D, Akzeptor in einer 1,4-Addition; oder E, Donor und Akzeptor in einer symmetrischen 1,2-Addition. In mehrstufigen Synthesen werden die einzelnen Zwischenprodukte durch einen Punkt abgetrennt nummeriert BAL und BFD als Katalysatoren Die C-C-Bindungsknüpfung zwischen Acetaldehyd (1) und dem α,β-ungesättigten Aldehyd (E)-ct-2-enal (16), (E)-ex-2-enal (17), (E)-2-Methylpent-2-enal (18) oder (E)-Zimtaldehyd (22), wurde mit den Enzymen BAL, BFDwt und BFD281A untersucht. Es wurden ausschließlich chemoselektiv α,β-ungesättigte 2-ydroxyketone (A) erhalten (Tab. 2). BAL BFDwt R 1 BFD281A + R 1 R 2 R 2 16, 17, 18, A1, 17A1, 18A1, 22A1 α,β-ungesättigter Aldehyd R 1 R 2 Enzym α,β-ungesättigtes 2-ydroxyketon (A) ee (E)-ct-2-enal (16) (E)-ex-2-enal (17) (E)-2-Methylpent-2-enal (18) (E)-Zimtaldehyd (22) (C 2 ) 4 (C 2 ) 2 BAL 62% 77% BFD-wt 16A1 26% 23% BFD281A <1% - BAL 80% 87% BFD-wt 17A1 79% 24% BFD281A 63% 27% C 2 BAL 18A1 71% >98% BFD-wt <1% - Tab. 2: Reaktionsweg A mit Acetaldehyd als Akzeptor. Ar BAL (R)-22A1 80% [99] 80% (E)-ct-2-enal (16), (E)-ex-2-enal (17) und (E)-2-Methylpent-2-enal (18): Umsetzungen in 1.5 ml KP i -Puffer (p 7), 5% MTBE, 30 mm Donor Substrat, 450 mm Acetaldehyd, 1 mg Protein-Lyophilisat. Bestimmung der Produktbildung (%) mittels NMR. (E)-Zimtaldehyd (22): Isolierte Ausbeute aus Synthese in 100 ml Reaktionsvolumen. Bestimmung des ee mittels PLC an chiraler Phase mit einer Chiralcel D- ((R)-22A1) oder Chiralpak AD Säule (16A1, 17A1, 18A1).

27 SPEZIELLER TEIL 21 Die ambidente Natur der umgepolten α,β-ungesättigten Aldehyde [55, 56] könnte Probleme in der Regioselektivität verursachen, da die elektrophile Addition der Akzeptor-Aldehyde sowohl aus 2-, als auch aus 4-Position stattfinden könnte. Des Weiteren ist BAL in der Lage Acetaldehyd als Donor in der symmetrischen Acetoin-Kondensation zu aktivieren. [100] Tatsächlich jedoch reagieren in Anwesenheit von Acetaldehyd α,β-ungesättigte Aldehyde selektiv als Donoren nach dem Reaktionsweg A, ähnlich wie aromatische Aldehyde. Es wurde jeweils nur ein Regioisomer, das α,β-ungesättigte 2-ydroxyketon (A), über die 1,2-Additionsreaktion erhalten. Schon aus früheren Arbeiten wird deutlich, dass alle bisher über BAL-Katalyse erhaltenen Carboligationsprodukte (R)-Konfiguration aufweisen. [38] Cosp et al zeigten über chiroptische Methoden, dass auch hier BAL die Carboligation zu (R)-2-ydroxy-5-phenylpent-4-en-3-on ((R)-22A1) katalysiert: [101] Für das -acetylierte Derivat (E-(R)-2-Acetoxy-5-phenyl-4- penten-3-on, ee = 80%) von (R)-22A1 wurde die optische Drehung mit [α] 25 D = (CCl 3 ) bestimmt. Die optische Drehung des bekannten E-(S)-2-Acetoxy-5-phenyl-4-penten- 3-ons (ee > 95%) wird in der Literatur mit [α] 25 D = 29 (CCl 3 ) beschrieben. [50] Die diastereoselektive Reduktion der Carbonylfunktion von (R)-22A1 zum syn- beziehungsweise anti-diol bestätigte das Ergebnis der (R)-Konfiguration an C2. Die optische Drehung des syn-diols betrug [α] 25 D = 6.1 (dr a:s = 12:88, c = 0.1, CCl 3 ), in der Literatur ist für (2R,3R)-5-Phenylpent-4-en-2,3-diol (ee = 92%) ein Drehwert von [α] 25 D = 15.5 (c = 0.3, CCl 3 ) angegeben. [102] Für das anti-diol wurde [α] 25 D = 7.8 (dr a:s = 78:22, c = 0.1, Et) gemessen, das bekannte (2R,3S)-5-Phenylpent-4-en-2,3-diol ist in der Literatur mit einer optischen Reinheit von 95% und einer optischen Drehung von [α] 25 D = 38 (c = 1.1, Et) zu finden. [83] (E)-ct-2-enal (16) und (E)-ex-2-enal (17) wurden auch als Substrate von BFDwt und (E)-ex-2-enal (17) von BFD281A akzeptiert. Es wurden ebenfalls selektiv α,β-ungesättigte 2-ydroxyketone (A) gebildet, die im Vergleich mit den über BAL-Katalyse erhaltenen die gleiche absolute Konfiguration zeigten. Die Enantioselektivitäten der α,β-ungesättigten 2-ydroxyketone wurden mittels PLC an chiraler Phase bestimmt, sie reichen von gering (16A1: 23% ee und 17A1: 24% ee über BFD Katalyse) bis ausgezeichnet (18A1: >98% ee über BAL-Katalyse).

28 22 SPEZIELLER TEIL Aromatische Aldehyde als Akzeptoren mit BAL als Katalysator Im letzten Kapitel wurde gezeigt, dass BAL Zimtaldehyd (22) als Donor aktiviert und an Acetaldehyd (1) addiert. Möglicherweise lässt sich der Akzeptor Acetaldehyd (1) durch einen aromatischen Aldehyd ersetzen und eine gemischte "Benzoin-ähnliche" Kondensation durchführen. [38] Da BAL auch in der Lage ist Benzaldehyd (3) als Donor zu aktivieren, wären jeweils bis zu vier verschiedene 1,2-Additionsprodukte möglich, entweder durch Kreuzkondensation mit (E)-Zimtaldehyd (22) als Donor (A) beziehungsweise Akzeptor (C) oder über die jeweilige Selbstkondensation (E) (Abb. 20). R R + R 22A3, 22A5, 22A10, 22A14, 22A15 22C3, 22C5, 22A10, 22C14, 22C : R = 5: R = 2-F 10: R = 2-Cl 14: R = 4-Br 22E22 15: R = 3,5- R 3E3, 5E5, 10E10, 14E14, 15E15 R Abb. 20: Denkbare 1,2-Additionen von 22 mit aromatischen Aldehyden. Verschiedene aromatische Aldehyde (3, 5, 10, 14, 15) wurden in Zusammenarbeit mit A. Cosp als Substrate zunächst im 1.5 ml Ansatz untersucht (Tab. 3). aromatischer Aldehyd Selbstkondensationsprodukt Kreuzkondensationsprodukt 3, R = 3E3 2% 22A3 14% 5, R = 2-F 5E5 10% 22A5 57% 10, R = 2-Cl 10E10 26% 22A10 16% 14, R = 4-Br 14E14 22% 22A14 6% 15, R = 3,5-15E15 29% 22A15 46% Tab. 3: Reaktionsweg A mit aromatischen Aldehyden als Akzeptoren. Umsetzungen in 1.5 ml KP i -Puffer (p 7), 20% DMS, 20 mm (E)-Zimtaldehyd (22), 10 mm aromatischer Aldehyd, 2 mg Protein-Lyophilisat. Bestimmung der Produktbildung (%) mittels GC-MS. Es wurden jeweils zwei der vier denkbaren Produkte gebildet, das Selbstkondensationsprodukt des aromatischen Aldehyds (E; 3, 5, 10, 14, 15) mit

29 SPEZIELLER TEIL 23 (R)-Konfiguration, [38] und das Kreuzkondensationsprodukt mit (E)-Zimtaldehyd (22) als Donor (22A3, 22A5, 22A10, 22A14, 22A15). (E)-Zimtaldehyd (22) fungierte somit in allen Reaktionen selektiv als Donor (A). Die aromatischen Aldehyde eignen sich, abhängig von ihrem Akzeptorcharakter, unterschiedlich gut für die Kreuzkondensationsreaktion mit (E)-Zimtaldehyd (22). Die Ursache der Donor- Akzeptor Selektivität liegt nicht nur in den elektronischen Eigenschaften der Substrate, wie im Fall der chemischen Kreuzbenzoinkondensation. [66, 103] Auch sterische Eigenschaften der Aldehyd-Substituenten und deren Interaktionen mit dem katalytischen Zentrum der BAL sind ausschlaggebend. [38] Ausserdem nimmt mit steigendem Donorcharakter der aromatischen Aldehyde, die Konkurrenzreaktion der Selbstkondensation zu. 2-Fluorbenzaldehyd (5) und 3,5-Dimethoxybenzaldehyd (15) eigneten sich besser als die anderen drei getesteten aromatischen Aldehyde (3, 10, 14) für die Kreuzkondensationsreaktion mit (E)-Zimtaldehyd (22). Deshalb wurden diese Reaktionen von A. Cosp am Institut für Biotechnologie 2 des FZ-Jülich zur Produktcharakterisierung mittels NMR in 50 ml Reaktionsvolumen synthetisiert (Tab. 4) R 5: R = 2-F 15: R = 3,5- BAL R 5E5, 15E15 R + 22A5, 22A15 R aromatischer Selbstkondensationsprodukt Kreuzkondensationsprodukt Aldehyd Ausbeute Ausbeute ee 5, R = 2-F 5E5 8% 22A5 56% n.b. 15, R = 3,5-15E15 20% 22A15 33% 72% Tab. 4: Reaktionsweg A mit aromatischen Aldehyden als Akzeptoren. Isolierte Ausbeuten aus Ansätzen in 50 ml Reaktionsvolumen. [66] n.b.: nicht bestimmt. Ausgehend von 2-Fluorbenzaldehyd (5) wurden 56% des Kreuzkondensationsproduktes (E)-1-(2-Fluorphenyl)-1-hydroxy-4-phenylbut-3-en-2-on (22A5) isoliert. Der Enantiomerenüberschuss des (E)-1-(3,5-Dimethoxyphenyl)-1-hydroxy-4-phenylbut-3-en-2- ons (22A15) wurde mittels NMR Analyse des (R)-Mosheresters (2-Methoxy-2-trifluormethyl- 2-phenylessigsäure-(MTPA)-ester) bestimmt. [104] Die durch Veresterung gebildeten Diastereomere aus aupt- und Unterschuss- Enantiomer unterscheiden sich im Protonen und 13 C NMR in ihren chemischen Verschiebungen.

30 24 SPEZIELLER TEIL Somit ließ sich über Integration der Signale (C=CC, C o-arc3, C p-arc3, ) im Protonen NMR der Enantiomerenüberschuss berechnen (Tab. 4). Des Weiteren wurde von A. Cosp das α-substituierte (E)-α-Methylzimtaldehyd (23) als Donorsubstrat eingesetzt (Abb. 21). Über Integration der Protonen NMR Signale (C=CAr, CC,, C=C ) und GC-MS Peakflächen der (R)- und (S)-Mosherester wurde für 23A10 der Enantiomerenüberschuss von 99% bestimmt (Abb. 21). Die (R)-Konfiguration der Produkte aus der gemischten "Benzoin-ähnlichen" Kondensation wurde für 23A10 exemplarisch über Vergleich der 13 C NMR Signale der (R)- und (S)-Mosherester ermittelt. [104, 105] Cl BAL + + Cl Cl Cl (R)-23A10 10E10 43% 17% 99% ee Abb. 21: Reaktionsweg A zu (R)-23A10 durch BAL-Synthese. Isolierte Ausbeuten aus Synthese in 30 ml Reaktionsvolumen. Bestimmung des ee über Protonen NMR und GC-MS der Mosherester und der absoluten Konfiguration über Vergleich der 13 C NMR Signale der (R)- und (S)-Mosherester. [106] Das Donor-Akzeptor-Konzept [38] konnte um die BAL-katalysierte Additionsreaktion zwischen α,β-ungesättigten (22 und 23) und aromatischen Aldehyden (3, 5, 10, 14, 15) erweitert werden. Die Kreuzkondensation verläuft selektiv über Weg A mit (E)-Zimtaldehyd (22) beziehungsweise (E)-α-Methylzimtaldehyd (23) als Donoren und liefert (R)-konfigurierte ydroxyenone (22A, 23A).

31 SPEZIELLER TEIL Reaktionsweg C Synthese von ydroxyketonen BAL als Katalysator Unter BAL-Katalyse reagieren α,β-ungesättigte Aldehyde als Donoren mit Acetaldehyd. (E)-Zimtaldehyd (22) und (E)-α-Methylzimtaldehyd (23) reagiert als Donor mit aromatischen Aldehyden. Auf der Suche nach α,β-ungesättigten Aldehyden mit Akzeptoreigenschaften wurden unter BAL-Katalyse kurzkettige aliphatische α,β-ungesättigte Aldehyde (19, 20, 21) in der Reaktion mit aromatischen Aldehyden (3, 14, 15) getestet. Auch hier sind vier verschiedene Kondensationsprodukte, entweder durch Kreuzkondensation mit dem α,β-ungesättigten Aldehyd als Donor (A) beziehungsweise Akzeptor (C), oder über die jeweilge Selbstkondensation (E), denkbar (Abb. 22). R 1 + R 3 R 2 R 3 R 2 R 1 R 1 R 1 R 1 R 2 R 3 R 3 R 3 R 2 R 2 Abb. 22: Denkbare 1,2-Additionen α,β-ungesättigter Aldehyde an aromatische Aldehyde. Es wurde sowohl die Selbstkondensation (E) der aromatischen Aldehyde (3, 14, 15), als auch die Kreuzkondensation beobachtet. Erstere zeigte, dass keines der Substrate die BAL inhibiert. Im Folgenden wurde die Aufmerksamkeit auf die Kreuzkondensation zwischen Acrolein (19), Methylacrolein (20) und Crotonaldehyd (21) mit Benzaldehyd (3), 4-Brombenzaldehyd (14) beziehungsweise 3,5-Dimethoxy-benzaldehyd (15) gelenkt, da hier die kurzkettigen aliphatischen α,β-ungesättigten Aldehyde 19, 20, 21 in allen Reaktionen ausschließlich chemoselektiv als Akzeptoren (C) fungierten (Tab. 5). Dies eröffnete den Reaktionsweg C.

32 26 SPEZIELLER TEIL R3 R BAL 3 R 2 + R2 R 1 R 1 3: R = 14: R = 4-Br 15: R = 3,5-19: R 2 = R 3 = 20: R 2 =, R 3 = 21: R 2 =, R 3 = 19C3, 20C3, 21C3, 19C14, 20C14, 21C14, 19C15, 20C15, 21C15 aromatischer Aldehyd α,β-ungesättigter Aldehyd Kreuzkondensationsprodukt 19 19C3 1% C3 12% 21 21C3 2% 19 19C14 < 1% C14 15% 21 21C14 4% 19 19C15 36% C15 55% Tab. 5: Reaktionsweg C mit BAL als Katalysator C15 25% Umsetzungen in 1.5 ml KP i -Puffer (p 7), 5% MTBE, 10 mm aromatischer Aldehyd, 100 mm α,β-ungesättigter Aldehyd, 1 mg BAL-Lyophilisat. Bestimmung der Kreuzkondensations-Produktbildung (%) mittels GC-MS. In diesen Reaktionen stellte 3,5-Dimethoxybenzaldehyd (15) im Vergleich zu Benzaldehyd (3) und 4-Brombenzaldehyd (14) den besten Donor dar. Methylacrolein (20) zeigte die besten Akzeptoreigenschaften (Tab. 5). Deshalb wurden die β,γ-ungesättigten ydroxyketone (20C3, 20C15) aus Methylacrolein (20) und Benzaldehyd (3) beziehungsweise 3,5-Dimethoxybenzaldehyd (15) zur Bestimmung des Enantiomerenüberschusses und zur Aufklärung der absoluten Konfiguration synthetisiert (Tab. 6). aromatischer α,β-ungesättigter Kreuzkondensationsprodukt Aldehyd Aldehyd Ausbeute ee absolute Konfig C3 7% > 98% n.b C15 34% > 99% R Tab. 6: Reaktionsweg C mit BAL als Katalysator. Isolierte Ausbeuten aus Ansätzen im 48 ml (20C3) oder 100 ml (20C15) Reaktionsvolumen. n.b.: nicht bestimmt.

33 SPEZIELLER TEIL 27 Der Enantiomerenüberschuss von > 98% des Produktes 20C3 wurde mittels PLC an chiraler Phase bestimmt. Durch Vergleich der Protonen NMR Signale und GC-MS Daten der (R)- und (S)-Mosherester wurde für 20C15 der Enantiomerenüberschuss von > 99% bestimmt (Tab. 6 und Abb. 23) ppm R C 2 R CF ppm C 2 R S F 3 C (R)-((R)-20C15)-Mo 3.69 ppm (S)-((R)-20C15)-Mo 3.61 ppm ben: (R,R) : (S,R) = 1:2 (NMR), 1:1 (GC-MS) Unten: (R,R) Abb. 23: Protonen NMR und GC-MS Vergleich der (R)- und (S)-Mosherester von 20C15.

34 28 SPEZIELLER TEIL Die (R)-Konfiguration der Kreuzkondensationsprodukte nach Reaktionsweg C durch BAL- Katalyse wurde für 20C15 über Vergleich der 13 C NMR Signale der (R)- und (S)-Mosherester [104, 105] ermittelt. ierbei werden die Substituenten des Alkohols nach ihren sterischen Ansprüchen in einen kleinen (Methylen-) und einen großen (Benzoyl-) Rest eingeteilt. Die Wechselwirkungen dieser Reste mit der Phenyl- beziehungsweise der Methoxygruppe im α-methoxy-α-trifluormethylphenylacetyl-teil des Mosheresters führen zu einer entsprechenden relativen och- oder Tieffeld Verschiebung der 13 C NMR Signale (Abb. 24). Tieffeld im Vergleich zu ochfeld im Vergleich zu C 2 C ppm ppm ppm ppm R R R S CF 3 CF 3 (R)-((R)-20C15)-Mo (oben) (S)-((R)-20C15)-Mo (unten) Abb. 24: 13 C NMR Signale von (R,R)-20C15-Mo (oben) und (S,R)-20C15-Mo (unten). Die Verbindung 20C15 kristallisiert in Form von farblosen, klaren Kristallen; mit diesen wurde eine Kristallstrukturanalyse von C. Röhr im Institut für Anorganische und Analytische Chemie der Universität Freiburg durchgeführt. Das Kristallsystem ist orthorhombisch in der Raumgruppe P (Z = 4; a = 7.272(3) Å, b = (4) Å, c = (6) Å). In Abb. 25

35 SPEZIELLER TEIL 29 ist die RTEP-Darstellung der Substanz 20C15 wiedergegben. Für den Torsionswinkel 2-C2-C1-1 wurden 12.5(2) gemessen und die Bestimmung des Winkels 1-2'-2 ergab 117(2). Für den Abstand zwischen 2 und 2' wurden 0.98(2) Å und zwischen 1 und 2' wurden 1.99(2) Å berechnet. Der kleine Torsionswinkel 2-C2-C1-1 und der geringe Abstand 1 und 2' deuten darauf hin, dass eine Wasserstoff-Brückenbindung zwischen dem Carbonyl-Sauerstoff (1) und dem ydroxyl-wasserstoff (2') vorliegt, eine für 2-ydroxyketone typische Erscheinung. Die Kristallstrukturanalyse zeigt somit eine rigide und zu anderen 2-ydroxyketonen vergleichbare Konformation von 20C15 auf. In Kombination mit dieser Information wurde über den UV und Circulardichroismus-Vergleich (Abb. 26) mit anderen (R)-konfigurierten Benzoinen (hier ist exemplarisch 15A4 herausgegriffen) [38] das Ergebnis der "Mosher-Methode" bestätigt. C10 1 2' 3 C8 C7 C6 C1 C2 2 2 C5 C3 C9 C8' C7' C4 3' C10' Abb. 25: Kristalle und Kristallstruktur von (R)-20C15. C 2 20C15 (durchgezogen) 15A4 (gepunktet) I Abb. 26: Circulardichroismus-Vergleich von (R)-20C15 mit (R)-15A4.

36 30 SPEZIELLER TEIL Die Kreuzkondensation der aromatischen Aldehyde 3, 14, 15 verläuft selektiv über Weg C mit Acrolein (19), Methylacrolein (20) beziehungsweise Crotonaldehyd (21) als Akzeptoren und liefert, wie am Beispiel 20C15 gezeigt, ydroxyenone in (R)-Konfiguration PDC als Katalysator Die gleichen Substrate, die von einem ThDP-abhängigen Enzym als Donoren umgesetzt werden, können im Katalysemechanismus eines anderen als Akzeptoren fungieren. [107] Pyruvatdecarboxylasen (PDC) [108] katalysieren die Addition eines Elektrophils an aromatische Aldehyde. [107] Ein spezieller Fall ist zum Beispiel die Decarboxylierung von Pyruvat zum aktivierten Acetaldehyd und dessen Addition an Benzaldehyd (3) als Akzeptorsubstrat zu (R)-Phenylacetylcarbinol ((R)-PAC). [109] R. Cardillo et al. zeigten, dass mit gereinigter PDC aus Saccharomyces cerevisae (SIGMA) die Kondensationsreaktion von Pyruvat (2) mit Benzaldehyd (3), aber nicht mit α,β-ungesättigten Aldehyden möglich ist. [110] Es ist jedoch bekannt, dass Bäckerhefe die Transformation nach Abb. 27 katalysiert: Aus der Glykolyse erhaltenes Pyruvat (2) addiert vermutlich unter der Katalyse der PDC an α,β-ungesättigte Aldehyde. Die so gebildeten α,β-ungesättigten ydroxyketone werden in situ von in der efe enthaltenen Alkoholdehydrogenasen zu Diolen [25, 82-85] reduziert. Bäckerhefe Bäckerhefe Glucose R' Pyruvat (2) (PDC) R' (AD) R' Abb. 27: Bäckerhefe-katalysierte Umsetzung von α,β-ungesättigten Aldehyden. [84] Im Rahmen dieser Arbeit wurde die C-C-Bindungsknüpfung zwischen Pyruvat (2) und den α,β-ungesättigten Aldehyden (E)-ct-2-enal (16), (E)-ex-2-enal (17), (E)-2-Methylpent-2- enal (18) oder (E)-Zimtaldehyd (22) mit den PDCs aus Saccharomyces cerevisiae (ScPDC) [107, 108] und Acetobacter pasteurianus (ApPDC) [111] untersucht (Tab. 7).

37 SPEZIELLER TEIL 31 R 2 ApPDC R 2 R 1 ScPDC + R 1 -C , 17, 18, 22 16C2, 17C2, 18C2, 22C2 α,β-ungesättigter Aldehyd R 1 R 2 Enzym α,β-ungesättigtes 3-ydroxyketon (C) ee (E)-ct-2-enal (16) (E)-ex-2-enal (17) (E)-2-Methylpent-2-enal (18) (C 2 ) 4 (C 2 ) 2 ScPDC 16C2 50% > 98% ApPDC 4% n.b. ScPDC 17C2 58% > 98% ApPDC 30% > 98% C 2 ScPDC 18C2 < 1% - ApPDC < 1% - (E)-Zimtaldehyd ScPDC < 1% - Ar 22C2 (22) ApPDC < 1% - Tab. 7: Reaktionsweg C mit PDC als Katalysator, 1.5 ml-ansätze. Die Bildung (%) der α,β-ungesättigten 3-ydroxyketone (C) wurde mittels Protonen NMR und der ee mittels PLC-DAD an chiraler Phase (Chiralpak AD) bestimmt. n.b.: nicht bestimmt. Auch hier könnte die ambidente Natur der α,β-ungesättigten Aldehyde [55, 56] Probleme in der Regioselektivität verursachen, da die nucleophile Addition des aktivierten Acetaldehyds sowohl in α - als auch in γ-position stattfinden könnte. [112] Tatsächlich jedoch reagieren die α,β-ungesättigten Aldehyde selektiv als Akzeptoren nach dem Reaktionsweg C, ähnlich wie Benzaldehyd (3). Es wurde jeweils nur ein Regioisomer, das β,γ-ungesättigte ydroxyketon (C), über die 1,2-Additionsreaktion erhalten (Tab. 7). (E)-2-Methylpent-2-enal (18) und (E)-Zimtaldehyd (22) waren unter den getesteten Bedingungen ungeeignete Substrate für beide Pyruvatdecarboxylasen. Die α,β-ungesättigten Aldehyde (E)-ct-2-enal (16) und (E)-ex-2-enal (17) ergaben gute Umsetzungen mit ausgezeichneten Enantioselektivitäten (ee > 98%). Die besten Substrateigenschaften zeigte (E)-ex-2-enal (17). Die Pyruvatdecarboxylase aus Saccharomyces cerevisiae erwies sich als gut geeigneter Katalysator für diese Reaktionen. Die unter BAL- und BFD-Katalyse als Donorsubstrate reagierenden α,β-ungesättigten Aldehyde (E)-ct-2-enal (16) und (E)-ex-2-enal (17) wurden mittels PDC als Akzeptoren umgesetzt.

38 32 SPEZIELLER TEIL 3.4. Zusammenfassung Reaktionsweg A und C Mit den Enzymen BAL, BFDwt und BFD281A wurde regio- und enantioselektiv Reaktionsweg A zugänglich. Es ließen sich α,β-ungesättigte aliphatische (16, 17, 18) beziehungsweise aromatische (22, 23) Aldehyde als Donoren und sowohl Acetaldehyd (1), als auch aromatische Aldehyde (3, 5, 10, 14, 15) als Akzeptoren einsetzen. Es wurden selektiv aliphatische (R)-ydroxyenone der isomeren Form A synthetisiert. Mit Acetaldehyd (1) als Akzeptor wurden Enantioselektivitäten von bis zu >98% ee (18A1) und mit aromatischen Aldehyden von bis zu 99% ee (23A10) erzielt. Über den Reaktionsweg C konnten mit den Enzymen BAL, ScPDC und ApPDC regiound enantioselektiv (R)-ydroxyenone der isomeren Form C gebildet werden. BAL katalysiert die Kreuzkondensation der aromatischen Aldehyde 3, 14, 15 mit Acrolein (19), Methylacrolein (20) beziehungsweise Crotonaldehyd (21) als Akzeptoren. Es wurden ydroxyenone in (R)-Konfiguration mit ausgezeichnetem Enantiomerenüberschuss (>99% ee für 20C15) erhalten. ScPDC und ApPDC katalysieren die Bildung β,γ-ungesättigter ydroxyketone (C) durch die enantioselektive Addition (ee > 98% für 17C2) von aktiviertem Acetaldehyd an α,β-ungesättigte Aldehyde. Durch geeignete Substratwahl wurden unter Katalyse desselben Enzyms (BAL) selektiv entweder (R)-ydroxyenone vom Typ A oder C synthetisiert. Außerdem wurden dieselben Substrate (16, 17), die mit BAL als Katalysator selektive Donoren waren von ScPDC beziehungsweise ApPDC als selektive Akzeptoren genutzt. Durch geeignete Enzymwahl können somit aus denselben Substraten selektiv entweder (R)-ydroxyenone der isomeren Form A oder C gewonnen werden.

39 SPEZIELLER TEIL Reaktionsweg D Synthese von 1,4-Diketonen Gewinnung des Katalysators PigD Klonierung PigD mit C-terminalem is-tag Das Ausgangsmaterial für die Arbeiten war die genomische DNA aus Serratia marcescens, sie wurde vom Institut für Mikrobiologie der Universität Freiburg zur Verfügung gestellt. Die molekularbiologischen Arbeiten wurden in Zusammenarbeit mit M. Richter durchgeführt. Mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR) wurde die DNA, die dem Protein PigD aus Serratia marcescens entspricht, vervielfältigt. Durch die dabei verwendeten Primer (pigd_forward, pigd_reverse) wurde außerdem am 5`-Ende eine NdeI, sowie am 3`-Ende eine XhoI Restriktionsschnittstelle generiert. Der Vektor pet22b(+) besitzt in seiner Multi Cloning Site diese beiden Schnittstellen. Sowohl der Vektor als auch das PCR-Produkt wurden dann mit den beiden Restriktionsenzymen verdaut und im Anschluss mit T4 DNA-Ligase ligiert. Zur Kontrolle wurde das pigd Gen nach Isolierung der DNA aus den Transformanten aus dem Plasmid pigd_pet22b(+) durch doppelten Verdau mit NdeI und XhoI herausgeschnitten (Abb. 28, Gelspur C). A: Linearisierter pet22b(+)-vektor. B: 1 kb-marker C: pet22b(+)-vektor kb Fragment (pigd, C-terminaler 6xis-Tag). Abb. 28: Doppelverdau von pigd_pet22b(+).

40 34 SPEZIELLER TEIL Abb. 29: pigd_pet22b(+). Die "in-frame" Klonierung (Insertion unter Beibehalt des korrekten Leserahmens) wurde darüber hinaus durch vollständige Sequenzierung bestätigt (4BASELAB). Die erhaltene Nukleotid-Sequenz ist im Anhang (9.1 Alignment der pigd Nukleotid-Sequenzen ) abgebildet. Mit dem rekombinanten Plasmid (Abb. 29) wurden E. coli D5α und E. coli XL1blue zur Vektorproduktion, sowie E. coli BL21(DE3)pLysS-, E. coli BL21(DE3)*CP und E. coli BL21(DE3) Zellen zur Expression transformiert. Auf diese Weise wurde ein Fusionsprotein von PigD aus Serratia marcescens als C-terminal 6xis-Tag tragendes Protein erhalten. Die erhaltene Aminosäure-Sequenz ist im Anhang (9.2 Aminosäure-Sequenz von PigD aus dieser Arbeit) ohne 6xis-Tag abgebildet PigD ohne is-tag Es besteht die Möglichkeit, dass der is-tag am C-terminalen Ende der Aminosäuresequenz die Protein-Expression, -Stabilität oder -Aktivität beeinflusst. Um dies zu überprüfen wurde PigD ohne is-tag hergestellt. Die pigd-nukleotid-sequenz wurd e ausgehend vom Plasmid pigd_pet22b(+), unter Konservierung des Stop Codons innerhalb der pigd Sequenz, kloniert. Durch die Wahl der Primer (pigd_forward, pigd_stop_reverse) wurde am 5`-Ende eine NdeI und am 3 -Ende eine

41 SPEZIELLER TEIL 35 XhoI Schnittstelle innerhalb der zu amplifizierenden cdna Sequenz eingeführt. Nach enzymatischem Verdau von Vektor und gereinigtem PCR-Produkt mit NdeI und XhoI, wurden die isolierten Fragmente mit T4 DNA-Ligase ligiert und das Plasmid pigd_stop=pet22b(+) erhalten. Zur Kontrolle wurde pigd aus dem Plasmid pigd_stop=pet22b(+) durch doppelten Verdau mit NdeI und XhoI geschnitten (Abb. 30). A: 1 kb-marker B: linearisierter pet22b(+)-vektor kb Fragment (pigd, ohne is-tag). Abb. 30: Doppelverdau von pigd_stop=pet22b(+) (links); pigd_stop=pet22b(+) (rechts). Die pigd Sequenz pigd_stop=pet22b(+) (Abb. 30, Gelspur B) wurde vollständig mit T7 primalen, T7 terminalen und von der Sequenz abgeleiteten Primern sequenziert (4BASELAB). Mit dem so erhaltenen rekombinanten Plasmid (Abb. 30) wurden E. coli D5α und E. coli XL1blue Zellen zur Vektorproduktion, sowie E. coli BL21(DE3) Zellen zur Expression transformiert. Auf diese Weise wurde ein Fusionsprotein ohne is-tag von PigD aus Serratia marcescens erhalten PigD mit N-terminalem is-tag Ein fehlender is-tag erschwert die Proteinreinigung, da nicht mehr die Immobilisierte Metallionen Affinitätschromatographie (IMAC), sondern andere Methoden, wie zum Beispiel die Grössenaussch luss- oder Ionenaustausch-Chromato graphie herangezogen werden müssen. Möglicherweise beeinflusst ein is-tag am N-terminalen Ende der Aminosäuresequenz die Protein-Expression, -Stabilität oder -Aktivität weniger als am C-terminalen Ende oder wirkt

42 36 SPEZIELLER TEIL sich sogar positiv aus. [113] Des Weiteren lassen sich ThDP-abhängige Enzyme mit N-terminalem is-tag in der Regel besser kristallisieren. [114] Um ein N-terminal 10xis-Tag tragendes PigD aus Serratia marcescens zu erhalten, wurde die 2.7 kb cdna von pigd aus dem Plasmid pigd_stop=pet22b(+) geschnitten und in den pet19b Vektor insertiert. Nach enzymatischem Verdau von Vektor und Plasmid (pigd_stop=pet22b(+)) mit NdeI und XhoI, wurden die isolierten Fragmente mit T4 DNA- Ligase ligiert und das Plasmid pigd_stop=pet19b erhalten. Zur Kontrolle wurde pigd aus dem Plasmid pigd_stop=pet19b durch doppelten Verdau mit NdeI und XhoI geschnitten (Abb. 31, Gelspur A). A: linearisierter pet19b-vektor kb Fragment (pigd, N-terminaler 10xis-Tag). B: 1 kb-marker Abb. 31: Doppelverdau von pigd_stop=pet19b. Abb. 32: pigd_stop=pet19b.

43 SPEZIELLER TEIL 37 Die DNA der pigd Sequenz in pigd_stop=pet19b wurde ausgehend vom 5 und 3 Ende mit T7 Primern sequenziert (4BASELAB). Mit dem so erhaltenen rekombinanten Plasmid (Abb. 32) wurden E. coli D5α und E. coli XL1blue Zellen zur Vektorproduktion, sowie E. coli BL21(DE3) Zellen zur Expression transformiert. Auf diese Weise wurde ein Fusionsprotein von PigD aus Serratia marcescens als N-terminal 10xis-Tag tragendes Protein erhalten pigd Nukleotid-Sequenz Vergleich Im Anhang (9.1 Alignment der pigd Nukleotid-Sequenzen aus Serratia) ist das Alignment der Nukleotid-Sequenz von pigd aus dieser Arbeit mit den beiden veröffentlichten aus Serratia marcescens (embl accession AJ ) und Serratia sp. (embl accession AJ ) abgebildet. Die Sequenz aus Serratia sp. ist um 108 Nukleodide kürzer, die aus Serratia marcescens um 6 Nukleotide länger, als pigd aus dieser Arbeit. Die Unterschiede zur Nukleotid-Sequenz von pigd aus Serratia marcescens (embl accession AJ ) sind farbig markiert. Blau sind Nukleotidunterschiede, die nur in zwei Fällen (Pro) eine Auswirkung in der Aminosäure-Sequenz zeigen. Diese zwei für Prolin kodierenden Triplets sind blau-gelb markiert, sie sind in Serratia sp. (embl accession AJ ) enthalten. Des Weiteren gelb markiert ist die 36 er Sequenz, als Übereinstimmungen mit Serratia sp., die aus dem Fehlen dreier einzelner Nukleotide zwischen den Positionen 2574/5, 2601/2 und 2610/1 im Vergleich zu Serratia marcescens (embl accession AJ ) entstanden ist Expression der PigD Varianten Die Zellen wurden in LB-Medium (100 µg/ml Ampicillin) bei 37 C und 120 Upm im Schüttelkolben (4 x 400 ml) inkubiert und nach IPTG-Zugabe (0.4 mm Endkonzentration) exprimiert. Die Expressionen in E. coli K12 BL21(DE3)-Zellen wurden bei 29 C über Nacht durchgeführt. Der Vergleich der "Codon Usage" [115] von Serratia marcescens und Escherichia coli K12 zeigte keine relevanten Unterschiede, die auf eine schlechtere Expression von pigd in E. coli hinweisen würde. In den unten abgebildeten SDS-PAGEs ist die PigD Bande bei knapp über 100 kd mit einem Pfeil gekennzeichnet (Abb. 33). Gelspur C zeigt die lösliche Fraktion einer pet22b(+)-leervektorexpression, hier ist an dieser Stelle keine Bande zu sehen. Sowohl die Expression von PigD mit C-terminalem 6x is-tag (Gelspur A) und N-terminalem 10x is-tag (Gelspur K), als auch die von PigD ohne is-tag (Gelspur I) blieben immer sehr gering. Die Bildung von Proteinaggregaten in Form von inclusion bodies war nicht die Ursache der geringen Proteinkonzentration in den löslichen Fraktionen

44 38 SPEZIELLER TEIL der Aufschlüsse, denn die unlöslichen Fraktionen der Aufschlüsse zeigten keine verstärkte Bande bei knapp über 100 kd (Gelspur F). Des Weiteren wurde von. Gieren am Institut für Molekulare Enzymtechnologie der Universität Düsseldorf im FZ-Jülich eine ZD- Fermentation der Expression von PigD mit C-terminalem 6x is-tag nach der Methode von Korz et al. [116] durchgeführt. In einem 40 L Reaktor bei 30 C, p 7.0 und einer Sauerstoffsättigung von 30-40% wurde bei einer D 600 ~ 60 die Expression durch Zugabe von IPTG (1.5 mm Endkonzentration) gestartet. Diese (Gelspur D) blieb noch niedriger, als die Expression im Schüttelkolben (Gelspur A). Zu bedenken ist hier, dass PigD ein Enzym aus einem Sekundärmetabolismus ist. Diese werden nicht selten weniger stark exprimiert als Enzyme des Primärstoffwechsels wie zum Beispiel die PDC. Abb. 33: SDS-PAGEs; PigD-Expression. A: Lösliche Fraktion des Aufschlusses der Zellen aus einer 4 x 400 ml E xpression von PigD mit C-terminalem 6x is-tag. C: Lösliche Fraktion der Leervektorexpression (pet22b(+)). D: Lösliche Fraktion des Aufschlusses der Fermenterzellen von PigD mit C-terminalem 6x is-tag. F: Unlösliche Fraktion des Aufschlusses der Fermenterzellen von PigD mit C-terminalem 6x is-tag. I: Lösliche Fraktion des Aufschlusses der Zellen aus einer 4 x 400 ml Expression von PigD ohne is-tag. K: Lösliche Fraktion des Aufschlusses der Zellen aus einer 4 x 400 ml Expression von PigD mit N-terminalem 10x is-tag. B, E, G,, J: Protein-Marker

45 SPEZIELLER TEIL Protein-Reinigung Die Proteinreinigung der mittels Ultraschall aufgeschlossenen Zellen, wurde über Immobilisierte Metallionen Affinitätschromatographie (IMAC) durchgeführt. Es wurden sowohl Talon beads für den analytischen Maßstab (3 ml lösliche Fraktion des Zellaufschlusses) als auch Nickel-NTA-Sepharose für den präparativen Maßstab ( ml lösliche Fraktion des Zellaufschlusses) verwendet (siehe Chromatographische Proteinreinigung). Zur Entwicklung eines idealen Protokolls der Proteinreinigung im präparativen Maßstab wurde eine Gradientenelution mit aufsteigender Imidazolkonzentration von 10 mm bis 300 mm in KP i -Puffer über 150 Minuten durchgeführt. PigD begann bei 100 mm Imidazol von der Säule zu eluieren. Mit dieser Information konnte als Standardmethode die Stufenelution genutzt werden. ier wurde nach 2-stündigem Waschen mit 50 mm Imidazol, da nun die Extinktion bei 280 nm konstant blieb, PigD mit 200 mm Imidazol von der Nickel- NTA-Sepharose eluiert. Das reine Eluat von PigD mit C-terminalem 6x is-tag wurde mit gesteigerter Proteinkonzentration entweder als Ultrafiltrat oder Lyophilisat in den enzymatischen Reaktionen eingesetzt. Abb. 34 (links) zeigt eine SDS- PAGE. Aufgetragen ist das Eluat nach der Reinigung über Nickel-NTA-Sepharose von PigD mit C-terminalem 6x is- Tag neben einem Protein- Marker. Abb. 34: SDS-Page: Eluat nach Reinigung über Ni-NTA (links); PigD-Lyophilisat (rechts).

46 40 SPEZIELLER TEIL PigD Aminosäure-Sequenz Die Bande bei knapp über 100 kd der SDS-PAGE des Eluats nach der Proteinreinigung von PigD mit C-terminalem 6x is-tag (siehe Abb. 34, links) wurde von T. Jank am Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Universität Freiburg über MALDI-TF-Analyse vermessen. 34 Fragmente wurden detektiert (siehe Proteinuntersuchungen mittels Massenspektro), von denen 28 mittels des Computerprogramms "Mascot" ( PigD aus Serratia marcescens (embl accession AJ ) zugeordnet werden konnten, was einer Sequenz-Abdeckung von 32% entspricht (Score: 204, Expect: 1.3e -14 ). Die Aminosäure-Sequenz von PigD aus dieser Arbeit ist im Anhang (9.2 Aminosäure- Sequenz von PigD aus dieser Arbeit) abgebildet. Sie unterscheidet sich von den bereits veröffentlichten Sequenzen aus Serratia marcescens (embl accession AJ ) und Serratia sp. (embl accession AJ ), [97, 117] indem sie praktisch ein ybrid aus jenen darstellt. In diesem ybrid ist der PigD Sequenz von Serratia marcescens je ein Prolin in Position 607 und 838 und ein 12 Aminosäuren langes Peptidsegment (Leu Ala Thr Ala Lys Gly Trp Gln Arg Asp Pro Ser (LATAKGWQRDPS)) in Position aus PigD von Serratia sp. incorporiert. Analysen der Aminosäure-Sequenz deuten darauf hin, dass das Protein zur Familie der ThDPabhängigen Enzyme gehört (siehe 2.2 Thiamindiphosphat-abhängige Enzyme). [118, 119] Sowohl das GDG Triplet im C-terminalen Teil (Position ), als auch die Ähnlichkeit in dieser Region (Position ) mit anderen bekannten ThDP Enzymen sprechen für diese Annahme. Jedoch ist die Konservierung der für ThDP-abhängige Enzyme charakteristischen Sequenz (GDG X8 E X4 A X5 P X6 NN) [15] relativ schwach ausgeprägt (GDG X19 P; in der Sequenz rot markiert). "Motiv Scans" ergaben in Position eine omologie (E-value: 3e -9 ) [119] zur Acetolactatsynthase AAS-I (Gen: ilvb aus E. coli, EC ). [120] Diese bindet ein Magnesium-Ion und ein Molekül ThDP pro Untereinheit und enthält ein Molekül FAD je Monomer, wobei die Rolle des FAD ungeklärt ist, da in der katalysierten Reaktion keine Redox-Chemie involviert ist. PigD scheint auch eine xidoreduktase Funktionalität zu besitzen, da über "Inter Pro Scan" in Position der PigD Aminosäure-Sequenz eine deutliche Sequenzhomologie zur IMPD (Inosin Monophosphat Dehydrogenase) Familie gefunden wurde.

47 SPEZIELLER TEIL Decarboxylaseaktivität von PigD Williamson et al. postulierten den ersten Schritt der Prodigiosin-Synthese, als die durch PigDkatalysierte Decarboxylierung von Pyruvat ( 2) und nachfolgende Addition des aktivierten C pelbindung von (E)-ct-2-enal (16). [97] 2 -Fragmentes an die Dop Die Bestimmung der Decarboxylaseaktivität erfolgte in dieser Arbeit durch einen gekoppelten enzymatischen Test (siehe Decarboxylaseaktivität). Voraussetzung hierfür ist, dass von PigD Pyruvat zu Acetaldehyd (1) und C2 umgesetzt wird. Ist dies der Fall, so wird der entstehende Acetaldehyd (1) durch ein ilfsenzym, der Alkoholdehydrogenase aus Pferdeleber (LAD), unter NAD-Verbrauch, zu Ethanol reduziert (Abb. 35). [121] Die Abnahme des NAD kann photometrisch bei 340 nm verfolgt werden. PigD NAD NAD + LAD C 3 C 2 - C 2 1 Ethanol Abb. 35: Reaktionsfolge zur Bestimmung der Decarboxylaseaktivität. Decarboxylierung von Pyruvat (2) und nachfolgende Reduktion von Acetaldehyd (1). Es wurde weder im zellfreien Rohextrakt, noch in gereinigter Enzymlösung (400 µg ml -1 ) signifikante Decarboxylase-Aktivität gemessen, obwohl in diesem Konzentrationsbereich Carboligaseaktivität (siehe Benzaldehyd-Derivate als 1,2-Akzeptoren) beobachtet wurde. Möglic herweise wird der durch Decarboxylierung von Pyruvat (2) entstehende aktivierte Acetaldehyd (1) nicht vom Enzym freigesetzt, sondern direkt auf einen Akzeptor übertragen. Der Akzeptor könnte zum Beispiel ein weiteres decarboxyliertes Pyruvat-Molekül zur Aceto inbildung (1E1) oder Pyruvat (2) selbst unter der Bildung von Acetolactat sein.

48 42 SPEZIELLER TEIL Charakterisierung des Substratspektrums von PigD PigD 1,2-Carboligaseaktivität Acetoinbildung hne Anwesenheit eines Elektrophils beziehungsweise eines weiteren Akzeptorsubstrates wurde über PigD-Katalyse die Kondensation von Pyruvat (2) zu (S)-Acetoin ((S)-1E1) mit einem Enantiomerenüberschuss von 70% bestimmt. Diese Reaktivität der (S)-Acetoin- Bildung wurde schon früher bei der Pyruvatdecarboxylase aus Zymomonas mobilis gefunden. [122, 123] Für analytische Referenzdaten wurde im Rahmen dieser Arbeit mit der Pyruvatdecarboxylase aus Saccharomyces cerevisiae für die Kondensation von Pyruvat (2) die Bildung von (R)-Acetoin ((R)-1E1) mit einem Enantiomerenüberschuss von 67% festgestellt. Schon in früheren Arbeiten wurde mit efe PDC die (R)-Acetoin Bildung beobachtet. [122] BAL und BFDwt katalysieren die Bildung von (R)-Acetoin ((R)-1E1) aus zwei Molekülen Acetaldehyd (1) (Tab. 8). [100] 2 2 PigD / ZmPDC / ScPDC C E1 2 1 BAL / BFDwt (R)-1E1 Enzym Substrat ee absolute Konfig. ZmPD ZmPD PigD 70% ] C [122 3] C [12 ScPDC 67% efe PD 2] C [12 [100] tald d (1 BAL Ace ehy ) BFDwt [100] Tab. 8: Acetoinbil dung (1E1). 29% Pyruvat ( 2) 20% 53% 40% 34% Bestimmun g des ee mit tels GC an chiraler stationä rer Phase mit einer FS-Lipodex D-Säule. S R

49 SPEZIELLER TEIL Benzaldehyd-Derivate als 1,2-Akzeptoren hydroxypropanone gebildet (Tab. 9). Auch Pyruvatdecarboxylasen, zum Beispiel aus [107, 109, 124] Saccharomyces sp. oder Zymomonas mobilis, katalysieren einige dieser Reaktionen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Substratspektren der Pyruvatdecarboxylase aus In Gegenwart aromatischer Aldehyde wurden ausgehend von Pyruvat mit PigD 1-Phenyl-1- Saccharomyces cerevisiae und PigD im inblick auf die 1-Phenyl-2-hydroxypropanon- Bildung verglichen und deutliche Unterschiede festgestellt. So eignete sich unter den getesteten Substraten 2-Iodbenzaldehyd (4) für PigD am besten, aber für die ScPDC am schlechtesten. 2-Chlorbenzaldehyd (8) dagegen wurde von der ScPDC sehr gut, von PigD dagegen schlechter umgesetzt als 3,5-Dichlorbenzaldehyd (6). Der Vergleich zeigt deutlich die für jedes Enzym charakteristische Selektivität. Für sie sind nicht nur die elektronischen Eigenschaften der Substrate, sondern vor allem sterische Eigenschaften der Aldehyd- Substituenten und deren Interaktionen mit dem katalytischen Zentrum der Enzyme ausschlaggebend. Sowohl 2-Iodbenzaldehyd (4), als auch 3,5-Dichlorbenzaldehyd (6), stellen eine Erweiterung der bisher mit Pyruvatdecarboxylasen getesteten Substratspektrum zur Bildung der 1-Phenyl-1-propanone dar. [107] PigD / ScPDC R 5 R R4 + * R 3 R 1 R 3 R 1 3 C R 2 - C R 2 R 5 3C2 4C2 5C2 6C2 7C2 8C2 9C2 10C2 11C2 12C2 13C2 R 1 I F F Cl F Br F R 2 Cl Cl F F R 3 F R 4 Cl F F R 5 F F PigD ScPDC n.b. n.b. 62 n.b. n.b. Tab. 9: : PigD-und ScPDC-katalysierte Umsetzungen mit Benzaldehyd-Derivaten. Allgemein: 1.5 ml Ansätze, p 7.0. Bedingungen für PigD: 20% DMS, 20 mm Benzaldehy d/-derivat, 50 mm Natrium Pyruvat, 870 µg PigD Protein; Bedingungen für ScPDC: 10% Ethanol, 20 mm Benzaldehyd Derivat, 50 mm Natrium Pyruvat, 30 µl ScPDC zellfreier Rohextrakt (370 U/ ml). Bestimmung des 1-Phenyl-1- hydroxypropanon beziehungsweise der -Derivate (%) mittels GC-MS. n.b.: nicht bestimmt.

50 44 SPEZIELLER TEIL Für ausgewählte 1-Phenyl-1-hydroxypropanone über PigD-Katalyse wurden die Enantiomerenüberschüsse bestimmt. PigD zeigte hier mittelmäßige bis gute Enantioselektivitäten (53-88% ee, Tab. 10). 3C2 4C2 5C2 6C2 77% 88% 73% 53% Tab. 10: Enantiomerenüberschüsse von 3C2, 4C2, 5C2 und 6C2 über PigD-Katalyse. Der ee wurde bestimmt mittels PLC an chiraler Phase m it einer Chiralcel D- Säule. Die absolute Konfiguration wurde für 1-(2-Iodphenyl)-1-hydroxypropan-2-on ( 4C2) und 1-(3,5-Dichlorphenyl)-1-hydroxy propan-2-on (6C2) bestimmt. ydroxyketone liegen häufig in einer sterisch fixierten Form über eine Wasserstoff- Brückenbindung zwischen dem Carbonyl-Sauerstoff und dem ydroxyl-wasserstoff vor. Evans et al. postulierten dies zum Beispiel auf Grund von NMR Experimenten für ein ydroxyketon als Zwischenprodukt in ihrer Totalsynthese des Antbiotikums X-206. [125] In dieser Arbeit wurde es für 20C15 mittels Röntgenstrukturanalyse gezeigt. Es ist höchst wahrscheinlich, dass auch 4C2 und 6C2 wie (R)-Phenylacetylcarbinol (( R)-PAC, (R)-3C2) auf diese Weise fixiert sind und alle drei die gleiche rigide Konformation einnehmen. In Kombination mit dieser Information wurde über UV und Circulardichroismus-Vergleich (Abb. 36) mit (R)-PAC ((R)-3C2) die (R)-Konfiguration der über PigD-Katalyse gewonnenen aromatischen 1,2-Additionsprodukte bestimmt. (R)-3C2 (gepunktet) I (R)-4C2 (durchgezogen) Cl Cl (R)-6C2 (gestrichelt) Abb. 36: Circulardichroismus-Vergleich von 4C2 und 6C2 mit (R)-PAC ((R)-3C2).

51 SPEZIELLER TEIL PigD 1,2-Donoren Zur Testung verschiedener Donorsubstrate wurde die 1,2-Addition an 2-Iodbenzaldehyd (4) ausgewählt, da der aromatische Aldehyd 4 gute Akzeptoreigenschaften aufwies (Tab. 9). Das Substratspektrum der 1,2-Carboligaseaktivität ließ sich mit 2-xobutyrat (25) auf der Seite der Donorsubstrate erweitern (Tab. 11). I + R PigD C * I R Donor 1,2-Carboligationsprodukt 24, R = 4C24 n.d. 2, R = 4C2 93% 25, R =C 2 4C25 22% 26, R = C( ) 2 4C26 n.d. 27, R = C 2 C 2 C - 4C27 n.d. Tab. 11: PigD 1,2-Donoren. 20% DMS, 20 mm 2-Iodbenzaldehyd (4), 50 mm Donorsubstrat, 870 µg PigD Protein, 1.5 ml-ansätze, Bestimmung der 1,2-Carboligationsprodukte (%) mittels GC-MS. n.d.: nicht detektiert GC-MS Assay Die besten Umsetzungen zeigte PigD mit 2-Iodbenzaldehyd (4) als Akzeptor und Pyruvat (2) als Donor zu (R)-1-(2-Iodphenyl)-1-hydroxypropan-2-on ((R)-4C2) (Tab. 9). Diese Reaktion wurde in einer 2-Punkt-Messung zur Bestimmung der Carboligaseaktivität der einzelnen Enzymfraktionen ausgenutzt. Substrate und Enzym wurden bei 30 C in KP i Puffer (p 7.0) inkubiert und nach 16 Stunden wurde das mit Ethylacetat extrahierte Gemisch mittels GC-MS vermessen. Als 1 U PigDLig wurde die Enzymmenge definiert, die 1 µmol 2-Iodbenzaldehyd (4) bei 30 C in 16 Stunden umsetzt. Die spezifische Ligase-Aktivität der einzelnen Enzymreinigungen lag bei UPigDLig mg -1 Protein. Die (R)-4C2-Bildung diente bei allen Reaktionen mit PigD als Positivkontrolle der Enzymaktivität.

52 46 SPEZIELLER TEIL TTC-Test Die Carboligase-Aktivität des Enzyms PigD sollte durch einen einfachen Farbassay nachgewiesen werden, [126] welcher bereits in Zufallsmutagenese-Ansätzen angewendet worden ist. [127] ier steht die Schnelligkeit beziehungsweise ochdurchsatzfähigkeit zu einer qualitativen Aussage über die Enzymaktivität im Vordergrund. Der Test beruht auf der xidation von ydroxyketonen zu Diketonen, wodurch das farblose 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) zum intensiv rot gefärbten Formazan reduzie rt wird (Abb. 37). Cl N N N N N R 1 R 2 N + + N N R 1 R 2 + Cl TTC ydroxyketon Formazan (rot) Dik eton Abb. 37: Reduktion des TTC durch ein ydroxyketon zum roten Formazan. In enzymatischen Reaktionen wurde gezeigt, dass PigD zwei Moleküle Pyruvat (2) decarboxyliert und zu Acetoin (1E1) umsetzt (siehe Tab. 8). Durch den TTC-Test lässt sich die PigD Aktivität zur Acetoinbildung aus Pyruvat abschätzen. In je 100 µl Lösung wurden PigD in aufsteigender Konzentration (10, 35, 50, 75, 100, 150 µg) und Pyruvat (2, 50 mm, 567 µg Natrium Pyruvat) bei Raumtemperatur inkubiert. Als Nachweisgrenze für diesen Farbtest wurde unter den Bedingungen dieser Arbeit eine Acetoinkonzentration (1E1) von 0.3 mm ( 0.6 mm Pyruvat, 1.2%) ermittelt. Im Fall 1 betrug die Inkubationszeit von Enzym und Substrat vor Zugabe des Farbreagenzes 4 Stunden, im Fall 2 betrug sie 16 Stunden. Fall 1: 100 µg Protein zeigte keine, 150 µg Protein zeigte Rotfärbung. Somit wurden hier, um in 4 Stunden mindestens 1.2% Pyruvat zu Acetoin (1E1) umzusetzen, 150 µg PigD benötigt. Fall 2: 35 µg Protein zeigte keine, 50 µg Protein zeigte Rotfärbung (siehe Abb. 38). Um in 16 Stunden mindestens 1.2% Pyruvat zu Acetoin (1E1) umzusetzen wurden 50 µg PigD benötigt. Abb. 38: TTC-Test. Abb. 38 zeigt den TTC-Test nach 16 Stunden Inkubation von PigD ( µg) und Pyruvat (50 mm) im 100 µl Ansatz.

53 SPEZIELLER TEIL Suche nach 1,4-Carboligaseaktivität Der postulierte Reaktionsweg Williamson et al. beschreibt den Biosyntheseweg des Sekundärmetaboliten Prodigiosin in Serratia marcescens. Der erste Schritt der postulierten Reaktion ist die durch PigDkatalysierte Decarboxylierung von Pyruvat (2) und die Addition des aktivierten C 2 - Fragmentes an die Doppelbindung von (E)-ct-2-enal (16) (Abb. 39). [97] PigD 2 + * - C 3C D2 Abb. 39: Postulierte, PigD-katalysierte Bildung von 3-Acetyloctanal (16D2) Synthese des racemischen 3-Acetyloctanal Zu Vergleichszwecken wurde 3-Acetyloctanal (rac-16d2) in racemischer Form in einer vierstufigen Synthese (1-4, Abb. 40) über eine Variation der Vorschrift von Williamson et al. [97] hergestellt. + (2) NaEt C 2 Br 78% (4) 3, DMS 21% DMS C 2 + I 3C 2 C rac-16d2.2 rac-16d2 (12%) C (1) NaEt C C 3 77% I (3) KtBu, Et2 [2] 99% (Na, 2 0 < 50% ) - C 2 - KEt C Abb. 40: Synthese des racemischen 3-Acetyloctanal (rac-16d2). 3 rac-16d2.1 rac-16d2.3 C 2

54 48 SPEZIELLER TEIL Die Alkylierung des Ethyl-3-oxobutanoats mit Iodpentan zum Ethyl-2-acetylheptanoat (16D2.1, Stufe 1, 77% Ausbeute) und die Reaktion mit Allylbromid zum Ethyl-2-acetyl-2- allylheptanoat (16D2.2, Stufe 2, 78% Ausbeute) wurden nach Williamson et al. [97] durchgeführt. Bei der Esterspaltung zum 3-Allyloctan-2-on (16D2.3, Stufe 3) wurde mit 5%iger und 8%iger Na im besten Fall 50% 2-Acetyl-2-allylheptansäureethylester (16D2.2) decarboxyliert. Deshalb wurde die Vorschrift nach Gassman et al. [128] geändert. ier wird 2 in equimolarer Menge zugesetzt und durch die starke Base Kalium-tert-Butoxid deprotoniert, so greift das - -Ion ohne Solvathülle an das sterisch gehinderte Carbonyl- Kohlenstoff der tertiären Esterfunktion an. Nach Variation war die Umsetzung vollständig (99% Ausbeute). Die zonolyse des so erhaltenen 3-Allyloctan-2-ons (16D2.3, Stufe 4, 21% Ausbeute) lieferte 3-Acetyloctanal (rac-16d2) in einer Ausbeute von 12% über vier Stufen α,β-ungesättigte Aldehyde als Substrate für PigD Die α,β-ungesättigten Aldehyde (E)-ct-2-enal (16), (E)-ex-2-enal (17) und (E)-2- Methylpent-2-enal (18) wurden mit Pyruvat und PigD als Katalysator umgesetzt (Tab. 12). PigD R R 1 + R 1 * * - 2C R 2 2 R2 R a,ß-ungesättigter Aldehyd Pyruvat (2) 2-ydroxyallylketon 2-ydroxyvinylketon α,β-ungesättigter Aldehyd R 1 R 2 2-ydroxyallylketon 2-ydroxyvinylketon ee ee (E)-ct-2-enal (16) (C 2 ) 4 16C2 17% 19% 16A2 6% >98% (E)-ex-2-enal (17) (C 2 ) 2 17C2 n.b. 19% 17A2 n.b. >98% (E)-2-Methylpent- 2-enal (18) C 2 18C2 n.b. 87% 18A2 n.b. >98% Tab. 12: α,β-ungesättigte Aldehyde als Substrate für PigD, 1.5 ml-ansätze. 30 mm α,β-ungesättigter Aldehyd, 50 mm Natrium Pyruvat, PigD Protein (zellfreier Extrakt, 10.5 mg), 1,2-Carboligationsprodukt (%) mittels GC-MS, ee (%) mittels PLC an chiraler Phase mit einer Chiralpak AD Säule. n.b.: nicht bestimmt. Pyruvat (2) wurde unter PigD-Katalyse selektiv in 1,2-Position an die getesteten α,β-ungesättigten Aldehyde addiert, die von Williamson et al. [97] postulierte 1,4-Addition wurde nicht beobachtet. Es wurden weder mittels GC-MS noch mittels NMR Analytik

55 SPEZIELLER TEIL 49 1,4-Additionsprodukte detektiert. In der C-C-Bindungsknüpfung zwischen den α,β-ungesättigten Aldehyden mit Pyruvat (2) zeigten 16, 17 und 18 sowohl Akzeptor, als auch Donor Eigenschaften. Da Pyruvat (2) decarboxyliert wird, ist das reagierende Substrat Acetaldehyd (1). Um die Diversität der Reaktivität zu verdeutlichen wurde in der Nummerierung (zum Beispiel 16A1 versus 16A2) das in der Reaktion eingesetzte Substrat, also Pyruvat ( 2), verwendet. Es entstehen sowohl 2-ydroxyallylketone (Reaktionsweg C) als auch 2-ydroxyvinylketone (Reaktionsweg A), wobei letztere mit ausgezeic hneten Enantiomerenüberschüssen gebildet werden. PigD-katalysiert im Fall von 16A2 (= 16A1), 17A2 (= 17A1), und 18A2 (= 18A1), die Bildung de s anderen Enantiomers als die BAL und bei 16C2, 17C2 und 18C2 die des gleichen Enantiomers wie mittels ScPDC. Auch unter Katalyse von ApPDC und ZmPDC findet C-C-Bindungsknüpfung in 1,2-Position an α,β-ungesättigte aliphatische Aldehyde statt (siehe PDC als Katalysator und Vergleich der Katalyseaktivitäten von ZmPDC, ApPDC und PigD). Die oben aufgezeigten Beobachtungen führten zur Schlussfolgerung, dass es sich auch bei PigD um eine Pyruvatdecarboxylase hand eln könnte, die Pyruvat (2) selektiv in 1,2-Position an α,β-ungesättigte aliphatische Aldehyde addiert Zusatz von Serratia marcescens Zellaufschluss Es ist denkbar, dass die 1,4-Addition von Pyruvat an (E)-ct-2-enal (16) einen Zusatz benötigt, der bei der Enzymreinigung abgetrennt wurde. Möglicherweise enthalten die Serratia marcescens Zellen zum Beispiel einen Kofaktor, ein Vitamin, ein Metallion, ein Chaperon, ein zusätzliches Enzym oder Protein, das für den postulierten 1,4-Angriff erforderlich ist. Um diese Frage zu k lären, wurden den Ansä tzen aufgeschlossene Serratia marcescens Zellen allein beziehungswe ise zusammen mit gereinigtem PigD-Protein zugesetzt und GC-MS analytisch verfolgt. Es wurde der 1,2-Akzeptor Benzaldehyd (3) für den Aktivitätsnachweis verwendet, (E)-ct-2-enal (16) und (E)-Zimtaldehyd (22) dienten als mögliche 1,4-Akzeptoren. Um einen Lösungsvermittlereinfluss auszuschließen wurden die Tests sowohl mit als auch ohne Zusatz von DMS (20%) durchgeführt.

56 50 SPEZIELLER TEIL Zusatz von Serratia marcescens (Sm) Zellaufschluss: Sm Zellen Pyruvat 3 Benzylalkohol Benzoesäure Benzaldehyd (3) (%) Benzylalkohol (%) Benzoesäure (%) Zeit (Stunden) mit ohne mit ohne mit ohne DMS (20%) DMS (20%) DMS (20%) n.d. n.d. n.d. n.d n.d. n.d n.d n.d. n. d n.d n.d. n.d n.d n.d. n.d. Tab. 13: Sm-Zelllysat-Ansatz mit Benzal dehyd (3). Sm Zellen Pyruvat 16 (E)-ct-2-enol (E)-ct-2-ensäure (E)-ct-2-enal (16) (%) (E)-ct-2-enol (%) (E)-ct-2-ensäure (%) Zeit (Stunden) mit ohne mit ohne mit ohne DMS (20%) DMS (20%) DMS (20%) n.d. n.d n.d. n.d n.d. n. d n. d n.d. 1 n.d n.d n. d. 43 Tab. 14: Sm-Zelllysat-Ansatz m it (E)-ct-2-e nal (16). Sm Zellen Pyruvat 22 (E)-Zimtalkohol (E)-Zimtsäure (E)-Zimtaldehyd (22) (%) (E)-Zimtalkohol (%) (E)-Zimtsäure (%) Zeit (Stunden) mit ohne mit ohne mit ohne DMS (20%) DMS (20%) DMS (20%) n.d. n.d. n.d. n.d n.d. n.d. n.d. n.d n.d. n.d. n.d. n.d n.d. 6 n.d. n.d n.d. 8 n.d. n.d. Tab. 15: Sm-Zelllysat-Ansatz mit (E)-Zimtaldehyd (22). Tab Tab. 15: 1.5 ml-ansätze mit Sm-Zelllysat (300 µl), Akzeptorsubstrat (20 mm) und Pyruvat (2, 50 mm); Detektionen (%) mittels GC-MS. n.d.: nicht detektiert.

57 SPEZIELLER TEIL 51 Zusatz von Serratia marcescens (Sm) Zellen und gereinigtem PigD-Protein: Sm Zellen + reines PigD Pyruvat 3 Benzylalkoho l Benzoesäu re 3C2 Zeit Benzaldehyd (3) Benzylalkohol Benzoesäure 1-ydroxy-1-phenylpropan-2-o n (3C2) (%) (%) (%) (%) (Stunden) mit o hne mit ohne mit ohne mit ohne DMS (20%) DM S (20%) DMS (20%) DMS (20%) n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d n.d. n.d n.d. n.d n.d. n.d n.d. n.d Tab. 16: Sm-Zelllysat-Ansatz + PigD mit Benzaldehyd (3). 16 Sm Zellen + reines PigD Pyruvat (E)-ct-2-enol (E)-ct-2-ensäure 16C2 16A2 (E)-3-ydroxy- (E)-2-ydroxy- Zeit (E)-ct-2-enal (E)-ct-2-enol (E)-ct-2-ensäure dec-4-en-2-on dec-4-en-3-on (16) (%) (%) (%) (16C2) (%) (16A2) (%) (Stunden) mit ohne mit ohne mit ohne mit ohne mit ohne DMS (20%) DMS (20%) DMS (20%) DMS (20%) DMS (20%) n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d n.d n.d n.d Tab. 17: Sm-Zelllysat-Ansatz + PigD mit (E)-ct-2-enal (16).

58 52 SPEZIELLER TEIL Sm Zellen + reines PigD Pyruvat 22 (E)-Zimtalkohol (E)-Zimtsäure 22ox2 Zeit (E)-Zimtaldehyd (E)-Zimtalkohol (E)-Zimtsäure (E)-5-Phenylpent-4-ene-2,3-dion (22) (%) (%) (%) (22ox2) (%) (Stunden) mit ohne mit ohne mit ohne mit ohne DMS (20%) DMS (20%) DMS (20%) DMS (20%) n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d n.d. 8 n.d. n.d n.d. n.d n.d. n.d n.d. n.d. 4 n.d. Tab. 18 : Sm-Zelllysat-Ansatz + PigD mit (E)-Zimtaldehyd (22). Tab Tab. 18: 1.5 ml-ansätze mit Sm-Zelllysat (300 µl) und PigD (0.65 mg), Akzeptorsubstrat (20 mm) und Pyruvat (2, 50 mm); Detektionen (%) mittels GC-MS. n.d.: nicht detektiert. In allen Ansätzen wurde kein 1,4-Additionsprodukt detektiert. In den Serratia marcescens Zellen enthaltene Reduktasen entzogen zum Teil die Substrate durch Reduktion den Additionsreaktionen (Tab Tab. 18). Der Zusatz von DMS verminderte die Aktivität der Reduktasen (Tab. 13) und die Carboligation konnte verstärkt stattfinden (Tab. 16), er hatte aber keinen signifikanten Einfluss auf die PigD Aktivität. Bei den Reaktionsgemischen mit DMS wurde keine xidation von (E)-ct-2-enal (16) zu (E)-ct-2-ensäure detektiert (Tab. 14 und Tab. 17). In den Ansätzen mit Serratia marcescens Zellen allein wurde die 1,2-Additionsreaktion zwischen Benzaldehyd (3) und Pyruvat (2) zum (R)-PAC ((R)-3C2) nicht detektiert (Tab. 13). Diese Reaktion zeigte als Aktivitätsnachweis in den Ansätzen mit Zusatz von gereinigtem PigD-Protein und DMS 60% Bildung von (R)-3C2 (Tab. 16). (E)-ct-2-enal (16) und (E)-Zimtaldehyd ( 22) zeigten Bildung des jeweiligen 1,2- Additionsproduktes (Tab. 17 und Tab. 18). Im Falle des (E)-ct-2-enal (16) wird (E)-3- ydroxydec-4-en-2-on (16C2) und (E)-2-ydroxydec-4-en-3-on (16A2) gebildet (Tab. 17), mit (E)-Zimtaldehyd (22) wird (E)-5-Phenylpent-4-en-2,3-dion (22ox2), ein xidationsprodukt na ch 1,2-Additon, detektiert (Tab. 18). Weder (E)-ct-2-enal (16) noch (E)-Zimtaldehyd (22) waren unter diesen Reaktionsbedingungen gute Substrate für PigD. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Ursache für das Ausbleiben der 1,4-Addition von Pyruvat (2) an (E)-ct-2-enal (16) nicht das Fehlen eines in Serratia marcescens Zellen enthaltenen Zusatzes ist.

59 SPEZIELLER TEIL Erste Detektion eines 1,4-Additionsproduktes Es konnte, wie unter den obigen Kapiteln beschrieben, eindeutig belegt werden, dass PigD, trotz enzymatischer Aktivität, die Bildung von 3-Acetyloctanal (16D2) aus (E)-ct-2-enal (16) nicht katalysiert (Abb. 41). PigD 3 C + * 3C D2 Abb. 41: Pyruvat (2) wird nicht in 1,4-Position an (E)-ct-2-enal (16) addiert. Pyruvatdecarboxylasen und Acetolactatsynthasen akzeptieren in der Regel keine weiter funktionalisierten Ketone als Substrate. Eine Ausnahme stellt zum Beispiel das Enzym YerE aus Yersinia pseudotuberculosis :VI dar, hier ist das postulierte Substrat eine aktivierte 3,6-Didesoxy-4-keto-hexulose. [129] Acetohydroxysäure-Synthasen (AAS) katalysieren den Transfer eines Acylrestes (Acetyl oder Propionyl) auf 2-Ketocarbonsäuren (Pyruvat oder [130] 2-Ketobutyrat). Dies wurde auch für eine Variante der ScPDC (PDC D28A) gezeigt. Ketone weisen im Vergleich zu Aldehyden eine stark erniedrigte Car bonylaktivität auf und der zusätzlich e Substituent am Carbonylkohlenstoff bewirkt eine grössere sterische inderung im aktiven Zentrum der Enzyme. So wird auch im Postulat von Williamson et al. davon ausgegangen, dass es sich bei dem natürlichen Akzeptorsubstrat um den Aldehyd (E)-ct-2-enal (16) handelt. [97] In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass α,β-ungesättigte aliphatische Aldehyde unter PigD-Katalyse selektiv 1,2-Aktivität zeigen (siehe α,β-ungesättigte Aldehyde als Substrate für PigD und Zusatz von Serratia marcescens Zellaufschluss). Um diese zu Gunsten der 1,4-Aktivität zurückzudrängen, wurde statt des α,β-ungesättigten aliphatischen Aldehyds (E)-ct-2-enal (16) das α,β-ungesättigte aliphatische Keton (E)-Non- 3-en-2-on (36) als Substrat getestet (Abb. 42). [131] PigD 2 - C * 36D2 Abb. 42: Erste Detektion eines 1,4-Additionsproduktes, 1.5 ml Ansatz. 20 mm (E)-Non-3-en-2-on (36), 50 mm Pyruvat (2), 0.60 mg PigD Protein, 1,4-Carboligationsprodukt (3-Pentanylhexan-2,5-dion, 36D2, %) ermittelt durch GC-MS-Analytik.

60 54 SPEZIELLER TEIL Im ersten 1.5 ml-ansatz mit 600 µg PigD Protein ( mol% Katalysator) wurden aus 4.0 mg (E)-Non-3-en-2-on (36) selektiv 1.2% 1,4-Carboligationsprodukt (36D2) mittels GC-MS detektiert. Durch Erhöhen der PigD Menge auf 2.0 mg ( mol% Katalysator) konnte die Stetter- Reaktion unter gleichen Ansatzbedingungen gesteigert werden und es wurden 25% 36D2 mittels GC-MS detektiert Verbesserung der Katalysator-Effektivität Um eine optimale Ausnutzung des Katalysators zu erreichen, wurden verschiedene Substrat-Konzentrationen für die 1,4-Addition zu 3-Pentanylhexan-2, 5-dion (36D2, Abb. 42) in KP i -Puffer (p 7.0) mit 20% DMS über einen Zeitraum von 87 Stunden verfolgt (Tab. 19). Natrium Pyruvat (2) 12.5 mm 25 mm 25 mm 25 mm (E)-Non-3-en-2-on (36) 5 mm 10 mm 20 mm 50 mm Zeit (Stunden) 3-Pentanylhexan-2,5-dion (36D2) (%) Tab. 19: Bildung von 36D2 in Abhängigkeit der Substratkonzentrationen. PigD-katalysierte Umsetzungen von (E)-Non-3-en-2-on (36) und Natrium Pyruvat (2) in steigenden Substratkonzentrationen. 1.5 ml KP i -Puffer (p 7), 20% DMS, 2.0 mg reines Protein. Produktbildung (%) mittels GC-MS. Die beste Umsetzung von 66% wurde bei einer Konzentration von 25 mm Natrium Pyruvat (2) und 20 mm (E)-Non-3-en-2-on (36) im Ansatz mit 2.0 mg PigD ( mol% Katalysator) erreicht. ier ist eine ausreichend hohe Substratkonzentration gegeben, ohne dass, aufgrund zu hoher Salz- beziehungsweise Pyruvat-Konzentration, das Protein denaturiert.

61 SPEZIELLER TEIL PigD 1,4-Carboligaseaktivität Ketone als 1,4-Akzeptoren Im Folgenden wurden verschiedene Ketone als 1,4-Akzeptoren in Katalysereaktionen mit 1.10 mg PigD Protein ( mol% Katalysator) in 1.5 ml Ansätzen mit 20 mm Akzeptorsubstrat getestet und die 1,4-Carboligations-Produktbildung über GC-MS und NMR verfolgt. Pyruvat (2) wurde unter PigD-Katalyse selektiv in 1,4-Position an α,β-ungesättigte aliphatische Ketone addiert, es trat keine 1,2-Addition auf (Abb. 43). + PigD 2 2 C But-3-en-2-on (30) (E)-5-Methylhex-3-en-2-on (32) (E)-ct-3-en-2-on (35) -C Pyruvat (2) Umsatz (NMR) 2% 3% 4% * exan-2,5-dion (30D2) * 3-Isopropylhexan-2,5-dion (32D2) * 3-Butylhexan-2,5-dion (35D2) 27% * (E)-Non-3-en-2-on (36) 3-Pentylhexan-2,5-dion (36D2) 27% * (E)-Dec-3-en-2-on (37) 3-exylhexan-2,5-dion (37D2) Abb. 43: Reaktionsweg D mit PigD, α,β-ungesättigte aliphatische Akzeptoren. * Umsatz mittels GC-MS. Mit zunehmender Kettenlänge der α,β-ungesättigten aliphatischen Ketone eignen sich diese besser als Substrate für PigD.

62 56 SPEZIELLER TEIL In Gegenwart α,β-ungesättigter aromatischer Ketone wurden ausgehend von Pyruvat (2) mit PigD selektiv 1,4-Diketone gebildet und es trat ebenfalls keine 1,2-Addition auf (Abb. 44). + 3 C PigD 2 Pyruvat (2) Umsatz (NMR) 12% -C * (E)-4-Phenylbut-3-en-2-on (38) C 2 5% 3-Phenylhexan-2,5-dion (38D2) * Cl 3-Phenylbut-3-en-2-on (40) (E)-4-(4-Chlorphenyl)- but-3-en-2-on (42) C3 3-(4-hydroxy-3-methoxy- phenyl)-hexan-2,5-dion (43D2) (E)-4-(4-ydroxy-3-methoxyphenyl)but-3-en-2-on (43) 33% 2% 14% 3-Phenylhexan-2,5-dion (38D2) Cl * 3-(4-Chlorphenyl)- hexan-2,5-dion (42D2) * C 3 * (E)-3-Phenyl- 1-phenylprop-2-en-1-on (44) 39% 1,3-Diphenylpentan-1,4-dion (44D2) * (E)-3-(2-ydroxyphenyl)- 1-phenylprop-2-en-1-on (45) 5% 3-(2-ydroxyphenyl)-1- phenylpentan-1,4-dion (45D2) * (E)-3-(4-Methoxyphenyl)- 1-phenylprop-2-en-1-on (46) 3-(4-Methoxyphenyl)- 1-phenylpentan-1,4-dion (46D2) Abb. 44: Reaktionsweg D mit PigD, α,β-ungesättigte aromatische Akzeptoren.

63 SPEZIELLER TEIL 57 Auch an α,β-ungesättigte heterocyclische Ketone wurde Pyruvat (2) unter PigD-Katalyse selektiv in 1,4-Position addiert ohne 1,2-Aktivität zu zeigen (Abb. 45). + 3 C PigD 2 S Auch hier sind, wie schon in früheren Kapiteln angesprochen (3.2.2 Aromatische Aldehyde als Akzeptoren mit BAL als Katalysator, Benzaldehyd-Derivate als 1,2-Akzeptoren), nicht nur die elektronischen Eigenschaften der Substrate, sondern vor allem sterische Eigenschaften der Substituenten und deren Interaktionen mit dem katalytischen Zentrum des Enzyms von Bedeutung. Die Ergebnisse zeigen, dass grössere sterische inderungen auf beiden Seiten der Substrate keinen negativen Einfluss auf die Aktivität von PigD haben, sondern diese zum Teil positiv beeinflussen. Beispiele hierzu sind (E)-4-(4-Chlorphenyl)-but- 3-en-2-on (42) im Vergleich zu 38 und (E)-3-(3-ydroxyphenyl)-1-phenylprop-2-en-1-on (45) im Vergleich zu 44. Methoxy-Gruppen als aromatische Substituenten scheinen die Substrateigenschaften zu vermindern, wie man an den geringeren Umsätzungen von sowohl 43 im Vergleich zu 38 und 42, als auch 46 im Vergleich zu 44 und 45 sieht. Ferner findet die 1,4-Additon an endständigen Doppelbindungen statt ( 40), dies ermöglicht eine Kettenverländerung unter gleichzeitigem Aufbau eines Stereozentrums. (E)-4-(Thiophen-2-yl)- but-3-en-2-on (47) Pyruvat (2) Umsatz (NMR) 15% 10% -C S * 3-(Thiophen-2-yl)- hexan-2,5-dion (47D2) * (E)-4-(Furan-2-yl)- but-3-en-2-on (48) 3-(Furan-2-yl)- hexan-2,5-dion (48D2) Abb. 45: Reaktionsweg D mit PigD, α,β-ungesättigte heterocyclische Akzeptoren. Abb. 43-Abb. 45: 1.5 ml KP i -Puffer (p 7), 20% DMS, 20 mm Akzeptorsubstrat, 25 mm Pyruvat (2), 1.10 mg PigD Protein, 1,4-Carboligationsprodukt (%) mittels NMR.

64 58 SPEZIELLER TEIL Die oben aufgeführten Reaktionen zeigen, dass PigD eine weite Spanne an unterschiedlichen Substraten umsetzt. Es wurde bewusst in allen Ansätzen 1.10 mg PigD ( mol%) pro 1.5 ml Ansatz eingesetzt, um die relative Aktivität der Substrate untereinander zu untersuchen. Durch Erhöhen der PigD Konzentration lässt sich der Umsatz deutlich steigern, wie am Beispiel des (E)-Non-3-en-2-on (36) gezeigt wurde (siehe Erste Detektion eines 1,4-Additionsproduktes und Verbesserung der Katalysator-Effektivität) Ketone ohne 1,4-Akzeptoreigenschaften Mit den Aliphaten (E)-3-Methylpent-3-en-2-on (31), (R)-5-Methyl-2-(propan-2-yliden)- cyclohexanon (33), Cyclohex-2-enon (34) und den Aromaten ( Z)-4-Phenylbut-3-en-2-on (39) und 3-Benzylidenpentan-2,4-dion (41) wurden keine 1,4-Carboligationsprodukte detektiert (Abb. 46). (E)-3-Methylpent -3-en-2-on (31) (R)-5-Methyl-2-(propan-2- yliden)-cyclohexanon (33) Cyclohex-2-enon (34) (Z)-4-Phenylbut -3-en-2-on (39) 3-Benzylidenpentan- 2,4-dion (41) Abb. 46: Ketone, für die mittels PigD-Katalyse keine 1,4-Addition detektiert wurde. 1.5 ml KP i -Puffer (p 7), 20% DMS, 20 mm Akzeptorsubstrat, 25 mm Pyruvat (2), 1.10 mg PigD Protein, 1,4-Carboligationsprodukt (%) bestimmt mittels NMR. (E)-3-Methylpent-3-en-2-on (31) ist wahrscheinlich zu klein und kann möglicherweise im katalytischen Zentrum nicht richtig fixiert werden. Je kleiner der Rest wird, desto schlechter wird die Umsetzung, dies kann man auch bei den α,β-ungesättigten aliphatischen Ketonen erkennen, die 1,4-Carboligation zeigen. Dass (Z)-4-Phenylbut-3-en-2-on (39) und 3-Benzylidenpentan-2,4-dion (41) nicht umgesetzt werden, spricht dafür, dass die Enzymtasche von PigD für Substrate in (E)-Konfiguration ausgerichtet sein könnte. Die Aufnahme von Substraten in (Z)-Konfiguration wäre somit sterisch gehindert.

65 SPEZIELLER TEIL Säurechlorid und xoester als mögliche 1,4-Akzeptoren Weitere Beispiele für die Substratspezifität von PigD sind Säurechlorid und xoester. Sowohl mit Zinnamoylchlorid (49), als auch mit den Sauerstoffestern, (E)-ct-2-ensäureethylester (50) und (E)-Zimtsäuremethylester (51), wurden mit 1.10 mg PigD Protein in 1.5 ml Ansätzen keine 1,4-Carboligationsprodukte detektiert. Cl (49) Zinnamoylchlorid (50) (E)-ct-2-ensäureethylester (51) (E)-Zimtsäuremethylester Abb. 47: Säurechlorid und xoester als mögliche Substrate für PigD. 1.5 ml KP i -Puffer (p 7), 20% DMS, 20 mm Akzeptorsubstrat, 25 mm Pyruvat (2), 1.10 mg PigD Protein, 1,4-Carboligationsprodukt (%) bestimmt mittels NMR Coenzym A Thioester als 1,4-Akzeptor Williamson et al. postulierten, dass PigD für die Synthese von 3-Acetyloctanal verantwortlich ist. [97] In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Pyruvat (2) unter PigD-Katalyse nicht in 1,4-P osition an (E)-ct-2-enal (16) addiert wird. Somit bleibt die Frage nach dem physiologischen Substrat von PigD noch offen. Nach Williamson et al. wird (E)-ct-2-enal (16) möglicherweise durch Enzyme der Fettsäuresynthese oder durch Autoxidation von ungesättigten Fettsäuren gebildet (Spiteller et al.). [132] Coenzym A ist ein natürlich vorkommender Acyl-Gruppenüberträger und direkt am Fettstoffwechsel beteiligt. Es ist in der Lage energiereiche Thioester-Bindungen zwischen der Thiolgruppe des Cysteamin-Anteils und den Fettsäuren zu bilden. In der β-xidation von ungesättigten Fettsäuren entsteht über mehrere Enzym-katalysierte Schritte zum Beispiel aus Linoleoyl-CoA trans- 2 - Decenoyl-CoA (Coenzym A -Thioester der (E)-Dec-2-ensäure). [133] Beim Abbau von gesättigten Fettsäuren wird durch die Mittelkettige-Acyl-CoA-Dehydrogenase ctanoyl-coa zu trans- 2 -ctenoyl-coa (Abb. 48) reduziert. [134] S N N N 3 C P P P Abb. 48: Coenzym A-Thioester der (E)-ct-2-ensäure. N N 2 N N

66 60 SPEZIELLER TEIL So besteht die Möglichkeit, dass nicht (E)-ct-2-enal (16) allein, sondern die an das Coenzym A gebundene Thioesterverbindung von PigD umgesetzt wird. Um diese ypothese zu untersuchen, wurde (E)-S-2-Acetamidoethyloct-2-enthioat (SNAC-Thioester, 52) von E. Breitling nach Liu et al. [135] und Trauger et al. [136] synthetisiert (Abb. 49). Über die Veresterung der (E)-ct-2-ensäure mit N-Acetylcysteamin wurde 52 in 78% Ausbeute erhalten. 1. N 2, 0 C: DCC, DMAP h, RT S 3 C N C + S 78% N 3 (E)-ct-2-ensäure N-Acetylcysteamin (E)-S-2-Acetamidoethyloct-2-enthioat (52) Abb. 49: Synthese von (E)-S-2-Acetamidoethyloct-2-enthioat (52). Der SNAC-Thioester (52) stellt einen verkürzten Nachbau der Coenzym A -Verbindung dar. Die bei der Enzymreaktion wahrscheinlich am tiefsten ins aktive Zentrum von PigD hineinreichenden funktionellen Gruppen, der Thioester der (E)-ct-2-ensäure mit Ethylamid- Funktion, sind enthalten. 52 könnte so dem Enzym die Anwesenheit des putativen physiologischen Substrates simulieren. Der Thioester (52) wurde als 1,4-Akzeptor in der Katalysereaktion mit PigD im 1.5 ml Ansatz getestet und die 1,4-Carboligations- Produktbildung mittels NMR Spektroskopie verfolgt (Abb. 50). N S (E)-S-2-Acetamidoethyloct-2-enthioat (52) PigD + 3 C 2 Pyruvat (2) -C * N C S 3 S-2-Acetamidoethyl-3-acetyloctanthioat (52D2) Abb. 50: Reaktionsweg D mit PigD, Thioester (52) als Akzeptor. Pyruvat (2) wurde unter PigD-Katalyse selektiv in 1,4-Position an den α,β-ungesättigten Thioester addiert (Abb. 50). Es wurden im Ansatz mit 1.10 mg PigD Protein und 7.3 mg (E)-S-2-Acetamidoethyloct-2-enthioat (52) 50% 1,4-Carboligationsprodukt (52D2) detektiert. Durch Erhöhen der PigD Konzentration sollte sich der Umsatz steigern lassen, wie am Beispiel des (E)-Non-3-en-2-on (36) gezeigt wurde. PigD zeigte mit 52 die beste 1,4-Carboligations-Aktivität von allen getesteten Substraten. Bei gleicher PigD-Konzentration wurde zum Beispiel mit (E)-Non-3-en-2-on (36) 27% 1,4-Carboligationsprodukt (36D2) (Abb. 43) und mit dem xoester der ct-2-ensäure (49) (Abb. 47) kein 1,4-Carboligationsprodukt detektiert. Dies bestärkt die ypothese, dass (E)-ct-2-enal (16) beziehungsweise (E)-ct-2-ensäure in Form des Coenzym A -Thioesters als Vorstufe von PigD umgesetzt wird.

67 SPEZIELLER TEIL xosäuren als 1,4-Donoren Für die 1,4-Addition an (E)-4-(4-Chlorphenyl)-but-3-en-2-on (42) wurden neben Pyruvat (2) verschiedene Donorsubstrate getestet (Tab. 20). Cl + R PigD 2 - C : R = 25: R = C 2 28: R = C 2 Br 29: R = C 2 C( ) 2 Donor Cl R 1,4-Carboligationsprodukt * 42D2 42D25 42D28 42D29 2, R = 42D2 30% 25, R =C 2 42D25 4% 28, R =C 2 Br 42D28 <1% 29, R = C 2 C( ) 2 42D29 <1% Tab. 20: xosäuren als 1,4-Donoren. 20% DMS, 20 mm (E)-4-(4-Chlorphenyl)-but-3-en-2-on (42), 25 mm Donorsubstrat, 1.10 mg PigD Protein, 1.5 ml A nsätze, 1,4-Carboligationspro dukt (%) über GCMS. Mit 2-xobutyrat (25) ließ sich das Substratspektrum der 1,4-Carboligaseaktivität, ebenso wie das der 1,2-Carboligaseaktivität (siehe PigD 1,2-Donoren), auf der Seite der Donorsu bstrate erw eitern Vergleich der Katalyseaktivitäten von ZmPDC, ApPDC und PigD mit α,β-ungesättigten Carbonylverbindungen als Akzeptoren Pyruvatdecarboxylasen und Acetolactatsynthasen akzeptieren in der Regel weder weiter funktionalisierte Ketone als Substrate, noch katalysieren sie die Umsetzung von α,β-ungesättigten Carbonylen in 1,4-Position. ier wurden die Substrate Benzaldehyd (3), (E)-ct-2-enal (16), (E)-Non-3-en-2-on (36) und (E)-4-(4-Chlorphenyl)-but-3-en-2-on (42) mit der Pyruvatdecarboxylase aus Zymomonas mobilis und Acetobacter pasteurianus und dem Enzym PigD in Anwesenheit von Pyruvat (2) umgesetzt. In Abb. 51 sind die theoretisch möglichen Produkte durch C-C-Bindungsknüpfung aufgeführt.

68 62 SPEZIELLER TEIL Substrate Benzaldehyd (3) (E)-ct-2-enal (16) (E)-Non-3-en-2-on (36) Cl (E)-4-(4-Chlorphenyl)- but-3-en-2-on (42) Kreuzkondensation A 2-ydroxy-1-phenylpropan-1-on (3A1) C 5 11 (E)-2-ydroxydec-4- en-3-on (16A1) Kreuzkondensation C 1-ydroxy-1-phenylpropan-2-on (3C2) C 5 11 (E)-3-ydroxydec-4- en-2-on (16C2) C 5 11 (E)-3-ydroxy-3- methyldec-4- en-2-on (36C2) Cl (E)-5-(4-Chlorphenyl)-3- hydroxy-3-methylpent-4- en-2-on (42C2) ation D C Acetyloctanal (16D2) C Pentanylhexan- 2,5-dion (36D2) Kreuzkondens Cl 3-(4-Chlorphenyl)- hexan-2,5-dion (42D2) Selbstkondensation E 2-ydroxy-1,2-diphenylethanon (3E3) C 5 11 (6E,10E)-9-ydroxy- hexadeca- 6,10-dien-8-on (16E16) 11 C 5 Abb. 51: Vier Substrate und ihre möglichen C-C-Bindungsknüpfungsprodukte. 3A1 3% 16A1 1% C2 9% 16C2 6% 36C2 n.d. 42C2 n.d D2 n.d. 36D2 n.d. 42D2 n.d. 3E3 27% 16E16 n.d Tab. 21: Vergleich der Katalyseaktivitäten, ZmPDC-katalysierte Umsetzungen. 3A1 n.d. 16A1 4% C2 24% 16C2 20% 36C2 n.d. 42C2 n.d D2 n.d. 36D2 n.d. 42D2 n.d. 3E3 n.d. 16E16 n.d Tab. 22: Vergleich der Katalyseaktivitäten, ApPDC-katalysierte Umsetzungen. 3A1 3% 16A1 4% C2 70% 16C2 6% 36C2 n.d. 42C2 n.d D2 n.d. 36D2 24% 42D2 44% 3E3 n.d. 16E16 n.d Tab. 23: Vergleich der Katalyseaktivitäten, PigD-katalysierte Umsetzungen. Tab Tab. 23: Enzym-katalysierte Umsetzungen von 3, 16, 36, ml KP i -Puffer, 30% DMS, 20 mm Akzeptor Substrat, 25 mm Natrium Pyruvat, 1.10 mg reines Protein. Produktbildung (%) mittels GC-MS. n.d.: nicht detektiert.

69 SPEZIELLER TEIL 63 Mit den Pyruvatdecarboxylasen aus Zymomonas mobilis und Acetobacter pasteurianus findet mit Benzaldehyd (3) und (E)-ct-2-enal (16) 1,2-Addition statt. Die Pyruvatdecarboxylasen setzten die α,β-ungesättigten Ketone 36 und 42 nicht um (Tab. 21 und Tab. 22). Das Protein PigD katalysiert mit den Substraten Benzaldehyd (3) und (E)-ct-2-enal (16) die 1,2-Addition. Bei diesen Reaktionsansätzen wird keine 1,4-Addition beobachtet (Tab. 23). PigD akzeptiert α,β-ungesättigte Ketone als Substrate, wobei (E)-Non-3-en-2-on (36) deutlich besser zum 1,4-Additionsprodukt umgesetzt wird, als der Aldehyd (E)-ct-2-enal (16) mit äquivalenter Seitenkette zum 1,2-Additionsprodukt. Das aromatische Substrat (E)-4-(4- Chlorphenyl)-but-3-en-2-on (42) zeigt eine weitere Erhöhung der 1,4-Carboligations- Mit Ketonen findet keine Reaktion in 1,2-Position statt, PigD katalysiert in Produktbildung. diesem Fall selektiv die C-C-Bindungsknüpfung in 1,4-Position (Tab. 23) Negativkontrolle mit Expressionsvektor ohne pigd-gen Bei den ersten Reinigungen von PigD über Ni-NTA-Chromatographie zeigte die Gelspur des Eluats eine schwache Bande bei 75 kd. Theoretisch könnte ein anderes Enzym als PigD eine so hohe Aktivität besitzen, dass nur Spuren für die Katalyse der beobachteten Umsetzungen ausreichen. Dieses könnte bei den Reinigungen ebenfalls angereichert worden sein und der Grund für die gefundenen Aktivitäten darstellen. Das unbekannte Enzym könnte entweder aus den E. coli Zellen oder aus der Expression eines DNA Abschnittes des pet22b(+) Vektors ohne insertiertes Gen pigd stammen. Die Bande bei 75 kd wurde von T. Jank am Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Universität Freiburg über MALDI-TF-Analysv ermessen und 37 Fragmente detektiert (siehe Proteinuntersuchungen mittels Ma ssenspektro). Über das Computerprogramms "Mascot" (ww w.matrixscience.com) wurden 18 der Fragmente dem hypothetischen Protein B2255 aus E. coli zugeordnet, was einer Sequenz-Abdeckung von 27% entspricht (Score: 101, Expect: ), beziehungsweise 17 der Fragmente der Transformylase Z3513 aus E. coli, was einer Sequenz-Abdeckung von 25% entspricht (Score: 91, Expect: ). Es wurden die folgenden Untersuchungen durchgeführt, um auszuschließen, dass die g efundenen Aktivitäten durch ein anderes Enzym als PigD verursacht wurden.

70 64 SPEZIELLER TEIL Der pet22b(+) Vektor wurde i n E. coli BL21(DE3) Zellen transformiert (im Folgenden "Leervektorzellen" genannt). In parallelen Expressionsansätzen wurden unter gleichen Bedingungen diese und die das Konstrukt pigd-pet22b(+) enthaltene E. coli BL21(DE3) Zellen (im Folgenden "PigD-Zellen" genannt) behandelt. Abb. 52: SDS-PAGE; Negativkontrolle mit Expressionsvektor ohne pigd-gen. A: Lösliche Fraktion des Aufschlusses der Expression von PigD mit C-terminalem 6x is-tag im Fermenter. B: Protein-Marker C: Lösliche Fraktion der Leervektorexpression (pet22b(+)). D: Lösliche Fraktion des Aufschlusses der Zellen aus einer 4 x 400 ml Expression von PigD mit C-terminalem 6x is-tag. E: Protein-Marker F: Eluat nach chromatographischer Proteinreinigung. Sowohl Leervektor- als auch PigD-Zellen wurden ungereinigt (Abb. 52) mit den Akzeptorsubstraten Benzaldehyd (2), 2-Iodbenz aldehyd (4), (E)-ct-2-enal (16), (E)-Non-3- en-2-on (36) sowie (E)-4-(4-Chlorphenyl)-but-3-en-2-on (42) und Pyruvat(2) in Bezug auf Carboligaseaktivität mittels GC-MS und PLC an chiraler Phase un tersucht. Es wurden in allen Ansätzen 45 mg Gesamtprotein eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Tab. 25 aufgelistet.