Parvo B19 IgM-ELISA medac

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1 Parvo B19 IgM-ELISA medac Enzymimmunoassay zur Bestimmung von IgM-Antikörpern gegen das Humane Parvovirus B19 German/English Version VP-D/DAL+ALe

2 VERTRIEB/ MARKETING/ DISTRIBUTION: medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D Wedel Telefon/ Phone: ++49 / / /351 Fax: ++49 / / BESTELLADRESSE/ ORDERING ADDRESS: Telefon/ Phone: ++49 / / Fax: ++49 / / VP-D/DAL+ALe

3 Parvo B19 IgM-ELISA medac Enzymimmunoassay zur Bestimmung von IgM-Antikörpern gegen das Humane Parvovirus B19 Katalog-Nr.: 190 ZUR IN VITRO DIAGNOSTIK EINFÜHRUNG Das Humane Parvovirus B19 (B19) gehört zur Familie der Parvoviridae. Das sehr kleine Virus besteht aus einzelsträngiger DNA, dem Nicht- Strukturprotein NS1 und einem Kapsid, zusammengesetzt aus den Strukturproteinen VP1 und VP2. Die Prävalenz von B19 in der Bevölkerung ist relativ hoch. Sie nimmt vom Kindesalter (10 %) bis zum 30. Lebensjahr (50 %) am stärksten zu. Infektionen mit dem Virus kommen häufiger im späten Winter und Frühling vor. Dabei kann es zu epidemischen Ausbrüchen, vor allem in Kindergärten und Schulen, kommen. Die Virusübertragung erfolgt durch Tröpfcheninfektion, aber auch durch Bluttransfusionen oder Transplantationen von Organen. Die Inzidenz von B19-haltigen Blutkonserven liegt zwischen 0,03 und 0,125 %. B19-Infektionen verlaufen ähnlich wie die meisten systemischen Virusinfektionen. Postnatale Infektionen verlaufen relativ harmlos, bei immunkompetenten Personen meist asymptomatisch. Oft kommt es zur Bildung eines typischen Exanthems, welches als Erythema infectiosum (Ringelröteln, fifth disease) bezeichnet wird. Ebenso wie die häufig auftretenden Polyarthralgien/Polyarthritiden wird das Exanthem als eine immunvermittelte Reaktion diskutiert. Da sich das Parvovirus B19 in den Erythroblasten des Knochenmarks vermehrt, kommt es zu einer ausgeprägten Anämie, die aber nach Bildung von Antikörpern wieder verschwindet. Bei Patienten mit Erkrankungen des blutbildenden Systems, bei immunsupprimierten Patienten und bei einer intrauterinen Infektion des Feten kann diese Anämie zu schweren Schäden führen, zum Beispiel einem Hydrops fetalis. Die Virämiephase dauert in der Regel vier bis sechs Tage und entspricht der Zeitspanne der Infektiosität des Patienten. Mit dem Parvo B19 IgM-ELISA medac sind IgM-Antikörper als Beweis einer frischen Infektion bis ca. acht Wochen nach Infektion nachweisbar. IgM-Antikörper können aber auch mehrere Monate persistieren, bei chronischen B19-Infektionen sogar über Jahre. In diesen Fällen kann der Antigennachweis, z. B. mittels PCR, geführt werden. VP-D/DAL+ALe

4 Es gibt Fälle (z. B. bei Immundefizienz), bei denen die IgM-Antwort nur schwach ausgeprägt ist oder sogar völlig ausbleibt. Testvorteile! Keine unspezifischen Reaktionen und falsch positiven Ergebnisse durch Rheumafaktoren.! Die brechbaren Mikrotiterstreifen gewährleisten eine optimale Testauslastung.! Keine Kreuzreaktivitäten bei einer Masern- oder Rubellavirusinfektion.! Keine Blockade der IgM-Antikörper durch hohe IgG-Titer.! Automatisierbar auf offenen ELISA-Gerätesystemen.! Hohe Spezifität und hohe Sensitivität durch Verwendung Baculovirus-exprimierter VP1- und VP2-Strukturproteine und von monoklonalem Antikörperkonjugat. Außer dem Parvo B19 IgM-ELISA medac Kat.-Nr.: 190 für 96 Bestimmungen führen wir auch den Parvo B19 IgG-ELISA medac Kat.-Nr.: 195 für 96 Bestimmungen VP-D/DAL+ALe

5 TESTPRINZIP Mit Anti-Human-IgM beschichtete Mikrotiterplatte. Die IgM-Fraktion aus dem Patientenserum wird auf der Mikrotiterplatte gebunden. Die Anti-Parvovirus B19-Antikörper binden das Parvovirus B19-Antigen (AG = Antigen). Die Peroxidase-konjugierten Anti- Parvovirus B19-Antikörper binden an das Virusantigen (P = Peroxidase). Inkubation mit TMB-Substrat (*). Stoppen der Reaktion mit Schwefelsäure. Die Auswertung erfolgt photometrisch. VP-D/DAL+ALe

6 PACKUNGSINHALT KAT.-NR.: Mikrotiterplatte: 12 Streifen à 8 Vertiefungen (mit Halterahmen und Trockenmittelpappe im Aluminiumbeutel), brechbar, beschichtet mit Maus-Anti-Human-IgM-Antikörpern (monoklonal), gebrauchsfertig. 2. Negative Kontrolle: 1 Fläschchen à 2 ml, humanes Serum, gebrauchsfertig, Xn, gesundheitsschädlich, enthält 0,1 % Natriumazid, R22, S Schwach Positive Kontrolle: 1 Fläschchen à 2 ml, humanes Serum, gebrauchsfertig, Xn, gesundheitsschädlich, enthält 0,1 % Natriumazid, R22, S Positive Kontrolle: 1 Fläschchen à 2 ml, humanes Serum, gebrauchsfertig, Xn, gesundheitsschädlich, enthält 0,1 % Natriumazid, R22, S Waschpuffer: 1 Flasche à 100 ml, PBS/Tween (10 x), ph 6,9 7,3. 6. Probenverdünnungspuffer: 1 Flasche à 250 ml, PBS/Tween/BSA, grün gefärbt, ph 6,6 7,0, gebrauchsfertig. 7. Antigen: 8 Fläschchen à 2 ml, rekombinantes humanes Parvovirus B19-Antigen, 0,5 µg/ml, lyophilisiert. 8. Konjugat: 1 Fläschchen à 1 ml (20 x), Maus-Anti-Parvovirus B19- Antikörper (monoklonal), HRP-konjugiert. 9. TMB-Substrat: 1 Fläschchen à 20 ml, gebrauchsfertig. 10. Stopplösung: 1 Fläschchen à 20 ml, 0,3 M Schwefelsäure (H 2 SO 4 ), gebrauchsfertig Halterahmen VP-D/DAL+ALe

7 1. LAGERUNG UND HALTBARKEIT Material/Reagenz Zustand Lagerung Haltbarkeit Testkit ungeöffnet C bis Verfalldatum Mikrotiterplatte geöffnet C im 6 Wochen Beutel mit Trockenmittelpappe Probenverdünnungspuffer geöffnet C bis Verfalldatum Antigen gelöst C 1 Woche Kontrollen geöffnet C bis Verfalldatum Waschpuffer unverdünnt C bis Verfalldatum Konjugat verdünnt C im 1 Woche Dunkeln TMB-Substrat geöffnet C im bis Verfalldatum Dunkeln Stopplösung geöffnet C bis Verfalldatum Die Reagenzien sind nach Ablauf des angegebenen Verfalldatums nicht mehr zu verwenden. 2. ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE REAGENZIEN UND MATERIALIEN 2.1. Aqua ad iniectabilia (H 2 O bidest.). Die Verwendung von entionisiertem Wasser kann zu Störungen im Testsystem führen Mikroliterpipetten für entsprechende Volumina Saubere Glas- oder Kunststoffgefäße zum Verdünnen von Konjugat, Waschpuffer und Proben Geeignete Vorrichtung zum Waschen der Mikrotiterplatte (z. B. Multistepper oder ELISA-Waschgerät) Mikrotiterplatten-Photometer mit Filtern für 450 nm und nm. VP-D/DAL+ALe

8 3. ANSETZEN DER REAGENZIEN Alle Kitkomponenten müssen vor Testansatz auf Raumtemperatur gebracht werden. Ermitteln Sie die Anzahl der benötigten Mikrotitervertiefungen Mikrotiterplatte Der Aluminiumbeutel muß nach jeder Entnahme zusammen mit der Trockenmittelpappe wieder fest verschlossen werden. Lagerung und Haltbarkeit der nicht verwendeten Mikrotitervertiefungen s. Tabelle Waschpuffer 1 Teil Waschpuffer (10x) wird mit 9 Teilen Aqua ad iniectabilia angesetzt (z. B. 50 ml Waschpuffer (10x) mit 450 ml Aqua ad iniectabilia). Für acht Vertiefungen werden 20 ml Waschpuffer benötigt. Evtl. im Waschpuffer (10x) vorhandene Kristalle sind vor dem Ansetzen durch Erwärmen (max. 37 C) und/oder Rühren bei RT in Lösung zu bringen Antigen Das Lyophilisat wird mit jeweils 2,0 ml Probenverdünnungspuffer aufgelöst. Die verschlossenen Fläschchen werden leicht geschwenkt, so daß auch am Verschluß haftende Partikel in Lösung gebracht werden. Nach dem Auflösen ist das Antigen grün gefärbt und gebrauchsfertig Konjugat 1 Teil Konjugat (20 x) wird mit 19 Teilen Probenverdünnungspuffer verdünnt (z. B. 40 µl Konjugat (20 x) mit 760 µl Probenverdünnungspuffer). Für acht Vertiefungen werden 800 µl benötigt. Nach dem Verdünnen ist das Konjugat grün gefärbt und gebrauchsfertig. Die Reagenzien einer Charge sind nicht mit Reagenzien anderer Chargen oder anderer Hersteller zu mischen. Nur bei exakter Einhaltung der Arbeitsvorschrift und bei Verwendung der Testkit-spezifischen Reagenzien werden valide und reproduzierbare Ergebnisse erhalten. VP-D/DAL+ALe

9 4. UNTERSUCHUNGSMATERIAL 4.1. Der Test ist geeignet zur Untersuchung von Serum und Plasma Eine Vorbehandlung der Seren (Plasmen), wie z. B. Inaktivierung, ist nicht erforderlich, sie sollten jedoch nicht mikrobiell kontaminiert und frei von Humanerythrocyten sein Die Seren (Plasmen) werden 1:200 mit Probenverdünnungspuffer verdünnt. Zur Titerbestimmung können die Proben beliebig weiterverdünnt werden. 5.A. ARBEITSVORSCHRIFT 5.1. Die Verpackung der Mikrotiterplatte an ZIP-Verschluß öffnen und die erforderliche Anzahl Mikrotitervertiefungen entnehmen (s. 3.1.). Die Mikrotitervertiefungen sind gebrauchsfertig und müssen nicht vorgewaschen werden Die Vertiefung A1 bleibt frei für die Ermittlung des Leerwertes (s. 6.A.). Jeweils 100 µl der Proben sowie der Kontrollen (die Schwach Positive Kontrolle sollte je Testlauf in Doppelbestimmung mitgeführt werden) in die Vertiefungen der Platte pipettieren Die Mikrotitervertiefungen 60 min (± 2 min) bei Raumtemperatur (18 bis 25 o C) inkubieren (feuchte Kammer oder mit Folie abgeklebt) Auflösen des Antigens (s. 3.3.) Nach Inkubation die Mikrotitervertiefungen dreimal mit jeweils 200 µl Waschpuffer waschen. Darauf achten, daß alle Vertiefungen beim Waschen gefüllt werden. Nach Beendigung des Waschvorgangs Mikrotitervertiefungen auf Filterpapier ausklopfen. Nicht austrocknen lassen! Umgehend weiterverwenden! µl Antigenlösung in alle Vertiefungen (außer A1) pipettieren Erneut 60 min (± 2 min) bei Raumtemperatur (18 bis 25 inkubieren (feuchte Kammer oder mit Folie abgeklebt). o C) 5.8. Verdünnen des Konjugats (s. 3.4.) Nach Inkubation die Mikrotitervertiefungen erneut dreimal waschen (s. 5.5.) µl Konjugatlösung (grün gefärbt) in alle Vertiefungen (außer A1) pipettieren Erneut 60 min (± 2 min) bei Raumtemperatur (18 bis 25 o C) inkubieren (feuchte Kammer oder mit Folie abgeklebt). VP-D/DAL+ALe

10 5.12.Nach Inkubation die Mikrotitervertiefungen fünfmal waschen (s. 5.5.) µl TMB-Substrat in jede Vertiefung (auch A1) pipettieren und 30 min (± 2 min) bei Raumtemperatur (18 bis 25 o C) im Dunkeln inkubieren. Positive Proben erscheinen blau gefärbt Durch Zugabe von 100 µl Stopplösung (0,3 M Schwefelsäure) in jede Vertiefung (auch A1) wird die Reaktion gestoppt. Es erfolgt ein Farbumschlag von blau nach gelb. Mikrotitervertiefungen vor photometrischer Messung von unten abwischen und darauf achten, daß keine Luftblasen in den Vertiefungen vorhanden sind! Die Messung ist innerhalb von 15 min nach dem Stoppen durchzuführen! 5.B. TABELLE ZUR ARBEITSVORSCHRIFT Parvo B19 IgM-ELISA medac Leerwert (A1) Negative Kontrolle Schwach Positive Kontrolle Positive Kontrolle Negative Kontrolle µl Schwach Positive Kontrolle µl - - Positive Kontrolle µl - Probe Probe µl 60 min bei 18 bis 25 C inkubieren, 3 x mit 200 µl Waschpuffer waschen Antigen - 100µl 100µl 100µl 100µl 60 min bei 18 bis 25 C inkubieren, 3 x mit 200 µl Waschpuffer waschen Konjugat - 100µl 100µl 100µl 100µl 60 min bei 18 bis 25 C inkubieren, 5 x mit 200 µl Waschpuffer waschen TMB-Substrat 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 30 min bei 18 bis 25 C im Dunkeln inkubieren Stopplösung 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Photometrische Auswertung bei 450 nm (Ref nm) VP-D/DAL+ALe

11 6.A. TESTBEURTEILUNG (VALIDITÄT) Die photometrische Auswertung erfolgt bei einer Wellenlänge von 450 nm (Referenzwellenlänge nm). Die OD des Leerwertes (Vertiefung A1) wird von allen OD-Werten subtrahiert. Der OD-Mittelwert der in Doppelbestimmung mitgeführten Schwach Positiven Kontrolle ist zu berechnen. Die Einzelwerte sollen nicht mehr als 20 % vom Mittelwert abweichen. Der OD-Mittelwert der Schwach Positiven Kontrolle muß > 0,15 und < 0,6 betragen. Das Verhältnis OD Negative Kontrolle muß < 0,6 betragen. OD Schwach Positive Kontrolle Das Verhältnis OD Positive Kontrolle muß > 1,5 betragen. OD Schwach Positive Kontrolle IgM Antikörper-Index = OD Patientenprobe OD Schwach Positive Kontrolle 6.B. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE IgM Antikörper-Index Interpretation 1,00 Positiv < 0,80 Negativ 0,80 und < 1,00 Grenzwertig Werte im Grenzbereich sollten kontrolliert werden, indem nach 14 Tagen eine zusätzliche Patientenprobe entnommen wird, die zusammen mit der ersten Probe auf eine Titerbewegung untersucht wird. Die Testergebnisse sollten stets im Zusammenhang mit dem klinischen Bild der Patienten und weiteren diagnostischen Parametern interpretiert werden. 7. LEISTUNGSMERKMALE Die nachfolgenden Leistungsmerkmale wurden im Rahmen der diagnostischen Evaluierung ermittelt. VP-D/DAL+ALe

12 7.A. SENSITIVITÄT UND SPEZIFITÄT 126 Patienten wurden mit Hilfe des Parvo B19 IgM-ELISA medac im Vergleich zu einem hochspezifischen ELISA eines Referenzinstitutes getestet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Vier- Felder-Tafel dargestellt. Referenztest negativ positiv Parvo B19 IgM-ELISA medac negativ positiv 0 17 Sensitivität = 100 % Spezifität = 100 % Positiver Vorhersagewert = 100 % Negativer Vorhersagewert = 100 % In einer zweiten klinischen Studie wurden 348 Seren von Parvovirus B19-infizierten und nicht-infizierten Personen untersucht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt. Erkrankung Probenzahl Positive Negative Erythema infectiosum Aplastische Krise Nicht-Infizierte Sensitivität = 98,1 % Spezifität = 100 % Positiver Vorhersagewert = 100 % Negativer Vorhersagewert = 99,2 % 7.B. PRÄZISION Serum Intraassay-Varianz Serum Interassay-Varianz MW OD S VK(%) n MW OD S VK(%) n NK 0,039 0,004 10,4 60 NK 0,037 0,003 6,9 3 SPK 0,241 0,011 4,55 60 SPK 0,219 0,015 6,8 3 PK 1,647 0,021 1,28 60 PK 1,518 0,017 1, ,534 0,029 5, ,618 0,020 3, ,289 0,033 2, ,468 0,022 1, ,772 0,029 1, ,865 0,023 1,2 15 NK = Negative Kontrolle; SPK = Schwach Positive Kontrolle; PK = Positive Kontrolle VP-D/DAL+ALe

13 ALLGEMEINE HANDHABUNGSHINWEISE Reagenzienflaschen und deren Verschlüsse nicht vertauschen, um Kreuzkontamination zu vermeiden. Sofort nach Gebrauch die Reagenzflaschen wieder fest verschliessen, um Verdunstung und mikrobielle Kontamination zu vermeiden. Nach Gebrauch sind die Reagenzien sofort wieder, entsprechend den vorgeschriebenen Lagerungsbedingungen, zu lagern, um die angegebene Haltbarkeit zu gewährleisten. SICHERHEITSHINWEISE Die einschlägigen Richtlinien für Laboratorien und die Unfallverhütungsvorschriften sind zu beachten. Die Reagenzien humanen Ursprungs wurden auf HBsAg, Anti-HIV 1/2 und Anti-HCV untersucht und für nicht reaktiv befunden. Dennoch sollten diese Reagenzien wie auch jene, die Bestandteile tierischer Herkunft enthalten (siehe Packungsinhalt), als potentiell infektiös behandelt werden, um das Risiko einer Ansteckung zu vermeiden. R 22: Gesundheitsschädlich beim Verschlucken. S 36: Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung tragen. ENTSORGUNGSHINWEISE Chemikalien und Zubereitungen, die als Reststoffe anfallen, sind in der Regel Sonderabfälle. Deren Beseitigung unterliegt den nationalen abfallrechtlichen Gesetzen und Verordnungen. Die zuständige Behörde oder Abfallbeseitigungsunternehmen informieren über die Entsorgung von Sonderabfällen. Hinweise auf Entsorgungsmöglichkeiten gibt ebenfalls das amtliche Merkblatt über die Vermeidung und die Entsorgung von Abfällen aus öffentlichen und privaten Einrichtungen des Gesundheitsdienstes (veröffentlicht u. a. im Staatsanzeiger für das Land Hessen, Nr. 44 vom 04. November 1991, S. 2449). LITERATURHINWEISE (s. S. 22) VP-D/DAL+ALe

14 Parvo B19 IgM-ELISA medac Enzyme immunoassay for the detection of IgM antibodies to Parvovirus B19 Cat. no.: 190 FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE ONLY INTRODUCTION Parvovirus B19 (B19) is a member of the family parvoviridae. The virus is very small and consists of single stranded DNA, the nonstructural protein NS1 and a capsid, containing the structural proteins VP1 and VP2. Parvovirus B19 infection is common. The highest rate of infection rises from 10 % in children to 50 % by the age of 30. Infections occur more often in late winter and spring accompanied by epidemic outbreaks in schools and nursery schools. The infection is generally transmitted by the respiratory route. Since the virus is present in patients sera it may be transmitted by blood and transplants. The incidence of B19 in banked blood is between 0.03 and %. The clinical manifestation of B19 infections are similar to most systemic virus infections. The clinical course of postnatal infections is relatively harmless, in immunocompetent individuals often without symptoms. In many cases, patients develop a typical exanthema, called erythema infectiosum (slapped cheek or fifth disease). Together with the frequently occuring polyarthralgias/polyarthritis the exanthema is discussed as an immunological reaction. Due to the high tropism of B19 to infect and destroy erythroid progenitor cells, an anemia is developed which disappears after production of antibodies. In patients with underlying hemolytic disorders or immunosuppression and in intrauterine infections of the fetus during the second or third trimester the anemia can lead to heavy damages, e. g. hydrops fetalis. The viremia usually lasts four to six days. During this period the patient is infectious. The Parvo B19 IgM-ELISA medac can be applied for the detection of specific Parvovirus B19 IgM antibodies in acute infections. In persistent or chronic forms of B19 infection IgM antibodies may persist for a couple of months sometimes for years. In these cases an antigen detection, via PCR, should be carried out. VP-D/DAL+ALe

15 It has to be taken into consideration that IgM antibodies are not always produced, e. g. in immunosuppressive patients. Advantages of the test! No unspecific reactions and no false positive results caused by rheumatoid factors.! The breakable microwell strips permit efficient use of the test.! No cross-reaction with rubella and measles virus infection.! No blocking of IgM antibodies by high IgG titer.! Suitable for automation on open ELISA devices.! The use of monoclonal antibody conjugate and recombinant antigens VP1 and VP2 produced by the baculovirus expression system makes the assay highly specific and sensitive. In addition to the Parvo B19 IgM-ELISA medac Cat. no.: 190 for 96 determinations we also distribute the Parvo B19 IgG-ELISA medac Cat. no.: 195 for 96 determinations VP-D/DAL+ALe

16 TEST PRINCIPLE The plate is coated with antihuman IgM immunoglobulin. IgM of the specimen is selectively bound to the wells. The Parvovirus B19 antibodies bind to the Parvovirus B19 antigen (AG = antigen). Peroxidase-conjugated anti- Parvovirus B19 antibodies bind to the antigen (P = peroxidase). Incubation with TMB-Substrate (*). The reaction is stopped by the addition of sulfuric acid. The absorption is read photometrically. VP-D/DAL+ALe

17 KIT CONTENTS Cat. no.: 190: 1. Microplate: 12 x 8 wells (with frame and desiccant in aluminium bag), breakable, coated with mouse anti-human IgM (monoclonal), ready to use. 2. Negative Control: 1 vial with 2 ml, human serum, Xn, harmful, R22, S36, contains sodium azide (0.1%), ready to use. 3. Weak Positive Control: 1 vial with 2 ml, human serum, Xn, harmful, R22, S36, contains sodium azide (0.1%), ready to use. 4. Positive Control: 1 vial with 2 ml, human serum, Xn, harmful, R22, S36, contains sodium azide (0.1%), ready to use. 5. Wash Buffer: 1 bottle with 100 ml, PBS/Tween (10x), ph Sample Diluent: 1 bottle with 250 ml, PBS/Tween/BSA, stained green, ph , ready to use. 7. Antigen: 8 vials with 2 ml, recombinant Parvovirus B19, 0.5 µg/ml, lyophilized. 8. Conjugate: 1 vial with 1 ml (20x), mouse-anti-parvovirus B19- antibody (monoclonal), HRP-conjugated. 9. TMB-Substrate: 1 vial with 20 ml, ready to use. 10. Stop Solution: 1 vial with 20 ml, 0.3 M sulfuric acid (H 2 SO 4 ), ready to use. 11. Frame 1. STORAGE AND STABILITY MATERIAL/REAGENT STATE STORAGE STABILITY Test kit unopened C until expiry date Microplate opened 2..8 C 6 weeks Sample Diluent opened C until expiry date Antigen reconstituted C 1 week Controls opened C until expiry date Wash Buffer opened, C until expiry date undiluted Conjugate diluted C 1 week TMB-Substrate opened C until expiry date Stop Solution opened C until expiry date Do not use the reagents after the expiry date. VP-D/DAL+ALe

18 2. REAGENTS AND MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED 2.1. Water for injection (H 2 O redist.). Use of deionised water can disturb the test procedure Adjustable micropipettes Clean glass or plastic containers for dilution of Conjugate, Wash Buffer and specimen Suitable device for microplate washing (e.g. multistepper or ELISA washer) Microplate reader with filters for 450 nm and nm. 3. PREPARATION OF THE REAGENTS Before starting the test procedure all kit components must be equilibrated to room temperature. Calculate the number of wells required Microplate The aluminium bag has to be tightly resealed together with the desiccant after each remove of wells. Storage and stability of the wells are indicated in table Wash Buffer Mix one volume of Wash Buffer (10x) with 9 volumes of water for injection (e.g. 50 ml Wash Buffer (10x) with 450 ml water). 20 ml of diluted wash buffer are needed for eight wells. Crystals in the Wash Buffer (10x) have to be dissolved by warming (max. 37 C) and/or stirring at RT Antigen Reconstitute the lyophilized antigen by adding 2 ml of Sample Diluent to one vial. Mix gently and take care that particles sticking to the closure are also dissolved. After reconstitution the antigen is stained green and ready to use Conjugate Mix one volume of Conjugate (20x) with 19 volumes of Sample Diluent (e.g. 40 µl Conjugate (20x) with 760 µl Sample Diluent). 0.8 ml Conjugate, ready to use, are needed for eight wells. After dilution the conjugate is stained green and ready to use. Do not mix reagents from different lots or manufacturers. Valid and reproducible results are only obtained if the test procedure is precisely followed and test kit-specific reagents are used. VP-D/DAL+ALe

19 4. SPECIMEN 4.1. The test is suitable for serum and plasma samples Pretreatment of sera (plasma), e.g. inactivation, is not necessary. However, they should neither be contaminated with microorganisms nor contain any red blood cells Serum or plasma samples have to be diluted 1 : 200 with Sample Diluent. For determination of the titer samples can be diluted further. 5.A. TEST PROCEDURE 5.1. Cut the aluminium bag above the zip fastener and take out the required number of microplate wells (see 3.1.). Microplate wells are ready to use and do not have to be prewashed Leave well A1 empty as blank (see 6.A.). Add 100 µl each of the diluted sample. Add 100 µl each of Negative, Weak Positive (in duplicate) and Positive Control to the wells Incubate the microplate wells for 60 min (± 2 min) at 18 o C to 25 C in a humid chamber or sealed with incubation cover foil Reconstitute the Antigen (see 3.3.) After incubation wash the microplate wells three times with 200 µl wash buffer per well. Pay attention that all wells are filled. After washing tap microplate wells on filter paper. Do not allow the wells to dry out! Proceed immediately! 5.6. Add 100 µl Antigen to each well (except A1) Incubate the microplate wells for 60 min (± 2 min) at 18 o C to 25 C in a humid chamber or sealed with incubation cover foil Dilute the Conjugate (see 3.4.) After incubation wash the microplate wells three times again (see 5.5) Add 100 µl Conjugate to each well (except A1) Incubate again for 60 min (± 2 min) at 18 o C to 25 C in a humid chamber or sealed with incubation cover foil After incubation wash microplate wells five times (see 5.5.) Add 100 µl of TMB-Substrate to each well (also A1) and incubate for 30 min (± 2 min) at 18 C to 25 C in the dark. Positive samples turn blue. VP-D/DAL+ALe

20 5.14.Stop the reaction by adding 100 µl of Stop Solution to each well (also A1). Positive samples turn yellow. Clean microplate wells from underneath before the photometric reading and take care that there are no air bubbles in the wells. The reading should be done within 15 min after adding the Stop Solution! 5.B. TABLE FOR THE TEST PROCEDURE Parvo B19 IgM ELISA Blank (A1) Negative Control Weak Positive Control Positive Control Sample Negative Control µl Weak Positive Control µl - - Positive Control µl - Sample µl Incubate for 60 min at 18 to 25 C, wash 3 x with 200 µl wash buffer Antigen - 100µl 100µl 100µl 100µl Incubate for 60 min at 18 to 25 C, wash 3 x with 200 µl wash buffer Conjugate - 100µl 100µl 100µl 100µl Incubate for 60 min at 18 to 25 C, wash 5 x with 200 µl wash buffer TMB-Substrate 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Incubate for 30 min at 18 to 25 C in the dark Stop Solution 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Photometric reading at 450 nm (ref nm) VP-D/DAL+ALe

21 6.A. CALCULATION OF RESULTS (VALIDITY) Read OD values at 450 nm (reference wavelength nm). Subtract the mean OD value of the blank (well A1) from all other OD values. Calculate the mean OD value of the Weak Positive Control. The single OD values must not differ more than 20 % from the mean OD value. The mean OD value of the Weak Positive Control has to be > 0.15 and < 0.6. The ratio OD Negative Control has to be < 0.6. OD Weak Positive Control The ratio OD Positive Control has to be > 1.5. OD Weak Positive Control IgM Antibody Index = OD Patient Sample OD Weak Positive Control 6.B. INTERPRETATION OF RESULTS IgM Antibody Index Interpretation 1,00 Positive < 0,80 Negative 0,80 and < 1,00 Equivocal Samples with equivocal results should be retested together with a fresh specimen taken 14 days later in order to determine a titer change. The results should always be interpreted in connection with clinical data and additional diagnostic parameters. VP-D/DAL+ALe

22 7. PERFORMANCE CHARACTERISTICS The following performance characteristics were determined during diagnostic evaluation. 7.A. SENSITIVITY AND SPECIFICITY 126 sera from patients were measured with the Parvo B19 IgM- ELISA medac in comparison to a highly specific in house ELISA in a reference institute. The results obtained are shown in the table below. Reference test Negative Positive Parvo B19 IgM-ELISA medac Negative Positive 0 17 Sensitivity = 100 % Specificity = 100 % Positive predictive value = 100 % Negative predictive value = 100 % 348 sera of Parvovirus B19 infected and non-infected patients were measured in a second clinical study. The results obtained are shown in the table below. Disease Samples Positive Negative Erythema infectiosum Aplastic Crisis Non-Infected Sensitivity = 98.1 % Specificity = 100 % Positive predictive value = 100 % Negative predictive value = 99.2 % VP-D/DAL+ALe

23 7.B. PRECISION Sample Intra-assay variation Sample Inter-assay variation mean SD CV n mean SD CV n OD (%) OD (%) NC NC WPC WPC PC PC NC = Negative Control; WPC = Weak Positive Control; PC = Positive Control GENERAL HANDLING ADVICES To avoid cross contamination do not exchange the vials and their screw caps. The reagents have to be sealed immediately after use to avoid evaporation and microbial contamination. After use, the reagents have to be stored as indicated to guarantee the shelf life. HEALTH AND SAFETY INFORMATION The local occupational safety and health regulations have to be regarded. Reagents of human origin have been tested and found to be negative for HBsAg, for antibodies to HIV-1/2 and to HCV. Nevertheless, it is strongly recommended that these materials as well as those of animal origin (see kit contents), should be handled as potentially infectious and used with all necessary precautions. R 22: Harmful if swallowed. S 36: Wear suitable protective clothing. DISPOSAL CONSIDERATIONS Residues of chemicals and preparations are generally considered as hazardous waste. The disposal of this kind of waste is regulated through national and regional laws and regulations. Contact your local authorities or waste management companies which will give advice on how to dispose hazardous waste. VP-D/DAL+ALe

24 LITERATUR/REFERENCES Brown, K.E.: Human Parvovirus B19 Epidemiology and Clinical Manifestations, in: Human Parvovirus B19. Monogr. Virol. Basel, Karger Verlag, 20, (1997). Brown, K.E. und Young, N.S.: Human Parvovirus B19: Pathogenesis of Disease, in: Human Parvovirus B19. Monogr. Virol. Basel, Karger Verlag, 20, (1997). Erdman, D.D.: Human Parvovirus B19: Laboratory Diagnosis, in: Human Parvovirus B19. Monogr.Virol. Basel, Karger Verlag, 20, (1997). Frickhofen N., Abkowitz J.L., Safford M., et al. Persistent B19 Parvovirus infection in patients infected with Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1): a treatable cause of anemia in AIDS. Ann. Int. Med. 113, (1990). Jäger, G.R. und Schwarz, T.F.: Hämatologische Bedeutung der Parvovirus B19-Infektion. Die gelben Hefte 34, (1994). Kurtzmann, G.J., Cohen B., Meyers P., Amunullah A., Young NS. Persistent B19 parvovirus infection as a cause of severe chronic anaemia in children with acute lymphocytic leukaemia. Lancet 2, (1988). Modrow, S., Hemauer, A., Gigler, A. Die Parvovirus B19-Infektion, Die gelben Hefte 38 (26), (1998). Prowse, C., Ludlam, C.A. und Yap, P.L.: Human Parvovirus B19 and Blood Products. Vox. Sang. 72, 1-10 (1997). Roggendorf, H. und Roggendorf, M.: Humanes Parvovirus B19, in: Diagnostische Bibliothek, Bd. 1, Virusdiagnostik, Porstmann, T. (Hrsg.), Blackwell Wissenschafts-Verlag, (1996). VP-D/DAL+ALe