Biochemische Untersuchungen zur Aktivität von P-TEFb

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1 Aus dem Institut für Physiologische Chemie Abteilung Biochemie supramolekularer Systeme der Ruhr-Universität Bochum ehem. Direktor: Prof. Dr. rer. nat. Roger S. Goody Biochemische Untersuchungen zur Aktivität von P-TEFb Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Florian Kraft aus Coesfeld 2012

2 Dekan: Referent: Prof. Dr. med. Klaus Überla Prof. Dr. rer. nat. Roger S. Goody Koreferent: Prof. Dr. rer. nat. Joachim Rassow Tag der mündlichen Prüfung:

3 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis... 1 Tabellenverzeichnis:... VII 1. Einleitung Infektion einer Zelle mit dem HI-Virus Transkription bei Eukaryoten Die C-terminale Domäne der RNA-Polymerase II Der Transkriptionszyklus Der Transkriptionsarrest Der positive Transkriptionselongationsfaktor b Transkriptionselongation von HIV Regulation der Kinaseaktivität von P-TEFb Bestandteile des inaktiven Pools Der aktive P-TEFb Pool P-TEFb Inhibition auf anderen Wegen Folgen fehlregulierter P-TEFb Aktivität Idee eines Fluoreszenz-basierten Kinaseassays Zielsetzung Material und Methoden Material Chemikalien Verbrauchsmaterialien Chromatographiematerialien Fluoreszenzfarbstoffe Nukleotide Reagenziensätze DNA-Konstrukte Enzyme, Proteine und Antikörper Mikroorganismen Materialien für die prokaryotische Zellbiologie Laborgeräte I

4 3.2. Molekularbiologische Methoden Polymerasekettenreaktion Agarosegelelektrophorese Restriktionsverdau Extraktion der DNA-Fragmente aus Agarosegelen Ligation Transformation Gewinnung und Isolierung der Plasmid-DNA DNA-Sequenzierung Glycerindauerkulturen Proteinchemische Methoden Proteinexpression und Zellernte Zellaufschluss Glutathionaffinitätschromatographie Präparative Größenausschlusschromatographie Ionenaustauschchromatographie Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese Bestimmung der Proteinkonzentration Konzentrierung der Proteine Filterbindungsassay ESI-Massenspektrometrie Biophysikalische Methoden Isotherme Titrationskalorimetrie Theorie des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer Komponenten des FRET-Assays Ergebnisse Setup eines Fluoreszenz-basierten Kinaseassays Peptid-Phosphorylierung durch den P-TEFb Komplex Fluoreszenzspektren des Donor-Akzeptor-Paars Basiseinstellungen Phosphorylierungs-abhängiges FRET-Signal Modulation der Kinaseaktivität von P-TEFb Faktoren zur Beeinflussung der P-TEFb Aktivität II

5 Herstellung des TatKip Konstrukts Bindungsverhalten von TatKip zu Cyclin T Substratphosphorylierung durch P-TEFb Aktivitätsmessung von P-TEFb Substratanalyse durch CTD-Tat Fusionskonstrukte Diskussion Reporterassay für P-TEFb auf Fluoreszenzbasis Modulation der Aktivität von P-TEFb Substraterkennung des P-TEFb Komplexes Zusammenfassung Literaturverzeichnis Danksagung Lebenslauf III

6 Abkürzungsverzeichnis: Å Angström (10-10 m) AIDS erworbenes Immundefizit Syndrom (aquired immune deficiency syndrome) ATP Adenosintriphosphat Bp Basenpaare CAK Cdk aktivierende Kinase (Cdk activating kinase) Cdk Cyclin-abhängige Kinase (cyclin-dependent kinase) CTD Carboxy-terminale Domäne (carboxy-terminal domain) C-Terminus Carboxy-Terminus Cyc Cyclin Da Dalton DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleid acid) DRB 5,6-Dichloro-1-β-D-ribofuranosylbenzimidazol DSIF DRB-Sensitivitäts-induzierender Faktor (DRB sensitivity inducing factor) EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EEC früher Elongationskomplex (early elongation complex) EGF epidermaler Wachstumsfaktor (epidermal growth factor) ESI-MS Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (electrospray ionisation mass spectrometry) GST Glutathion-S-Transferase GTF Genereller Transkriptionsfaktor h Human Hexim1 HMBA-induzierbares Protein (HMBA inducible protein 1) HIV Humanes Immunodefizienz Virus HMBA Hexamethylen-Bisacetamid hnrnp Heterogene nukleäre Ribonukleoproteine (heterogeneous nuclear ribonucleoproteins) IP Isoelektrischer Punkt IPTG Isopropyl-1-β-D-thiogalaktopyranosid kda Kilodalton LTR Long terminal repeat IV

7 M mol/l, molar ml Milliliter min Minute µm µmol/l, mikromolar ncrna nicht codierende Ribonukleinsäure (non coding ribonucleic acid) NF-κB Nukleärer Faktor der kappa Leichtketten in B-Lymphozyten nm nmol/l, nanomolar nt Nukleotid N-Terminus Aminoterminus NELF negativer Elongationsfaktor (negative elongation factor) PAGE Polyacrylamidgelektrophorese PBS Phosphat gepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline) PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction) PDB Proteindatenbank (protein data bank) PIC Präinitiationskomplex (preinitiation complex) Pol Polymerase ppm tausendstel Teilchen (parts per million) P-TEFb positiver Transkriptionselongationsfaktor b (positive transcription elongation factor b) RNA Ribonukleinsäure (ribonucleid acid) rrna ribosomale Ribonukleinsäure (ribosomal ribonucleic acid) rpm Umdrehungen pro Minute (revolutions per minute) SDS Natriumdodecylsulfat (sodium dodecylsulfate) snrna kleine nukleäre Ribonukleinsäure (small nuclear ribonucleic acid) Tat Transaktivator der Transkription (transcriptional activator) TAR RNA Transaktivation Antwort RNA (transactivation response RNA) TEMED N, N, N, N -Tetramethylethylendiamin TEV Tobacco etch virus UV Ultraviolett v/v Volumen pro Volumen (volume per volume) w/v Gewicht pro Volumen (weight per volume) V

8 Abbildungsverzeichnis: Abbildung 1: Übersicht der CTD-modifizierenden Proteine... 3 Abbildung 2: Phasen zu Beginn des Transkriptionszyklus... 4 Abbildung 3: Kristallstruktur des P-TEFb Komplexes... 8 Abbildung 4: Kristallstruktur des Cdk2-CycA Komplex mit Cdc Abbildung 5: Schema des HIV-Genoms Abbildung 6: HIV-1 Tat vermittelte Transkriptionsaktivierung Abbildung 7: Domänenstruktur von Tat Abbildung 8: Kristallstruktur des Cyclin T1-Tat-TAR Komplexes Abbildung 9: Interaktionspartner des aktiven und inhibierten P-TEFb Pools.. 13 Abbildung 10: Pentamere Domänenstruktur humaner Hexim-Proteine Abbildung 11: Domänenstruktur von PIE-1 und Cdc Abbildung 12: Formel zur Berechnung der FRET-Effizienz Abbildung 13: FRET basierter Reporterassay Abbildung 14: Darstellung der Pepide für den FRET-Ansatz Abbildung 15: Massenspektrometrie von drei Peptiden Abbildung 16: Fluoreszenz-Spektren der Fluorophore Eu 3+ und APC Abbildung 17: FRET-Effizienz bei variierender Konzentrationen von Peptid und APC-markiertem Antikörper Abbildung 18: Kumulative Ergebnisse aus dreizehn TR-FRET-Messungen.. 48 Abbildung 19: Das Tat-TAR Element auf der Oberfläche von equinem Cyclin T1 sowie der Inhibitor p27 Kip1 im Komplex mit Cdk2/CycA Abbildung 20: Darstellung und Massenspektroskopie von TatKip Abbildung 21: Domänenstruktur des Fusionskonstruktes TatKip Abbildung 22: Isotherme Titrationskalorimetrie von Cyclin T1 zu TatKip Abbildung 23: Darstellung und Phosphorylierung von GST-CTD13x Substratprotein Abbildung 24: Radioaktiver Filterbindungsansatz zur Bestimmung der Kinaseaktivität von P-TEFb mit TatKip Abbildung 25: Radioaktiver Filterbindungsansatz zur Bestimmung der Kinaseaktivität von P-TEFb mit TatKip und Hexim Abbildung 26: Modell zur Orientierung der CTD-Tat Konstrukte Abbildung 27: Design und Reinigung der CTD-Tat Fusionskonstrukte VI

9 Abbildung 28: Massenspektrometrie der nativen und phosphorylierten CTD-Tat Konstrukte I-III Abbildung 29: Erster Test der CTD-Tat Fusionskonstrukte im Filterbindungsansatz Abbildung 30: Zweiter Test der CTD-Tat Fusionskonstrukte im Filterbindungsansatz Abbildung 31: Vergleich der N-terminalen Domänen von Cdk2 und Cdk Abbildung 32: Interaktionen zwischen p27 Kip1 und dem N-terminalen Kinaseflügel von Cdk Abbildung 33: Tat gebundener P-TEFb Komplex Tabellenverzeichnis: Tabelle 1: Pipettierschema für einen PCR-Ansatz Tabelle 2: Pipettierschema für einen Ligationsansatz Tabelle 3: Ansatz für die Sequenzierungs-PCR Tabelle 4: Parameter der Sequenzierungs-PCR Tabelle 5: Pipettierschema zur Herstellung der SDS-Gele VII

10 1. Einleitung 1.1. Infektion einer Zelle mit dem HI-Virus Weltweit sind laut UNAIDS AIDS Report vom Ende 2011 etwa 33,4 Millionen Personen mit dem Humanen Immundefizienz Virus (HIV) infiziert, welches beim Menschen das erworbene Immundefizienz Syndrom (aquired immunodeficiency syndrome, AIDS) verursacht. Das zur Familie der Retroviren zählende HI-Virus aus der Gattung der Lentiviren kann humane T-Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen sowie dendritische Zellen infizieren. Neben dem CD4-Rezeptor als wichtigster Bindungspartner sind auch die Chemokinrezeptoren CXCR4 und CCR5 an der Invasion der Wirtszelle beteiligt (Berger et al., 1999). Das vom HI-Virus eingebrachte Erbgut wird durch das virale Enzym Reverse Transkriptase in doppelsträngige DNA überführt und über das Enzym Integrase in das zelluläre Genom integriert. Für die Produktion neuer viraler Proteine ist das Virus auf die Transkription des integrierten Genoms in Boten-RNA (messenger-rna, mrna) angewiesen, welche in eukaryotischen Zellen durch die RNA-Polymerase II gebildet wird. Mit Hilfe des regulatorischen Proteins Tat gelingt dem HI-Virus eine Steigerung der Transkription des eigenen Genoms im Vergleich zu zellulärer DNA um den Faktor 100 (Casse et al., 1999). Die Untersuchung der zellulären Interaktionspartner des Proteins Tat hat in den letzten zwei Jahrzehnten wichtige Erkenntnisse zur Transkriptionsregulation in Eukaryoten beigetragen, die im folgenden Abschnitt dargestellt werden Transkription bei Eukaryoten Die Transkription bezeichnet die von den RNA-Polymerasen vermittelte Synthese von Ribonukleotidketten auf Basis einer DNA-Matrize. Die DNA- Basensequenz aus den Desoxyribonukleotiden Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin bestimmt dabei die Sequenz der gebildeten RNA aus den jeweils komplementären Ribonukleotiden Uracil, Adenin, Cytosin und Guanin. In eukaryotischen Zellen unterscheidet man drei RNA-Polymerasen (RNA-Pol I, II und III). Die RNA-Pol I transkribiert ribosomale-rna (ribosomal RNA, rrna), 1

11 die RNA-Pol II produziert Boten-RNA (messenger RNA, mrna) und kleine nukleäre-rna (small nuclear RNA, snrna), während die RNA-Pol III die Synthese von Transfer-RNA (transfer RNA, trna) und 5S ribosomaler RNA vermittelt (Cramer et al., 2008). Die eukaryotische RNA-Pol II ist ein 514 kda schwerer Multienzymkomplex aus insgesamt zwölf Untereinheiten. Der Transkriptionskomplex besteht neben der RNA-Pol II aus konservierten generellen Transkriptionsfaktoren (general transcription factor, GTF) und ist in Eukaryoten funktionell und strukturell konserviert (Naar et al., 2001). In der Promotorregion sind zahlreiche Initiationsfaktoren an der Assemblierung des Transkriptionskomplexes im Bereich der Transkriptionsstartstelle beteiligt. Diese Initiationsfaktoren binden proximal und distal der Transkriptionsstartstelle gelegene DNA-Sequenzen, die einen positiven (enhancer) oder negativen (silencer) Effekt auf die Transkriptionsrate besitzen. Coaktivatoren oder Corepressoren interagieren dabei zwischen Initiationsfaktoren und Transkriptionskomplex und vermitteln den jeweils stimulierenden oder inhibierenden Effekt (Kadonaga, 2004). Den wichtigsten Co-Aktivator stellt der aus bis zu 30 Untereinheiten bestehende Mediatorkomplex dar. Dieser verarbeitet Signale von regulatorisch wirksamen Transkriptionsfaktoren und leitet diese durch Interaktion mit der C-terminalen Domäne von Rpb1 und weiteren RNA-Pol II-Untereinheiten an die Transkriptionsmaschinerie weiter (Kornberg, 2005) Die C-terminale Domäne der RNA-Polymerase II Die größte Untereinheit der RNA-Pol II Rpb1 ist über ein Verbindungselement (linker) mit einer konservierten C-terminalen Domäne (C-terminal domain, CTD) verbunden. Diese Domäne, die nur die RNA-Pol II besitzt, besteht aus mehreren Wiederholungen der Heptadsequenz Y1S2P3T4S5P6S7, deren Anzahl mit der Komplexität eines Organismus zunimmt (Prelich, 2002). So besteht die CTD der RNA-Pol II von Hefe (S. cerevisiae) aus 26 Heptaden, 45 Heptade bilden die CTD der Fruchtfliege (D. melanogaster) und 52 Heptade kennzeichnen die CTD von Eukaryoten. Eine Reduktion der Heptadwiederholungen sowie das Einbringen von Alaninresten in eine 2

12 Heptadsequenz haben letale Auswirkungen, da die CTD der RNA-Pol II für die Zellvitabilität essentiell ist (Phatnani and Greenleaf, 2006). Während des Transkriptionszyklus unterliegt die CTD der RNA-Pol II zahlreichen kovalenten Modifizierungen, welche durch die in Abbildung 1 dargestellten Proteine katalysiert werden. Die CTD wird dabei hauptsächlich von drei Transkriptions regulierenden Cyclin-abhängigen Kinasen (cyclindependent kinase, Cdk) phosphoryliert. Der Transkriptionsfaktor IIH (transcription factor IIH, TFIIH) beinhaltet die mit Cyclin H (CycH) assozierte Cdk7, die ebenso wie die Cdk8-CycC des Mediatorkomplexes S5 Reste der CTD phosphoryliert. Der in dieser Arbeit näher analysierte P-TEFb Komplex phosphoryliert bevorzugt S2 Reste der Heptadsequenz, Serinreste an Position 5 sind jedoch auch als Substratakzeptor beschrieben worden (Saunders et al., 2006). Neue Erkenntnisse belegen, dass die Cyclin K assoziierten Cyclinabhängigen Kinasen 12 und 13 wie P-TEFb S 2 Reste der RNA-Pol II CTD phosphorylieren (Bartkowiak et al., 2010; Blazek et al., 2011). Die Phosphorylierung von S 7 durch die Kinaseaktivität des TFIIH wurde in Zusammenhang mit der Transkription von kleiner nukleärer RNA (small nucelear RNA, snrna) gebracht, jedoch scheint eine weitere bislang unbekannte Kinase daran beteiligt zu sein (Chapman et al., 2007; Egloff et al., 2007; Boeing et al., 2010). Neben Kinasen modifizieren Peptidyl-Prolyl- Isomerasen die Struktur der CTD, indem sie die Prolinreste innerhalb der Heptade cis-trans isomerisieren. Ein breites Spektrum an möglichen Phosphorylierungsmustern der CTD, kombiniert mit der variablen Prolin-Konformation, schafft eine große Variabilität für die 52 Heptade der CTD von RNA-Pol II. Das Gesamtmuster der CTD- Modifizierungen kennzeichnet letztendlich spezifische Aktivitätszustände der Abbildung 1: Übersicht der CTD-modifizierenden Proteine. An der Modifizierung sind Cyclin-abhängige Kinasen, Phosphatasen und Peptidyl-Prolyl-Isomerasen beteiligt (entnommen aus Saunders et al., 2006). 3

13 RNA-Pol II (Buratowski, 2003). Die CTD bindenden Faktoren scheinen dabei Heptad übergreifend eine Octamersequenz als Erkennungssequenz zu nutzen. Hinweise auf die strukturellen Eigenschaften ergeben sich bislang nur aus NMR Studien oder Kristallstrukturen von CTD bindenden Proteinen, die einzelne Heptadpeptide gebunden haben (zusammengefasst in Meinhart et al., 2005) Der Transkriptionszyklus Der Transkriptionszyklus besteht aus den Phasen Initiation, Elongation und Termination, welche die RNA-Pol II während der mrna-synthese durchläuft. Bei der Initiation wird eine RNA-Polymerase II an eine Transkriptionsstartstelle rekrutiert und die DNA Matrize in das aktive Zentrum der Polymerase geführt. In Abbildung 2 sind die Phasen zu Beginn des Transkriptionszyklus dargestellt, welche der Transkriptionskomplex bis zur prozessiven Synthese eines komplementären RNA-Basenstrangs während der produktiven Elongation durchläuft. Die Termination umfasst die Freisetzung des mrna-strangs sowie die Dissoziation des Transkriptionskomplexes vom DNA-Strang (Übersichtsartikel in Saunders et al., 2006). Abbildung 2: Phasen zu Beginn des Transkriptionszyklus. Am Präinitiationskomplex assembliert die RNA-Pol II (blaue Blase) mit Generellen Transkriptionsfaktoren (orange Blasen) an der Transkriptionsstartstelle (aus Margaritis and Holstege, 2008 entnommen und modifiziert). 4

14 Der Transkriptionsarrest Wie bereits in Abbildung 2 ersichtlich wird der Transkriptionskomplex nach dem Entkommen aus der Promotorregion in einen promotornahen Arrest überführt, bevor es zur produktiven Elongation kommt. Erste Erkenntnisse dieses Teilschritts stammen aus Studien mit dem ATP-Analogon 5,6-Dichloro-1-β-D- Ribofuranosylbenzimidazol (DRB), die zeigten, dass in eukaryotischen Zellkulturen die Synthese von vollständigen mrna-transkripten stark reduziert wurde (Sehgal et al., 1976). Dabei wurden große Mengen von kurzen 5 methylierten mrna-transkripten gefunden, die auf einen Arrest der RNA- Polymerase II vor der Elongation hinweisen (Marshall and Price, 1992). Auf Grundlage dieser Ergebnisse wurde ein Modell entwickelt, nachdem negative Transkriptionsfaktoren (negative transcription elongation factor, N-TEF) die RNA-Pol II kurz nach der Initiation anhalten. Dieser Stopp kann durch die Kinaseaktivität einer DRB-sensitiven Kinase aufgehoben werden, die einen positiven Transkriptionselongationsfaktor (positive transcription elongation factor, P-TEF) darstellt. Im Zellkern von Hefen wurden DNA-gebundene, pausierte RNA-Polymerase II Komplexe in Promotorregionen einzelner Gene nachgewiesen, die im Rahmen einer Stressreaktion kurzfristig aktiviert werden (Gilmour and Lis, 1986). Weitere Untersuchungen zeigten, dass in vielen Teilen des Genoms der Fruchtfliege in einem Transkriptionsarrest befindliche RNA-Polymerase II Komplexe vorhanden sind (Kim et al., 2005; Muse et al., 2007). In humanen Zellen konnte eine Transkriptionsregulation auf Ebene der Elongation mittlerweile für die essentiellen Strukturgene der Hox Gruppe sowie für die Signaltransduktions vermittelte Entzündungsantwort auf Lipopolysacharide gezeigt werden (Chopra et al., 2009; Hargreaves et al., 2009). Bei der Transkriptionsregulation gewinnt daher neben der umfassend untersuchten Initiation die Regulation der Elongation zunehmend an Bedeutung (Margaritis and Holstege, 2008). Verantwortlich für den Transkriptionsarrest sind der DRB Sensitivitätinduzierende Faktor (DRB sensitivity-inducing-factor, DSIF) und der negative Elongationsfaktor (negative elongation factor, NELF) (Yamaguchi et al., 1999). Welcher Wirkmechanismus von NELF und DSIF den Transkriptionskomplex 5

15 pausiert, ist bislang nicht geklärt. Bekannt ist jedoch, dass zunächst das DSIF Heterodimer über die Spt5 Untereinheit an die RNA Pol II bindet, ohne Einfluss auf deren katalytische Aktivität zu nehmen (Yamaguchi et al., 1999). Dieser DSIF/RNA-Pol II Komplex wird von NELF erkannt und als trimärer Komplex in einen Transkriptionsarrest überführt. Den Übergang des arretierten Transkriptionskomplexes zur produktiven Elongation vermittelt das Signal des positiven Transkriptionselongationsfaktor b (P-TEFb), der aus der Cyclin-abhängigen Kinase 9 (Cdk9) sowie einem regulatorischen Cyclin, meist Cyclin T1 (CycT1), besteht. Dazu phosphoryliert die Cdk9 Kinase S 2 Reste innerhalb der C-terminalen Domäne der RNA Pol II und überführt diese in die hyperphosphorylierte Form, die mit einer hohen Prozessivität mrna transkribiert (Yamada et al., 2006). Phosphoryliert werden außerdem Serinresten der NELF Untereinheit RD sowie Threoninreste von DSIF aus dem CTR1 Segment von Spt, die innerhalb einer CTD-ähnlichen Heptadsequenz liegen (Fujinaga et al., 2004; Yamada et al., 2006). Die Phosphorylierung der NELF-E Untereinheit in der Nähe des RNA- Erkennungsmotivs führt zur Dissoziation vom trimären Komplex und ermöglicht die Formierung des produktiven Elongationskomplexes, an dem DSIF als Elongationsfaktor gebunden bleibt (Zhou and Yik, 2006). Der Transkriptionsarrest fungiert als wichtiger Kontrollpunkt, um Cofaktoren für die posttranskriptionale Modifikation und Reifung der mrna zu rekrutieren. Das Capping Enzym bindet spezifisch die an S 5 phosphorylierte CTD (Komarnitsky et al., 2000), während die an S 2 Resten phosphorylierte CTD als Bindungsmotiv für Faktoren dient, die an der Polyadenylierung und dem Splicen der mrna beteiligt sind (Sims et al., 2004). Außerdem werden wichtige Chromatinmodifizierenden Proteine über Interaktionen mit der hyperphosphorylierten CTD rekrutiert (Egloff and Murphy, 2008). Das Phosphorylierungsmuster der CTD bestimmt somit die Reifung der produzierten mrna und vermittelt gleichzeitig Einfluss auf die Chromatinstruktur. Am Ende eines Transkriptionszyklus können Phosphatasen wie die FCP1 die CTD der RNA-Pol II in den hypophosphorylierten Zustand zurückführen und für einen neuen Transkriptionszyklus regenerieren (Mandal et al., 2002). 6

16 1.3. Der positive Transkriptionselongationsfaktor b Der aus zwei Untereinheiten bestehende positive Transkriptionselongationsfaktor b wurde erstmals aus Drosophila-Zellextrakten isoliert, wobei die Substanz DRB die Produktion langer mrna-transkripte inhibierte (Marshall and Price, 1995). Als Substrat dieses sogenannten P-TEFb Komplexes wurde daraufhin die C-terminale Domäne der RNA-Pol II beschrieben (Marshall et al., 1996). Sequenzanalysen ergaben, dass eine nach ihrem PITARLE Motiv benannte 42 kda schwere Kinase, die als cell division cycle 2 verwandte Kinase bereits gereinigt worden war (Grana et al., 1994), das humane Homolog der aus Drosophila gereinigten Kinase ist (Zhu et al., 1997). Aufgrund der Ähnlichkeit zur cell division cycle 2 Kinase wurde die PITARLE Kinase als Cdk9 den Cyclin-abhängigen Kinasen zugeordnet (Peng et al., 1998). Knapp zehn Jahre später wurde eine zweite Variante der Cdk9 mit einem Molekulargewicht von 55 kda identifiziert, die N-terminal zusätzlich 117 Aminosäuren besitzt (Shore et al., 2003). Dieser größeren Cdk9 Kinase wird eine Rolle im Rahmen der Muskelzellregeneration zugeschrieben (Giacinti et al., 2008). Vier Jahre nach Entdeckung der Cyclin-abhängigen Kinase 9 wurde eine Gruppe von Cyclinen als Bindungspartner beschrieben, die aus Cyclin T1, den zwei Splice-Varianten Cyclin T2a und T2b sowie aus Cyclin K besteht (Edwards et al., 1998; Peng et al., 1998). Cyclin T1 assoziiert dabei am häufigsten mit Cdk9 und wurde in 80% des zellulären P-TEFb Pools nachgewiesen (Peng et al., 1998). Im N-Terminus von Cyclin T1 bestehen zwei konservierte Cyclin- Boxen, die von zwei kleineren Helices N- und C-terminal flankiert werden. Diese Cyclin-Boxen ähneln strukturell denen von Zellzyklus-Cyclinen und vermitteln essentielle Interaktionen für die Kinaseaktivität der Cdk9. Für den C-terminalen Bereich von Cyclin T1 ist die Funktion bislang unklar, es wurden jedoch eine konservierte histidinreiche Domäne sowie eine prolinreiche Region beschrieben (Anand et al., 2007). Im Gegensatz zu Zellzykluscyclinen weisen die Cdk9 bindenden Cycline ein konstantes Expressionsmuster auf (Garriga et al., 2003). 7

17 Anhand der in Abbildung 3 gezeigten Kristallstruktur des P-TEFb Komplexes können charakteristische Merkmale von Cdk-Cyclin Paaren veranschaulicht werden (Baumli et al., 2008). Das aktive Zentrum formiert sich zwischen dem N- und C-terminalen Kinaseflügel, wobei die für die Kinaseaktivität essentielle Interaktion zum Cyclin über die N-terminale Domäne von Cdk9 vermittelt wird. Dabei interagiert das Sequenzmotiv PITARLE der Cdk9 mit konservierten Resten der N-terminalen Cyclinbox. Eine zweite für die Cdk9 Aktivierung notwendige Bedingung ist die Phosphorylierung eines Threonins (T186) im Bereich des Aktivierungssegments. Diese Phosphorylierung konnte bislang keiner fremden Kinase zugeschrieben werden, es gibt jedoch Hinweise auf eine Auto-Phosphorylierung der Cdk9 in cis (Baumli et al., 2008). Vergleicht man die P-TEFb Kristallstruktur mit der umfassend untersuchten Struktur des verwandten Cdk2-Cyclin A Komplexes, so fällt eine Rotation des Cyclins um 26 Grad auf. Die Interaktionsfläche zwischen Cdk9 und Cyclin T1 beträgt nur 60% der Interaktionsfläche im Cdk2-Cyclin A Paar. Außerdem fällt auf, dass der phosphorylierte Threoninrest im Aktivierungssegment nicht zur Cdk-Cyclin Interaktion beiträgt. Die Substratbindung einer Proteinkinase beeinflussen neben dem Phosphatgruppenakzeptor besonders die Aminosäuren in Umgebung des Abbildung 3: Kristallstruktur des P-TEFb Komplexes. Cdk9(hellgrün) assoziiert mit Cyclin T1 (braun) und bindet im aktiven Zentrum Mg 2+ und ATP (A+B). Flavopiridol (FP) beeinflusst die Struktur der glycinreichen Schleife (rot, C) (PDB-ID: 3BLQ, 3BLR). 8

18 modifizierten Serins, Threonins oder Tyrosins (Holmes and Solomon, 1996). Die Prolin-gerichtete Cyclin-abhängige Kinase 9 weist dabei eine Substratspezifität für ein SP-Motiv auf, das innerhalb der Y 1 S 2 P 3 T 4 S 5 P 6 S 7 - Heptade der CTD von RNA-Pol II wiederzufinden ist. Neben dem aktiven Zentrum von Cdk9 besteht durch eine spezielle Konformation von Valin 190 eine hydrophobe Tasche auf der Oberfläche, in die nur ein Prolinrest inserieren kann (Baumli et al., 2008). Dieses Merkmal ist auch auf der Oberfläche der Cdk2 vorhanden, wird jedoch durch eine Präferenz für einen basischen Rest im Substratmotiv S/T-P-X-K/R ergänzt (Brown et al., 1999). An der Substraterkennung und spezifität von Cyclin-abhängigen Kinasen wirken auch die jeweiligen Cycline mit. So wurde für das konservierte histidinreiche Segment im zentralen Teil der Cycline T1 und T2 eine Bindung mit der C-terminalen Domäne der RNA-Pol II nachgewiesen (Taube et al., 2002). Dem Cyclin K fehlt dieses Motiv, jedoch kann das Einbringen des histidinreichen Segments von Cyclin T1 (Aminosäuren ) diese Eigenschaft übertragen (Lin et al., 2002). Ein leucinreiches Segment innerhalb von Cyclin T2 soll ebenfalls mit der CTD interagieren (Kurosu et al., 2004). Bei den Zellzyklus regulierenden Cyclinen A und E wurden so genannte Andockstellen (docking sites) in Form einer MRAIL-Sequenz beschrieben, die mit Substraten und zellulären Inhibitoren interagiert welche ein R-X-L-F-G Motiv Abbildung 4: Kristallstruktur des Cdk2-CycA Komplex mit dem Substratpeptid Cdc6* (A). Neben der Interaktion am katalytischen Zentrum (B) erfolgt die Substraterkennung über ein Cyclin A bindendes R-X-L-F-G Motiv (C) (*modifizierte Sequenz, PDB: 2CCH, 2CCI). 9

19 aufweisen (veranschaulicht in Abbildung 4). Eine solche docking site konnte auf der Oberfläche von Cylcin T1 zwar nicht nachgewiesen werden, dennoch stellt eine positiv geladene Struktur auf der Oberfläche von Cyclin T1 eine wichtige Bindungsstelle für Interaktionspartner des P-TEFb Komplexes dar, die besonders im Rahmen der viralen Transkriptionsregulation von Bedeutung ist (Anand et al., 2007) Transkriptionselongation von HIV-1 Das virale Erbgut des HIV-1 wird im Laufe des retroviralen Replikationszyklus in das zelluläre Genom integriert und durch zelluläre Proteine transkribiert. Es kodiert für drei Strukturproteine (gag, pol und env), vier akzessorische Proteine (vif, vpr, vpu und nef) sowie für zwei regulatorische Proteine (tat und rev). Das HIV-1 Genom wird von langen terminalen Wiederholungssegmenten (long terminal repeat, LTR) flankiert (Abbildung 5), wobei die Transkriptionsinitiation im Bereich des 5 LTR stattfindet (Jones and Peterlin, 1994). Vor über zehn Jahren wurde P-TEFb als essentieller Faktor für die Expression des HIV-1 Genoms in vitro und in vivo identifiziert (Wei et al., 1998). Zu den initiationsfördernden DNA-Bereichen in der Promotorregion des HIV-1 5 LTR zählen drei Tandem-Sp1 Bindungsstellen, ein Tata-Element sowie eine hoch aktive Initiationssequenz. (Übersichtsartikel in Karn and Stoltzfus, 2012). Zusätzlich vermittelt eine Enhancer Region mit zwei NF-κB-Bindungsmotiven positiven Einfluss auf die Transkription, an die entweder NF-κB oder NFAT bindet (veranschaulicht in Abbildung 6). Nach erfolgreicher Initiation und CTD Phosphorylierung durch die Cdk7 aus dem TFIIH verlässt der Transkriptionskomplex die Transkriptionsstartstelle. Aus Abbildung 5: Schema des HIV-Genoms. Von zwei long terminal repeats (LTR) flankiert kodiert das HIV-1 Genom für drei Strukturgene, zwei regulatorische Proteine Tat und Rev sowie für akzessorische Proteine (entnommen aus Karn and Stoltzfus, 2012). 10

20 Abbildung 6: HIV-1 Tat vermittelte Transkriptionsaktivierung. Nachdem der frühe Elongationskomplex pausiert wurde, rekrutiert Tat den P-TEFb Komplex an die TAR RNA und vermittelt den Übergang zur effizienten Elongation (entnommen aus Karn and Stoltzfus, 2012). den ersten 59 Nukleotiden des viralen Transkripts entsteht ein mrna- Strukturelement, das so genannte Transaktivierende Antwortelement (transactivation response element, TAR). Dieses bildet eine stabile Haarnadelstruktur, die an der Spitze eine Schleife (loop) aus sechs Nukleotiden und seitlich durch eine Aufwölbung (bulge) aus vier Nukleotiden gekennzeichnet ist. Kurz darauf wird der frühe Elongationskomplex durch die Faktoren DSIF und NELF in den Transkriptionsarrest überführt (Kapitel 1.2.3). Um den Transkriptionsarrest zu überwinden bindet das Transkriptions-transaktivierende Protein (transcriptional transactivator, Tat) das TAR Element und rekrutiert P-TEFb als Elongationsfaktor (Wei et al., 1998). Die Phosphorylierung von NELF- und DSIF-Untereinheiten sowie der CTD von RNA Pol II durch Cdk9 bewirkt den Übergang zum reifen Elongationskomplex. An diesem Komplex sind weitere Elongationsfaktoren wie der ELL-Komplex gebunden. Durch die Rekrutierung von P-TEFb an die Promotorregion des viralen Genoms vermittelt Tat eine Steigerung der Transkriptionsaktivität des viralen Genoms um mehrere Potenzen. Durch die P-TEFb vermittelte CTD-Phosphorylierung entsteht dabei die Grundlage zur korrekten Reifung und Prozessierung der viralen mrna-transkripte (Chao and Price, 2001; Yang et al., 2001). Abbildung 7: Domänenstruktur von Tat. (Tahirov et al., 2010) 11

21 Abbildung 8: Kristallstruktur des Cyclin T1-Tat-TAR Komplexes. Der Cysteinrest 261 (*) gilt als essentieller Baustein für die Interaktion mit viralem Tat Protein (A). Vergrößerungsansicht der Tat-TAR-Cyclin T1 Interaktion (B) (Abbildung nach Anand et al., 2008, PDB: 2W2H). Das TAR bindende Protein Tat besteht aus insgesamt fünf Regionen (Abbildung 7). Die N-terminale Aktivierungsdomäne besteht aus einem sauren, prolinreichen Abschnitt, einem cysteinreichen Abschnitt sowie einem konservierten core Element. Daran schließt sich ein argininreiches Motiv (arginine-rich motif, ARM) an, das aufgrund seiner basischen Reste als RNA- Bindungsdomäne und nukleäres Lokalisationssignal (nuclear localization signal, NLS) fungiert. Den C-Terminus des Tat Proteins bildet eine glutaminreiche Domäne (Jones and Peterlin, 1994). Für die Rekrutierung von P-TEFb zum TAR Element durch das Tat Protein sind zwei Domänen von besonderer Bedeutung (Karn, 1999). Zum einen bindet das argininreiche Motiv (49-57) von Tat die TAR RNA über die uridinreiche Aufwölbung, zum anderen interagiert die Aktivierungsdomäne von Tat mit einer Zielregion von Cyclin T1, dem Tat-TAR Erkennungsmotiv (Tat-TAR recognition motif, TRM). Innerhalb des TRM von Cyclin T1 ist ein Cysteinrest (C261) für die Ausbildung des intermolekularen Zink-Fingers zwischen Tat und Cyclin T1 essentiell (Garber et al., 1998). Ohne diesen Cysteinrest kommt es zu keiner stabilen Assemblierung von Tat und P-TEFb, sodass murines Cyclin T1, dem dieser Rest fehlt, nicht zu einer Tat-vermittelten Transkriptionsaktivierung befähigt ist. Daher können Mäuse nicht suffizient mit HIV infiziert werden. Strukturelle Einblicke in die Interaktion zwischen Tat, TAR und Cyclin T1 erlaubt die in Abbildung 8 dargestellte Kristallstruktur der HIV-1 Homologen Tat und TAR vom EIAV (equine infectious anemia virus) im Komplex mit einer Cyclinbox 12

22 von equinem Cyclin T1 (Anand et al., 2008). Das dem HIV-1 verwandte Retrovirus vom Pferd nutzt ebenfalls die Tat-TAR Interaktion um über die Rekrutierung von P-TEFb die Transkriptionsrate zu steigern (Leroux et al., 2004). Die große Furche des TAR RNA Elements wird durch das α-helikal organisierte ARM von Tat gebunden (Abbildung 8). Wechselwirkungen zwischen Cyclin T1 und Tat bestehen zwischen dem TRM und der Aktivationsdomäne von Tat sowie zwischen C-terminal des ARM gelegenen Resten und einer Schleife zwischen den Helices H4 und H5, die für T-Typ Cyclin Proteine charakteristisch ist (Anand et al., 2007). Anhand dieser Kristallstruktur lässt sich begründen, weshalb die Acetylierung des Tat Proteins an dem Lysinrest (K50) die Interaktion zum TAR-Element destabilisiert (Kaehlcke et al., 2003). Dieser Lysinrest ist dem Rückgrat der TAR-Schleife zugewandt und geht ionische Wechselwirkungen mit Phosphatgruppen ein, die durch eine Acetylierung unterbrochen würden. Mittlerweile sind weitere kovalente Modifizierungen von Tat bekannt, die aktivierenden oder inhibierenden Einfluss auf die P-TEFb Interaktion ausüben (Ott et al., 2011) Regulation der Kinaseaktivität von P-TEFb Der P-TEFb Pool eukaryotischer Zellen wird hauptsächlich von zwei unterschiedlich großen Formen gebildet, einem kleineren aktiven Komplex der mit Chromatin-modulierenden Proteinen interagiert und einem größeren, inaktiven P-TEFb Komplex (Abbildung 9). Abbildung 9: Interaktionspartner des inaktiven und aktiven P-TEFb Pools. 13

23 Bestandteile des inaktiven Pools Das Grundgerüst des inaktiven P-TEFb Pools wird durch eine 331 nt umfassende 7SK kleine nukleäre RNA (small nuclear RNA, snrna) gebildet, die von der RNA-Pol III transkribiert wird. Zum Schutz vor Degradation wird das 5 Ende der 7SK snrna durch das 7SK Methyl-Phosphat-Capping Enzym (methyl-phosphate capping enzyme, MPCE) methyliert, während das dem Lupus Antigen verwandte Protein 7 (lupus antigen related peptid 7, Larp7) das Uridin-reiche Segment am 3 Ende der 7SK snrna schützt (zusammengefasst in Diribarne and Bensaude, 2009). Beide 7SK snrna interagierende Proteine, MPCE und Larp7, sollen an 7SK snrna assoziiert bleiben und Bestandteile des großen inaktivierten Komplexes bilden (Barboric et al., 2009; Jeronimo et al., 2007). Im inaktiven Pool ist die Inhibition der P-TEFb Aktivität dem 42kDa großen Protein Hexim1 zuzuschreiben, das erstmals als Hexamethylen Bisacetamid (HMBA) induzierbares Protein in humanen glatten Muskelzellen identifiziert wurde, jedoch auch in weiteren Zelltypen existiert (Ouchida et al., 2003; Yik et al., 2005). Die Induktion dieses dimeren Proteins gleicht dem Effekt des Cdk9- Inhibitors DRB, der in einer verminderten Transkriptionsrate sowie einer vermehrten Freisetzung von unreifen, kurzen mrna Fragmenten besteht (Michels et al., 2004). Die in Abbildung 10 dargestellte Domänenstruktur der Hexim Protein schlägt eine Einteilung in fünf Regionen vor (Czudnochowski et al., 2010), wovon mindestens drei von essentieller Bedeutung für die Funktion im inaktiven P-TEFb Pool sind. Das nukleäre Lokalisationssignal (nuclear localization signal, NLS) aus basischen Resten interagiert mit der nukleären Transportmaschinerie und bindet über ein argininreiches Motiv (arginine-rich motiv, RRM) die 7SK snrna, während das negativ geladene Cluster von Hexim die Inhibition von P-TEFb bewirken soll (Michels et al., 2003; Yik et al., 2003). Die C-terminale Domäne von Hexim wird aufgrund einer Affinität zum Cyclin T Protein auch als Cyclin T bindende Domäne (cyclin T1 binding domain, TBD) bezeichnet (Dulac et al., 2005; Li et al., 2005; Yik et al., 2005). Die TBD von Hexim1 vermittelt die Dimerisierung und konnte als coiled-coil Struktur in unserer Arbeitsgruppe identifiziert werden (Dames et al., 2007). 14

24 Abbildung 10: Pentamere Domänenstruktur humaner Hexim-Proteine.. Die Cyclin T Bindungsdomäne bildet den C-Terminus der Hexim-Proteine (entnommen aus Czudnochowski et al., 2010). Der im Rahmen der Promotionsarbeit von Nadine Czudnochowski untersuchte Inhibitionsmechanismus von Hexim1 legt eine zweifache Interaktion zum P-TEFb Komplex nahe. Für die Inhibition von P-TEFb sind sowohl die Cyclin T1 bindende Domäne (TBD) als auch das N-terminal davon gelegene konservierte Motiv P-Y-N-T ( ) notwendig. Mutationen innerhalb dieses Motivs reduzieren die Inhibition des P-TEFb Komplexes deutlich (Michels et al., 2004). Ein dualer Interaktionsmechanismus zwischen Inhibitor und Cdk-Cyclin Paar ist auch für den Cdk2-CycA Komplex beschrieben. Der zelluläre Cdk2 Inhibitor p27 Kip1 bindet über ein R-X-L Motiv das Cyclin A und interagiert C-terminal über eine Helix mit dem aktiven Zentrum von Cdk2 (Russo et al., 1996). Dort nimmt ein konservierter Tyrosinrest den Platz eines ATP-Moleküls ein. Im P-Y-N-T Motiv von Hexim ist ebenfalls ein Tyrosin vorhanden, jedoch scheint der Threoninrest zur Inhibition beizutragen, wie Ergebnisse der Dissertation von Nadine Czudnochowski belegen. Neben dem Hexim1 Protein existiert eine als Hexim2 bezeichnete homologe Variante aus 286 statt 343 Aminosäuren. Dieses weist von der Arginin-reichen Sequenz im NLS bis zur C-terminalen TBD annähernd 50% Sequenzidentität mit Hexim1 auf (Byers et al., 2005; Yik et al., 2005). Trotz verschiedener Expressionsmuster in unterschiedlichen Geweben können die Hexim Proteine die zelluläre Aktivität des jeweiligen Homologen kompensieren. Dabei scheint der unterschiedlich große N-terminale Teil regulatorische Funktion zu übernehmen, der C-terminale Teil die Inhibition des P-TEFb Komplexes zu vermitteln. 15

25 Der aktive P-TEFb Pool Studien von biologisch aktiven P-TEFb Komplexen zeigen, dass diese mit dem Bromodomänen protein 4 (bromodomain protein 4, Brd4) assoziiert vorliegen (Jang et al., 2005; Yang et al., 2005). Brd4 ist ein 200 kda großes Protein der konservierten BET Familie, die durch zwei Tandem-Bromodomänen und eine extra terminale Domäne gekennzeichnet sind (Dey et al., 2000; Jeanmougin et al., 1997). Die Bromodomäne wird als funktionelle Einheit angesehen, welche über Interaktionen mit modifizierten Histonproteinen dazu dient, den Histon Code zu entschlüsseln. Dabei weist Brd4 eine Affinität zu den acetylierten Histonen H3 und H4 auf, die typischerweise Bereiche von aktiv transkribierten Regionen kennzeichnen (Dey et al., 2003). Durch eine stabile Assoziation von Brd4 mit Chromatinstrukturen auch während der Mitose könnte Brd4 an der Übermittlung epigenetischer Information beteiligt sein (Dey et al., 2003). Über die Interaktion mit P-TEFb stellt Brd4 einen Bestandteil des Mediatorkomplexes dar, welcher direkten Einfluss der Chromatinstruktur auf die Transkriptionsaktivität eines Gens vermittelt (Wang et al., 2012). Die Interaktion zwischen Brd4 Protein und dem P-TEFb Komplex läuft über die konservierte C-terminale Domäne von Brd4 ab (Bisgrove et al., 2007). Im Unterschied zum viralen Protein Tat welches über die Cyclinbox von Cyclin T1 interagiert bindet die C-terminale Domäne von Brd4 vermutlich Cdk9, da eine Assoziation mit der Cyclinbox von Cyclin T1 nicht nachgewiesen werden konnte (Vollmuth, 2010). Das Gleichgewicht von P-TEFb zwischen inaktivem und aktivem Pool ist für die Kontrolle von Zellwachstum und Zelldifferenzierung essentiell (He et al., 2006; Zhou and Yik, 2006). An der Freisetzung von P-TEFb aus dem 7SK RNP sind posttranslationale Modifikationen der Bestandteile des inaktiven Komplex beteiligt (Schroder et al., 2012 und dortige Referenzen). Die Acetylierung von Cyclin T1 durch die Histonacetyltransferase p300 erfolgt an bis zu vier Lysinresten in der zentralen Coil-Coil-Region. Dies erhöht die Bindungsaffinität für Brd4 und könnte zur Dissoziation von P-TEFb aus dem inaktiven P-TEFb Pool beitragen (Cho et al., 2009). 16

26 P-TEFb Inhibition auf anderen Wegen Während bei der Cdk9 Inhibition durch Hexim Protein ein P-Y-N-T Motiv eine Rolle spielt, verwenden Keimbahnproteine aus der Fruchtfliege Drosophila und dem Fadenwurm Caenorhabditis elegans einen anderen Mechanismus, um den P-TEFb äquivalenten Komplex zu inhibieren. Keimbahnzellen schützen ihre Fähigkeit zu jedem Zelltyp zu differenzieren, indem die Transkription von Differenzierung fördernder Gene durch einen Elongationsarrest verhindert wird. Diese Transkriptionsblockade ist in Drosophila und Caenorhabditis elegans durch das Fehlen von S 2 -phosphorylierten CTD-Heptaden der RNA-Pol II gekennzeichnet, einem Elongation fördernden Signal im Transkriptionszyklus. Die P-TEFb vermittelte Phosphorylierung von S 2 Resten wird in Drosophila durch das polar granule component (Pgc) Protein und in Caenorhabditis elegans durch das PIE-1 Protein gehemmt (Hanyu-Nakamura et al., 2008; Zhang et al., 2003). Beide Proteine interagieren mit Cdk9 und Cyclin T, weisen jedoch keine sequenzielle Ähnlichkeit auf. Für das Protein PIE-1 des Fadenwurms wurden eine Cyclin T bindende Domäne sowie ein CTD ähnliches Heptadmotiv beschrieben, welche für Inhibition von P-TEFb notwendig sind (Ghosh and Seydoux, 2008). Die Cyclin bindende Domäne liegt dabei 25 Aminosäuren vom Kinase inhibierenden Heptadmotiv entfernt (Abbildung 11). Im Vergleich dazu bilden 19 Aminosäuren den Abstand zwischen Erkennungsmotiv und Phosphatakzeptor für den Cdk2-CycA Komplex, wie die Kristallstruktur eines modifizierten Substratproteins Cdc6 im Komplex mit Cdk2-CycA veranschaulicht (Cheng et al., 2006). In diesem Kontext scheint der Abstand zwischen aktivem Zentrum der Cdk und der Cyclinregion, welche mit Bindungspartnern interagiert, zwischen den Kinasen Cdk2 und Cdk9 vergleichbar zu sein. Der Inhibitionsmechanismus des PIE-1 Proteins unterscheidet sich grundlegend von dem des Hexim Proteins. Während das Hexim Protein durch einen Tyrosin- Rest ATP-Moleküle aus der Bindungstasche verdrängen soll, wirkt das PIE-1 Protein über ein substratähnliches Heptadmotiv inhibierend. Die Inhibition der Cdk9 durch das PIE-1 Protein wird auf einen Alanin-Rest im Heptadmotiv der Sequenz YAPMAPT zurückgeführt, der die Position des in P-TEFb Substraten 17

27 Abbildung 11: Domänenstruktur von PIE-1 und Cdc6. Der Abstand zwischen Cyclin bindender Domäne und Cdk interagierender Domäne beträgt im PIE-1 Protein 25 AS (A), beim Cdk2 Substrat Cdc6 sind es 19 AS (B). phosphorylierten S 2 Restes einnimmt. Daher scheint eine Serin-zu-Alanin- Mutation innerhalb einer an P-TEFb gebundenen Heptadsequenz inhibierenden Einfluss auf die P-TEFb Aktivität vermitteln zu können Folgen fehlregulierter P-TEFb Aktivität Die physiologische Bedeutung von P-TEFb als generellen Transkriptionsfaktor verdeutlicht die Tatsache, dass eine medikamentöse Inhibition von P-TEFb durch Flavopiridol die Produktion von reifer mrna um bis zu 70% reduziert (Chao and Price, 2001). Aus medizinischer Sicht spielt die Kinaseaktivität des P-TEFb Komplexes neben HIV-1 auch bei Erkrankungen wie kardialer Muskelzellhypertrophie, Brustkrebs und speziellen Leukämieformen eine wichtige Rolle (Kohoutek, 2009). Im Zuge einer chronischen Belastung oder bei biomechanischem Stress reagieren kardiale Myozyten mit einer Hypertrophie, die von einer Zunahme des Zellvolumens, erhöhter Proteinbiosynthese sowie Reaktivierung fetaler Genprogramme gekennzeichnet ist. Solche Hypertrophie fördernde Reize können über eine gesteigerte Aktivierung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren vermittelt werden (Sano et al., 2002). Insgesamt führen diese Signale zu einer Rekrutierung von P-TEFb Komplexen aus dem inaktiven 7SK RNP, sodass pausierte Komplexe von RNA-Pol II vermehrt in reife Elongationskomplexe überführt werden. Das führt zu einer überproportional gesteigerten mrna- und Proteinbiosynthese und Hypertrophie der Kardiomyozyten. Der wichtigste zelluläre P-TEFb Inhibitor Hexim wurde erstmals als Tumorantigen im serösen Ovarialkarzinom entdeckt, ohne dass die molekularbiologische Funktion von Hexim Proteinen bekannt war (Stone et al., 2003). Noch im gleichen Jahr wurden Hexim Proteine als Bindungspartner des 18

28 Östrogenrezeptors α (estrogen receptor α, ER α) beschrieben, der bei Brusttumoren pathophysiologische und pharmakologische Relevanz besitzt (Wittmann et al., 2003). In Zellen von invasiv wachsendem Brustkrebs wurde eine verminderte Expression von Hexim Proteinen nachgewiesen. Gleichzeitig konnte durch eine Überexpression von Hexim ein antiproliferativer Effekt auf Brustkrebszellen erzielt werden (Wittmann et al., 2005). Damit zeigt die Stimulation der Heximexpression ähnliche Effekte wie die seit Jahren angewandte Gabe von Östrogenrezeptorantagonisten (Dey et al., 2007). Auch bei Leukämien der Mixed-lineage Leukämie (MLL) Reihe, die besonders aggressive Formen der akuten Leukämie verursachen, wurde eine Assoziation zum P-TEFb Komplex entdeckt (Hess, 2004; Slany, 2005). Pathophysiologisch liegt dieser Leukämieform eine chromosomale Translokation der Histon- Methyltransferase MLL zu Grunde, die physiologisch einen Bestandteil eines Chromatin modulierenden Komplexes bildet. Durch die Translokation entstehen Fusionskonstrukte mit dem Eleven nineteen Leukemia Gen oder dem Gen für das AF4 Protein. Die entstandenen Proteine assoziieren mit P-TEFb und rekrutieren P-TEFb zum Chromatin beeinflussenden Komplex (Bitoun et al., 2007; Mueller et al., 2007). Ein Apoptose fördernder Effekt des P-TEFb Inhibitors Flavopiridol konnte bereits für Zellen der chronisch lymphatischen Leukämie (chronic lymphocytic leukemia, CLL) nachgewiesen werden (Chen et al., 2005). Als therapeutische Option bei fortgeschrittenen Sarkomen wird Flavopiridol bereits in frühen Phasen klinischer Studien angewendet (Luke et al., 2012). Dass aktiv transkribierende Gene durch eine Assoziation mit Brd4 gekennzeichnet sind spielt in der Transkriptionsregulation des Protoonkogens Myc eine bedeutende Rolle (Zuber et al., 2011). Durch den vor kurzem entdeckten Brd4 Inhibitor JQ1 konnte in aggressiv wachsenden Tumorzellen ein Wachstumsstopp sowie eine Differenzierung der Zellen erreicht werden. Im Mausmodell erzielte die Substanz eine Reduktion der Tumormasse und eine Verlängerung des Überlebens. Neben einer potentiellen Anwendung als Chemotherapeutikum gegen Tumoren werden Brd4 Inhibitoren neuerdings auch als antiinflammatorische Therapieoption diskutiert (Filippakopoulos et al., 2010; Muller et al., 2011). 19

29 Die Rekrutierung von P-TEFb Komplexen aus dem 7SK RNP ermöglicht maligne entarteten Zellen die Transkriptionsrate gezielt zu steigern. Dabei betreffen einige beobachtete Veränderungen Bestandteile des 7SK RNP selbst. Das 7SK RNA stabilisierende Protein Larp7 wird in drei Domänen, das N-terminale Lupus Antigen Motiv, das RNA-Erkennungsmotiv sowie eine C-terminale Domäne, eingeteilt (Barboric et al., 2009; Krueger et al., 2008). In Tumorzellen wurden vermehrt Deletionen der C-terminalen Domäne von Larp7 beschrieben, die zu einer Destabilisierung des 7SK RNP und somit zu einer erhöhten Verfügbarkeit von P-TEFb Komplexen führen. Weiterhin scheint die Stabilität des 7SK RNP für die Differenzierung von Epithelzellen der Brustdrüse von Bedeutung zu sein, da eine RNA-Interferenz vermittelte Minderexpression von Larp7 zu einer Entdifferenzierung führt (He et al., 2008). Nicht zuletzt wurde das Expressionslevel von Larp7 Protein als prognostischer Marker bei Gebärmutterhalskrebs vorgeschlagen, da eine Minderexpression mit einer erhöhten Inzidenz von Lymphknotenmetastasen einhergeht (Biewenga et al., 2008). Somit steht die Integrität des 7SK RNP beziehungsweise die Verfügbarkeit von P-TEFb Aktivität im direkten Zusammenhang mit infektiösen (HIV), benignen (kardiale Hypertrophie) sowie malignen (Tumoren) Prozessen. Für neue Therapieoptionen dieser Erkrankungen ist daher die Suche nach neuen, potenten Inhibitoren der Cdk9 erstrebenswert Idee eines Fluoreszenz-basierten Kinaseassays Ein Kinaseassay auf Basis der FRET-Technologie (Fluoreszenz-Resonanz- Energietransfer) ermöglicht das Hochdurchsatz-Screening, ein Verfahren bei dem in kurzer Zeit zahlreiche chemische Moleküle auf deren Einfluss auf die enzymatische Aktivität eines Proteins hin getestet werden. Da die pathophysiologische Relevanz des P-TEFb Komplexes aufgrund neuer Forschungserkenntnisse weiter zunimmt, werden Screening-Verfahren für pharmakologische Inhibitoren der Cdk9 Kinase zunehmend attraktiver (Wang and Fischer, 2008). Im Vergleich zu dem bislang in unserer Arbeitsgruppe etablierten radioaktiven Filterbadassay weist ein Fluoreszenz-basierter Kinaseassay deutliche Vorteile 20

30 auf. Es entfallen sowohl die erhöhten Sicherheitsrisiken bei der Arbeit mit radioaktivem Material als auch die Produktion von radioaktivem Abfall. Im Gegensatz zum kurzlebigen Isotop 32 P werden für einen solchen Assay stabile Fluoreszenzmoleküle verwendet, die eine deutlich längere Halbwertszeit als das radioaktive 32 P besitzen. Fluoreszenzmoleküle können unkompliziert gelagert werden und sind besser verfügbar, sodass innerhalb von kurzer Zeit Messungen zur Kinaseaktivität durchgeführt werden können, ohne dass radioaktives Material mit einer Lieferzeit von mehreren Tagen bestellt werden muss. Die Idee für einen Fluoreszenz-basierten Kinaseassay des P-TEFb Komplexes entstand im Rahmen der Diplomarbeit von Jana Fiedler, deren Projekt von Caroline Egele und mir fortgeführt wurde. 21

31 2. Zielsetzung Der Einfluss auf die Kinaseaktivität von P-TEFb von zellulären Interaktionspartnern wie dem zellulären Inhibitor Hexim oder dem Aktivator Brd4 ist in unserer Arbeitsgruppe bislang mit einem radioaktiven Filterbindungsansatz untersucht worden. Ein Teilprojekt dieser Arbeit verfolgt das Ziel einen Reporterassay zur P-TEFb Kinaseaktivität auf Basis der TR-FRET Technologie zu entwickeln, der Antikörper gebundene langlebige Fluorophore anstelle von radioaktivem ATP nutzt. An der Inhibition der P-TEFb Aktivität durch Hexim1 sind zwei Regionen des zellulären Inhibitors beteiligt, die synergistisch mit Kinase- und Cyclinuntereinheit interagieren (Czudnochowski et al., 2012). Das verwandte Cdk2-CycA Paar interagiert ebenfalls dual mit dem zellulären Inhibitor p27 Kip1 und Substraten wie Cdc6 (Brown et al., 1999). In Analogie zu diesem dualen Interaktionsmechanismus sollen im Rahmen dieser Arbeit Fusionskonstrukte hergestellt werden, die über eine Cyclin T1 bindende Domäne mit P-TEFb assoziieren und über eine weitere Domäne negativen Einfluss auf die Cdk9 Aktivität vermitteln. Die Bindung des Fusionskonstrukts an Cyclin T1 soll über Teile des Proteins Tat von HIV-1 erfolgen. Der Einfluss auf die Kinaseaktivität von Cdk9 soll anschließend mit einem radioaktiven Kinaseassay untersucht werden. Ein Fusionskonstrukt mit negativem Einfluss auf die P-TEFb Aktivität könnte als Kosubstrat in kristallographischen Studien eingesetzt werden oder auf einen Einfluss auf die Tat vermittelte Transkriptionsaktivierung hin untersucht werden. 22

32 3. Material und Methoden 3.1. Material Chemikalien In dieser Studie wurden Chemikalien von folgenden Firmen verwendet: AppliChem, Darmstadt Boehringer, Mannheim Fluka, Neu-Ulm Gerbu, Gaiberg GE-Healthcare, Freiburg J.T. Baker, Deventer, Niederlande Merck, Darmstadt Roth, Karlsruhe Serva, Heidelberg Sigma-Aldrich, Steinheim Verbrauchsmaterialien Dialyseschläuche Elektroporationsküvetten Ultrafiltrationseinheiten Whatman P81 Zellulosepapier Roth, Karlsruhe Invitrogen, Karlsruhe Millipore Amicon, Witten Omnilab Bremen Chromatographiematerialien Säulenmaterialien GSH 4 Fast Flow Säulen Hi Load 16/10 SP Sepharose HP Superdex 75 10/300 Superdex /300 GE Healthcare, Freiburg GE Healthcare, Freiburg GE Healthcare, Freiburg GE Healthcare, Freiburg Fluoreszenzfarbstoffe Streptavidin-Kryptat Zenon Mouse IgG Labeling Kit Cisbio Bioassays, Bagnols-sur-Cèze, Frankreich Invitrogen, Karlsruhe 23

33 Nukleotide ATP, 100 mm Stammlösung [γ- 32 P]-ATP, 5 µci/µl, 3000 mci/mmol GE Healthcare, Freiburg Perkin Elmer, Boston, MA, USA Reagenziensätze QIAprep Plasmid Miniprep Kit QIAprep Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden Qiagen, Hilden DNA-Konstrukte Marker DNA LMW-Marker Primer Vektor pgex-4t1 TEV-side modifiziert Invitrogen, Karlsruhe MWG Biotech, München GE Healthcare, Freiburg Enzyme, Proteine und Antikörper Enzyme Expand High Fidelity PCR System Polymerase Restriktionsendonukleasen T4-DNA Ligase TEV-Protease Roche, Mannheim New England Biolabs, Schwalbach MPI Dortmund Roche Mannheim Peptide Biotin-YSPTSPS Biotin-PSYSPTSPS Biotin-PTSPSYSPTSPS MPI Dortmund MPI Dortmund MPI Dortmund Proteinstandard für SDS-PAGE GE Healthcare, Freiburg Da (Phosphorylase b), Da (Albumin), Da (Ovalbumin), Da (Carbonische Anhydrase), Da (Trypsininhibitor), Da (α-lactalbumin) Antikörper RNA Polymerase II 8WG16 Monoklonaler Antikörper Covance, Emeryville, CA, USA 24

34 Mikroorganismen E.coli Stamm Genotyp BL21 (DE3) F- ompt hsds (r B -m B -) dcm gal (DE3) BL21 (DE3) RIL F- ompt hsds(r B -m B -) dcm Tet r gal λ (DE3) enda Hte [argu iley leuw Cam r ] BL21 (DE3) RP F- ompt hsds(r B -m B -) dcm Tet r gal λ (DE3) enda Hte [argu prol Cam r ] Top10 F-mcrA (mrr-hsdrms-mcrbc) Ф80lacZ M15 lacx74 reca1 arad139 (ara leu) 7697 galu galk rpsl (StrR) enda1 nupg Materialien für die prokaryotische Zellbiologie Antibiotikum: 100 mg/l Ampicillin Serva, Heidelberg LB-Medium: 10 g/l Pepton(140)-Hydrolysat, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl, ph 7, Laborgeräte Autoklav Varioklav Brutschrank Heraeus CO 2 Auto zero ESI-Massenspektrometer: LCQ Finnigan advantage MAX mit Agilent 1100 HPLC-System FluoroMax-3 Spectrofluorometer FPLC Äkta prime Gefriergerät (-80 C) Hereaus Herafreeze Heizschüttler Eppendorf Thermomixer Kühlzentrifuge Eppendorf 5810R Magnetrührer MR 2000 Microfluidizer M-110S Mikrokalorimeter VP-ITC und itc200 PCR-Maschine PCR-Sprint Photometer Eppendorf Biophotometer Schüttelinkubator SDS-PAGE Gelkammer Mini- Protean III H+P Labortechnik, Oberschleissheim Hereaus, Hanau Thermo Fisher, Waltham, MA, USA Agilent, Santa Clara, CA, USA Jobin Yvon Inc., Edison, NJ, USA GE Healthcare, Freiburg Hereaus, Hanau Eppendorf, Wesseling-Berzdorf Eppendorf, Wesseling-Berzdorf Heidolph, Schwabach Microfluidics Corp., Newton, UK Microcal, Northampton, UK ThermoHybaid, Ulm Eppendorf, Wesseling-Berzdorf Brunswick, Nürtingen Bio-Rad, München 25

35 Tecan Safire 2 Fluoreszenz-, Absorptions- und Lumineszenz- Detektor Ultraschallbad Sonorex Super RK 103H Ultraschallgerät Branson Sonifier W-250 Vortexter Vortex Genie 2 Voyager-DE pro MALDI Massenspektrometer Waage Sartorius BP110S Zentrifuge J2-HS MTX Lab Systems, Vienna, VI, USA Bandelin electronic, Berlin Branson, Danbury, CT, USA Bender & Hobein, Bruchsal Perseptive Biosystems, Weiterstadt Sartorius, Göttingen Beckmann, Fullerton, CA, USA 26

36 3.2. Molekularbiologische Methoden Polymerasekettenreaktion Die Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) dient zur Amplifikation einer spezifischen Nukleinsäuresequenz innerhalb eines DNA- Abschnitts und besteht aus vielen Wiederholungen eines Zyklus, der von drei Reaktionsschritten gebildet wird. Im ersten Reaktionsschritt werden die DNA- Doppelstränge durch Erhitzen in DNA-Einzelstränge getrennt (denaturation), an die sich im nächsten Reaktionsschritt die Primer anlagern (annealing). Eine thermostabile DNA-Polymerase synthetisiert daraufhin im dritten Reaktionsschritt, ausgehend von den 3'Hydroxylenden der Primer, die komplementäre DNA-Sequenz (elongation). Durch die Verwendung von mehreren synthetischen Primern mit einer komplementären Sequenz von 15 bis 20 nt können vollständig neue DNA-Konstrukte hergestellt werden. Mit den flankierenden Primern wird anschließend das Gesamtfragment amplifiziert. Tabelle 1: Pipettierschema für einen PCR-Ansatz Konzentration Volumen (µl) DNA-Matrize 100 ng/µl 1 dntp 2,5 mm 4 Primer (sense) 10 pmol/µl 1 Primer (antisense) 10 pmol/µl 1 Polymerasepuffer 10x 5 Polymerase 5000 U/ml 0,5 ddh 2 O 37,5 Die Denaturierung der DNA-Stränge erfolgte bei 96 C initial für 3 min, in den PCR-Zyklen für jeweils 15 s. Die Hybridisierung der Primer an die DNA fand bei 58 C für 30 s statt, woraufhin die Primerverlängeru ng bei 72 C für 60 s katalysiert wurde. Eine PCR umfasste dabei insgesamt 25 Zyklen. 27

37 Agarosegelelektrophorese Zur Größenanalyse und Präparation können DNA-Fragmente mittels einer Agarosegelelektrophorese ihrer Größe nach aufgetrennt werden. Die negativ geladene DNA bewegt sich im elektrischen Feld zur Anode, wobei kleinere Fragmente schneller durch die Agarosematrix wandern als größere DNA- Fragmente. Für die Elektrophorese wurden Gele mit einem Anteil von 1-2% (w/v) Agarose hergestellt und die Gelproben mit 1/6 Volumen Probenpuffer sowie einem DNA- Größenstandard (1kb DNA-Leiter, Invitrogen) aufgetragen. Anschließend wurde eine konstante Spannung von 110V angelegt. Sowohl die Gele als auch der TBE-Laufpuffer beinhalteten Ethidiumbromid, das in die DNA interkaliert und unter UV-Licht die DNA sichtbar macht. TBE-Puffer: Probenpuffer (6x): 89 mm Tris ph 8,9 10% (w/v) Ficoll 89 mm Borsäure 0,025% (w/v) Bromphenolblau 0,9 mm EDTA 0,025% (w/v) Xylencyanol In TBE-Puffer Restriktionsverdau Um die Template-DNA für ein bestimmtes Proteinkonstrukt in einen Expressionsvektor zu ligieren, wurden die Enden der DNA-Fragmente mit Restriktionsenzymen behandelt. Restriktionsendonukleasen erkennen und schneiden doppelsträngige DNA an spezifischen, meist palindromischen DNA- Sequenzen. Der Restriktionsverdau wurde unter anderem zur Erfolgskontrolle der Ligation des Expressionsvektors angewendet. Zur Durchführung wurden die vom Hersteller angegebenen Puffer- und Temperaturbedingungen eingehalten Extraktion der DNA-Fragmente aus Agarosegelen Die Isolierung von DNA-Fragmenten aus einem Agarosegel erfolgte unter Verwendung eines Qiagen Gelextraktionskits gemäß dem Herstellerprotokoll. 28

38 Ligation Die gereinigten DNA-Fragmente aus dem Restriktionsverdau können mit dem Enzym Ligase in einen Vektor ligiert werden. Dabei verknüpft die Ligase die freien 3 -Hydroxylgruppen mit den 5 -Phosphatgruppen zwischen Vektor und DNA-Fragment. Der Reaktionsansatz wurde für mindestens 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Tabelle 2: Pipettierschema für einen Ligationsansatz Volumen (µl) Geschnittener Vektor 1 Geschnittenes DNA-Fragment 6 10x Ligationspuffer 2 T4-DNA-Ligase 0,5 H 2 O Transformation Die Transformation dient dem Einbringen von ringförmiger Doppelstrang-DNA in E.coli Bakterienzellen zur Vervielfältigung oder Expression. Dabei steht sowohl die Hitze- als auch die Elektroschock-Transformation als Methode zur Auswahl. Für eine Hitzetransformation werden 2 g Bakterienzellen langsam aufgetaut und mit ~30 ng Plasmid-DNA für 30 min auf Eis inkubiert. Dazu werden kompetente Zellen verwendet, deren Zellwand durch DMSO permeabel gemacht worden ist. Die Aufnahme des Plasmids wird durch einen 45 s andauernden Hitzeschock von 45 C gefördert. Anschließend werden die E.coli-Zellen auf ampicillinhaltigen LB-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 37 C inkubiert. Bakterien, die das Plasmid aufgenommen haben, werden durch das Resistenzgen für Ampicillin auf dem Vektor selektioniert. Bei der Elektrotransformation werden kompetente Bakterienzellen und Plasmid- DNA gemischt und in eine Elektroporationskammer überführt. Durch einen kurzen Stromstoß von 1,5 kv (25 µf) werden die Membranen permeabilisiert und das Plasmid kann in die Bakterien gelangen. Sofort nach dem 29

39 Elektroschock werden die Bakterien in ca. 2 ml LB-Medium aufgenommen und für 30 min bei 37 C angezüchtet, bevor sie auf ampi cillinhaltigen LB-Agar- Platten ausgestrichen und über Nacht bei 37 C inkub iert werden Gewinnung und Isolierung der Plasmid-DNA Um quantifizierbare Mengen von Plasmiden zu gewinnen werden Bakterienkolonien von Ampicillin-haltigen LB-Agar-Platten gepickt und in 3 ml LB-Medium mit Ampicillin angeimpft. Wenn die Kultur bei 37 C und 140 rpm eine OD 600 von 2 erreicht hat, werden 2 ml Bakteriensuspension abzentrifugiert und zur Plasmidextraktion genutzt. Unter Verwendung des Qiagen Miniprep Kits wurde das gewünschte Plasmid aus den Bakterien isoliert. Das Verfahren beruht auf der alkalischen Lyse der Bakterienzellen und Fällung der Proteine mittels Natrium-Dodecylsulfat (sodium-dodecylsulfat, SDS). Anschließend wird durch eine Ionenaustauschchromatographie an einer Silicamembran die Plasmid-DNA gereinigt und mit H 2 O eluiert. Die Lagerung der Plasmid-DNA erfolgte bei -20 C DNA-Sequenzierung Zur Sequenzanalyse der konstruierten Plasmide wurden Sequenzierungs-PCRs nach dem Prinzip der Kettenabbruchmethode von Sanger durchgeführt. Durch die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleotiden (ddntp) entstehen in einer PCR unterschiedlich lange DNA-Fragmente, deren Gesamtsequenz über eine Kapillargelelektrophorese und anschließende Fluoreszenzdetektion bestimmt werden kann. Für die Sequenzierungs-PCR wurde ein Big-Dye Terminator Sequencing Kit verwendet, dessen Terminator Mix die AmpliTaq-DNA-Polymerase und die vier fluroeszenzmarkierte ddntps enthält. Folgend sind ein Reaktionsansatz sowie die PCR-Parameter dargestellt. 30

40 Tabelle 3: Ansatz für die Sequenzierungs-PCR Volumen (µl) Terminator Mix 4 Miniprep-DNA 2 Sequenzierungspuffer 2 Sequenzierungsprimer 1 H 2 O 11 Tabelle 4: Parameter der Sequenzierungs-PCR Temperatur Zeit Denaturierung 96 C 10 s Hybridisierung 58 C 5 s Elongation 60 C 240 s Im Anschluss an die PCR wurden die Reaktionsprodukte mit Ethanol gefällt und nach einem Waschschritt mit 70%igem Ethanol getrocknet. Die Analyse mittels Kapillargelelektrophorese und Fluoreszenzmessung erfolgte in der zentralen Einrichtung für Biotechnologie am MPI-Dortmund Glycerindauerkulturen Glycerindauerkulturen bieten die Möglichkeit transformierte Bakterien dauerhaft zu lagern. Transformierte Bakterien werden in ampicillinhaltigem LB-Medium bei 37 C bis zu einer OD 600 von 0,8 angezüchtet µl dieser Kultur werden mit 800 µl 50% (v/v) Glycerol gemischt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 C gelagert Proteinchemische Methoden Proteinexpression und Zellernte Zur Proteinexpression wurden BL21(DE3) Zellen und BL21(DE3)RP Zellen verwendet. Für die Vorkultur wurden 100 ml LB-Medium mit entsprechendem Antibiotikum aus einer Glycerindauerkultur angeimpft und über Nacht bei 37 C 31

41 und 180 rpm inkubiert. Die Hauptkultur aus 2 l ampicillinhaltigem LB-Medium in 5 l Glaskolben wurde mit der Vorkultur vom Vortag zu einer OD 600 von 0, inokuliert. Unter ständigem Schütteln mit 180 rpm wurden die Kulturen bei 30 C bis zu einer OD 600 von 0.4 herangezogen und bis zur Induktion auf die Expressionstemperatur von 20 C abgekühlt. Die Induk tion wurde ab einer OD 600 von 0,6-0,8 durch Zugabe von 0.1-0,5 mm IPTG (Isopropyl-1-Thio-D- Galactopyranosid) gestartet. Nach einer Expressionsdauer von 14 h bei 20 C erfolgte die Ernte durch Zentrifugation bei 5000 rpm für 20 min. Die Zellpellets wurden jeweils mit 15 ml PBS (phosphate buffered saline) resuspendiert und bei 3500 rpm für 20 min erneut abzentrifugiert. Diese Pellets wurden bis zur Verwendung in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 C gelagert. PBS-Puffer: 10 mm NaCl 10 mm NaP i, ph 7, Zellaufschluss Um die überexprimierten Proteine extrahieren zu können ist ein Zellaufschluss erforderlich, der unter der Verwendung eines Microfluidizers oder mittels Ultraschall durchgeführt werden kann. Zunächst wurde das Zellpellet mit entsprechendem Lysepuffer resuspendiert und mit dem Proteaseinhibitor PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) versetzt. Im Microfluidizer wurde die Zellsuspension zwei- bis dreimal unter Hochdruck (800 bar) durch eine Kapillare gepresst und dadurch aufgeschlossen. Bei der Ultraschallanwendung wurden die mit einem Eisbad gekühlten Zellen maximal dreimal 15 Pulsen Ultraschall ausgesetzt und der Erfolg des Aufschlusses lichtmikroskopisch kontrolliert. Um die unlöslichen Anteile zu entfernen, wurden die jeweiligen Zelllysate anschließend für 30 min bei x g und 4 C abzentrifugiert Glutathionaffinitätschromatographie Die exprimierten Proteine enthalten durch die Vektorsequenz einen Glutathion- S-Transferase-Anker (GST-Anker). Dessen hohe Affinität zum natürlichen 32

42 Substrat Glutathion (GSH) vermittelt die Bindung der exprimierten Proteine an ein GSH-haltiges Säulenmaterial. Zur Aufbereitung des Zelllysates wurde Säulenmaterial der Firma GE Healthcare verwendet, in dem GSH über einen Linker an Sepharose-Beads gekoppelt ist. Nach dem Auftragen des löslichen Zelllysates auf die GSH-Säule wurden mit einem Hochsalzpuffer (1 M Salzgehalt) unspezifisch bindende Proteine von der Säule entfernt mit Laufpuffer das gewünschte Milieu hergestellt. Mit einem 10 mm GSH-haltigen Laufpuffer wurde die Elution durchgeführt und das Eluat fraktioniert aufgefangen. Die Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE analysiert und zusammengeführt, wenn das GST-Fusionsprotein darin enthalten war. Die Abspaltung des GST-Affinitätsankers wurde durch die Zugabe einer TEV (Tobacco Etch Virus)-Protease erreicht, die im molaren Verhältnis 1:50 eingesetzt und über Nacht bei 4 C inkubiert wurde Präparative Größenausschlusschromatographie Bei der Größenausschlusschromatographie werden die Proteine anhand ihrer Größe und Form aufgetrennt und separiert. Große Proteine durchwandern eine Porenmatrix deutlich schneller als kleine Proteine, da diese aufgrund ihrer Größe an vielen kleinen Poren binden und einen längeren Weg zurücklegen müssen. Das Eluat wird fraktioniert aufgefangen und kann über SDS-PAGE auf den Proteingehalt untersucht werden. Diese Methoden wurde mit der Superdex /60 Gelfiltrationssäule von GE Healthcare zur weiteren Reinigung nach der Affinitätschromatographie durchgeführt Ionenaustauschchromatographie Die Trennung eines Proteingemisches mit einem Kationenaustauscher erfolgt nach dem Prinzip der Ionenaustauschchromatographie. Die Chromatographiesäule eines Kationenaustauschers besitzt innerhalb der Matrix zahlreiche fixierte Anionen, an welche die positiven Ladungsreste von Proteinen binden. Die Bindungsaffinität eines Proteins hängt dabei von dessen Ladungszustand ab, der durch den isoelektrischen Punkt (IP) und den umgebenden ph Wert bestimmt wird. Nach dem Beladen der Säule mit einem Proteingemisch wird die 33

43 Salzkonzentration (NaCl) im Laufpuffer kontinuierlich gesteigert. Durch die steigende Konzentration von Na + -Ionen werden die Proteine schrittweise von der Säulenmatrix verdrängt und fraktioniert aufgefangen. In dieser Studie wurde die Kationenaustauschchromatographie zur Trennung des GSTs vom Zielprotein nach dem TEV-Verdau durchgeführt Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese Mit der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese nach Laemmli können Proteine ihrer Größe nach aufgetrennt und auf den Reinheitsgrad untersucht werden (Laemmli, 1970). Die Substanz Natrium-Dodecylsulfat denaturiert Proteine und überträgt negative Ladungsreste auf die Proteine. Die Mobilität der Proteine in der Elektrophorese hängt dabei von deren Molekulargewicht ab. Durch die Verwendung eines Molekulargewichtsstandards kann das Molekulargewicht gereinigter Proteine geschätzt werden. Für die Gelpräparation und Elektrophorese wurde das Mini-Protean III System der Firma Bio-Rad genutzt. Das Trenn- und Sammelgel wurde nach folgendem Rezept hergestellt: Tabelle 5: Pipettierschema zur Herstellung der SDS-Gele Trenngel 15% Trenngel 18% Sammelgel 6% ddh 2 O 2,4 ml 1,1 ml 1,35 ml Trenngelpuffer 2,5 ml 3,9 ml - Sammelgelpuffer - - 0,625 ml 30% (w/v) Acrylamid 5 ml 9 ml 0,025 ml 10% (w/v) SDS 0,1 ml 157 µl 25 µl TEMED 5 µl 4,7 µl 1,25 µl APS 50 µl 157 µl 12,5 µl 34

44 Nach der Polymerisation der Gele wurden die Proteinproben im Probenpuffer aufgetragen, nachdem sie zuvor für 3 min bei 95 C m it dem Probenpuffer inkubiert wurden. Bei einer konstanten Spannung von 200 V erfolgte die Auftrennung der Proteinproben. Anschließend wurde das Gel in einer Färbelösung mit Coomassie Brilliantblau gefärbt und wieder entfärbt, sodass der an den Proteinen gebundene Farbstoff die Proteinbanden visualisiert. Sammelgelpuffer: Trenngelpuffer: 0,5 M Tris-HCl ph 6,8 1,5 M Tris-HCl ph 8,8 0,4% (w/v) SDS 0,4% (w/v) SDS 10x Laufpuffer: Probenpuffer: 250 mm Tris-HCl ph 8,3 62,5 mm Tris-HCl ph 6,8 2 M Glycin 25% (v/v) Glycin 1% (w/v) SDS 2% (w/v) SDS 0,01% (w/v) Bromphenolblau 10% (w/v) β-mercaptoethanol Färbelösung: Entfärbepuffer: 5% (v/v) Essigsäure 5% (v/v) Essigsäure 10% (v/v) Ethanol 10% (v/v) Ethanol 0,1% (w/v) Coomassie R Bestimmung der Proteinkonzentration Die Proteinkonzentrationen wurden mit der Methode nach Bradford (Bradford, 1976) sowie über die UV-Absorption bei 280 nm bestimmt. Bei der ersten Methode bindet der Säurefarbstoff Coomassie Brilliantblau G-250 an die Seitenketten der Aminosäuren Arginin, Histidin, Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin. Dadurch wird die anionische Form des Farbstoffs stabilisiert, was eine Verschiebung des Absorptionsmaximums des Farbstoffes von 465 nm zu 595 nm zur Folge hat. Für die Messungen dieser Studie wurde das Bradford-Reagenz der Firma BioRad verwendet. In einem 1 ml Ansatz wurden 1-10 µg Protein in 800 µl Wasser mit 200 µl Bradford-Reagenz vermischt. Nach 5 min Inkubationszeit erfolgte die Absorptionsmessung bei 595 nm. Anhand einer vorher erstellten Kalibriergeraden mit BSA-Protein konnte die Konzentration der Proteinprobe berechnet werden. 35

45 Die Seitenketten aromatischer Aminosäuren bewirken eine Absorption bei 280 nm, was für die zweite Methode, die UV-Absorption, genutzt wird. Durch das Lambeert-Beersche Gesetz kann mithilfe des Extinktionskoeffizienten und der Absorption bei 280 nm die Konzentration einer Proteinlösung bestimmt werden. Für die Messung wurde Spektralphotometer ND-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) verwendet. Der Extinktionskoeffizient wurde auf Grundlage der Aminosäuresequenz mit dem Programm Protparam des Internetservers Expasy ( berechnet Konzentrierung der Proteine Zur Erhöhung der Proteinkonzentration wurden Ultrafiltrationseinheiten der Firma Amicon verwendet, deren Membran Poren einer definierten Größe besitzen. Durch die Zentrifugation einer Proteinlösung bei maximal 3500 x g passieren je nach Molekulargewicht kleinere Proteine die Membran und führen zu einer Volumenabnahme. Die Zentrifugationsschritte erfolgten bei 4 C Filterbindungsassay Zur Untersuchung der Kinaseaktivität von P-TEFb unter Anwesenheit von möglichen Interaktionspartnern wurde in dieser Studie ein radioaktiver Filterbindungsassay verwendet. Ein Ansatz aus P-TEFb, Substratprotein, Testprotein und ATP mit Spuren von [γ- 32 P]-ATP wurde nach einer Inkubationszeit auf Phosphozellulosepapier gegeben, das anschließend mit Phosphorsäure gewaschen wurde. Unter sauren Bedingungen lagern sich Proteine über positive Ladungsreste an ein Filterpapier, nicht jedoch die radioaktiven Nukleotide allein. Durch die Aktivitätsmessung des inkorporierten [γ- 32 P]-ATP auf dem Substratprotein konnte auf die Kinaseaktivität von P-TEFb zurückgeschlossen werden. Die Kinaseansätze mit einem Volumen von 35 µl enthielten 0,3 µm P-TEFb, 100 µm CTD-Substratprotein, 100 µm ATP mit 0,5 µci [γ- 32 P]-ATP und Testprotein CTD-Tat oder TatKip in verschiedenen Konzentrationen. Mit der Zugabe von ATP/[γ- 32 P]-ATP wurde die Reaktion gestartet und die Proben wurden für 10 min bei 30 C schüttelnd bei 300 rpm i n einem Eppendorf 36

46 Thermomixer inkubiert. Anschließend wurden 15 µl eines Reaktionsansatzes auf 1 cm² Whatman P81 Filterpapier pipettiert, unmittelbar in 0,75% (v/v) Phosphorsäure eingetaucht und 5 min gewaschen. Nach zwei weiteren Waschschritten mit jeweils mind. 5 ml Phosphorsäure je Filterpapier wurde das Filterpapier in Szintillationsgefäße überführt. In einem Beckmann Coulter Szintillationsgerät wurde mit dem 32 -P Programm die Radioaktivität der Filterpapiere über einen Zeitraum von einer Minute gemessen. Aus jedem Ansatz wurden 15 µl Proben auf zwei Filterpapiere gegeben und die erhaltenen Werte gemittelt. Kinasepuffer (10x): 500 mm Hepes ph 7,6 340 mm KCl 70 mm MgCl 2 25 mm DTT 50 mm β-glycerolphosphat ESI-Massenspektrometrie Zur genauen Bestimmung der Molekülmasse von gereinigten oder phosphorylierten Proteinen wurde die Elektrospray-Ionisations- Massenspektrometrie (ESI-MS) verwendet. Da die ESI-MS Messung empfindlich gegenüber Salzen in der Proteinlösung ist, werden die Proteinproben vor der Ionisation über eine vorgeschaltete C 4 -Säule entsalzen. Durch das Einsprühen der Proben in eine Kammer mit hohem elektrischen Potential werden die Proteine ionisiert und anschließend in einer Ionenfalle analysiert. Die Messanlage besteht aus einem Agilent 1100 Chromatographiesystem mit Finnigan LCQ Advantage MAX Elektrospray- Massenspektrometer und VYDAC-Protein-C 4 -Säulen (Grace, Deerfield, IL, USA). Die Auswertung erfolgt mit den Programmen Xcalibur und MagTran. 37

47 3.4. Biophysikalische Methoden Isotherme Titrationskalorimetrie Mit Hilfe der isothermen Titrationskalorimetrie (isothermal titration calorimetry, ITC) können thermodynamische Parameter einer Interaktion zweier Moleküle sensitiv und schnell ermittelt werden (Wiseman et al., 1989). Das Prinzip dieser Methode beruht darauf, dass die Temperaturen in einer Mess- und einer Referenzzelle durch einen elektrischen Regelkreis konstant gehalten werden. Als Voraussetzung müssen Mess- und Referenzzelle thermisch gegen äußere Temperatureinflüsse isoliert sein. Während einer ITC-Messung wird ein Ligand schrittweise zu einem in der Messzelle befindlichen Bindungspartner titriert. Die Interaktion zwischen Ligand (in einer Spritze) und Reaktionspartner (in der Messzelle) kann eine Temperaturänderung in der Messzelle bewirken, die als Verminderung oder Erhöhung des Heizstroms registriert wird. Zur Analyse der Interaktion wird das Integral der Wärmetönung gegen das molare Verhältnis der eingesetzten Proteine aufgetragen. Aus dem erhaltenen Kurvenverlauf lassen sich für die Bindung die thermodynamische Parameter G, H und S, die Stöchiometrie der Interaktion sowie die Dissoziationskonstante K d berechnen. Die ITC-Messungen wurden mit einem itc 200 (Microcal) durchgeführt, dessen Spritzenvolumen 40 µl beträgt und dessen Messzelle 250 µl umfasst. Bei einer Temperatur von 15 C wurden mit einem Zeitintervall von 4 min Injektionsvolumina von 2 µl in die Messzelle injiziert. Durch eine vorherige Dialyse wurden die Proteinlösungen in denselben Puffer überführt und sorgfältig entgast Theorie des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer Der Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer, auch Förster-Resonanz- Energietransfer (fluorescence/foerster-resonance-energy-transfer, FRET) genannt, beschreibt den Energietransfer eines angeregten Donorfarbstoffes auf einen zweiten Farbstoff, den Akzeptor. Dabei werden die Farbstoffe über Vektoren wie zum Beispiel Antikörper an einer Zielstruktur, dem target, in räumliche Nähe gebracht. In Reaktionsansätzen mit und ohne Akzeptor- 38

48 fluorophor wird nach Anregung (Exzitation) des Donorfluorophors dessen Emission gemessen. Findet ein Energietransfer auf den Akzeptorfarbstoff statt, reduziert sich die Emission des Donorfluorophors, während die Emission des Akzeptorfluorophors zunimmt. Je stärker die Fluoreszenzintensität des Donors durch den Energietransfer auf den Akzeptor reduziert wird, desto größer ist die sogenannte FRET-Effizienz. Diese Effizienz wird maßgeblich durch den Abstand der Fluorophore beeinflusst, der durch den Förster-Radius charakterisiert wird. Der Förster-Radius beschreibt dabei den Abstand eines Donor-Akzeptor-Paares, bei dem die Intensität des Energietransfers 50% beträgt. Das in dieser Studie verwendete Donor-Akzeptor-Paar Europium (Eu 3+ ) und Allophycocyanin (APC) weist mit 9,5 nm einen vergleichsweise großen Förster Radius auf (Mathis, 1993). Es gilt zu berücksichtigen, dass bei einigen FRET-Paaren die initial stattfindende Exzitation des Donorfluorophors zu einer direkten Anregung des Akzeptors-Fluorophores führen kann. Da sich jedoch die Emissionszeit des Donorfluorophores im Vergleich zur kurzlebigen Akzeptoremission über Mikrobis Millisekunden erstreckt, kann die direkte Exzitation des Akzeptors über eine als lag time bezeichnete Zeitverzögerung ausgeblendet werden. Mit der Ausblendung des der initialen Akzeptorexzitation kann somit die abstandsabhängige FRET-Intensität korrekt bestimmt werden. Das als zeitverzögerte Fluoreszenz (time-resolved fluorescence, TRF) bezeichnete Prinzip soll für diesen Reporterassay im Rahmen der TR-FRET Messung angewendet werden. Die Auswertung erfolgt über die in der Abbildung 12 dargestellte Formel zur Berechnung der FRET-Effizienz. Abbildung 12: Formel zur Berechnung der FRET-Effizienz Komponenten des FRET-Assays Die bei den FRET-Experimenten eingesetzten biotinylierten Peptide wurden von Jana Fiedler im Rahmen ihrer Diplomarbeit am MPI Dortmund synthetisiert. Das 39

49 für die Phosphorylierung der Peptide verwendete P-TEFb Protein wurde von Nadine Czudnochowski bereitgestellt. Eine Kontrolle der Peptidphosphorylierung erfolgte mittels ESI-Massenspektrometrie. Der Streptavidin Europium (SA-Eu 3+ ) Komplex wurde in 50 mm Hepes ph 7,5, 0,4M KF (Fluoreszenzpuffer) gelöst. Mit dem Allophycocyanin (APC) Mouse IgG 2a -Labeling Kit (Invitrogen) wurde der IgG 2a Antikörper 8WG16 (Covance) nach Herstellerangaben markiert (3 IgG 2a APC /Antikörper) und ebenfalls in Fluoreszenzpuffer gelöst. SA-Eu 3+ und APC-markierte Antikörper 8WG16 wurden mit nativen oder phosphorylierten Peptiden in 20 µl Ansätzen in weißen 384-well Platten (Greiner Bio-One, Frickenhausen) präpariert. Nach einer Inkubationszeit von 20 min bei 30 C wurden die zeitverzögerten FRET-Mes sungen mit einem Tecan Safire 2 Fluoreszenz-, Absorptions- und Lumineszenz-Detektor durchgeführt. Die Exzitation fand bei 310 nm statt, während zeitversetzt die Emission bei 620 nm und 665 nm registriert wurde. 40

50 4. Ergebnisse 4.1. Setup eines Fluoreszenz-basierten Kinaseassays Der Kinaseassay zur Beurteilung der P-TEFb Aktivität durch Messung eines TR-FRET Signals besteht aus zwei Schritten und wird in Abbildung 13 veranschaulicht. Während der Kinasereaktion wird P-TEFb, ATP und Substratpeptid mit einer Testsubstanz inkubiert. Das biotinylierte Substratpeptid besteht dabei aus mindestens einer Heptasequenz Y 1 S 2 P 3 T 4 S 5 P 6 S 7, der repetitiven Substratsequenz von P-TEFb in der CTD der RNA Pol II. Der zweite Schritt erfordert die Zugabe des Donorfluorophors Streptavidin- Europium (SA-Eu 3+ ) sowie des Allophycocyanin (APC) markierten Antikörpers. Aufgrund der stabilen Streptavidin-Biotin Interaktionen assoziiert das Donorfluorophor Europium mit dem Substratpeptid. Der APC-markierte Antikörper 8WG16 ist gegen das unphosphorylierte Peptid gerichtet und bringt Donor- und Akzeptorfluorophor in räumliche Nähe. Erfolgt die Exzitation des Donorfluorophors, kann über die Berechnung der FRET-Effizienz bestimmt werden, ob Donor- und Akzeptorfarbstoff innerhalb des Förster-Radius stabil angeordnet wurden und eine Interaktion stattfindet. Wird das Substratpeptid durch P-TEFb phosphoryliert, kommt es zu keiner Assoziation und es entsteht kein FRET-Signal. Sobald eine Testsubstanz in der Kinasereaktion P-TEFb inhibierend wirkt, führt unphosphoryliertes Peptid zu einem positiven FRET-Signal. Da eine Mindestgröße der Interaktionsfläche von P-TEFb und Antikörper mit dem Substratpeptid nicht bekannt ist, werden drei verschieden lange Peptide aus sieben, neun und zwölf Aminosäuren aus der CTD-Sequenz eingesetzt (Abbildung 14). Ein längeres Peptid könnte durch zunehmenden Donor- Akzeptor-Abstand negativen Einfluss auf die FRET-Effizienz nehmen, deren Intensität mit der sechsten Potenz der Entfernung abnimmt. 41

51 Abbildung 13: Der Reporterassay besteht aus Kinasereaktion und FRET-Messung, welche die Zugabe der Antikörper und Streptavidin gebundenen Fluorophore benötigt. 42

52 Peptid-Phosphorylierung durch den P-TEFb Komplex Im Rahmen der Diplomarbeit von Jana Fiedler wurden mehrere Biotingekoppelte Peptide aus sieben bis zwölf Aminosäuren synthetisiert, die aus unterschiedlich langen Heptaden der Sequenz Y 1 S 2 P 3 T 4 S 5 P 6 S 7 bestehen und jeweils immer nur eine S 2 -Position beinhalten. Die in Abbildung 14 dargestellten biotinylierten Peptide bilden das Grundgerüst für den FRET-basierten Reporterassay und sollen mit dem Donor-Fluorophor Streptavidin-Europium assoziieren. Für die Kinasereaktion des Reporterassays soll gezeigt werden, dass Cdk9-CycT1 Protein die synthetisierten Peptide phosphoryliert. Dazu werden Phosphorylierungsansätze mit Cdk9-CycT1, Peptid und ATP in Kinasepuffer bei 30 C für mehrere Stunden inkubiert und anschließend per LC-ESI-MS untersucht. Eine Größenzunahme von 80 Da entspricht dem Gewicht einer übertragenen Phosphatgruppe, sodass das Molekulargewicht Aussagen über den Phosphorylierungszustand der Peptide zulässt. In Abbildung 15 sind ESI-Massenspektren von drei Peptiden vor und nach der Kinasereaktion dargestellt. Dabei werden Massen nachgewiesen, die den drei Peptiden im nativen (A-C) und phosphorylierten (D-F) Zustand entsprechen. Die Probe des zwölf Aminosäuren langen Peptids III weist Rückstände eines Peptids aus elf Aminosäuren auf, das aus einer unvollständigen chemischen Synthese resultiert aber ebenfalls durch P-TEFb phosphoryliert wird. Abbildung 14: Darstellung der im FRET-Ansatz eingesetzten Peptide. Die verwendeten Peptide für den P-TEFb Reporteransatz weisen unterschiedliche Längen auf und besitzen jeweils nur einen S 2 -Rest (blau). 43

53 Abbildung 15: Auswertung der Massenspektrometrie von drei Peptiden. Die Peptide I, II und III wurden vor (A-C) und nach (D-F) einer Inkubation mit P-TEFb und ATP auf das Molekulargewicht untersucht. Rote Zahlen beschreiben die Anzahl der Phosphatgruppen. Die Phosphorylierung der von Jana Fiedler hergestellten Peptide durch den P-TEFb Komplex wurde in ihrer Diplomarbeit gezeigt und dokumentiert, die dargestellten Messungen sind eigene Reproduktionen der Ergebnisse Fluoreszenzspektren des Donor-Akzeptor-Paars Zur Prüfung des Donor-Akzeptor-Paares wurden die Fluorophore mit einem Fluoreszenzspektrometer im Gleichgewichtszustand (steady state) auf Emission und Exzitation hin untersucht. Dazu wurden die Fluorophore in den späteren Arbeitskonzentrationen mit einem Fluoromax Spektrometer analysiert. Das in Abbildung 16 dargestellte Emissionsspektrum des Donorfluorophors Europium mit einer Exzitation bei λ ex = 310 nm zeigt ein Emissionsmaximum bei λ em = 619 nm. Für das Akzeptorfluorophor Allophycocyanin wurde ein Exzitationsspektrum aufgenommen, bei dem die Emission bei λ em = 665 nm in Abhängigkeit von der Exzitationswellenlänge aufgezeichnet wurde. Das Maximum der Anregung wurde kurz unterhalb von λ ex = 650 nm erreicht, während eine Exzitation bei λ ex = 620 nm eine Anregung des Akzeptorfarbstoffes von 70% des Maximalwertes bewirkt. Zuletzt wurde ein Emissionsspektrum des Akzeptorfluorophores am Antikörper aufgenommen, 44

54 Abbildung 16: Fluoreszenz-Spektren der Fluorophore Eu 3+ und APC. Normierte Fluoreszenzspektren der eingesetzten Fluorophore Streptavidin-Europium (SA-Eu 3+ ) und Allophycocyanin, der den Antikörper markiert. indem der Farbstoff bei λ ex = 620 nm angeregt wurde. Im aufgenommenen Spektrum befindet sich das Emissionsmaximum bei λ em = 660 nm. Da das Emissionsmaximum des Donors Europium innerhalb des Exzitationsspektrums des Akzeptors APC liegt, ist diese Fluorophor-Paarung für den Reporteransatz geeignet Basiseinstellungen Für den TR-FRET basierten Reporterassay wurden neben den Peptid- und Fluorophorkonzentrationen auch die Geräteeinstellungen variiert. Dazu wurden 20µl große Reaktionsansätze aus Peptid und Donor, Peptid und Akzeptor, sowie Peptid mit Donor- und Akzeptorfarbstoff hergestellt und in 384 well Platten auf die FRET-Effizienz hin analysiert. Der Donorfluorophor SA-Eu 3+ wurde den Herstellerangaben entsprechend mit 10 nm eingesetzt, während die Peptid- und Fluoreszenzfarbstoffkonzentrationen zwischen 10 nm und 50 nm variiert wurden. In der FRET-Messung wurde das Europium-Kryptat durch Exzitation bei λ ex = 310 nm angeregt und die Emission bei λ em = 620 nm (Donor) sowie bei λ em = 665 nm (Akzeptor) detektiert. Außerdem wurden in den erweiterten Geräteeinstellungen die Parameter Zeitverzögerung (lag time), 45

55 Abbildung 17: FRET-Effizienz bei variierender Konzentrationen von Peptid und APCmarkiertem Antikörper. Strepatvidin-Eu 3+ wurde mit 10 nm je Ansatz eingesetzt. Die lag time betrug 60 µs, die integration time 500 µs, die Blendenweite auf 5 nm eingestellt. Zeitdauer der Messung (integration time) und die Blendenweite (slits) variiert und in Bezug zu den Messwerten angepasst (Daten nicht gezeigt). In Abbildung 17 sind die Messergebnisse einer Versuchsreihe dargestellt, die nach einer lag time von 60 µs innerhalb von 500 µs integration time bei einer Blendenweite von 5 nm aufgezeichnet wurden. Darin ist zu erkennen, dass mit zunehmender Konzentration von Peptid und Akzeptor tragenden Antikörper die FRET-Effizienz ansteigt. Dieser Trend trifft für Peptid 1 und Peptid 3 zu, jedoch ergibt sich beim Peptid 2 für die zweite Konfiguration eine sehr geringe FRET-Effizienz. Die maximale FRET-Effizienz von 49% konnte mit 50 nm Peptid 3 und 50 nm APC-markiertem Antikörper erzielt werden. 46

56 Phosphorylierungs-abhängiges FRET-Signal Der Reporterassay soll mit dem vorliegenden Setup FRET-Signale in Abhängigkeit vom Phosphorylierungsgrad der Peptide erzeugen, sodass eine Aussage über die Kinaseaktivität des P-TEFb Komplexes getroffen werden kann. Um diesen Sachverhalt zu überprüfen, wurden Ansätze mit nativen sowie mit phosphorylierten Peptiden analysiert. Als Kontrolle wurden Ansätze gemessen, die Donor- und Akzeptor-Fluorophor in den jeweiligen Konzentrationen aber kein Peptid beinhalten. Da der Primärantikörper gegen die CTD-Heptade ohne Phosphorylierung gerichtet ist, sollte das FRET-Signal hauptsächlich bei nativem Peptid entstehen. Bei den Ansätzen mit phosphorylierten Peptiden wird ein Signal nahe dem Hintergrund-Rauschen erwartet, welches durch Ansätze ohne Peptid bestimmt wird. Die phosphorylierten Peptide wurden zuvor in einer Phosphorylierungsreaktion hergestellt und mittels ESI-MS auf die Masse geprüft. Die Ergebnisse von insgesamt dreizehn Messungen mit nativem und phosphoryliertem Peptid im Vergleich zu Ansätzen ohne Peptid sind in Abbildung 18 zusammengefasst. Bei einer Konzentration von 10 nm des APC-markierten Antikörpers erzeugten die nativen Peptide in den Messungen eine FRET-Effizienz zwischen 6-14%, mit phosphorylierten Peptiden 1, 2 und 3 wurden FRET-Effizienzen zwischen 9-11% dokumentiert. In Ansätze ohne Peptid wurde im Mittel eine FRET-Effizienz von 16% ermittelt, ein höherer Wert als in Anwesenheit der Peptide. In Abbildung 18 B sind die Ergebnisse der Messungen mit fünf-fach höheren Akzeptorfluorophorkonzentration von 50 nm dargestellt. Dabei liegt die FRET-Effizienz bei nativen Peptiden zwischen 17-26%, bei phosphorylierten Peptiden zwischen 2-18%. In den Kontrollansätzen, die kein Peptid enthalten, wurde eine mittlere FRET-Effizienz von 29% ermittelt. Die dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die zugesetzten Peptide weder im nativen noch im phosphorylierten Zustand einen positiven Einfluss auf die FRET-Effizienz vermitteln. Zwar konnte durch Erhöhung der Akzeptorkonzentration auf 50 nm die FRET-Effizienz in fast allen Ansätzen gesteigert werden, jedoch erzeugt kein Ansatz mit Donorfluorophor, Substratpeptid und APC-markiertem Antikörper ein FRET-Signal, welches über dem der Kontrolle ohne Peptid liegt. 47

57 Abbildung 18: Kumulative Ergebnisse aus dreizehn TR-FRET-Messungen. Abbildungen A und B unterscheiden sich in der Konzentration des Akzeptorfluorophors. Die lag time betrug 60 µs, die integration time 500 µs, die Blendenweite 5 nm. In diesen Reaktionsansätzen konnte somit kein spezifisches FRET-Signal erzeugt werden, das in Abhängigkeit vom Phosphorylierungszustand des Substratpeptids eine Aussage zur Kinaseaktivität des P-TEFb trifft. 48

58 4.2. Modulation der Kinaseaktivität von P-TEFb Faktoren zur Beeinflussung der P-TEFb Aktivität Um den P-TEFb Komplex bei pathophysiologischen Prozessen wie der Transkriptionsregulation von HIV-1 gezielt zu beeinflussen, ist das Verständnis der proteinogenen Regulationsmechanismen des Cdk9-CycT1 Paares erforderlich. Der im Rahmen der Doktorarbeit von Nadine Czudnochowski untersuchte Interaktionsmechanismus von P-TEFb mit der TBD sowie dem P-Y-N-T Motiv von Hexim erinnert an die zweiseitige Interaktion von Cdk2-CycA mit dem Inhibitor p27 Kip1. Dieser lagert sich an die docking site von Cyclin A über ein konserviertes R-X-L-F-G Motiv an und inhibiert die Cdk2 mit einem C-terminal gelegenen Motiv. Aufgrund einer 40% Sequenzhomologie zwischen Cdk2 und Cdk9 soll untersucht werden, ob p27 Kip1 Einfluss auf die Kinaseaktivität von Cdk9 ausüben kann, wenn es mit einer Cyclin T1 affinen Domäne fusioniert wird. Da zu Beginn dieser Studie die Struktur von P-TEFb noch nicht veröffentlicht war, wurde die Planung anhand der Kristallstrukturen von equinen Cyclin T1-Tat-TAR Komplexes (Abbildung 19 A+B) sowie des Cdk2-CycA-p27 Kip1 Komplexes (Abbildung 19 C) durchgeführt. Die Cyclin bindende Domäne des Fusionskonstrukts besteht aus Tat (1-72). Dessen C-terminal gelegenes Arginin-reiche Segment (I 49-L 69) nimmt auf der Oberfläche von Cyclin T1 eine Position ein, die der Lokalisation der docking site von Cyclin A ähnelt (Abbildung 19 A-D). Für die Fusion von Tat mit p27 Kip1 ist daher der Bereich C-terminal des R-X-L-F-G Motivs von p27 Kip1 relevant. Dort besteht, eingeleitet von einem DHEEL-Motiv, ein helikal organisiertes Segment, das eine Orientierung zur Cdk2 aufweist. Dieses Segment soll im Fusionskonstrukt eine Orientierung zur Cdk9 einnehmen. Zur Veranschaulichung sind in Abbildung 19 E und F sowohl das Arginin-reiche Segment von Tat sowie der C-terminale Bereich von p27 Kip1 (D 37-K 97) dargestellt. 49

59 Abbildung 19: Das Tat-TAR Element auf der Oberfläche von equinem Cyclin T1 (A+B) sowie der Inhibitor p27 Kip1 im Komplex mit Cdk2/CycA (C). Abschnitte D, E und F simulieren die gewünschte Orientierung des Fusionskonstrukts aus Tat und p27 Kip1 (PDB: 1JSU, 2W2H). 50

60 Herstellung des TatKip Konstrukts Das TatKip Konstrukt (Abbildung 21) wurde aus sechs Primern mittels PCR zu einem template amplifiziert und in einen pgex-4t1 TEV (amp) Vektor ligiert. Nach der Kontrolle des Vektors durch eine Sequenzanalyse wurde das TatKip Konstrukt mit GST-Anker für die Expression in BL21(DE3) Zellen transformiert. Die Reinigung des TatKip Proteins erfolgte über eine GSH-Affinitäts- Chromatographie und Verdau mittels TEV-Protease, die im molaren Verhältnis 1:50 eingesetzt wurde. Mittels Größenausschlusschromatographie sowie alternativ über Kationenaustauschchromatographie wurde die Trennung von GST Protein und dem Fusionskonstrukt TatKip angestrebt. Die Größe und Reinheit des produzierten TatKip Proteins wurde mittels SDS- Gelelektrophorese und LC-ESI-Massenspektrometrie überprüft (Abbildung 20). Das 18%ige SDS-Gel der Endprodukte beider Reinigungsverfahren zeigt neben der Bande des TatKip Proteins auch Verunreinigungen. Die Doppelbanden auf Höhe der 30 kda Marke können durch freies GST entstehen, die Bande auf Höhe von 16kD durch degradiertes Protein. Zur exakten Massenbestimmung Abbildung 20: Darstellung und Massenspektroskopie des TatKip Konstrukts. Coomassie gefärbtes 18%iges SDS-Gel (A) mit 10 µg TatKip Protein. Überprüfung des Molekulargewichts mittels ESI-MS bei einer theoretischen Masse von Da (B und C). 51

61 Abbildung 21: Domänenstruktur des Fusionskonstruktes TatKip aus HIV-1 Tat (1-72, hellgrün) und p27 Kip1 (37-97, gelb). wurden die TatKip-Proteinlösungen durch eine Aceton-Fällung für die Massenspektrometrie vorbereitet und analysiert. Die theoretische Masse des Fusionsproteins von Da konnte für beide Reinigungsverfahren mit Da für die Größenausschluss-Chromatographie und mit Da für die Kationenaustauscher-Chromatographie bestimmt werden (Abbildung 20B und C) Bindungsverhalten von TatKip zu Cyclin T1 Der potentielle P-TEFb Inhibitor TatKip soll eine hohe Affinität zur regulatorischen Untereinheit von P-TEFb, dem Cyclin T1 Protein, aufweisen. Mittels isothermer Titrationskalorimetrie (isothermal titration calorimetry, ITC) wurde das Fusionsprotein TatKip auf eine Bindung an Cyclin T1 (1-272) Protein hin untersucht, welches nach demselben Schema wie TatKip exprimiert und gereinigt wurde. Die technische Anleitung und Auswertung dieser Messung mit dem Programm Origin 7.0 erfolgte durch Dr. André Schönichen. Die Abbildung 22 zeigt das Ergebnis der ITC Messung, bei der 300 µm Cyclin T1 (1-272) zu 30 µm TatKip titriert worden sind. Dabei konnte eine Bindung zwischen Cyclin T1 und TatKip nachgewiesen werden und die Affinität des Fusionskonstrukts zur P-TEFb Untereinheit zu K d = 1.7 µm bestimmt werden. Der erste Schritt, die Anlagerung des Konstrukts TatKip an das Cyclin T1 Protein, ist somit erfolgreich. Ob die zweite Domäne, der p27 Kip1 Teil, inhibierend auf die Kinaseaktivität der Cdk9 wirkt, soll im radioaktiven Filterbadassay untersucht werden. 52

62 Abbildung 22: Isotherme Titrationskalorimetrie von 0,3 µm Cyclin T1 zu 0,03 µm TatKip. Kontrollen bilden die Titrationen von 0,3 mm Cyclin T1 (1-272) (A) bzw. 0,03 mm TatKip (B) in Puffer. Aus der Differenz der Wärmetönung kann K d = 1,7 µm bestimmt werden (D) Substratphosphorylierung durch P-TEFb Für die Aktivitätsmessung von P-TEFb im radioaktiven Kinaseassay wurde ein GST-Anker gekoppeltes Protein aus dreizehn Wiederholungen der CTD- Heptadsequenz Y 1 S 2 P 3 T 4 S 5 P 6 S 7 gereinigt (Abbildung 23A). Die Masse des gereinigten Proteins wurde mittels ESI-Massenspektrometrie zu Da bestimmt, einer Differenz von 3 Da zur theoretischen Masse von Da (Abbildung 23B). Das sogenannte GST-CTD13x Protein wurde in einem Phosphorylierungsansatz eingesetzt und als Substrat für P-TEFb getestet. Der verwendete P-TEFb Komplex besteht aus humanem Cdk9 Protein, das an T186 phosphoryliert ist und aus Insektenzellen gereinigt wurde, sowie aus E.coli gereinigtem Cyclin T1 Protein (1-272). Der in allen Experimenten verwendete 53

63 Abbildung 23: Darstellung und Phosphorylierung von GST-CTD13x Substratprotein. Coomassie gefärbtes 18%iges SDS-Gel (A). ESI-Massenspektren von GST-CTD13x vor (B) und nach (C) der Phosphorylierungsreaktion mit P-TEFb (Anzahl der Phosphatgruppen in rot). P-TEFb Komplex wurde von Nadine Czudnochowski gereinigt und für diese Studien bereitgestellt. Im Phosphorylierungsansatz wurden 0,3 µm Cdk9-Cyc T1 (1-272), 100 µm GST-CTD13x und 2,5 mm ATP in einem Mg 2+ -haltigen Puffer bei 30 C für mehrere Stunden inkubiert. Mittels ESI-MS wurde das Substratprotein auf Größenunterschiede nach der Phosphorylierungsreaktion untersucht (Abbildung 23C). Eine Größenzunahme von 80 Da entspricht dabei dem Gewicht einer Phosphatgruppe (PO 3 2- ), die auf das Substrat übertragen wurde. Im ESI-MS Spektrum konnten Massen der Größe Da und Da nachgewiesen werden, die GST-CTD13x Proteinen mit zwölf (37752 Da) bzw. dreizehn (37832 Da) Phosphorylierungen entsprechen. Diese Methode liefert keinen Hinweis auf die Position der Phosphorylierung innerhalb der Heptadsequenz, die Anzahl der Phosphorylierungen lässt jedoch vermuten, dass innerhalb eines Heptads jeweils ein Serinrest durch P-TEFb phosphoryliert wurde. Für den Einsatz des GST-CTD13x Substratproteins im radioaktiven Filterbadassay wurde beabsichtigt GST-gekoppeltes Protein eingesetzt, da die positiven Ladungsreste des GST-Ankers für die Bindung an das Phospho- 54

64 Zellulosepapier erforderlich sind. Aufgrund der nachgewiesenen Phosphorylierung kann das GST-CTD13x Protein für die Aktivitätsbestimmung verwendet werden Aktivitätsmessung von P-TEFb Der Einfluss des Fusionskonstrukts TatKip auf die Kinaseaktivität der Cdk9 wurde mit einem radioaktiven Filterbindungsansatz untersucht, der von Nadine Czudnochowski in der Arbeitsgruppe etabliert wurde. Mit dieser Methode kann die Aktivität des P-TEFb Komplexes zusammen mit Interaktionspartnern wie Hexim 1 oder dem Fusionskonstrukt TatKip gemessen werden. Dazu werden Kinase und Substrat in Mg 2+ -haltigem Kinasepuffer mit ATP versetzt, das geringe Mengen an radioaktivem [γ- 32 P]-ATP enthält. Die Reaktionsansätze werden bei einer Temperatur von 30 C inkubiert und auf ein Phospho- Zellulosepapier pipettiert, das daraufhin sofort mit Phosphorsäure gewaschen wird und zur Auswertung in ein Szintillationsröhrchen gegeben wird. Die Szintillationsmessung ermittelt Werte in cpm (counts per minute), die als Maß für die Phosphat-Übertragung des P-TEFb Komplexes auf das Substratprotein interpretiert werden. Die Ergebnisse von insgesamt drei Versuchsreihen sind in Abbildung 25 dargestellt. Die Kinaseaktivität von P-TEFb wurde jeweils mit einem Standardansatz aus 0,3 µm Cdk9-CycT1 Protein, 100 µm GST-CTD13x Substrat-Protein und 100 µm ATP verglichen (P-TEFb). Zu den Kontrollansätzen am rechten Rand der Abbildungen zählt ein Standardansatz, dem 3 µm Flavopiridol zugesetzt wurde (+ Flavopiridol). Die medikamentöse Inhibition der Cdk9 senkt die relative Kinaseaktivität auf Werte zwischen 1-2%. Dies entspricht den Werten aus zwei weiteren Kontrollansätzen mit einem Ansatz ohne Substrat (P-TEFb+ATP) sowie einem Ansatz ohne P-TEFb (CTD+ATP). Vergleichswerte der P-TEFb Aktivität im Beisein des zellulären Inhibitors Hexims wurden erzeugt, indem Hexim ( ) in 10- und 20- fachem Überschuss Standardansätzen zugegeben wurde. Das von Nadine Czudnochowski bereitgestellte Heximkonstrukt führte zu einer konzentrationsabhängigen Reduktion des Phosphatübertrags auf Werte von 6% bzw. 16% bei zehnfachem Überschuss und bei zwanzigfachem Überschuss auf Werte von 4% bzw. 11% (Abbildung 25 A+B). 55

65 Zur Analyse des Einflusses des TatKip Proteins auf die P-TEFb Aktivität wurden dem Standardansatz TatKip Protein aus zwei verschiedenen Präparationen in den Konzentrationen 0,3 µm, 3 µm und 6 µm zugefügt. Bei einer P-TEFb- Konzentration von 0,3 µm steht der Interaktionspartner TatKip dem P-TEFb Komplex daher im Verhältnis 1:1, 10:1 und 20:1 gegenüber (1x, 10x, 20x). Das als TatKip 1 bezeichnete Protein wurde über Größenaustausch- Chromatographie, das Protein TatKip 2 mittels einer Kationenaustauscher- Säule präpariert. Im Rahmen der ersten Versuchsreihe wurde für TatKip 1 konzentrationsunabhängig eine relative Kinaseaktivität zwischen % bestimmt, für TatKip 2 eine konzentrationsabhängige Reduktion auf bis zu 74%. Die in Abbildung 25 A gezeigten Proben mit TatKip 1 und 2 weisen eine relative Kinaseaktivität zwischen 41-59% auf, es besteht jedoch kein direkt konzentrationsabhängiger Effekt auf die P-TEFb Aktivität. Die gemessene relative Kinaseaktivität in den Ansätzen der dritten Versuchsreihe veranschaulicht Abbildung 25 C. Darin variieren die Werte von TatKip 1 und TatKip 2 zwischen einem Minimalwert von 77% und einem Maximalwert von 124% der relativen Kinaseaktivität. Abbildung 24: Radioaktiver Filterbindungsansatz zur Bestimmung der Kinaseaktivität von P-TEFb mit TatKip. Die Balken entsprechen dem Phosphatübertrag in Relation zum Standardansatz (P-TEFb). Konzentrationsverhältnisse sind unten angegeben. 56

66 Abbildung 25: Radioaktiver Filterbindungsansatz zur Bestimmung der Kinaseaktivität von P-TEFb mit TatKip und Hexim. 57

67 Durch die Zugabe des Fusionskonstrukts TatKip aus zwei verschiedenen Präparationen konnte in den dargestellten Messungen keine reproduzierbare, konzentrationsabhängige Reduktion der Kinaseaktivität von P-TEFb gezeigt werden. Insgesamt bewirkt das Fusionsprotein TatKip aus Tat (1-72) und p27 Kip1 (37-97) somit keine Inhibition der P-TEFb Untereinheit Cdk Substratanalyse durch CTD-Tat Fusionskonstrukte In diesem Teilexperiment soll untersucht werden, ob ein definitiver Abstand zwischen Rekrutierungsstelle und Substratakzeptoraminosäure für Substrate des P-TEFb Komplexes festgelegt werden kann. Studien zur Wechselwirkung des Proteins PIE-1 mit P-TEFb lassen vermuten, dass der Abstand zwischen Cyclin bindender Domäne und Cdk-interagierender Substratsequenz 25 Aminosäuren beträgt. Gelingt es ein Substratprotein stabil am P-TEFb Komplex zu positionieren, könnte eine modifizierte Substratsequenz inhibierenden Einfluss auf Cdk9 ausüben. Ein Fusionskonstrukt soll über eine Tat-Domäne an Cyclin T1 binden und über einen N-terminalen Teil aus Wiederholungen der Heptadsequenz Abbildung 26: Modell zur Orientierung der CTD-Tat Konstrukte. Cdk9 in grün, die Cyclinboxen in Blau. Von der Tat Domäne (violett) sollen sich die CTD-Heptade (orange Linie) zum aktiven Zentrum orientieren. (PDB-Dateien: 3QMZ, 2W2H) 58

68 Y1S2P3T4S5P6S7 mit dem aktiven Zentrum von Cdk9 interagieren können (Abbildung 26). Dazu wurden drei CTD-Heptade an eine Domäne des Tat Proteins (39-72) fusioniert (Abbildung 27A). Der Abstand zwischen Cyclin- Bindungsmotiv in Form der Tat-Domäne und den CTD-Heptaden wurde durch verschieden viele Glycine zwischen den Domänen variiert. Damit soll ein Fusionsprotein identifiziert werden, das aufgrund einer hohen Affinität an P-TEFb bindet und an nur einem Serinrest phosphoryliert wird. An einem solchen Substratprotein würde nach einer Serin-zu-Alanin-Mutation im Bereich des S 2 Rests die Auswirkung auf die Cdk9 Aktivität untersucht. Für diese Versuchsreihe wurden drei CTD-Tat Fusionskonstrukte mit synthetisierten Primern amplifiziert und in einen pgex4t1 Vektor ligiert. An die Expression in E.coli Bakterienzellen schloss sich die Reinigung über GSH- Affinitätschromatographie an. Der GST-Affinitätsanker wurde nach einem Verdau mit TEV-Protease durch eine Kationenaustauschchromatographie abgetrennt. Im 18%igen SDS-Gel konnten die CTD-Tat Proteine ohne Verunreinigungen dargestellt werden (Abbildung 27B). Die Analyse des Molekulargewichts mittels ESI-Massenspektroskopie bestätigte die theoretisch Abbildung 27: Design und Reinigung der CTD-Tat Fusionskonstrukte. Domänenarchitektur der Fusionskonstrukte sowie eines potentiellen P-TEFb Inhibitors (A). Coomassie gefärbtes 18%iges SDS-Gel mit Proben der Fusionskonstrukte CTD-Tat (B). 59

69 berechneten Massen der Konstrukte (Abbildung 28). Dabei wurde in der Probe des Proteins CTD-Tat II die Masse des CTD-Tat III Proteins detektiert. Da die phosphorylierte Probe des CTD-Tat II Proteins keine Masse des CTD-Tat III Konstrukts enthält, sind vermutlich Rückstände innerhalb der Entsalzungssäule im Gerät die Ursache für die Verunreinigung der Probe. Die CTD-Tat Proteine wurden mit P-TEFb und ATP in Kinasepuffer inkubiert und anschließend massenspektrometrisch auf eine Änderung der Masse untersucht (siehe Kapitel 4.2.4). Eine Massenzunahme von 80 Da entspricht einer übertragenen Phosphatgruppe. Die CTD-Tat Fusionskonstrukte wurden durch P-TEFb bis zu drei Mal phosphoryliert (Abbildung 28D-F). Die ESI-Massenspektrometrie lässt keine direkt quantitative Aussage über die Phosphorylierung zu, es kam jedoch nur beim längsten CTD-Tat Konstrukt zu einem dreifachen Phosphatübertrag. Der Abstand zwischen CTD-Heptad und Tat-Domäne scheint daher Einfluss auf die Substraterkennung von P-TEFb zu besitzen. Um zu überprüfen, ob die Fusionskonstrukte mit der Oberfläche von Cyclin T1 interagieren, wurden die Proteine mittels ITC-Messungen auf eine Interaktion mit Cyclin T1 (1-272) untersucht. Für keines der CTD-Tat Fusionskonstrukte Abbildung 28: Massenspektrometrie der nativen (A-C) und phosphorylierten (D-F) CTD- Tat Konstrukte I-III. Rote Ziffern stehen für die Anzahl der übertragenen Phosphatgruppen. 60

70 konnte jedoch eine Bindung gezeigt werden (Daten nicht gezeigt). P-TEFb scheint die CTD-Heptade einzeln zu phosphorylieren und durch eine nahe gelegene Tat-Domäne an der Substraterkennung gehindert zu werden. Im radioaktiven Kinaseassay wurde testweise untersucht, ob die CTD-Tat Fusionskonstrukte einen Einfluss auf die Gesamtaktivität des P-TEFb Komplexes ausüben (Abbildungen 29 und 30). Agieren die CTD-Tat Proteine als Substratprotein, sollte die Gesamtaktivität durch die Zugabe von CTD-Tat Fusionskonstrukten im Standardansatz mit GST-CTD13x Protein steigen. Bleiben die CTD-Tat Konstrukte aufgrund einer nicht detektierten Assoziation auf der P-TEFb Oberfläche gebunden, könnte eine verminderte Gesamtaktivität resultieren. In der ersten Messreihe wurde eine relative P-TEFb Aktivität von 55% bei hundertfachem Überschuss von CTD-Tat II Konstrukt beobachtet (Abbildung 29). Bei einer weiteren Messung (Abbildung 30) betrug für denselben Ansatz die relative Kinaseaktivität 201%. Ein eindeutiger Effekt von CTD-Tat II auf die P-TEFb kann dadurch nicht vorhergesagt werden. Im Rahmen der zweiten Messreihe wurde im Ansatz mit CTD-Tat III Protein eine relative Kinaseaktivität von 380% dokumentiert. Ein so hoher Wert könnte am ehesten einem Artefakt Abbildung 29: Erster Test der CTD-Tat Fusionskonstrukte im Filterbindungsansatz. 61

71 Abbildung 30: Zweiter Test der CTD-Tat Fusionskonstrukte im Filterbindungsansatz. Aufgrund von höheren Messwerten wurde die Ordinatenachse angepasst. entsprechen, das durch eine präparationsbedingte verlängerte Inkubationszeit entstanden ist. Für die Proben von P-TEFb und CTD-Tat I Protein wurden relative Kinaseaktivitäten dokumentiert, die eine einer Aktivität von % entsprechen. Das CTD-Tat Projekt wurde gegen Ende meiner Projektphase nicht weiter fortgeführt. Ein Erfolg versprechender Ansatz könnte die Synthese mehrerer Tat-Heptadkonstrukte darstellen, die über eine größere Tat-Domäne mit P-TEFb assemblieren und im Bereich des aktiven Zentrums von Cdk9 die Sequenz YAPMAPT oder YAPTSPS positionieren. Durch die Verwendung der CTD-Tat Konstrukte konnte kein inhibierender Effekt dokumentiert werden. Im Falle einer stabilen Assoziation mit Cyclin T1 wären CTD-Tat Fusionskonstrukte auch zu Kristallisationsstudien für einen P-TEFb-Substratkomplex einsetzbar. 62

72 5. Diskussion 5.1. Reporterassay für P-TEFb auf Fluoreszenzbasis Systeme zur TR-FRET basierten Bestimmung der Kinaseaktivität konnten bislang für viele Kinasen etabliert werden, unter anderem für die Kinaseaktivität des epidermalen Wachstumsfaktor Rezeptors und die Haspin Kinase (Hirata et al., 2004; Patnaik et al., 2008). Dabei wird der Streptavidin gekoppelte Akzeptorfarbstoff APC an biotinylierten Substratpeptiden positioniert, während Europium markierte Antikörper spezifisch phosphorylierte Serin- oder Tyrosinreste im Substratpeptid binden. Unterschiede zum Versuchsaufbau dieser Arbeit sollen folgend diskutiert werden. Die Kombination von Europium und Allophycocyanin stellt aufgrund der vielen etablierten FRET-basierten Kinaseassays ein attraktives Donor-Akzeptor-Paar dar. Zur Kontrolle der beschafften Farbstoffe für den vorliegenden Versuchsaufbau konnten in Gleichgewichtsmessungen (steady state) Fluoreszenzspektren dokumentiert werden, die einen Energietransfer vom Donor Streptavidin-Eu 3+ auf den Akzeptor Allophycocyanin nahe legen. Die Substratpeptide dieser Versuchsreihe wurden von der Diplomandin Jana Fiedler synthetisiert, deren Phosphorylierung durch P-TEFb massenspektrometrisch nachgewiesen werden konnte. Um den Phosphorylierungszustand der Peptide zu erfassen, wurde der monoklonale Antikörper 8WG16 vom Typ IgG2a eingesetzt, welcher unphosphorylierte Peptide mit repetitiven YSPTSPS-Sequenzen erkennt und bindet (Jones et al., 2004). In der zitierten Studie wird eine signifikant höhere Affinität für die unphosphorylierte Hepadsequenz YSPTSPS gezeigt, eine Bindung an phosphorylierte Peptide kann zu einem deutlich geringeren Grad jedoch dennoch erfolgen. Die mögliche Alternative zum Antikörper 8WG16 bestand in dem kommerziell verfügbaren IgM-Antikörper H5, welcher die am zweiten Serin phosphorylierte CTD-Sequenz YSPTSPS erkennt. Da dieser Antikörper vom IgM-Typ jedoch nicht über die verwendeten IgG 2a -bindenden Antikörperfragmente mit dem Akzeptorfluorophor APC markiert werden konnte, schied diese Alternative aus. 63

73 Bei den FRET-Messungen der Ansätze im 20 µl Format konnte durch die Anregung des Europiums ein stabiles Signal bei λ ex = 620 nm erzeugt werden, dessen Intensität durch die Zugabe von Akzeptor-Fluorophor im Mittel aber nur sehr ineffizient abgenommen hat. Dabei konnte unter den drei unterschiedlich langen Peptiden kein Peptid identifiziert werden, welches ein konstantes FRET- Signal erzeugte. In Vorexperimenten zur Anpassung des Gerätesetups wurde eine zunehmende FRET-Effizienz mit steigender Konzentration der Fluoreszenzfarbstoffe beobachtet. Der Vergleich der Messdaten von Ansätzen mit und ohne Peptid zeigt jedoch, dass die Zugabe des Peptids keine Steigerung der FRET-Effizienz zur Folge hatte. Daher scheint die hier angestrebte Assemblierung der Komponenten, welche in Abbildung 14 veranschaulicht ist, nicht im ausreichenden Maße einzutreten. Obwohl der Einsatz einer 5-fach höheren Konzentration von Akzeptorfluorophor die FRET- Effizienz in fast allen Ansätzen verdoppelte, konnte zwischen Ansätzen mit phosphoryliertem und nativem Peptid keine signifikante Differenz dokumentiert werden. Eine deutliche Differenz zwischen phosphoryliertem und nativem Peptid wurde nur für das Peptid 3 dokumentiert, obwohl auch hier die gemessene FRET-Effizienz unterhalb des Signals des Ansatzes ohne Peptid liegt. Daher muss man konstatieren, dass in den durchgeführten Untersuchungen bei einem deutlichen Hintergrundsignal die Zugabe der Substratpeptide keine Steigerung der FRET-Effizienz erwirkt hat. Die FRET- Messungen mit Ansätzen ohne Peptid deuten auf eine Peptid unabhängige Interaktion der Fluorophore hin. Eine Hypothese wäre, dass die zugesetzten APC-markierten F ab -Fragmente direkt mit Biotin kreuzreagieren und nicht am Antikörper gebunden bleiben. Ein Schwachpunkt des vorliegenden Versuchsaufbaus besteht darin, dass für den eingesetzten Antikörper 8WG16 kein Beleg vorgelegt wird, dass eine Interaktion mit den eingesetzten Peptiden besteht. Die Untersuchung der Spezifität von 8WG16 wurde mit Peptiden aus drei Wiederholungen der Heptasequenz durchgeführt (Jones et al., 2004). Da die verwendeten Peptide kürzer sind, könnte die räumliche Konfiguration der Substratpeptide variabler sein als in der CTD der RNA-Polymerase II und die Interaktion erschweren. Der Versuch, mittels Fluoreszenzmessung die Kinaseaktivität des P-TEFb Komplexes zu bestimmen, stellte sich als ein aufwendiges und störanfälliges 64

74 Experiment dar. Die im Rahmen der Fluoreszenzmessungen ermittelten Werte wiesen aufgrund einer hohen Variabilität keine gute Reproduzierbarkeit auf. Fehlerquellen können in den Interaktionen zwischen Streptavidin-Eu 3+ und dem Biotin des Substratpeptids, zwischen der Heptadsequenz und dem Antikörper 8WG16 sowie der Interaktion zwischen APC-markiertem F ab -Fragment und F c - Teil des Antikörpers auftreten. Erstrebenswert wäre für die zuletzt aufgeführte Interaktion eine kovalente Markierung des Antikörpers mit dem Akzeptorfluorophor, die zum Zeitpunkt unserer Untersuchung nicht verfügbar war. Attraktiv wäre außerdem eine kovalente Markierung eines Antikörpers, der gegen die phosphorylierte Heptadsequenz gerichtet ist. Die im Rahmen dieser Studie durchgeführten Bestrebungen, einen Reporterassay zur Bestimmung der Kinaseaktivität von P-TEFb auf Basis einer TR-FRET Messung zu erstellen, haben bislang nicht zu einem stablien FRET- Signal geführt, das durch P-TEFb-Aktivität modifiziert wurde. Neben zahlreichen Variablen, wie den nicht-kovalenten Wechselwirkungen und dem hohen Hintergrundsignal sollte daher in weiteren Schritten evaluiert werden, welche Bestandteile vereinfacht werden können, damit ein Kinaseassay ohne radioaktive Substanzen entwickelt werden kann. Gelänge es stabile TR-FRET-Assaybedingungen zu erstellen, könnten im Rahmen eines Hoch-Durchsatz-Screenings neue spezifische Inhibitoren von Kinasen gesucht werden (Übersichtsartikel in von Ahsen and Bomer, 2005). Spezifische P-TEFb Inhibitoren könnten im Kontext der antiretroviralen HIV- Therapie die Tat-vermittelte Stimulation der Transkription viralen Genoms beeinflussen. Im Gegensatz zur bisherigen antiviralen HIV-Therapie würde dadurch ein zelluläres Protein attackiert, welches anders als virale Proteine keiner hohen Mutationsrate unterliegt. Dabei sind vor allem Inhibitoren von Bedeutung, welche den Tat-gebundenen P-TEFb Komplex erkennen und inhibieren. 65

75 5.2. Modulation der Aktivität von P-TEFb Neben der Entwicklung eines Reporterassays zur Bestimmung der Kinaseaktivität des P-TEFb Komplexes sollten im Rahmen dieser Arbeit Aktivitäts-modulierende Proteine hergestellt werden, welche die P-TEFb Aktivität inhibieren. Da der zelluläre P-TEFb Inhibitor Hexim über mindestens zwei Domänen mit dem P-TEFb Komplex interagiert, wurde eine zweiseitige Interaktion zwischen Fusionsprotein und P-TEFb Komplex angestrebt. Der erste Teil der Fusionskonstrukte sollte als Cyclin T1 bindende Domäne die Assoziation mit dem P-TEFb Komplex vermitteln, die zweite Domäne einen inhibierenden Effekt auf die Kinaseaktivität der Cdk9 ausüben. Da während der Planungsphase Informationen zur P-TEFb Komplexstruktur noch fehlten, wurde die Kristallstruktur des verwandten Cdk2-CycA Paares herangezogen. Für das erste Fusionskonstrukt wurde eine Cyclin T1 bindende Domäne des Tat Proteins mit einem Cdk2 inhibierenden Abschnitt von p27 Kip1 fusioniert. Im Anschluss an die erfolgreiche Reinigung dieser sogenannten TatKip Proteine konnten die Assoziation mit Cyclin T1 (1-272) in einem ITC-Experiment gezeigt und die Dissoziationskonstante K d zu 1,7 µm bestimmt werden. Da die Dissoziationskonstante K d = 1,7 µm einer mittelstarken Protein-Protein Interaktion entspricht, kann von einer Anlagerung von TatKip an den P-TEFb Komplex ausgegangen werden. Bei der Untersuchung des Einflusses von TatKip auf die Kinaseaktivität von P-TEFb konnte im radioaktiven Filterbadassay keine signifikante Inhibition nachgewiesen werden. Demnach scheint der p27 Kip1 -Abschnitt des Fusionskonstrukts nicht analog zur Interaktion zwischen p27 Kip1 und Cdk2 mit dem N-terminalen Flügel der Cdk9 Kinase interagieren zu können. Der alleinige Nachweis einer Bindung zwischen TatKip und Cyclin T1 lässt leider keine Aussage darüber zu, wie sich das TatKip Konstrukt an der Oberfläche des P-TEFb Konstrukts anlagert. Anhand der während der Projektendphase veröffentlichten Kristallstrukturen von P-TEFb sowie eines Tat-P-TEFb Komplexes zwei Jahre darauf, können jedoch mögliche Hindernisse für das TatKip Konstrukt auf der Oberfläche von Cdk9 visualisiert werden (Baumli et al., 2008; Tahirov et al., 2010). 66

76 Die in Abbildung 31 dargestellten N-terminalen Kinaseflügel von Cdk2 und Cdk9 sind durch ein β-faltblatt aus jeweils fünf β Strängen gekennzeichnet. Die Stränge β 1 und β 2 liegen zusammen mit der dazwischen befindlichen glycinreichen Schleife im Dach des katalytischen Zentrums der jeweiligen Cdk (Baumli et al., 2008; Jeffrey et al., 1995). Bei Cdk2 fällt eine ausgeprägte Krümmung des β-faltblatts auf, welche durch hydrophobe Interaktionen von konservierten Aminosäuren stabilisiert wird. Bei Cdk9 positioniert sich oberhalb des β-faltblatts der im Vergleich zur Cdk2 längere N-Terminus. Bei der Anlagerung des Inhibitors p27 Kip1 kommt es zu einer Interaktion zwischen einer β-haarschleife von p27 Kip1 und konservierten, hydrophoben Resten des β-faltblatts von Cdk2 (Russo et al., 1996). Dadurch kommt es zu einer deutlichen Abflachung der Krümmung. Die in Abbildung 32 gezeigte Kristallstruktur von Cdk2 gebundenem p27 Kip1 zeigt die Verdrängung des β 1 -Strangs von Cdk2 aus dem β-faltblatt. Dabei wird der β 2 -Strang von Cdk2 um bis zu 8,5 Å verschoben, was eine Vergrößerung des Spalts zum katalytischen Zentrum zur Folge hat. In diese Öffnung inseriert die Helix von p27 Kip1 und verhindert eine ATP-Bindung. Der inhibierende Einfluss von p27 Kip1 auf die Cdk2 Kinaseaktivität wird auch bereits durch die Aufweitung des katalytischen Spalts vermittelt, da p27 Kip1 Proteine ohne Helix ebenfalls inhibitorisch wirken können (Luo et al., 1995; Polyak et al., 1994). Abbildung 31: Vergleich der N-terminalen Domänen von Cdk2 (A) und Cdk9 (B) (PDB: 1FIN und 3BLQ) 67

77 Abbildung 32: Interaktionen zwischen p27 Kip1 und dem N-terminalen Kinaseflügel von Cdk2. Die β-haarschleife von p27 Kip1 interagiert mit dem β-faltblatt von Cdk2. Anstelle des β 1 -Strangs von Cdk2 interagiert ein β-strang von p27 Kip1 mit dem β 2 -Strang (PDB: 1JSU). Welche Position das Fusionskonstrukt TatKip auf der Oberfläche des P-TEFb Komplexes eingeht, lässt sich durch die durchgeführten Experimente nicht vorhersagen. Sollte jedoch die p27 Kip1 Domäne in die Nähe des N-terminalen Kinaseflügels der Cdk9 gelangen, könnten Interaktionen zum β-faltblatt hypothetisch Einfluss auf die Kinaseaktivität haben. Dagegen spricht jedoch, dass aufgrund des N-Terminus von Cdk9 die Interaktion zum β-faltblatt erschwert sein dürfte. Dieser liegt oberhalb des β-faltblatts von Cdk9 und interagiert mit der Helix 5 von Cyclin T1 (Baumli et al., 2008). Weitere Belege, die eine fehlende Inhibition von P-TEFb durch das TatKip Protein erklären, lassen sich durch Tat vermittelte Änderungen der P-TEFb Struktur liefern. Der Vergleich der Kristallstrukturen von freiem und Tat gebundenem P-TEFb zeigt, dass die Anlagerung von Tat eine Rotation der Cdk9 um 8,5 bewirkt. Somit wird die Distanz zwisch en der Bindungsstelle von TatKip auf der Cyclin Oberfläche und Interaktion mit dem N-terminalen Kinaseflügel vergrößert (Tahirov et al., 2010). Im Rahmen der Anlagerung von Cyclin T1 kommt es zu einer diskreten Positionsänderung des phosphorylierten Threoninrests 186 an der T-Schleife der Cdk9 Kinase. Außerdem vermittelt Tat eine Annäherung der ersten 68

78 Abbildung 33: Tat gebundener P-TEFb Komplex. Cdk9 in grün mit gylcinreicher Schleife und Strängen β 1 und β 2 in rot. Cylcin T1 in blau, daran gebundenes Tat (1-49) in violett. In dunkelgrau ein Magnesiumion, in hellgrau zwei Zinkionen (PDB: 3MIA). Cyclinbox von Cyclin T1 an Cdk9. Helix 5 von Cyclin T1 verschiebt die Schleife zwischen dem β 3 -Strang und der α-c Helix um etwa 2,4 Å. Daraus folgt eine Konformationsänderung der Stränge β 1 und β 2 von Cdk9, zwischen denen die glycinreiche Schleife besteht. Diese an der Substraterkennung beteiligte Struktur wird somit durch die Anlagerung von Tat an den P-TEFb Komplex beeinflusst. Diese Beobachtung könnte erklären, weshalb in der Literatur auch Hinweise auf eine Phosphorylierung von S 5 Resten innerhalb der CTD- Heptadwiederholungen zu finden sind (Zusammenfassung in Meinhart et al., 2005). Zusammenfassend können neben dem im Vergleich zu Cdk2 längeren N-Terminus auch Cyclin T1 bedingte Konformationsänderungen des N-terminalen Kinaseflügels von Cdk9 eine verfehlte Inhibition durch das TatKip Protein erklären. Der Versuch ein Substratprotein mit einer Domäne des viralen Tat-Proteins an P-TEFb zu rekrutieren, scheiterte aufgrund einer verfehlten Affinität zu Cyclin T1. Kritisch ist anzumerken, dass die suggerierte Orientierung auf der Cyclinoberfläche aus einer Kristallstruktur stammt, in der die Tat-Domäne über einen Glycinlinker mit Cyclin T1 vorliegt und ein TAR Element stabilisierend auf 69