12 Enzymatische Prozesse *

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1 12 Enzyatishe Prozesse * Nahde in apitel 3 bereits die Grundlagen der Enzykinetik erläutert wurden, beshäftigt sih dieses apitel it der tehnishen Nutzung von Enzyen. Die Geshihte enzyatisher Prozesse beginnt shon vor ehreren Tausend Jahren. eit a Jahren wird z. B. das Enzy Chyosin zur äseherstellung genutzt. Die wissenshaftlihe Behandlung dieses Theas geht allerdings nur etwa zwei Jahrhunderte zurük führte Pasteur die erste ikrobielle Raeatspaltung von Weinsäuren ithilfe des hielpilzes Peniilliu glauu durh (Pasteur 1858). In den folgenden 70 Jahren wurde vereinzelt über neue enzyatishe Prozesse berihtet, so gelang es 1880 in den UA, das wohl erste hirale Produkt, Milhsäure, durh Ferentation zu produzieren (heldon 1993). Ab 1926, als uner das erste Enzy kristallisierte und den endgültigen Beweis führte, dass Enzye rein heishe ubstanzen sind, wurde das Potenzial der Enzye für die tehnishe Verwendung erkennbar (uer 1926). o setzte der Cheiker Otto Röh kurze Zeit später Enzye aus der Bauhspeiheldrüse als Beize für die Gerberei in der Lederindustrie ein und löste dait das unhygienishe Verfahren it Hundekot oder Taubenist ab (Buhholz und ashe 1997). Aber erst durh die Entwiklungen der Rekobinanten DNA-Tehnologie in den 1950er- Jahren war es öglih, die quantitative Verfügbarkeit von Enzyen wesentlih auszudehnen. Neben der Möglihkeit, nun untershiedlihe Enzye kostengünstig in Bakterien und Pflanzen in großen Mengen herzustellen, wurden Methoden entwikelt, die die Erforshung der Reaktionsehanisen und die direkte Manipulation der Enzyeigenshaften erlauben. * Autoren: ebastian Briehle, Mihael Howaldt, Thoas Röthig, Andreas Liese Das Potenzial der Enzye in industriellen Prozessen besteht darin, dass Enzye eine einzige definierte Reaktion bzw. eine lasse von Reaktionen katalysieren. I Vergleih zu anorganishen atalysatoren laufen enzyatish katalysierte Reaktionen unter ilden Reaktionsbedingungen in Bezug auf ph, Teperatur und Druk ab (apitel 3). Enzye katalysieren genau eine definierte Einzelreaktion, bei der eistens keine Verunreinigungen der Produkte durh Nebenreaktionen auftreten. Die Reaktionsedien, bestehend aus einigen wenigen oponenten, haben eist eine genau definierte Zusaensetzung, sodass die Aufreinigung verhältnisäßig geringe osten verursaht. Durh opplung ehrerer enzyatisher Reaktionen lassen sih Reaktionssequenzen aufbauen, u so auh koplexe Verbindungen synthetisieren zu können, doh steigen in der Praxis it der Anzahl der tufen einer solhen Reaktionssequenz die Problee bei der tehnishen Realisierung überproportional. Ein besonderer Vorteil von Enzyen ist ihre tereo- und Regiospezifität, da sie eistens nur ein Enantioer hiraler ubstrate transforieren bzw. nur ein Enantioer hiraler Produkte erzeugen, was gerade in der Produktion von Feinheikalien und Vorprodukten für die Pharazeutishe Industrie von großer Bedeutung ist. Daher gewinnen Enzye aufgrund ihrer hohen elektivität, pezifität und katalytishen Effizienz zunehende Bedeutung. Enzye werden in industriellen Prozessen in untershiedliher For eingesetzt. In odernen Prozessen werden eistens isolierte Enzye verwendet, die in bakteriellen, pflanzlihen oder tierishen Zellen produziert und aus diesen in oftals aufwendigen Prozessen isoliert werden. Diese Zellen können allerdings auh direkt i enzyatishen Prozess genutzt werden. Optish aktive Cyanhydrine lassen sih z. B. ithilfe von H. C h i e l ( e d. ), B i o p r o z e s s t e h n i k p e k t r u A k a d e i s h e r V e r l a g H e i d e l b e r g

2 Enzyatishe Prozesse geahlenen Bitterandeln durh das andeleigene Enzy Hydroxynitrilase synthetisieren. Ein Überblik über die Enzye, die in industriellen Prozessen eingesetzt werden, gibt Abbildung Die Hauptanwendungsgebiete für industrielle Enzye sind die Lebensittelindustrie und die Verwendung als Detergenzien. Als potenzielle Wahstusgebiete ersheinen besonders die Pharaindustrie sowie der Bereih des Uweltshutzes und in diesen Bereihen vor alle der Einsatz von speziellen Biokatalysatoren, da diese ein breites Anwendungsspektru aufweisen. In diese apitel werden die Grundlagen zu Auslegung, Berehnung und Betrieb von enzyatishen Prozessen diskutiert. I Vordergrund steht die tehnishe Nutzung von Enzyen. U enzyatishe Transforationsprozesse beurteilen zu können, werden neben der atheatishen Beshreibung idealer Reaktortypen die Vor- und Nahteile freier und heish/physikalish odifizierter (iobilisierter) Enzye diskutiert. Untershiedlihe Prozessführungen werden beshrieben sowie auf untershiedlihe Reaktionsedien, wässrige oder niht-konventionelle, wie organishe Lösungsittel, überkritishe Fluide und ionishe Flüssigkeiten, eingegangen. Für eine ausführlihere Darstellung wird auf die Fahliteratur über Enzytehnik, Biotransforation und Reaktionstehnik verwiesen. Zur Vereinfahung der Darstellung wird nur auf Enzye it einer hyperbolishen inetik eingegangen also Enzye, die sih durh eine Geshwindigkeitsgleihung vo Typ der Mihaelis-Menten-Gleihung beshreiben lassen, während allosterishe Enzye (apitel 3) niht berüksihtigt werden Matheatishe Beshreibung idealer Reaktortypen In diese Abshnitt werden die Grundlagen zur Berehnung von idealen Reaktortypen diskutiert. Betrahtet wird hier nur die Änderung der Masse bzw. toffenge der an einer Reaktion teilnehenden ubstanzen. Die Berehnung der Änderungen der Energie wird niht diskutiert. In apitel 4 und in apitel 11 sind Prozesse zur Ferentation von Zellen beshrieben. Die atheatishen Grundlagen sind identish zu den Grundlagen zur Berehnung enzyatisher und heisher Prozesse. Zu besseren Verständnis sind die Herleitungen der Berehnungsgleihungen hier allgeein gehalten und die Gleihungen sind sowohl für enzyatish als auh für heish katalysierte Reaktionen gültig. Man kann drei ideale Reaktortypen untersheiden: Abb Industrielle Enzye in der Cheie- und Nahrungsittelindustrie (Frost und ullivan 2003)

3 12.1 Matheatishe Beshreibung idealer Reaktortypen Rührkessel it völliger Durhishung (idealer Rührkessel), diskontinuierlih betrieben (atz- bzw. bath-reaktor) Rührkessel it völliger Durhishung (idealer Rührkessel), kontinuierlih betrieben (ontinuously operated stirred tank reator, CTR) tröungsrohr it Propfenströung (idealer Rohrreaktor), kontinuierlih betrieben (plug flow reator, PFR) Der bath-reaktor zeihnet sih dadurh aus, dass während des Betriebs des Reaktors keine Massenströe in den Reaktor ein- oder austreten; es ist also ein abgeshlossenes yste bzw. ein diskontinuierliher Prozess. I Gegensatz dazu sind die kontinuierlih betriebenen Reaktoren CTR und PFR offene ystee (apitel 4), da hier während des Betriebs Massenströe ein- und austreten. Das wesentlihe Merkal der idealen Rührkessel ist die hoogene Durhishung des esselinhalts zu jede Zeitpunkt, was bedeutet, dass keine Teperatur-, Druk- oder onzentrationsuntershiede i Reaktionsvoluen vorliegen (apitel 7). Das Haupterkal des idealen Rohrreaktors ist das pfropfenförige Geshwindigkeitsprofil i tröungsrohr (plugg Pfropfen). Alle Fluid- eleente passieren das Reaktionsvoluen it der gleihen Geshwindigkeit. Eine Mishung in Bewegungsrihtung, d. h. entlang der Rohrahse, ist daher auszushließen. Die Grundlage zur Berehnung sind die Massenbilanzgleihungen, wie sie shon i apitel 4 eingeführt worden sind. Zur Berehnung werden die Gesatassenbilanz des ystes, die Bilanzen der untershiedlihen toffe (ubstrate und/oder Produkte) und die (enzy-)kinetishen Gleihungen (apitel 3) herangezogen. Zu Aufstellen der Bilanzgleihungen zieht an eine gedahte Bilanzgrenze u ein definiertes Voluen; dies kann das gesate Voluen des Reaktors, aber auh ein beliebig kleines Voluen sein, und betrahtet die über die Bilanzgrenze ein- und austretenden Massenströe sowie die i Bilanzvoluen stattfindenden Reaktionen der bilanzierten Größe. Die ue der tröe und der Reaktionen beshreibt dann die zeitlihe Änderung der bilanzierten Größe. Forel 12.1 stellt eine Bilanzgleihung in Worten dar. zeitlihe Änderung der Bilanzgröße (12.1) Matheatish folgt daraus die Gesatassenbilanz (12.2a); bei der Betrahtung der gesaten Masse wird der Reaktionster gleih null, da keine Masse produziert bzw. vernihtet werden kann: dr i,ein i,aus (12.2a) dt i i R : Gesatasse des bilanzierten Voluens [kg] i,ein bzw. aus: ue aller ein- bzw. austretenden Massenströe [kg s 1 ] i: Indizes für die ein- und austretenden Massenströe und die Bilanz für eine oponente j: d j j,i,ein j,i,aus + r j V R (12.2b) dt i i j : Masse des bilanzierten toffes [kg] i,ein,bzw. aus: ein- bzw. austretende Massenströe des bilanzierten toffes [kg s 1 ] V R : Bilanzvoluen [3] r j : assenbezogene Reaktionsgeshwindigkeit des bilanzierten toffes [kg s 1 3] j,i: Indizes für den bilanzierten toff bzw. für die ein- und austretenden Massenströe Mit j M j. n j und r j M j. R j lässt sih die Massenbilanz für eine oponente j in die toffbilanzgleihung überführen: dn j dt i n j,i,ein n i j,i,aus eintretende tröe der Bilanzgröße austretende tröe Reaktionen der Bilanzgröße + der Bilanzgröße + R j V R n j : toffenge des bilanzierten toffes [ol] ṅn j,i ein bzw. aus : ein- bzw. austretende Molströe [ol s 1 ] M j : olare Masse des bilanzierten toffes [kg ol 1 ] R j : olbezogene Reaktionsgeshwindigkeit [ol s 1 3 ] (12.2)

4 Enzyatishe Prozesse Als weitere Vereinfahung zur Berehnung wird angenoen, dass die Dihte des ystes konstant ist, wie es bei Reaktionen in flüssiger Phase in der Regel der Fall ist Der bath-reaktor Der bath-reaktor ist in Abbildung 12.2 dargestellt. Er besitzt weder Zu- noh Abfluss. Zu Beginn der Reaktion wird der Reaktor it allen nötigen Reaktanden befüllt, und die Reaktion wird durh Zugabe des atalysators (Enzys) oder eines ubstrates gestartet. obald der gewünshte Usatz erreiht worden ist, wird die Reaktion abgebrohen. Der Abbruh kann z. B. durh Inaktivieren des atalysators (Enzy) herbeigeführt werden, inde der ph-wert oder die Teperatur verändert werden. Alternativ kann der atalysator (Enzy) von de Produkt-ubstrat-Geish durh Filtration abgetrennt werden. Die Veränderungen der Reaktionsbedingungen it der Zeit und de Ort sind in Abbildung 12.2 dargestellt: Die Reaktion beginnt it hohen ubstrat- und niedrigen Produktkonzentrationen, während gegen Ende der Reaktion der ugekehrte Fall vorliegt. I bath-reaktor stellt sih also kein stationärer Zustand ein. Die Funktionen, die die urvenverläufe beshreiben, sind i Folgenden hergeleitet: Da es sih u ein geshlossenes yste handelt, ohne Zu- oder Abflüsse, ist die Masse des ystes konstant und die Bilanzen vereinfahen sih zu d R 0 : Gesatasse (12.3) dt dn j R j V R : bilanzierte oponente (12.4a) dt Aufgrund der konstanten Dihte ist auh das Reaktionsvoluen V R konstant. Durh Teilen der Gleihung (12.4a) durh V R lässt sih die Bilanzgröße als onzentration angeben: d j R j (12.4b) dt R j ist die spezifishe Reaktionsgeshwindigkeit bezüglih der oponente j. Die Reaktionsgeshwindigkeiten bezüglih der einzelnen oponenten sind über die stöhioetrishen Faktoren iteinander verknüpft (Abshnitt 3.2): dξ dn j R 1 j R νv ν j (12.5) dt dt νv ν j In apitel 3 wurde die Berehnung der Reaktionsgeshwindigkeit basierend auf der Enzykinetik beshrieben. Die Reaktionsgeshwindigkeit einer enzyatishen Reaktion wird in der Regel it v bezeihnet. Für eine einfahe, irreversible, enzykatalysierte Reaktion > P, beshreibbar it der Mihaelis-Menten-inetik ohne Inhibierung folgt: dξ dp d v ax s R RP R v dt dt dt + s (12.6) and v ax sind die Mihaelis-onstante bzw. x die axiale Reaktionsgeshwindigkeit. Zu be- Abb ybolishe Darstellung eines bath-reaktors und sheatishe Darstellung der onzentrationsprofile als Funktion der Zeit und des Ortes. Die Bilanzgrenze zur Aufstellung der Bilanzgleihungen ist rot eingezeihnet

5 12.1 Matheatishe Beshreibung idealer Reaktortypen ahten ist der Vorzeihenwehsel, der durh die stöhioetrishen Faktoren, je nahde ob an die Bilanzgleihung für das Produkt (+) oder ubstrat ( ) aufstellt, eingeführt wird. Durh Integration der Gleihung (12.6) kann der zeitlihe Verlauf der ubstrat- bzw. Produktkonzentration bzw. der zeitlihe Verlauf hiervon abgeleiteter Größen wie Usatz, elektivität oder Ausbeute berehnet werden. t 1 t 0 dtt t 1 wobei der Usatz χ als, t 0, t χ 1,t 0 definiert ist. t0, t 1, t 0 d v, t 1 (12.7) (12.8) (12.9) ontinuierlihe Reaktoren In eine idealen kontinuierlih betriebenen Rührkesselreaktor r (Abb. 12.3) sind analog zu ideal durhishten bath-reaktor keinerlei Gradienten innerhalb des Reaktors vorhanden. In eine solhen CTR R stellt sih ein Fließgleihgewiht (Abshnitt 3.2) ein. Das Fehlen von Gradi-, t 0 + v ax,t 0 v t ln ( ) t ax Δ + (, t t 0, 1, t 1 ln + χ ( ), t 0 d enten und die Existenz eines Fließgleihgewihts bedeuten, dass ein CTR unter Auslaufbedingungen arbeitet. Mit Auslaufbedingungen sind die Bedingungen geeint, die i Austritt bzw. Ausfluss des Reaktors vorliegen. Die onzentrationen aller oponenten fallen it de Eintritt in den Reaktor augenbliklih von den Werten i Zustro auf die Werte i Austritt ab (Abb. 12.3). Durh die Annahe eines Fließgleihgewihts vereinfaht sih die Gesatassenbilanz zu: ein 0 i, i,aus (12.10a) i i und die Bilanzgleihung der einzelnen oponente 0 n j, i,ein n j,i,aus + R j, V R (12.10b) i i j,aus Rj,R j,aus : Reaktionsgeshwindigkeit der oponente j bei der a Reaktoraustritt vorliegenden onzentration j,aus Unter der Annahe der konstanten Dihte folgt aus Gleihung (12.10a), dass die ue der Voluenströe a Eingang gleih der des Ausgangs ist. Q Q Q (12.11) F i ein, j i aus, j Q : Voluenstro [3 s 1 ] Q F : ue der Voluenströe des Feeds [3 s 1 ] Durh die Einführung der Voluenströe lassen sih die Molströe in Gleihung (12.10b) auh als onzentrationen ausdrüken: Abb ybolishe Darstellung eines CTR und sheatishe Darstellung der sprunghaften onzentrationsänderung a Eintritt in den Reaktor (Übershreitung der gestrihelten senkrehten Linie). Die Bilanzgrenze zur Aufstellung der Bilanzgleihungen ist rot eingezeihnet

6 Enzyatishe Prozesse 0 Q Q + R i ein, j j,i,ein i aus, j j,i,aus j, V j,aus R (12.12) In eine Reaktor it nur eine Zulauf und eine Ablauf sowie der Einführung der ittleren Verweilzeit (Gleihung (12.14)) vereinfaht sih Gleihung (12.12) zu: ( ) j,aus j,ein τ (12.13) R j, j, aus wobei die ittlere Verweilzeit τ definiert ist als: τ V R Q F : ittlere Verweilzeit [s] (12.14) Die ittlere Verweilzeit beshreibt die Zeit wie lange ein kleines Flüssigkeitsvoluen i Mittel i Reaktor verweilt. Die spezifishe Reaktionsgeshwindigkeit R j, j lässt sih analog zu bath-reaktor it, aus der in apitel 3 beshriebenen Enzykinetik beshreiben. Mit der Definition des Usatzes χ lässt sih so für eine enzykatalysierte Reaktion die erforderlihe Verweilzeit τ für einen gewünshten Usatz χ bestien (Gleihung (12.15)). χ τ,ein (12.15) v,aus In eine idealen Rohrreaktor fließt die Reaktionslösung als Pfropfen durh das Rohr. In eine PFR bilden sih weder lainare noh turbulente tröungsprofile aus, noh tritt eine Rükverishung auf; d. h. jedes Flüssigkeitseleent verbringt die gleihe Zeit i Reaktor und bewegt sih it der ittleren Geshwindigkeit v x durh den Reaktor. Bildlih kann an sih den PFR so vorstellen, dass unendlih viele kleine, ideale bath-reaktoren it der Geshwindigkeit LR v Q x V R und de Voluen dv R durh das Rohr wandern (Abb. 12.4). Alle diese kleinen bath-reaktoren verbringen genau gleih viel Zeit i Rohrreaktor. Diese Reaktionszeit entspriht der Verweilzeit τ i Rohrreaktor. Deshalb sind auh die atheatishe Beshreibung des bath-reaktors und des PFRs identish, nur dass die Reaktionszeit t durh die Verweilzeit τ ersetzt werden uss, d. h. die Diensionen sind vertausht. I Vergleih zu bath-reaktor ändert sih also die onzentration niht über die Zeit, sondern entlang der Länge des Reaktors, während an eine festen Ort x n die onzentration über die Zeit konstant ist. Für einen stationären Betrieb resultiert daher aus der Massenbilanz: τ,aus χ d dχχ dττ τ, ein (12.16) 0 v v, ein 0 U die für einen gewünshten Usatz χ er- forderlihe Verweilzeit τ zu bestien, uss bei PFR also die Gleihung (12.16) analog zu bath-reaktor integriert werden, nahde die Gleihung für die Reaktionsgeshwindigkeit eingesetzt worden ist. In Tabelle 12.1 sind die Auslegungsgleihungen für den PFR und den CTR für vershiedene Enzykinetiken dargestellt. Die Ergebnisse für Abb ybolishe Darstellung eines PFR und sheatishe Darstellung der onzentrationsprofile als Funktion der Zeit und des Ortes. Das Voluen dv R kennzeihnet einen kleinen bath-reaktor, der it der Geshwindigkeit v x durh den Rohrreaktor wandert

7 12.1 Matheatishe Beshreibung idealer Reaktortypen den PFR gelten ebenfalls für den bath-reaktor, wobei statt der Verweilzeit τ die Reaktionszeit t zu setzen ist. Mithilfe dieses vorgestellten atheatishen Modells lassen sih untershiedlihe Bauarten von Reaktoren beshreiben. Die Idealisierung der Reaktoren ist allerdings eine Modellvorstellung, die in der Realität nieals erreiht werden kann. Häufig sind aber insbesondere i kleinen Maßstab die Abweihungen vo idealen Zustand so klein, dass der reale Reaktor als ideal durhisht bzw. it Propfenströung betrahtet werden kann. Durh obinationsshaltungen der idealen Einzelreaktoren lassen sih auh koplexere Bauarten beshreiben. Der Festbettreaktor kann bei niedrigen tröungsgeshwindigkeiten und keiner tofftransportliitierung als idealer Rohrreaktor betrahtet werden. Bei Festbettreaktor sind die Träger diht gepakt und werden vo Reaktionsediu uspült (Abb. 12.5a). Bei eine Wirbelshihtreaktor hingegen werden die Träger durh den Flüssigkeitsstro aufgewirbelt (Abb. 12.5b). Es kot zu einer Rükverishung entlang der Längsahse des Reaktors. Die Charakteristik des Wirbelshihtreaktors liegt je nah Grad der Rükverishung zwishen der des PFR und der des CTR. Daher lässt sih das Verhalten durh eine obinationsshaltung von PFRs und CTRs beshreiben. Tabelle 12.1 Vergleih der Reaktionsgeshwindigkeit i CTR und i PFR als Funktion der Verweilzeit. I Fall des bath-reaktors ist τ durh die Reaktionszeit t und,ein und,aus durh die ubstratkonzentration a Anfang bzw. Ende der Reaktion zu ersetzen PFR, bzw. bath-reaktor CTR Einfahe Mihaelis- Menten-inetik (MM) vax v +,ein τ ln ( ) ( ein,aus ) ( aus ), +, vax +,aus ln +, ein ( ) χ vax τ χ + 1 χ, ein χ,aus MM it ubstratübershussinhibierung vax v + (1 + ) i vax + τ ln 2, ein 2 2, ein + 2 2, aus i ln i ( ),ein,aus + χ (2 χ) ),ein +( ( ) χ vax τ ( ),,aus +, aus χ +, ein χ+χ+ (1 χ) ) 1 χ 2, ein i + 2, aus i MM it kopetitiver Produktinhibierung vax v P (1 + ) + ip vax τ 1+ ip + 1 ip + 1, 1 ip,ein ( ) ein ip,ein ln χ ln ( ),ein, aus v τ vax + ( ) χ + 1 χ, ein ip,,, aus + 1, ein χ 2 χ (1 χ) ),aus +, ein ip, aus

8 Enzyatishe Prozesse Abb heatishe Darstellung des Festbettreaktors (a) und des Wirbelshihtreaktors (b). Die atalysatorpartikel sind rot dagestellt Reaktorwahl Die Enzykinetik beeinflusst die in den vershiedenen Reaktoren erzielbaren Usätze in untershiedliher Weise. Wie die Herleitung zeigt, können der bath-reaktor und der PFR it den gleihen Auslegungsgleihungen beshrieben werden, daher verhalten sih diese beiden Reaktoren unter Einbezug der Enzykinetik gleih. Die Leistung eines bath-reaktors hängt soit vor alle von den Rüstzeiten ab, je größer der Anteil der Rüstzeiten a Gesatprozess ist, desto geringer ist die Leistung des bath-reaktors. Bei vernahlässigbaren Rüstzeiten sind die Leistungen des bath- und plugflow-reaktors gleih. Aus der Reaktionstehnik kann abgeleitet werden, dass bei gleihe Usatz substratübershuss-inhibierte Reaktionen vorteilhafter i CTR und produktinhibierte Reaktionen vorteilhafter i bath-reaktor bzw. PFR ablaufen. Dies hängt dait zusaen, dass überall i CTR Auslaufbedingungen vorliegen, soit in Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen niedrige ubstrat- und hohe Produktkonzentrationen vorliegen. I bath-reaktor hingegen baut sih die Produktkonzentration erst i Verlauf der Reaktion auf. Entsprehend herrshen bei Eintritt in den PFR hohe ubstratkonzentrationen vor, und erst it der Passage durh den Reaktor wird ubstrat in Produkt ugewandelt, sodass in Abhängigkeit von der axialen oordinate untershiedlihe ubstrat- und Produktkonzentrationen vorliegen. Weiterhin ist aus der Reaktionskinetik bekannt, dass alle Reaktionen it Reaktionsordnungen größer null shneller i PFR als i CTR ablaufen. Enzye katalysieren i Bereih hoher ubstratkonzentrationen eine Reaktion nullter Ordnung, während i Bereih niedriger ubstratkonzentrationen eine Reaktionskinetik erster Ordnung vorliegt (Abb. 3.4). Der Übergangsbereih wird durh die Mihaelis-Menten- Gleihung beshrieben. Ein wesentliher Paraeter bei der Beurteilung der Reaktorwahl ist soit r 0, das Verhältnis der anfänglihen ubstratkonzentration,tt 0 zu -Wert des Enzys,, t 0 r (12.17) 0 Wenn die Bedingung r 0 >> 1 (d. h. >> ) über den gesaten Reaktionsbereih erfüllt ist, befindet sih i Fall einer einfahen Mihaelis- Menten-inetik die Reaktion stets i Bereih nullter Ordnung, und es werden identishe Usätze i CTR und i PFR erzielt. Diese ituation liegt vor, wenn z. B. die -Werte klein sind bzw. kein hoher Usatz angestrebt wird. Falls diese Bedingung niht erfüllt ist, dann ist bei gleiher Verweilzeit der Usatz i CTR kleiner als der i PFR. In den Abbildungen 12.6 bis 12.8 wird der Enzybedarf i PFR und CTR verglihen. Hierbei ist e CTR die absolute Enzyenge bzw. Enzyaktivität, die in eine CTR erforderlih ist, u den gewünshten Usatz zu erreihen. Der Enzybedarf in vershiedenen Reaktoren lässt sih vergleihen, inde das Verhältnis e CTR / e PFR gegen den gewünshten Usatz aufgetragen wird. Aus den in Tabelle 12.1 dargestellten Gleihungen ist ersihtlih, dass eine Verdopplung der Enzyaktivität v ax den gleihen Effekt hat wie eine Verdopplung der Verweilzeit τ. Dait gilt also e CTR /e PFR τ CTR /τ PFR.

9 12.1 Matheatishe Beshreibung idealer Reaktortypen In Abbildung 12.6 ist e CTR /e PFR für eine einfahe Mihaelis-Menten-inetik und untershiedlihe r 0 -Werte aufgetragen. Bei eine r 0 -Wert von 100 ist die Reaktion über weite Usatzbereihe nullter Ordnung. Erst in der Nähe des vollständigen Usatzes ist die ubstratkonzentration so gering geworden, dass die inetik zunähst in den Übergangsbereih und dann in den Bereih erster Ordnung gelangt. Deentsprehend treten Untershiede zwishen CTR und PFR erst bei sehr hohen Usätzen auf. Je niedriger der r 0 -Wert ist, bei desto geringeren Usätzen weiht das Verhältnis e CTR / e PFR vo Wert 1 ab. Bei de kleinen Wert r 0 0,1 befindet sih die Reaktion von Anfang an i Bereih erster Ordnung, sodass der CTR bereits bei geringen Usätzen ehr Enzy als der PFR benötigt, u den gleihen Usatz zu erreihen. In Abbildung 12.7 ist e CTR /e PFR für ein Enzy it ubstratübershussinhibierung wiedergegeben. Hier ist ein konstanter r 0 -Wert von 10 gewählt, und der Paraeter der urven ist r i, das Verhältnis des i - und des -Wertes: Allgeein gilt, dass nur bei Werten r ip >1 die Reaktion effizient durhgeführt werden kann. Bei Werten r ip <1 ist die Reaktion zu sehr gehet, u hohe Usätze zu erreihen (Lee und Abb Vergleih des Enzybedarfs i CTR und i PFR für ein Enzy it einfaher Mihaelis-Menten-inetik i r (12.18) i Bei starker ubstratübershussinhibierung d. h. kleine r i ist der CTR bis zu hohen Usätzen de PFR überlegen. Wenn die Reaktion nur geringfügig substratübershussinhibiert ist, dann ist bei niedrigen Usätzen der CTR, bei hohen Usätzen der PFR vorteilhafter. Abbildung 12.8 gibt die Verhältnisse für eine Enzykinetik it kopetitiver Produktinhibierung g wieder, wobei wie in Abbildung 12.6 r 0 10 gewählt wurde und r ip der Paraeter P ist: Abb Vergleih des Enzybedarfs i CTR und i PFR für ein Enzy it ubstratübershussinhibierung ip r (12.19) ip I Fall der Produktheung ist der PFR de CTR in allen Fällen überlegen: Bei großen r ip - Werten also kleiner Heung durh das Produkt überwiegt der Einfluss der Mihaelis- Menten-inetik bzw. der Reaktion erster Ordnung, während bei kleinen ip / -Werten der Einfluss der Produktinhibierung den PFR bei allen Usätzen begünstigt. Abb Vergleih des Enzybedarfs i CTR und i PFR für ein Enzy it kopetitiver Produktinhibierung

10 Enzyatishe Prozesse Whitesides 1985). Da die kinetishen Paraeter einer Reaktion niht verändert werden können, ist es nur öglih, hohe Usätze zu erreihen, wenn durh ein entsprehendes Prozessdesign die Produktkonzentration niedrig gehalten werden kann. Dieses kann z. B. durh selektiven Austrag des Produktes geshehen (Liese et al. 1996). Bei industriellen Prozessen interessiert i Wesentlihen der Bereih von Usätzen χ > 0,8 bis in die Nähe des vollständigen Usatzes. Aus den Abbildungen 12.6 bis 12.8 ist ersihtlih, dass gerade in diese Bereih die größten Änderungen i Verhältnis e CTR /e PFR auftreten. Die Wahl des geeigneten Reaktors kann dait die Effektivität des Prozesses entsheidend beeinflussen. Falls das Reaktionsgleihgewiht auf eite des ubstrates liegt oder das Produkt heend auf die Enzyaktivität wirkt, dann kann ein selektiver Produktaustrag die Produktivität des Reaktionssystes vergrößern. Dies ist z. B. öglih, inde eine selektive Mebran eingesetzt wird, die nur Produkt, niht aber Enzy oder ubstrat passieren lässt. In solhen ituationen bieten sih kontinuierlih betriebene Reaktoren an. Die teigerung des Usatzes durh kontinuierlihen Produktaustrag soll an eine einfahen Enzyprozess deonstriert werden, der in eine CTR (Abb. 12.3) abläuft. Die Reaktion ist eine irreversible Ein-ubstrat-Reaktion it kopetitiver Produktheung P (Gleihung (3.50b)): vax s v P 1+ + (12.20) ip und die elektivitäten der Produktabtrennstufe für ubstrat und Produkt werden durh β s und β P beshrieben: β β P,aus,R P,aus P,R (12.21a) (12.21b) wobei,aus, P,aus,,R und P,R die ubstrat- bzw. Produktkonzentration a Prozessausgang bzw. i Rührkesselreaktor sind. Für β s β P 1 verhält sih der Reaktor wie ein klassisher Rührkesselreaktor, in de ubstrat und Produkt in gleihe Maße abgetrennt werden. I stationären Zustand lauten die Massenbilanzen für ubstrat und Produkt: Q ein Q F aus Q,ein F F,aus V,R R (12.22a) 0 Q Q + v (12.22b) 0 Q + v (12.22) F P,aus V,R R wobei V R für das Reaktorvoluen und,ein für die ubstratkonzentration i Zulauf steht. Durh Gleihsetzen der Gleihungen (12.22b) und (12.22) ergibt sih: (12.23) P, aus,ein,aus Durh Einsetzen der Gleihungen (12.21) in (12.23) und durh Einsetzen von (12.20) in (12.22) kann P,R eliiniert werden. Nah einigen Uforungen erhält an die Reaktorkonzentration,R als Funktion der kinetishen onstanten, der elektivitäten und der Verweilzeit i Reaktor: b ± 2 a 2 b 4 a, R 2 it: a β 2 ip β β P a (12.24) (12.25a) Da a sowohl positiv als auh negativ sein kann, uss der Vorzeihenwehsel in Gleihung (12.24) beahtet werden. b 2 ip β β,ein P,ein + β + v ax τ,ein (12.25b) 2,ein 1 + (12.25) ip β P Abbildung 12.9 gibt die teigerung des Usatzes in eine Rührkesselreaktor bei konstanter Verweilzeit τ, vershieden stark ausgeprägten Produktinhibierungen r ip und variierender elektivität des Produktaustrags β P an. Aus Abbildung 12.9 ist ersihtlih, dass die Produktivität des Reaktors durh selektiven Produktaustrag erheblih gesteigert werden kann. Die Erhöhung des Usatzes fällt uso gewihtiger aus,

11 12.1 Matheatishe Beshreibung idealer Reaktortypen je stärker das Ausaß der Produktinhibierung ist. Neben den Vor- und Nahteilen der untershiedlihen Reaktoren bei untershiedlihen Enzykinetiken ist die ontrolle z. B. des ph- Wertes aufgrund der besseren Durhishung bei Rührkesseln einfaher. Gleihes gilt für die Abb teigerung des Usatzes eines Enzyreaktors durh selektiven Produktaustrag. Die Paraeter für die iulation wurden auf folgende Werte gesetzt: r 0 10; v ax τ 15 ; β s 0,5 auerstoffversorgung bei Einsatz von Oxidasen, die auerstoff als ein ubstrat benötigen. Weitere Aspekte sind die Investitions- und Lohnkosten bei Betrieb. Die niedrigen Investitionskosten und hohe Flexibilität des bath-reaktors werden erkauft durh hohe Lohnkosten, da ein diskontinuierliher Prozess shlehter autoatisiert werden kann i Vergleih zu kontinuierlih betriebenen Prozessen. Der hohe Regelaufwand und der hohe Autoatisierungsgrad von kontinuierlihen Prozessen treiben die Investitionskosten nah oben, allerdings kann eine gleihbleibende Produktqualität bei gleihzeitig hohen Rau-Zeit-Ausbeuten erreiht werden. Die Vor- und Nahteile der untershiedlihen Reaktoren sind in Tabelle 12.2 zusaengefasst Reaktorwahl anhand eines Beispiels Abshließend zur theoretishen Betrahtung der idealen Reaktoren soll die Reaktorwahl anhand der enzykatalysierten ynthese von hiralen Tabelle 12.2 Vergleih der idealen Reaktoren Vorteile Nahteile bath-reaktor hohe Flexibilität diskontinuierlih hoher Usatz shlehteste Rau-Zeit-Ausbeute auf- niedrige Investitionskosten wegen grund von tand- und Rüstzeiten eist geringere Regelaufwand hohe Lohnkosten durh höheren einfahe ph-ontrolle und auerstoff- Personalaufwand versorgung (Oxidasen) hohe ubstratkonzentrationen ubstratübershussinhibierung PFR höhste Rau-Zeit-Ausbeute geringe Flexibilität weitgehende Autoatisierung ontrolle der Reaktionsbedingungen wie geringe Lohnkosten ph oder po 2 shwierig bzw. unöglih kleine Reaktorvoluina hohe Investitionskosten gleihbleibende Produktqualität hoher Regelaufwand hohe ubstratkonzentrationen wenig geeignet bei ubstratübershussinhibierung CTR einfahe ph-ontrolle und auerstoff- geringe Flexibilität versorgung (Oxidasen) aufgrund der hohe Investitionskosten idealen Durhishung hoher Regelaufwand ontrolle der Reaktionsgeshwindigkeit hohe Produktkonzentration weitgehende Autoatisierung wenig geeignet bei Produktinhibierung geringe Lohnkosten niedrigerer Usatz für Reaktionen kleine Reaktorvoluina erster und höherer Ordnung gleihbleibende Produktqualität

12 Enzyatishe Prozesse Cyanhydrinen diskutiert werden. (R)-Hydroxynitrillyase ((R)-HNL), (R)-Oxynitrilase) katalysiert die enantioselektive Addition von Blausäure (HCN) an Benzaldehyd und andere Aldehyde (Gregory 1999). Allerdings verindert eine konkurrierende niht-enzyatishe Parallelreaktion den Enantioerübershuss des Produktes (ragl et al. 1990; Abb ). Betrahtet an nun die Reaktionsgeshwindigkeiten der beiden Reaktionen in Abhängigkeit von der Benzaldehydkonzentration, ergibt sih folgendes Bild: Die enzyatishe Reaktion verhält sih geäß der Mihaelis-Menten-inetik, und die axiale Reaktionsgeshwindigkeit ist erreiht bei einer ubstratkonzentration von a. 5 ol l 1 (HCN-onzentration Abb Enzykatalysierte Addition von Blausäure an Benzaldehyd und Parallelreaktion Abb inetik der enzykatalysierten Addition von Blausäure an Benzaldehyd und der Parallelreaktion als Funktion der Benzaldehydkonzentration

13 12.2 Tehnisher Einsatz von freien und iobilisierten Enzyen ,0 ol l 1 ). Die Reaktionsrate der heishen Reaktion steigt linear it der ubstratkonzentration (erste Ordnung). Als onsequenz ist die enzyatishe Reaktion doinierender bei geringen Benzaldehydkonzentrationen (Abb ). Für das zweite ubstrat HCN gilt die analoge Überlegung. Aus der Betrahtung der Verläufe der enzykatalysierten Hauptreaktion und der stöhioetrishen Nebenreaktion kann festgestellt werden, dass die elektivität bezüglih des gewünshten Enantioers bei niedrigen ubstratkonzentrationen a größten ist. Da in eine CTR a stationären Betriebspunkt onzentrationen konstant gehalten werden können und die gewünshte onzentration über die Verweilzeit bzw. atalysatorenge eingestellt werden kann, wird in diese Beispiel ein solher Reaktor favorisiert. Der -Wert bezüglih HCN ist allerdings it 711 ol l 1 i Vergleih zu -Wert für Benzaldehyd ehr als fah erhöht ( Benzaldehyd 0,46 ol l 1 ). tellt an den stationären Betriebspunkt i CTR bei eine hohen Usatz ein, resultiert aufgrund der Auslaufbedingungen eine niedrige ubstratkonzentation; d. h. für die enzykatalysierte Reaktion resultiert eine Reaktionsordnung > 0 und soit eine niedrige Reaktionsgeshwindigkeit. Man betreibt den Reaktor also bei onditionen, bei denen r 0,HCN <<1 ist. Bei kleinen r 0 -Werten ist der CTR de PFR jedoh deutlih unterlegen (Abb. 12.6). U hohe Usätze i CTR zu erreihen, üsste daher die atalysatorenge oder das Reaktorvoluen erhöht werden, was zu erhöhten Prozesskosten führen würde. Hier könnte also ein PFR von Vorteil sein. Dieses Beispiel ist ein typishes Optiierungsproble, welhes häufig bei industriellen Prozessen auftritt. Es uss abgewogen werden zwishen der gewünshten Reinheit des Produktstros nah der Reaktion und den dadurh entstehenden Mehrkosten. Die Wahl des besten Reaktortyps und der optialen Reaktionsbedingungen ist in diese Fall niht nur auf Basis der Reaktionskinetik zu treffen, sondern bedarf eines iulationsodells basierend auf den Massenbilanzen, it de sih Faktoren wie Produktionsvoluen, atalysatorkosten, tabilität des atalysators und osten für die Aufarbeitung des Produktes abshätzen und optiieren lassen. Alle diese Aspekte beeinflussen die Reaktorwahl und üssen für jeden Prozess neu betrahtet werden Tehnisher Einsatz von freien und iobilisierten Enzyen Nahde in den vorgehenden apiteln die Reaktoren und deren Vor- und Nahteile theoretish diskutiert wurden, stellt sih nun die Frage des tehnishen Einsatzes von Enzyen. Hierbei gilt es zu klären, ob freie unodifizierte Enzye oder heish/physikalish odifizierte Enzye eingesetzt werden. Die heishe/physikalishe Modifikation von Enzyen kann auf untershiedlihe Art erfolgen (Abb ): Einshließen des Enzys in (Gel-)apseln oder Fasern; kovalente, ionogene oder adsorptive Bindung des Enzys an Trägeraterialien; Quervernetzung der einzelnen Enzye (rosslinking) bzw. der einzelnen Enzye und Trägerpartikel (Co-rosslinking) zur Bildung eines stabilen Enzyaggregates. Die Entsheidung, ob niht-odifizierte oder odifizierte Enzye verwendet werden sollen, wird von vielen Faktoren beeinflusst und uss für jeden Anwendungsfall gesondert getroffen werden. In Tabelle 12.3 sind Vor- und Nahteile dieser beiden Verfahren zusaengefasst. Während freie Enzye nur in Lösung eingesetzt werden können und eist it aufwendigen Ultrafiltrationen vollständig von de Reaktionsediu abgetrennt werden üssen (Abshnitt 12.5), erweitert sih das Anwendungsspektru durh die Modifikation von Enzyen. o lassen sih einfaher kontinuierlihe Prozesse realisieren, wie z. B. Festbett- oder Wirbelshihtreaktoren, wofür die Fixierung (Iobilisierung) des Enzys an einen Träger notwendig ist. Da kleine Träger und apseln in Lösungen suspendiert werden können, kann auh eine quasi hoogene atalyse realisiert werden. Dieses gilt

14 Enzyatishe Prozesse Tabelle 12.3 Vergleih der Vor- und Nahteile niht-odifizierter und odifizierter Enzye Niht-odifizierte Enzye geringe osten hoogene atalyse häufig eingeshränkte tabilität unveränderte Aktivität unveränderte kinetishe onstanten ershwerte eparation vo Reaktionsediu und atalysator ershwerte Wiederverwendung feste ubstrate öglih Modifizierte Enzye hohe osten geringe Aktivitätsausbeute durh die Modifizierung heterogene atalyse bei trägergebundenen Enzyen, d. h. unter Uständen tofftransportliitierung erhöhte tabilität veränderte kinetishe onstanten einfahe eparation vo Reaktionsediu und atalysator einfahe Wiederverwendung nur löslihe ubstrate Einshluss Bindung Matrixeinshluss trägerfixiert nativ apseln Fasern ionish/ adsorptiv kovalent rosslinking o-rosslinking Enzy Enzy Enzy Enzy Enzy Enzy Abb Arten der heish/physikalishen Modifikation von Enzyen Enzy Enzy Enzy Enzy Enzy Enzy Enzy Enzy Enzy Enzy Enzy Enzy Enzy Enzy Enzy aber nur, wenn die Diffusionsliitierung aufgrund des kleinen Partikeldurhessers in der Größenordnung des -Wertes liegt. Durh die Vergrößerung des ittleren Partikeldurhessers gegenüber de freien Enzys reduziert sih allerdings der Aufwand bei der Abtrennung von Feststoff und Reaktionsediu. Ein wesentliher Faktor, der die Entsheidung zu Einsatz von odifizierten Enzyen beeinflusst, sind die osten für das Enzy. Bei preiswerten Enzyen lohnt sih der Aufwand für die Modifikation niht; solhe Enzye werden nur einal eingesetzt und a Ende des Prozesses verworfen. Werden die Produktionskosten jedoh wesentlih von den Enzykosten bestit, so kann durh Modifikation, Rezirkulierung und Rükhalt des Enzys i Reaktor die Turnover- Zahl für das Enzy (Mol erzeugtes Produkt je Mol verbrauhtes Enzy) erhöht und dait der relative Anteil der Enzykosten an den Gesatkosten gesenkt werden. Falls durh Modifikation die tabilität des Enzys wesentlih erhöht werden kann, resultieren längere tandzeiten des kontinuierlihen Prozesses Prozessvarianten Der einfahste Prozess ist der Einsatz von freien Enzyen. Die unodifizierten Enzye werden

15 12.3 Prozessvarianten a Anfang des Prozesses zugesetzt und nah Ablauf der Reaktion verworfen. olh ein Prozess kann ein bath-prozess sein, es koen aber auh CTR oder PFR zu Einsatz. In allen Fällen handelt es sih u eine hoogene atalyse, bei der das Enzy in der Regel a Ende des Prozesses inaktiviert wird. Je nah Anwendungsfall verbleibt das (inaktivierte) Enzy in der Produktlösung oder wird i Zuge der Produktaufarbeitung entfernt. olh eine Prozessführung ohne Rükhaltung, Wiederverwendung bzw. Rezirkulierung des atalysators ist niht nur auf unodifizierte Enzye beshränkt; suspendierbare iobilisierte Enzye sowie quervernetzte Enzye könnten ebenfalls eingesetzt werden, allerdings sind die osten der heish/physikalishen Modifikation eist zu hoh und die Vorteile zu gering, als dass sih solh ein Aufwand lohnt. Werden daher teure oder odifizierte Enzye eingesetzt, üssen diese vielfah rezykliert werden, u den resultierenden Prozess ökonoish zu gestalten. Zwei grundlegende Prozessvarianten sind hier denkbar: Iobilisieren des Enzys in apseln, Fasern oder auf akroskopishen Trägern, die dann in Festbett- bzw. Wirbelshihtreaktoren eingesetzt werden können (Abb. 12.5). Es handelt sih u eine heterogene atalyse. Das Enzy verbleibt ortsfest i Reaktor und wird vo Reaktionsediu uspült, ohne dass es vo Produktstro aus de Reaktor getragen wird. Oft wird de Enzy durh die Bindung an feste Träger zusätzlih tabilität verliehen, wobei häufig ein wesentliher Nahteil die auftretenden tofftransportliitierungen sind (Abshnitt 12.4). Löslihe, freie bzw. suspendierbare, odifizierte Enzye werden it kontinuierlih betriebenen eparationsodulen vorwiegend Mebranfiltern a Verlassen des Prozesses gehindert. Durh diese Art der Prozessführung lassen sih die Vorteile der heterogenen atalyse in eine kontinuierlihen Prozess realisieren. Mebranreaktoren sind die bekannteste tehnishe Lösung und werden i Abshnitt 12.5 diskutiert. Der Produktstro aus eine Reaktor it iobilisierten Enzyen bzw. it Rükhaltung des Enzys ist weitgehend frei von Enzyverunreinigungen, sodass die Iobilisierung als erster hritt der Produktaufarbeitung (Downstrea Proessing, apitel 10) betrahtet werden kann. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn reine Produkte gewünsht sind. Bei den vorher genannten Prozessvarianten handelt es sih in der Regel u einphasige, vorwiegend wässrige ystee. Lange Zeit wurde angenoen, dass die Biokatalyse auf rein wässrige Medien und daher auh auf wasserlöslihe ubstrate und Produkte beshränkt sei. Tatsählih arbeiten viele Enzye jedoh natürliherweise in niht wässrigen Ugebungen, z. B. in Zellebranen. Bereits 1936 führte y Estersynthesen, katalysiert durh Lipasen in eine organishen Lösungsittel, Benzol, durh. Die Entdekung, dass Biokatalysatoren auh in niht rein wässriger Ugebung arbeiten, hat der Biotehnologie eine neue Reaktionsführung ershlossen. Viele organishe Produkte, die heute in der heishen, pharazeutishen oder Lebensittelindustrie hergestellt bzw. als Grundsubstanzen benötigt werden, sind niht oder nur gering wasserlöslih, oder sie sind instabil i wässrigen Milieu. Diese Produktklasse und viele neuartige Produkte können it biotehnologishen Methoden durh die Nutzung von niht-konventionellen Reaktionsedien hergestellt werden. Als niht-konventionelle Reaktionsedien werden ystee bezeihnet, die entweder hauptsählih aus organishen Verbindungen (Lösungsittel, ubstrat, Produkt), überkritishen oder ionishen Flüssigkeiten bestehen. Auh gasförige Reaktionssystee werden zu den niht-konventionellen Reaktionsedien gezählt. Geeinsa ist diesen ysteen ein i Vergleih zu konventionellen Reaktionsedien reduzierter Wasseranteil. Ein weiterer wihtiger Vorteil vieler nihtkonventioneller Reaktionsedien ist ein gutes Lösungsverögen für hydrophobe, in Wasser shwerlöslihe Verbindungen. Ein Vergleih der Vor- und Nahteile niht-konventioneller Reaktionssystee ist in Tabelle 12.4 gegeben. Die untershiedlihen niht-konventionellen Reaktionsedien werden in Abshnitt 12.6 diskutiert.

16 Enzyatishe Prozesse Tabelle 12.4 Vergleih der Vor- und Nahteile niht-konventioneller Reaktionsedien Vorteile erhöhte onzentration von gering wasserlöslihen ubstraten/produkten erleihterte Produktaufarbeitung durh Phasentrennung (Trennung Produkt/atalysator, Rükhaltung des atalysators) Vershiebung des Reaktionsgleihgewihtes zu höheren Usätzen durh Produktextraktion Reversion einer hydrolytishen Reaktion durh Verringerung der Wasseraktivität Nahteile Proteindenaturierung in unnatürlihen Medien und an der Phasengrenzflähe durh Grenzfläheneffekte Diffusionsliitierung (tofftransport über die Phasengrenzflähe) aufwendige Prozessführung hohe Prozessdrüke bei Einsatz von überkritishen Lösungsitteln Toxizität und Brennbarkeit von organishen Lösungsitteln weniger erforsht 12.4 tofftransportliitierung bei trägeriobilisierten Enzyen Wie bereits erwähnt kann es bei trägeriobilisierten Enzyen zu tofftransportliitierungen koen. Zur Beurteilung iobilisierter Enzye wird der Wirkungsgrad η verwendet, der in der Gleihung (12.26) definiert ist. spezifishe Reaktionsgeshwindigkeit des iobilisierten Enzys η spezifishe Reaktionsgeshwindigkeit des freien Enzys v i. v frei (12.26) Der Wirkungsgrad η ist eine Funktion vershiedener Paraeter. Wenn die durh die Iobilisierung hervorgerufenen Änderungen der Enzyeigenshaften vernahlässigt werden, dann wird die Reaktionsgeshwindigkeit i Wesentlihen durh die onzentration der ubstanzen bestit, die sih in unittelbarer Nähe des Enzys befinden. Diese onzentrationen werden von externen und internen tofftransporteffekten beeinflusst, wobei die externen Effekte durh die Uströung des Trägers (onvektion) und die internen Effekte durh die in den Poren eines porösen Trägers (Diffusion) auftretenden Transportphänoene bewirkt werden (vgl. auh Abshnitt 6.3.3). In Abbildung sind sheatish die Verhältnisse dargestellt, die bei Einsatz iobilisierter Enzye auftreten. Die Mihaelis-Menten-Gleihung eines iobilisierten Enzys lautet dait: vapp vax +,Bulk,Bulk bzw. in der Lineweaver-Burk-For: 1 v v,app vax ax 1 1,Bulk,Bulk v 1 vax,app vax (12.27) (12.28) Die onzentration,bulk ist hierbei die i ern der Lösung (engl. bulk) vorliegende onzentration. In Abbildung wird a Beispiel der einfahen Mihaelis-Menten-inetik unter Verwendung des Lineweaver-Burk-Diagras gezeigt, wie η die beobahtete Enzykinetik beeinflussen und zu Fehlshlüssen bezüglih der Enzykinetik führen kann. Bei hohen ubstratkonzentrationen wird der Einfluss des tofftransports vernahlässigbar, und die Lineweaver-Burk-Auftragung ergibt die korrekten Werte für und v ax. Bei niedrigen ubstratkonzentrationen hingegen wird die inetik ier stärker vo tofftransport beeinflusst, und der aus der Lineweaver-Burk- Auftragung erittelte Wert für,app ist ein heinwert (app. engl. apparent, sheinbar), der niht de wahren Wert entspriht. Der Wirkungsgrad η nit bei,bulk 0 seinen geringsten Wert an.

17 12.4 tofftransportliitierung bei trägeriobilisierten Enzyen Abb (a) onzentrationsprofil an eine niht-porösen Träger, der it Enzy beladen ist und von ubstratlösung uströt wird; (b) onzentrationsprofil an eine porösen Träger, der in den Poren it Enzy beladen und von ubstratlösung ugeben ist Abb Einfluss des tofftransports auf die inetik iobilisierter Enzye (nah Prenosil et al. 1987) Externe tofftransportliitierung Zur Erläuterung der externen tofftransportliitierung wird ein niht-poröses Partikel betrahtet, bei de alles Enzy auf der Oberflähe iobilisiert ist (Abb a). In der Lösung liegt ubstrat der onzentration,bulk vor, das aus de ern der tröung durh onvektion an die Grenzshiht gebraht wird. In der Grenzshiht stellt der onzentrationsgradient die einzige treibende raft dar, und das ubstrat bewegt sih durh Diffusion bis zu Enzy. I stationären Zustand uss das pro Zeiteinheit zu Enzy transportierte ubstrat gleih de dort pro Zeiteinheit verbrauhten ubstrat sein. Für eine einfahe Mihaelis-Menten-inetik ist dait die apparente Reaktionsgeshwindigkeit v app durh Gleihung (12.29) gegeben: vax vapp kls ( ) (12.29) + wobei k ls der toffübergangskoeffizient von der flüssigen zur festen Phase und die a Enzy vorliegende ubstratkonzentration sind. Man beahte die Analogie zwishen dieser Gleihung und Gleihung (6.50), die für den auerstoffübergang von der gasförigen in die flüssige Phase und den anshließenden auerstoffverbrauh durh Mikroorganisen hergeleitet wurde.

18 Enzyatishe Prozesse In apitel 6 ist die Ähnlihkeitstheorie eingeführt worden, die zur Maßstabsübertragung diensionslose Größen verwendet. Auf dieses onzept wird hier zurükgegriffen. Die hier verwendeten diensionslosen Größen sind i apitel 6 beshrieben. Unter Verwendung der diensionslosen Größen, (12.30a),Bulk (12.30b),Bulk und der Daköhlerzahl Da lässt sih Gleihung (12.29) vereinfahen: 1 Da + (12.31) Dabei ist die physikalishe Bedeutung der Daköhlerzahl von Bedeutung: Da axiale v ax Reaktionsgeshwindigkeit k ls.,bulk axiale toffübergangsgeshwindigkeit (12.32) Falls Da << 1 gilt, dann wird v app durh die Reaktionsgeshwindigkeit bestit. Ugekehrt wird für Da >> 1 die apparente Reaktionsgeshwindigkeit durh den toffübergangswiderstand bestit. Diese beiden Grenzfälle werden als reaktionsliitierter Bereih bzw. diffusionsliitierter Bereih bezeihnet. χ erhält an durh Auflösen von Gleihung (12.31): ² ± + (12.33) 2 4 it Da + 1 (12.34) Die externe tofftransportliitierung wird durh die tröungsbedingungen beeinflusst und ist durh die diensionslose herwoodzahl h gekennzeihnet: k d h ls (12.35) D wobei d den Partikeldurhesser und D den Diffusionskoeffizienten darstellen. Für Festbettund Wirbelshihtreaktoren gilt die folgende orrelation: n h b. 1. n 2 Re (12.36) Re ist die Reynoldszahl, die hidtzahl und b eine onstante; und die Exponenten n 1 und n 2 werden von den tröungsbedingungen bestit. Die Analogie zwishen toff- und Wäreübergang wird deutlih, wenn an die Gleihungen (12.36) und (6.73) vergleiht. I Rührkesselreaktor wird die Vorhersage des toffübergangs dadurh ershwert, dass die Geshwindigkeit der Flüssigkeit ortsabhängig ist und dass niht die absolute Geshwindigkeit, sondern die relative Geshwindigkeit zwishen Flüssigkeit und Partikeln den toffübergang bestit. In vershiedenen orrelationen wird k ls als Funktion des Leistungseintrags oder der Reynoldszahl des Rührers angegeben. Weitere orrelationen nehen die For von Gleihung (6.64) an Interne tofftransportliitierung U die pro Träger iobilisierte Menge an Enzy zu axiieren, werden eist poröse Träger verwendet, bei denen sih das Enzy auh auf den inneren Oberflähen befindet. Die innere Oberflähe eines solhen Partikels kann das Vielfahe der äußeren Flähe betragen. Das onzentrationsprofil des ubstrates i Inneren des Trägers wird von der Diffusion und der Reaktion i Partikel bestit. Für einen kugelförigen Träger gilt i stationären Zustand folgende Massenbilanz, wobei eine einfahe Mihaelis-Menten-inetik angenoen wurde: d² 2 d vax Deff + (12.37) dr² r dr + it den Randbedingungen: d r 0 0; rr (12.38) dr 0 Dieses Proble wurde bereits i Abshnitt a Beispiel der Diffusion des auerstoffs in ein kugelföriges Aggloerat aus Bioasse behan-

19 12.4 tofftransportliitierung bei trägeriobilisierten Enzyen delt (Gleihungen (6.51 und 6.52)). Der effektive Diffusionskoeffizient D eff f wird unter andere von der Porosität des Trägers, der Tortuosität ( Verwikeltheit ) der Porengänge und der Größe der Poren i Vergleih zur Größe des diffundierenden Partikels beeinflusst. D eff f ist deshalb shwierig zu berehnen und wird häufig unter Verwendung eines atheatishen Modells aus den experientellen Daten erittelt. Analog zu Abshnitt kann auh hier ein Thieleodul φ definiert werden (siehe Gleihung (6.56)), der ein Maß für das Verhältnis des toffstros it ubstratverbrauh zu toffstro des ubstrats durh reine Diffusion ist. In der Herleitung von Gleihung (12.37) wurde angenoen, dass die Enzybeladung entlang der Poren einheitlih ist. Da aber auh die Beladung des Trägers it Enzy ein kinetisher Prozess ist, bei de das Enzy in die Poren diffundieren und dort it der Matrix reagieren uss, tritt häufig eine uneinheitlihe Enzyverteilung auf, sodass v ax in Gleihung (12.37) eine Funktion des Radius ist. Zusätzlih zu der externen tofftransportliitierung tritt also eine interne tofftransportliitierung auf, die den Wirkungsgrad η des iobilisierten atalysators herabsetzt. Das Verhältnis von externe zu interne toffstro wird durh die Biotzahl Bi harakterisiert, die in Gleihung (6.70) bereits für den Wäretransport beshrieben wurde: externer toffstro kls d Bi (12.39) interner toffstro D Aus der Biotzahl kann entnoen werden, ob Diffusionsliitierungen überwiegend durh externe oder durh interne Liitierungen verursaht werden. Die Beshreibung der kinetishen Eigenshaften von Enzyen, die auf bzw. in Trägern iobilisiert sind, wird durh eine Reihe anderer Faktoren ershwert, die unter de Überbegriff Mikrougebung zusaengefasst werden können. Mit Mikrougebung ist die direkte Ugebung des iobilisierten Enzys geeint. Die Bedingungen in der Mikrougebung können sih von den Bedingungen i ern der Lösung untersheiden. o kann eine Nettoladung des Trägers dazu führen, dass sih die Verteilung von H + - und OH -Ionen an der Oberflähe des eff Trägers von de Verhältnis in freier Lösung untersheidet, wodurh sih der ph in der Mikrougebung des Proteins ändert. Ebenso kann sih,app verändern, wenn ein geladenes ubstrat durh ein auf einer geladenen Matrix iobilisiertes Enzy ugesetzt wird. Analoges gilt für hydrophobe Wehselwirkungen. Ein weiterer ögliher Grund für veränderte kinetishe Eigenshaften kann darin liegen, dass das Enzy durh eine kovalente Bindung an einen Träger iobilisiert wurde und dass dadurh geladene Gruppen des Enzys neutralisiert und dait die truktur des Enzys geändert wird. Die Einflüsse der Mikrougebung auf die Enzykinetik sind der Grund, waru iobilisierte Enzye häufig andere kinetishe Eigenshaften aufweisen als die freien Enzye Experientelle Bestiung der tofftransportliitierung Zur Untersuhung, ob ein yste diffusionsliitiert ist, wird der Integralreaktor genutzt. Bei Integralreaktor handelt es sih u einen Festbettreaktor. Man verwendet Festbettreaktoren it untershiedlihen Reaktorvoluina bzw. atalysatorassen. Zwei untershiedlihe Experientaltehniken werden genutzt (Abb ): Abb Integralreaktor zur Untersuhung von tofftransportliitierung

20 Enzyatishe Prozesse a) I ersten Fall wird das atalysatorvoluen variiert, allerdings die Verweilzeit konstant gehalten. b) I zweiten Fall wird sowohl das atalysatorvoluen als auh die Verweilzeit variiert. Da i Fall (a) die Verweilzeit bei Durhgang durh die untershiedlihen Rohrreaktoren konstant gehalten wird, gilt: V τ (12.40) V R1 R2 Q 1 Q 2 Abb Vergleih des Usatzes in zwei PFR bei untershiedlihen atalysatorengen und gleiher Verweilzeit. Liegt keine toffliitierung vor, ist der Usatz in beiden Reaktoren gleih (obere urve) Man isst nun in den untershiedlihen Reaktoren den Usatz χ und trägt diesen als Funktion des Voluenstros Q 2 auf. Dait erhält an sheatish das folgende Bild (Abb ): Nit der Usatz trotz konstanter Verweilzeit it zunehender tröungsgeshwindigkeit zu, so liegt zuindest bei hohen tröungsgeshwindigkeiten Diffusionsliitierung vor. Bleibt dagegen der Usatz unabhängig von der tröungsgeshwindigkeit so liegt ein Fall von Reaktionsliitierung vor. Der Einfluss der tröungsgeshwindigkeit bei konstanter Verweilzeit kann auh aus der Daköhlerzahl abgelesen werden. vax Da (12.41) k da gilt v vax Bulk, ls,bulk f ( ) und f (Q ) k ls Bei untershiedlihen tröungsgeshwindigkeiten bleibt v ax /, Bulk unverändert, k ls steigt allerdings it der tröungsgeshwindigkeit, wodurh Da erniedrigt wird. Liegt allerdings Da selbst bei hohen tröungsgeshwindigkeiten oberhalb von eins, ist die Reaktionsgeshwindigkeit durh den toffübergangswiderstand bestit. I zweiten Fall wird das Reaktorverhalten bei untershiedlihen Verweilzeiten harakterisiert und die Funktion des Usatzes von der Verweilzeit χ f ( ) für die beiden untershiedlihen Bettvoluina untersuht. Trägt an nun den Usatz als Funktion der Verweilzeit auf, lassen sih prinzipiell zwei Fälle untersheiden (Abb ). I reaktionsbestiten Fall lassen sih die Messwerte aus beiden Reaktoren als Funktion der Verweilzeit in eine urvenzug interpolieren. I diffusionsbestiten Fall ist bei gegebener Verweilzeit der Usatz in de Reaktor it der höheren tröungsgeshwindigkeit jeweils größer. Abb Vergleih des Usatzes als Funktion der Verweilzeit in zwei PFR it untershiedlihen atalysatorengen. Ist das yste niht stofftransportliitiert, liegen die Usätze in beiden Reaktoren auf eine urvenzug.

21 12.5 Enzy-Mebranreaktoren Enzy-Mebranreaktoren Bei diese Verfahren werden die atalysatoren durh eine Mebran a Verlassen des Reaktorraues gehindert. Mebranen können diffusiv oder konvektiv betrieben werden. I Diffusionsreaktor wird das ubstrat an der Mebran vorbeigeführt, diffundiert durh die Mebran zur Enzylösung, wird dort ugesetzt und diffundiert als Produkt zurük in den Zulauf (Abb ). Die Diffusion bietet Vorteile, wenn sherepfindlihe atalysatoren, wie z. B. Zellen, eingesetzt werden. Diffusion ist allerdings ein sehr langsaer Prozess, daher lassen sih hohe Produktivitäten nur in konvektiv betriebenen Mebranreaktoren erzielen, bei denen das ubstrat in den Reaktor, in de sih das Enzy befindet, geleitet wird, dort reagiert und als Produktlösung abfiltriert wird. I Folgenden werden daher nur konvektiv betriebene Mebranreaktoren diskutiert. U geringe Verweilzeiten und dait hohe Rau-Zeit-Ausbeuten zu erzielen, werden i Allgeeinen konzentrierte Enzylösungen i Mebranreaktor eingesetzt. Da bei der Filtration konzentrierter Proteinlösungen der erzielbare Transebranfluss weit geringer als der vergleihbare Fluss it Wasser ist, können nur in Ausnahefällen (z. B. bei hohen Verweilzeiten und bei Verwendung von Enzyen it einer hohen spezifishen Aktivität) einfahe Filtrationszellen it integrierter Mebran als kontinuierlihe Rührkesselreaktoren eingesetzt werden. Meist ist ein separates Mebranodul it einer größeren Mebranflähe erforderlih. In eine konvektiv betriebenen Mebranreaktor können unodifizierte, löslihe Enzye aber auh auf Trägern fixierte, in apseln eingeshlossene oder auh quervernetzte Enzyaggregate eingesetzt werden, sofern diese i Reaktionsediu suspendiert werden können onvektiv betriebene Mebranreaktoren Abb Das Prinzip des Mebran-Diffusionsreaktors. ubstrat, P Produkt, E Enzy. Die Mebran ist rot dargestellt Die Mebrantehnik ist ein Teilgebiet der Filtration. Die Grundlagen der Filtration sind in apitel 10 näher beshrieben. Mebranreaktoren werden vor alle ross-flow betrieben. Der Aufbau eines ross-flow-filteroduls ist in Abbildung dargestellt. Bei der ross-flow-filtration ströt der Zulauf (Feed) über die Mebran. Bei ausreihender tröungsgeshwindigkeit werden Teilhen durh Turbulenzen und Wirbel wieder zurük in die tröung transportiert. Dadurh wird die Abb Prinzipieller Aufbau eines ross-flow-betriebenen Mebranoduls

22 Enzyatishe Prozesse Dekshihtbildung verieden (apitel 10). Die filtrative tofftrennung erfolgt it Mebranen als Filterediu. Die treibende raft der Mebranfiltration ist ausshließlih der Drukgradient. Die Trennwirkung wird i Wesentlihen von der ittleren Porengröße bestit. Die Mebrantehnik erögliht eine Trennung bis hin in den olekularen Bereih und ist daher auh zur Abtrennung von Enzyen geeignet. A Ende des Filtrationsvorgangs resultieren ier zwei Flüssigkeiten, das Filtrat (Pereat) und das onzentrat (Retentat). Ein wihtiger Paraeter zur Bewertung von Mebranprozessen ist das Rükhalteverögen (Retention) der Mebran. Die Retention ist definiert als: R 1 (12.42) P R wobei P bzw. R die onzentrationen der zurükgehaltenen oponente i Pereat bzw. Retentat darstellen. In Abbildung ist die spezifishe onzentration der zurükgehaltenen oponente (atalysator) über die Zahl der ittleren Verweilzeit N _ τ t_ in eine kontinuierlih betriebenen Mebranreaktor dargestellt. Es ist deutlih zu sehen, dass für eine kontinuierlihe Prozessführung die Retention einen Wert von deutlih über 99 % annehen uss, u eine effektive Rükhaltung des atalysators zu gewährleisten, da selbst bei einer Retention von R 99 % nah a. 70 Verweilzeiten die Hälfte des atalysators über die Mebran ausgetragen wurde. Das Retentionsverögen einer Mebran kann durh zwei Arten der Versuhsdurhführung bestit werden (Abb ). Bei der Gleihgewihtsbestiung g wird eine bekannte Menge der zu veressenden ubstanz in das geshlossene yste gegeben. Das Filtrationsodul wird nun als diskontinuierliher Filter betrieben, inde die Retentatseite vershlossen wird. Das Pereat wird so lange rezirkuliert, bis sih ein Gleihgewiht einstellt. Danah wird sowohl auf der Pereat- als auh auf der Retentatseite die onzentration der zu veressenden oponente bestit, wodurh direkt auf die Retention geshlossen werden kann. Bei der gravietrishen Methode wird eine bekannte Menge der zu veressenden ubstanz in das Mebranodul eingepupt. Auh in diese Fall wird das Filtrationsodul als diskontinuierliher Filter betrieben und die Retentatseite vershlossen. ubstratfreie Flüssigkeit wird nun it eine konstanten Voluenstro durh das Modul gepupt und die onzentration der zu veressenden oponente wird a Auslass überwaht. Die über den Versuhszeitrau durh die Mebran gelangte Menge der veressenen oponente wird bestit, wodurh sih der Abb Verlust an atalysator über die Mebran in eine kontinuierlih betriebenen Mebranreaktor bei untershiedlihen Rükhalteverögen R Abb Bestiung des Retentionsverögens einer Mebran it der (a) Gleihgewihtsbestiung und (b) gravietrishen Methode. Die zu veressende ubstanz ist in Rot dargestellt

23 12.5 Mebranreaktoren Grad des Rükhalteverögens zu einer bekannten Verweilzeit τ bestien lässt. Alternativ wird nah einer definierten Anzahl von Verweilzeiten das Retentatvoluen des Filtrationsoduls entnoen und gravietrish analysiert Prozesse it separater Filtrationseinheit In der folgenden Ableitung, die eine Erweiterung der Herleitung von Flashel (1983) darstellt, wird das Verhalten eines Enzyreaktors it externe Filtrationsodul beshrieben. In Abbildung ist sheatish ein in drei egente unterteilter Rohrreaktor gezeigt: Das gesate yste besteht aus de eigentlihen Reaktor (Voluen V R ) it de Voluenstro Q R, de Mebranodul (Voluen V M ) it de Voluenstro Q M und de Rüklauf (Voluen V RL ) it de Voluenstro Q RL. Das Rüklaufverhältnis Q Rv Q RL F ist ein Maß für die interne Rükverishung, wobei QF der Feedstro ist. Bei vernahlässigbar kleine Voluen des Rüklaufs und der Mebraneinheit lässt sih die bekannte Gleihung für Rohrreaktoren it Rüklauf anwenden (Hill 1977): ( ). d τ v,ein (12.43) R V. v 1+ R V Für Rv 0 beshreibt die Gleihung (12.43) das Verhalten eines PFRs, und für Rv das eines idealen Rührkesselreaktors. In Abbildung ist a Beispiel einer substratübershussinhibierten Mihaelis-Menten-inetik der Einfluss des Rüklaufverhältnisses auf das Verhältnis e CTR /e PFR dargestellt, wobei ein r 0 -Wert von 10 und eine durh das Verhältnis r i 1 gegebene starke ubstratübershussinhibierung vorliegt. Die urven für R v 0 in Ab- bildung und für r i 1 in Abbildung 12.6 entsprehen einander. Mit zunehende Rüklaufverhältnis verindert sih der Untershied Abb Aufteilung des Mebranreaktors in drei egente. Grau: Reaktor; hellrot: Mebranodul; dunkelrot: Rüklauf Abb Eignung des Rohreaktors it Rüklauf und des Rührkesselreaktors für ein Enzy it ubstratübershussinhibierung. Paraeter ist das Rüklaufverhältnis R v zwishen de Rohrreaktor und de Rührkesselreaktor onzentrationsverteilung in den drei egenten Reaktor, Mebranodul und Rüklauf In realen Reaktoren ist die Vernahlässigung der Voluina V M und V RL in der Regel niht zulässig. Da die Enzye niht iobilisiert und dait frei beweglih i Reaktor sind, werden sie während der Passage des Mebranoduls konzentriert und als hohkonzentrierte Lösung über den Rüklauf de Reaktor wieder zugeführt. Dait ergibt sih die onzentration der atalysatoren in den drei egenten als eine Funktion des Rüklaufverhältnisses R v und der Voluina V R, V M und V RL.

24 Enzyatishe Prozesse In dieser Ableitung wird von einer ideal seipereablen Mebran ausgegangen, die alles Enzy vollständig zurükhält, während das Reaktionsediu die Mebran ungehindert passieren kann. Die gesate Enzyenge E ges i Reaktionssyste verteilt sih auf die drei Einzelvoluina V R, V M und V RL : E ges V R E,R +V M E,M +VRL E,RL (12.44) wobei E,R, E,M und E,RL die Enzykonzentrationen i Reaktor, i Mebranodul und i Rüklauf darstellen. An jede Ort i Reaktor gilt die ontinuitätsgleihung: R E,R M ( ) E,M ( ) QRL E, RL Q Q (12.45) Die onzentrationen i Reaktor und i Rüklauf sind konstant, während sih die onzentration i Mebranodul ändert. Unter der Annahe eines über die Länge des Mebranoduls konstanten Filtratstros ist der Retentatstro i Modul nur eine Funktion der axialen oordinate (Abb ): Q Q QR Q L F ( ) x + R M F 1 v x L (12.46) Die Annahe eines konstanten Filtratflusses über die Länge der Mebran ist dann gültig, wenn die durh die Aufkonzentrierung hervorgerufene höhere onzentration der gelösten ubstanzen nur vernahlässigbaren Einfluss auf die Mebranpereabilität und den osotishen Druk hat. Die ittlere onzentration i Mebranodul ergibt sih dait zu: L L 1 QR E,R ( v ) E,R 1 E, M dx ( ) dx L Q x M L Rv L (12.47) E,M ( ) 1+ R v E,R v ln R (12.48) v Mit den Gleihungen (12.44) und (12.45) folgt für die onzentrationen i Reaktor und i Rüklauf: E,R V R +V M 1+ R v E, RL E,R Rv E 1+ R R v ( v ) ln +VRL v ges 1+ R R v v (12.49) (12.50) Bei Rührkesselreaktoren kann das Rüklaufverhältnis beliebig verändert werden, ohne dass sih Abb heatishe Darstellung der Abnahe des Voluenstros i Mebranodul (a) und der daraus resultierenden Aufkonzentrierung des Enzys i Reaktor, i Mebranodul und i Rüklauf (b)

25 12.6 Niht-konventionelle Reaktionsedien die Charakteristik des Reaktors ändert. Dait kann durh Erhöhung des Rüklaufverhältnisses eine gleihäßige Enzyverteilung i gesaten Reaktor erreiht werden ( E,R E,M E,RL ). Da sih der Rohrreaktor it steigende Rüklaufverhältnis ier ehr der Charakteristik des Rührkesselreaktors nähert, bei niedrige R v aber die i Reaktor vorliegende Enzykonzentration wesentlih geringer als die auf das gesate Reaktorvoluen V ges V R + V M + VRL bezogene Enzykonzentration ist, uss für jede Geoetrie das optiale Rüklaufverhältnis gefunden werden. Abbildung stellt das Verhältnis der Enzykonzentration e real R in eine Reaktor it externer Filtereinheit zu der Enzykonzentration e R in eine Reaktor it integrierter Mebran bzw. in eine Reaktor it externer Filtrationseinheit und unendlihe Rüklaufverhältnis dar. Paraeter sind das Rüklaufverhältnis und die drei Voluina V R, V M und V RL. Man erkennt, Abb Die Enzykonzentration in eine Reaktor it externer Filtrationseinheit i Verhältnis zu der Enzykonzentration eines Reaktors bei unendlihe Rüklaufverhältnis als Funktion des Rüklaufverhältnisses R v und der Voluina der Reaktorko- ponenten. (a) Paraeter der beiden urven ist V M / V g it V RL /V g 0,02 konst.; (b) Paraeter bei den urven ist V RL /V g it V M/Vg 0,02 konst. dass sih bei geringe Rüklaufverhältnis das eiste Enzy i Rüklauf bzw. i Mebranodul aufhält Niht-konventionelle Reaktionsedien Wie bereits erwähnt sind die eisten eingesetzten niht-konventionellen Reaktionsedien organishe Lösungsittel. Hierbei uss an untersheiden zwishen de Einsatz von reine Lösungsittel (Abshnitt ) und wässrigen Mehrphasensysteen (Abshnitt ). Ein flüssiges Mehrphasensyste ist ein yste bestehend aus indestens zwei niht iteinander ishbaren Phasen. Man untersheidet bei den flüssigen Mehrphasensysteen je nah der Zusaensetzung der Phasen wässrig/wässrige Zweiphasensystee und wässrig/organishe Zweiphasensystee. Wässrig/wässrige Mehrphasensystee bestehen aus zwei ineinander unlöslihen wässrigen Phasen. Diese treten z. B. bei Polyer/Polyerlösungen oder Polyer/alzlösungen unter bestiten Bedingungen auf (vgl. Abshnitt ). Für die Biokatalyse spielen die wässrig/wässrigen Zweiphasensystee allerdings eine untergeordnete Rolle, sie werden jedoh zur Aufarbeitung von Enzyen industriell eingesetzt. Von wahsender Bedeutung für die Biokatalyse sind wässrig/organishe Zweiphasensystee; sie sollen daher hier näher diskutiert werden. Ein solhes Reaktionssyste besteht aus einer wässrigen und einer wasserunlöslihen organishen Phase. Die organishe Phase besteht in diesen ysteen aus eine organishen Lösungsittel, das als Trägerphase fungiert und in de das ubstrat bzw. das Produkt gelöst ist, oder i Extrefall aus einer reinen Lösungsittel-, ubstrat- bzw. Produktphase. Eine Einteilung kann aufgrund untershiedliher Voluenverhältnisse von organisher und wässriger Phase erfolgen. Für niht-konventionelle Reaktionsedien it organishen Lösungsitteln können folgende Fälle untershieden werden (Abb ): rein organish Eulsionen Mikroeulsion und revers iellare ystee

26 Enzyatishe Prozesse Abb lassifizierung organish/wässriger ystee Rein organishe ystee Bei diese Reaktionssyste wird das Enzy in der organishen Phase suspendiert (als Lyophilisat oder auf Trägern iobilisiert). Der Wassergehalt ist in diese Fall auf das trukturwasser reduziert, das auf der Enzyoberflähe gebunden vorliegt und auh durh Lyophilisation niht entfernt werden kann (Faber 2000). Obwohl diese ystee in der Literatur als low water edia bzw. anhydrous solvent bezeihnet werden, ist die Wasser- aktivität in solhen ysteen von entsheidender Bedeutung für die Enzyaktivität. Enzye sind nur in ihrer natürlihen onforation katalytish aktiv. Diese onforation wird unter andere durh elektrostatishe und hydrophobe Wehselwirkungen, durh Wasserstoffbrükenbindungen und durh Van-der-Waals-räfte erzeugt. Wasser beeinflusst diese Wehselwirkungen, Enzye ändern daher in Abwesenheit von Wasser ihre onforation und sind in der Regel niht aktiv. Die Menge an Wasser, die ein Enzyolekül benötigt, u seine Tertiär- bzw. Quartärstruktur zu erhalten, kann jedoh erstaunlih gering sein; häufig nur Moleküle. U die katalytishe Aktivität von Enzyen in organishen Lösungsitteln zu gewährleisten, uss de organishen Lösungsittel deshalb Wasser zugesetzt werden. Manhe Enzye (z. B. hweine-pankreas-lipase) haben jedoh Wasser, auh i lyophilisierten Zustand, so fest gebunden, dass sie in beinahe trokenen organishen Lösungsitteln aktiv sind. In der Regel liegt das hydratisierte Enzy dabei als feste Phase suspendiert in der organishen Phase vor. Wegen der vershwindend geringen Menge des in diesen Reaktionssysteen vorhandenen Wassers wird häufig der Begriff der reinen organishen Lösungsittel für die Reaktionsphase verwendet, obwohl dies streng genoen niht korrekt ist, da organishe Lösungsittel teilweise Wasser enthalten. Die Wasserenge, die nötig ist, u die höhste Aktivität des Enzys zu erreihen, uss für jedes Reaktionssyste neu bestit werden. ie ist für jedes Enzy untershiedlih und wird stark vo Lösungsittel beeinflusst. Ershwerend kot hinzu, dass eine genaue ysteatik zur Bestiung der notwendigen Wasserengen noh niht besteht. Ein weiterer Nahteil ist, dass das Einstellen der Wasseraktivität i Lösungsittel (und dait auh a Enzy) nur über Uwege öglih ist, was zu weiteren Additiven i yste und zusätzlihe apparativen Aufwand führt.

27 12.6 Niht-konventionelle Reaktionsedien Viele Enzye sind niht ausreihend stabil in reinen organishen Lösungsitteln. Die tabilität kann in vielen Fällen jedoh draatish erhöht werden, wenn das Enzy auf eine Träger iobilisiert oder quervernetzt wird. Es gibt allerdings auh Beispiele, in denen die Thero- und Langzeitstabilität in organishen Lösungsitteln höher ist als in wässrigen Medien. Die geringe olvatisierung der Enzye in eine rein organishen Lösungsittelsyste führt zu einer starren onforation der Proteinoleküle. Diese Einshränkung der Proteinbeweglihkeit sowie die Reduzierung der Reaktion der Proteinoleküle it Wasser z. B. OH - oder H + -katalysierte Hydrolyse von Peptidbindungen und Zerstörung von Disulfidbindungen, die zu einer irreversiblen Desaktivierung des Enzys führen (apitel 3) können zu einer teigerung der tabilität des Enzys i Vergleih zu wässrigen Medien führen. Aufgrund der Einshränkung der Proteinbeweglihkeit in rein organishen Medien hängt der Zustand des Enzys von seiner Vorbehandlung ab. Es hat ier die onforation, in der es zur Zeit der Lyophilisierung vorlag (sogenannter oleular eory effet) (Griebenow und libanov 1996; libanov 2001). Das Enzy hat in seiner onforation und seiner Hydrathülle den Zustand aus de wässrigen Mediu (ph et.) gespeihert und verhält sih in de organishen Lösungsittel ähnlih wie in de wässrigen Mediu, aus de es lyophilisiert wurde. Da es sih bei eine rein organishen yste u ein Einphasensyste handelt, können die oben beshriebenen Reaktoren (bath-reaktor, CTR, PFR) und Prozessvarianten (Iobilisierung i Festbett und Wirbelshihtreaktor oder Mebranreaktoren) eingesetzt werden Wässrig/organishe Zweiphasensystee Bei wässrig/organishen Zweiphasensysteen befindet sih der Biokatalysator in der wässrigen Phase. Es wird die natürlihe Affinität des Produktes zur organishen Phase ausgenutzt, u das Produkt vo Biokatalysator zu trennen. Zusätzlih wird der Einfluss einer eventuell existierenden Produktinhibierung verindert, da das Produkt in die organishe Phase extrahiert wird und das Enzy nur eine geringe Produktkonzentration wahrnit. Zweiphasensystee bieten sih daher für Reaktionen an, deren ubstrate hydrophil und deren Produkte hydrophob sind, da in der das Enzy enthaltenden wässrigen Phase stets eine hohe ubstratkonzentration verfügbar ist, jedoh nur wenig Produkt vorliegt. Dies führt zu Reaktionsgeshwindigkeiten, die wesentlih höher als die bei rein wässrigen ysteen erzielbaren Reaktionsgeshwindigkeiten liegen. Reaktionsgleihgewihte können durh die Vershiebung der Gesatkonzentrationen verlagert werden, Reaktionen können sogar entgegen ihrer i Wasser vorherrshenden Reaktionsrihtung ablaufen (siehe Veresterungen). Die Produktaufarbeitung kann für hydrophobe Produkte vereinfaht werden, da ein Aufarbeitungsshritt die Extraktion bereits i Reaktor integriert ist. Außerde ist die Gefahr ikrobieller ontainationen durh den Zusatz einer organishen Phase verringert, da die eisten Mikroorganisen in organishen Lösungsitteln niht überleben können Eulsionen Eulsionen sind ystee von zwei niht oder nur begrenzt iteinander ishbaren flüssigen Phasen. Man untersheidet i Allgeeinen zwishen Wasser-in-Öl-Eulsionen (W/O) oder Öl-in- Wasser-Eulsionen (O/W), je nahde, welhe die kontinuierlihe und welhe die dispergierte Phase ist (Abb ). U eine gute Verteilung der dispergierten Phase innerhalb der kontinuierlihen Phase zu erhalten, werden die Phasen durh starke herkräfte intensiv verisht. Auf diese Weise entstehen kleine Eulsionströpfhengrößen (Durhesser 1 μ), wie z. B. in der Milh. Eulsionen, die eine nur grob dispergierte Phase enthalten, sind aber in der Regel niht langzeitstabil. Durh die untershiedlihe Dihte der Phasen und durh Grenzfläheneffekte neigen die Tröpfhen zu Zusaenfließen, und die Phasen trennen sih nah einiger Zeit akroskopish. U eine Eulsion aufrehtzuerhalten, uss daher peranent Energie durh z. B. Rühren eingetragen oder die Eulsion durh Zugabe von Eulgatoren stabilisiert werden. Eulgatoren vereinfahen außerde die feine

28 Enzyatishe Prozesse Verteilung der beiden Phasen ineinander. Eulgatoren sind grenzflähenaktive toffe, die z. B. die Grenzflähenspannung herabsetzen. ie bestehen aus eine hydrophoben hwanz und eine hydrophilen opf und rihten sih entsprehend an Phasengrenzflähen aus. Der hydrophobe hwanz hält sih dabei i organishen Lösungsittel auf, der hydrophile opf in der wässrigen Phase (Abb und 12.27) Mikroeulsionen und reverse Miellen Als besondere lasse der Eulsionen werden die Mikroeulsionen und die reversen Miellen betrahtet (Abb ). Zur Erzeugung und tabilisierung dieser Eulsionen werden de yste in der Regel Tenside zugesetzt. Mikroeulsionen sind Eulsionen it sehr kleinen Tröpfhendurhessern. Reverse Miellen bestehen aus Aggregaten von Tensiden it noh geringeren Durhessern (15 20 Å). ie sind in der Lage, hydrophile ubstanzen (z. B. Enzye) in ihre Inneren einzushließen und so zu lösen. Die Durhesser der Tröpfhen sind so gering, dass die Lösungen optish transparent ersheinen und Phasengrenzflähen von bis zu /l Lösung erhalten werden. Der Übergang von reversen Miellen zu Mikroeulsionen ist niht eindeutig definiert und wird nah der Miellgröße festgelegt. Je nah de Grad der Hydrophilität des Enzys hält sih das Enzy entweder völlig in der Mielle (Abb a), in der Zwishenphase (Abb b) oder teilweise i organishen Lösungsittel auf (Abb ). Die reversen Miellen geben de Enzy also die Möglihkeit, sih seine optialen Ugebungsbedingungen, die häufig de Zustand in der lebenden Zelle entsprehen, selbst zu shaffen. Mikroeulsionen und reverse Miellen zeihnen sih gegenüber herkölihen Zweiphasensysteen besonders durh ihre therodynaishe tabilität aus; die Tröpfhen neigen niht zu Zusaenfließen, und die beiden Phasen sind ineinander fein verteilt. Ein Vorteil dieser ystee gegenüber einfahen Eulsionen liegt daher in der großen Phasengrenzflähe und de dait verbesserten tofftransport zwishen den zwei Phasen. Zusätzlih bieten Mikroeulsionen und reverse Miellen den Vorteil, dass ein hydrophiles Enzy durh die Anordnung der Tenside an der Phasengrenzflähe niht in direkten ontakt it der organishen Phase kot. Da viele Enzye an der Phasengrenzflähe Wasser/organishes Lösungsittel durh Grenzflähenkräfte denaturiert werden, tritt in reversen Miellen und Mikroeulsionen häufig eine i Vergleih zu anderen wässrig/organishen ysteen erhöhte tabilität des Enzys auf. Mikroeulsionen und reverse Miellen sind also ystee, die sih i Wesentlihen aus drei oponenten zusaensetzen. ie sind therodynaish stabil, und ihre Zusaensetzung kann i ternären Phasendiagra (Abb ) abgelesen werde. Der rote L 2 -Bereih in Abbildung gibt den Bereih an, in de reverse Miellen auftreten. Die Größe der reversen Miellen hängt von de Verhältnis der Wasserkonzentration zur Tensidkonzentration (w 0 ) ab. Abb Aufbau von Mikroeulsionen bzw. reversen Miellen (nah helnitsky et al. 1988). (a) Hydrophiles Enzy, (b) grenzflähenaktives Enzy, () hydrophobes Enzy

29 12.6 Niht-konventionelle Reaktionsedien Abb Dreieksdiagra des ystes AOT (Natriu-bis(2-ethylhexyl)-sulfosuinat)/Iso-Oktan/ Wasser (Taaushi und Watanabe 1980). L1: norale Miellen, L2: reverse Miellen, 2L: Oktan/Wasser- Eulsion, D und F: flüssigkristalline Mesophasen it laellarer und reverser hexagonaler truktur, L+LC: flüssige Phase und flüssigkristalline Mesophase Abb onzentrationsverläufe an den Phasengrenzflähen einer Eulsion it hydrophile ubstrat und hydrophobe Produkt P, bei der die Reaktion in der wässrigen Phase stattfindet 2 w0 (12.51) Als weitere Einflussgrößen sind Teperatur, Ionenkonzentrationen und Art und Menge weiterer gelöster toffe zu berüksihtigen. Bei geringen Verhältnissen von Wasser- zu Tensidkonzentrationen halten sih nur ein Enzyolekül und einige Dutzend Wasseroleküle pro Mielle auf. Durh Einsatz von z. B. kurzkettigen Alkoholen anstatt von Tensiden können auh stabile Mikroeulsionen ohne Tenside erzeugt werden, was die Produktaufarbeitung unter Uständen wesentlih vereinfaht Reaktionsgleihgewihte in Zweiphasensysteen Aufgrund der untershiedlihen Beshaffenheit der beiden Phasen stellen sih in eine Zweiphasensyste nah de Nernst shen Verteilungssatz für eine gelöste ubstanz untershiedlihe Gleihgewihtskonzentrationen in den Phasen ein (vgl. Abshnitt ). Die Bedingung für das therodynaishe Gleihgewiht ist dann erfüllt, wenn das heishe Potenzial in beiden Phasen identish ist. Findet in einer der beiden Phasen eine Reaktion statt, so uss für das verbrauhte ubstrat und das entstehende Produkt deshalb ein tofftransport zwishen den Phasen zustande koen. Dieser onzentrationsausgleih erfolgt durh Diffusion der ubstanzen von der einen in die andere Phase. Dabei entsteht das in Abbildung dargestellte onzentrationsprofil für ubstrat und Produkt P. Die Geshwindigkeit des tofftransports wird durh physikalishe onstanten, wie z. B. den Diffusionskoeffizienten der transportierten Moleküle in den beiden Phasen, aber auh durh die Dike der Grenzshihten und Größe der Phasengrenzflähe bestit. Läuft eine Reaktion nun vergleihsweise shnell zu tofftransport ab, so liegt Diffusionsliitierung (Da >> 1; Abshnitt ) vor, d. h. die Reaktionsgeshwindigkeit wird durh den tofftransport bestit. U diesen Zustand zu vereiden, wird eine öglihst feine Verteilung der beiden Phasen (d. h. geringe Tröpfhengrößen) angestrebt, dait die Phasengrenze groß ist und der tofftransport shnell vonstattengeht. Wegen der herepfindlihkeit von Enzyen sind de Erzeugen einer beliebig feinen Dispersion durh Erhöhen der

30 Enzyatishe Prozesse Rührintensität jedoh Grenzen gesetzt, sodass bei Einsatz dieser ystee die Reaktion in der Regel i diffusionsliitierten Bereih stattfindet. Das Gleihgewiht einer Reaktion eines ubstrates zu Produkt P ist durh eine therodynaishe Gleihgewihtskonstante eq festgelegt. ie gibt das Verhältnis der Aktivitäten von Produkt und ubstrat i Reaktionsediu an (γ und γ P sind die Aktivitätskoeffizienten von P ubstrat und Produkt). P (12.52) P,eq P,eq eq (12.53),eq,eq Der Verteilungskoeffizient * eines gelösten ubstrates in eine Zweiphasensyste ist ebenfalls eine therodynaishe Gleihgewihtsgröße und hängt i Wesentlihen von der Zusaensetzung der beteiligten Phasen und der Teperatur ab. Er beshreibt die Verteilung des ubstrates zwishen zwei niht ishbaren Phasen und ist geäß Gleihung (12.54) definiert. * x org w x org w (12.54) org x ist der Molanteil des ubstrates in der organishen Phase und x w der Molanteil des ubstrates in der wässrigen Phase. org und w sind die Aktivitätskoeffizienten des ubstrates in der organishen bzw. der wässrigen Phase. Bei sehr großer Verdünnung des ubstrates w org gilt 1 und 1 und soit (vgl. Abshnitt ): * eq x x org w org w v v org w org v w v (12.55a) it de in der Biotehnologie häufig benutzten Verteilungskoeffizienten des ubstrates auf onzentrationsbasis und de Molvoluen v org der organishen bzw. v w der wässrigen Phase: org w (12.55b) w Analog gilt geäß Gleihung (12.53) für 1 org und 1: P,eq eq (12.56),eq Der Verteilungskoeffizient P für das Produkt P P ist analog zu Gleihung (12.54) bzw. Gleihung (12.55b) definiert Vershiebung des Reaktionsgleihgewihts durh Produktextraktion Betrahtet an ein Zweiphasensyste als ein hoogenes Gesatsyste, so lässt sih für dieses yste analog zu Gleihung (12.56) eine Gleihgewihtskonstante Ges eq definieren: Ges Ges P,eq eq Ges (12.57),eq Diese Gleihgewihtskonstante des Gesatsystes wird von der Gleihgewihtskonstanten der W Reaktion in der wässrigen Phase eq und den Verteilungskoeffizienten des ubstrates und des Produktes P bestit (Abb ). Die Gesat-Produkt- und Gesat-ubstratkonzentration setzt sih aus der in der organishen und der in der wässrigen Phase vorhandenen Produkt- bzw. ubstratenge zusaen. W W org org Ges P V + P V eq W W org org (12.58) V + V Durh Erweitern der Gleihung (12.58) it W W W W P V / V und durh Einsetzen der Gleihungen (12.56) und (12.55b) erhält an (Martinek et al. 1981): Ges W 1+ P eq eq (12.59) 1 + it α als de Verhältnis des Voluens der organishen Phase V org zu de Voluen der wässrigen Phase V W. Abb Reaktionsgleihgewiht i Zweiphasensyste

31 12.6 Niht-konventionelle Reaktionsedien Abb Reaktionsgleihgewiht als Funktion der Verteilungskoeffizienten und der Phasenzusaensetzung α org V α (12.60) W V Abbildung stellt den aus Gleihung (12.59) resultierenden Verlauf der Gleihgewihtskonstante Ges eq für vershiedene α dar. Man erkennt, dass bei großen Verhältnissen von Voluen der organishen zur wässrigen Phase die Gleihgewihtskonstante des Gesatsystes u einige Zehnerpotenzen gegenüber der Gleihgewihtskonstante i wässrigen yste vershoben werden kann, wenn die Verteilungskoeffizienten von Produkt und ubstrat sih stark untersheiden. Analog erhält an für eine Zwei-ubstratzwei-Produkt-Reaktion geäß Abbildung die Gleihgewihtskonstante für das Zweiphasensyste. Ges eq it W eq w P w A W eq w Q w B ( ) ( 1( + ) P ( ) ( ) A Q B (12.61) (12.62) Aus Abbildung wird ersihtlih, dass die Gleihgewihtskonstante einer Zwei-ubstratzwei-Produkt-Reaktion in eine Zweiphasensyste ebenfalls stark von de Verhältnis der Voluina von organisher zu wässriger Phase abhängt. Durh geeignete Wahl von α in eine Zweiphasensyste kann an sowohl eine Verringerung als auh eine Erhöhung des Gleihgewihtsusatzes herbeiführen. Ist der Verteilungskoeffizient Abb Modellzusaenhänge für eine Zwei- ubstrat-zwei-produkt-reaktion in eine Zweiphasensyste für das ubstrat A und das Produkt Q identish, so erhält an den in Abbildung dargestellten Verlauf der Gleihgewihtskonstanten. Wird das Produkt it der organishen Phase zur weiteren Aufarbeitung abgezogen, so ist jedoh niht die Zusaensetzung des Gesatsystes von Interesse, sondern der erreihbare Usatz in der organishen Phase. Für diesen Fall lässt sih in Analogie zu Gleihung (12.62) eine Gleihgewihtskonstante für die organishe Phase definieren: org org P org Q eq (12.63) org org A B Durh Einsetzen der Gleihungen (12.55b) und (12.62) in (12.63) erhält an: org eq P Q W (12.64) eq A B Das Verhältnis der Gleihgewihtskonstanten ist dann proportional zu de Verhältnis der Vertei-

32 Enzyatishe Prozesse Abb Reaktionsgleihgewiht als Funktion der Verteilungskoeffizienten und der Phasenzusaensetzung α lungskoeffizienten und unabhängig vo Verhältnis der Voluina von organisher zu wässriger Phase. In logarithisher hreibweise lautet Gleihung (12.64): log org eq W eq log P +log Q ( A B ) (12.65) Durh enntnis der Verteilungskoeffizienten von ubstrat und Produkt lässt sih it Gleihung (12.65) das sheinbare Gleihgewiht in der organishen Phase berehnen. ind keine experientellen Daten über Verteilungskoeffizienten von ubstraten und Produkten vorhanden, so lassen sie sih aus der heishen truktur der ubstanzen abshätzen. Dabei wird das Molekül in seine Bestandteile (Gruppen) zerlegt und als ue dieser Bestandteile interpretiert. pezifishe toffdaten für diese Bestandteile und Wehselwirkungen zwishen Bestandteilen des Moleküls kann an der Literatur entnehen (Rekker 1977; Hansh und Leo 1979). Da sih bei der Uwandlung eines ubstrates in ein Produkt nur gewisse Gruppen a Molekül ändern, folgt, dass sih die Verteilungskoeffizienten von ubstrat und Produkt auh nur in den Beiträgen der toffdaten dieser Gruppen untersheiden können. Da andere Teile des Moleküls durh die Reaktion niht beeinflusst werden, ändern sih die Beiträge dieser Gruppen zur Berehnung des Verteilungskoeffizienten des Moleküls niht. Daraus folgt geäß Gleihung (12.65), dass das Verhältnis der Gleihgewihtskonstanten nur durh die Beiträge der reagierenden Gruppe bestit wird, wobei Wehselwirkungsparaeter it anderen Gruppen des Moleküls berüksihtigt werden üssen. org eq log W eq Gruppenparaeter für nur in Produkten vertretene Gruppen Gruppenparaeter für nur in ubstraten vertretene Gruppen Aus diese Zusaenhang lässt sih das Verhältnis der Gleihgewihtskonstanten für Reaktionstypen in vershiedenen Mehrphasensysteen nah den Daten von Rekker (1977) vorhersagen (Halling 1990). Dabei sollte allerdings berüksihtigt werden, dass die Berehnungsethode nah Rekker oder Hansh niht alle Wehselwirkungen der Molekülbestandteile berüksihtigt und bei einigen ubstanzen daher nur Abshätzungen über die Vershiebung der Gleihgewihtskonstanten in eine Zweiphasensyste zulässt. Tabelle 12.5 gibt eine Übersiht über das Verhältnis der Gleihgewihtskonstanten vershiedener enzyatish katalysierter Reaktionstypen in Zweiphasensysteen, die sih aus untershiedlihen organishen Lösungsitteln zusaensetzen. Dabei wurde angenoen, dass es sih bei der Oxidation von Alkoholen u eine Ein- ubstrat-reaktion handelt, obwohl dies streng genoen niht korrekt ist. Zur Oxidation von Alkoholen uss ein Oxidationsittel (z. B. NADP + ) eingesetzt werden, das als zweites ubstrat auftritt

33 12.6 Niht-konventionelle Reaktionsedien Tabelle 12.5 Verhältnis der Gleihgewihtskonstanten log ( org eq / W eq ) in vershiedenen Zweiphasensysteen für untershiedlihe Reaktionstypen. Werte für Veresterung aliphatisher Moleküle basieren auf Gruppenparaetern nah Rekker (1977), weitere Daten basieren auf experientell erittelten Verteilungskoeffizienten (nah Halling 1990) Gruppenparaeter für Lösungsittel aliphatisher aliphatisher aliphatishe log Alkohol Ester Carbonsäure ( org / w ) n-otanol 1,47 0,938 1,251 1,16 Veresterung Ether 1,879 1,238 1,553 1,56 aliphatisher Alkohole Benzol 3,128 2,898 1,51 4,52 CCl 4 3,19 3,30 1,44 5,05 Öle 2,861 2,253 1,93 3,18 log -Werte für Lösungsittel Propan-2-ol Aeton log ( org / w ) n-otanol 0,05 0,24 0,29 Oxidation von Ether 0,26 0,21 0,05 Propan-2-ol Benzol 0,94 0,05 0,89 CCl 4 1,09 0,30 0,79 Öle 1,19 0,81 0,38 Lösungsittel Benzylalkohol Benzaldehyd log ( org / w ) Oxidation von n-otanol 1,10 1,45 0,35 Benzylalkohol Cylohexan 0,62 1,23 1,85 n-hexan 0,76 1,11 1,87 und während der Reaktion reduziert wird (zu NADPH). Die Berehnung der Gleihgewihtskonstanten in Tabelle 12.5 ipliziert also, dass die Verteilungskoeffizienten für das zweite ubstrat und das zweite Produkt (NADP + und NADPH) identish sind und daher keinen Einfluss auf die org Gleihgewihtskonstante eq haben. Für NADP + als Oxidationsittel ist diese Annahe zulässig, da sowohl NADP + als auh NADPH sih ausshließlih in der wässrigen Phase aufhalten. Für die Herleitung von Gleihung (12.62) und die Berehnung der in Tabelle 12.5 angegebenen Werte wurde angenoen, dass die ubstrate und Produkte in unendliher Verdünnung vorliegen und die Aktivitätskoeffizienten eins sind. Für höhere onzentrationen ist diese Annahe niht zulässig. Durh die UNIFAC-Methode lassen sih durh Gruppenparaeter auh Aktivitätskoeffizienten nah der heishen trukturforel berehnen. Das Verhältnis der Gleihgewihtskonstanten einer Zwei-ubstrat-zwei-Produkt-Reaktion wird ebenfalls durh Gleihung (12.64) angegeben, wobei berüksihtigt werden uss, dass die Gleihgewihtskonstanten und Verteilungskoeffizienten geäß den Gleihungen (12.53) und (12.54) Funktionen der Aktivitätskoeffizienten sind. oit lassen sih auh Vorhersagen über das Verhältnis der Gleihgewihtskonstanten in Zweiphasensysteen treffen, die ubstrate und Produkte in höheren onzentrationen enthalten Reversionsreaktionen In vielen Reaktionen ist Wasser ein Reaktionspartner. Enzye, die solhe Reaktionen katalysieren, sind die Hydrolasen. Beispiele für diese Enzye sind die Lipasen oder Esterasen (Abb ). Lipasen sind grenzflähenaktive Enzye, die in wässriger Ugebung Ester hydrolytish spalten

34 Enzyatishe Prozesse Abb Reaktionsshea der Lipase-katalysierten Hydrolyse bzw. Veresterung und in Eulsionen Veresterungen oder Uesterungen eröglihen (vgl. Tabelle 12.5). Wegen ihrer günstigen Verfügbarkeit, ihrer hohen tereo- und Regiospezifität haben Lipasen ehrere industrielle Anwendungen gefunden. Bei der Hydrolyse in wässrigen ysteen wird die onzentration des Wassers in der Regel als konstant (55,5 ol/l) angenoen und die Wasseraktivität zu eins gesetzt. Ist die Wasseraktivität kleiner als eins, so kann jedoh das Gleihgewiht einer Reaktion z. B. von der Hydrolyse zu einer ondensation vershoben werden. Neben der Erhöhung des Usatzes von Veresterungsreaktionen durh Einsatz eines Zweiphasensystes und Produktextraktion kann an den Usatz durh Verringerung der Wasseraktivität steigern. Ist nur wenig Wasser vorhanden, so wird die ondensationsreaktion die Hydrolyse überwiegen. U die Reaktion durh Verringerung der Wasseraktivität zu vollständige Usatz zu treiben, uss deshalb das durh die Reaktion entstandene Wasser während der Reaktion stetig entfernt werden. Dies kann z. B. durh Vakuudestillation, Troknung der organishen Phase über Molekularsiebe oder auh über Pervaporation it wasserselektiven Mebranen erfolgen Prozessführungs- und Aufarbeitungsverfahren von Mehrphasensysteen Tehnishe Enzye sind in der Regel hydrophil und halten sih dann ausshließlih in der wässrigen Phase bzw. an der Phasengrenzflähe auf. Da Zweiphasensystee häufig durh die Diffusion der ubstrate und Produkte zwishen den beiden Phasen liitiert sind, wird versuht, die Phasengrenzflähe zu axiieren. Eine feine Dispersion zweier unlösliher Phasen wird noralerweise durh hohe Rührleistungen erreiht. In biotehnologishen Reaktoren sind de Leistungseintrag durh Rühren jedoh Grenzen gesetzt, da der Energieaufwand sowie der Investitionsaufwand für den Reaktor stark ansteigen und sherepfindlihe Enzye durh den hohen Energieeintrag zerstört werden könnten. Die Zugabe von stabilisierenden Zusätzen (z. B. Tenside, Eulgatoren) verringert den Aufwand zur Aufrehterhaltung einer Eulsion; allerdings ershweren sie die Aufarbeitung erheblih. Die Entishung der Eulsion in eine das Enzy enthaltende und eine das Produkt enthaltende Phase erleihtert die Produktaufarbeitung, da die Phasen leiht ehanish getrennt werden können. Dies geshieht uso shneller, je größer die dispergierten Tröpfhen sind. Hier treten also bei der Auslegung eines Prozesses zwei gegensätzlihe Ziele auf: Zu einen uss für einen optialen tofftransport i Reaktor ständig gerührt und die dispergierte Phase so fein wie öglih verteilt werden, zu anderen soll für die Aufarbeitung eine öglihst shnelle und einfahe Phasentrennung erhalten werden, was durh öglihst grobe Dispersionen erreiht wird. Deshalb üssen bei der Aufarbeitung von Zweiphasensysteen je nah Problefall vershiedene Verfahrenstehniken angewendet werden. Ist der Dihteuntershied der beiden Phasen ausreihend, so kann die Phasentrennung durh edientation erfolgen. Bei geringeren Dihtedifferenzen wird die Zentrifugation eingesetzt (vgl. Abshnitt , Abb ). Ist die Eulsion durh Zusatz von Tensiden stabilisiert, so lassen sih die beiden Phasen nur shwierig akroskopish trennen. Hier üssen Eulsionsspaltverfahren, wie z. B. die Mebranfiltration, die Elektrokoaleszens oder Flotationsverfahren eingesetzt werden, u eine Trennung der Phasen zu erreihen.

35 12.6 Niht-konventionelle Reaktionsedien Abb Mebranreaktor it Mikroeulsion bzw. reversen Miellen als Reaktionsediu, Produktabtrennung über Ultrafiltration und nahgeshaltete Destillation. ybole vgl. Abb Die Aufarbeitung von Mikroeulsionen oder reversen Miellen stellt ein besonderes Proble dar, da die dispergierten Tröpfhen besonders klein und ehanishe Trennverfahren nur begrenzt anwendbar sind. Eine koplette Phasentrennung der beiden Phasen ist hier in der Regel niht öglih, ohne den Biokatalysator zu shädigen. In einigen Mikroeulsionen und revers-iellaren ysteen kann durh Teperaturänderung eine Entishung herbeigeführt werden. Man erhält dann eine den Biokatalysator enthaltende Phase und eine das Produkt enthaltende Phase. Dieses Vorgehen hängt jedoh stark von der Zusaensetzung des Mehrkoponentensystes ab und uss i Einzelfall getestet werden. Alternativ kann an durh den Einsatz der Ultra- bzw. der Nanofiltration reverse Miellen bzw. Mikroeulsionströpfhen zu eine Großteil i Reaktor zurükhalten und die das Produkt enthaltende organishe Phase abtrennen (Abb ). Das Tensid wird dabei jedoh niht vollständig durh die Mebran zurükgehalten, da niht alle Tensidoleküle in Miellaggregaten gebunden sind. In reversen Miellen oder Mikroeulsionen liegt das Tensid sowohl gebunden in Miellaggregaten als auh als gelöstes Monoer vor, das durh die Mebran niht zurükgehalten wird (Lüthi und Luisi 1984). Deshalb ist der Produktstro it Tensid verunreinigt, und de Reaktor uss ständig neues Tensid zugeführt werden. Da die Phasentrennung bei Mikroeulsionen und reversen Miellen so shwierig ersheint, haben diese ystee in der präparativen Biotehnologie bisher nur wenig Einsatz gefunden. Die Trennung der organishen und der wässrigen Phase ist jedoh in vielen Fäl-

36 Enzyatishe Prozesse Abb Mebranreaktor it Mikroeulsion bzw. reversen Miellen als Reaktionsediu, Produktabtrennung über Pervaporation (nah Röthig 1992) len gar niht notwendig. Häufig eröglihen die physikalishen Eigenshaften des Produktes auh die Produktentfernung direkt aus de Zweiphasen-Reaktor. Ist das Produkt z. B. leiht flühtig, kann es durh Destillation bzw. Pervaporation in gleiher Weise wie aus eine Einphasen-Reaktor abgetrennt werden, ohne dass die Eulsion erst gespalten werden uss. Bei der Pervaporation kann durh den Einsatz von Mebranen ein Aufarbeitungsshritt integriert und das Produkt it erhöhter elektivität abgetrennt werden, ohne dass Tensid i Produktstro vorliegt (Abb ) Aktivität und tabilität von Enzyen in Mehrphasensysteen Die bisherigen Ausführungen gingen davon aus, dass das Enzy in Mehrphasensysteen sih genauso verhält wie in rein wässrigen Medien. Diverse Ergebnisse belegen jedoh, dass in Mehrphasensysteen die spezifishe Aktivität, die ubstrat-, tereo- und Regiospezifität und die tabilität des atalysators verändert sein können. Dies ist auf olekularer Ebene auf Wehselwirkung der Proteine it gelösten ubstanzen und den Einfluss von Grenzflähenkräften auf die tertiäre und quartäre truktur der Enzye zurükzuführen. Wie bei trägeriobilisierten Enzyen kann sih auh die Mikrougebung verändern; so können sih in feinen Eulsionstropfen die ph-werte vershieben oder sih ubstrat- und Produktkonzentrationen bzw. Ionenstärken verändern. Diese Einflussgrößen sind wegen der geringen Abessungen der feinen Eulsionstropfen jedoh nur shwer und eist nur indirekt zugänglih. Manhe Enzye zeigen in Mehrphasensysteen erhöhte Aktivitäten, so wurde z. B. für Peroxidase in reversen Miellen eine gegenüber wässrigen Lösungen 20-fah höhere Aktivität festgestellt (helnitsky et al. 1988). Die eisten bisher in Zweiphasensysteen untersuhten

37 12.6 Niht-konventionelle Reaktionsedien Enzye zeigen jedoh Aktivitäten, die vergleihbar oder unterhalb der in Wasser geessenen Werte liegen. Die Abweihungen des Enzyverhaltens in Mehrphasensysteen sind erst dann prägnant, wenn die Wasserkonzentration gering wird, wie das z. B. in reversen Miellen der Fall ist. Dieses ist wiederu auf die Änderung der Mikrougebung zurükzuführen, so vershiebt sih der ph-wert in den Eulsionstropfen bei Einsatz von ionishen Tensiden (Martinek et al. 1982). Die eisten Enzye haben in Mehrphasensysteen eine gegenüber rein wässrigen Medien herabgesetzte tabilität. Dies ist in Eulsionen insbesondere auf die Auffaltung der Enzye durh Grenzflähenkräfte an der Phasengrenze zurükzuführen. Wie shon bei den rein organishen Lösungsitteln gezeigt, kann die tabilität jedoh auh erhöht sein. Dieses hängt von der Menge des freien Wassers in de Eulsionstropfen ab, je kleiner der Tropfen ist, desto ehr nähern sih die Verhältnisse de rein organishen Lösungsittel an. Die erhöhte tabilität von Enzyen in Mehrphasensysteen kann soit durh verringerte Proteinbeweglihkeit und verringerte Menge an freie Wasser z. B. in Mikroeulsionstropfen erklärt werden. In Mehrphasensysteen können auh erhöhte Langzeitstabilitäten von Enzyen gefunden werden, wenn weitere Effekte, die zur Desaktivierung des Enzys führen, unterbunden werden. o können z. B. in reversen Miellen die Grenzfläheneffekte nur noh in verringerte Maße zur Auffaltung des Enzys führen. Die Proteinaggregation, die zur Desaktivierung führen kann, ist in reversen Miellen auh verringert, da diese aufgrund ihrer geringen Abessungen nur ein Proteinolekül aufnehen können Wahl des geeigneten organishen Lösungsittels Ein wihtiger Faktor bei der Biokatalyse in reinen organishen Lösungsitteln und organish/ wässrigen Zweiphasensysteen ist die Wahl des adäquaten Lösungsittels. Es wurde lange angenoen, dass die Polarität des organishen Lösungsittels der entsheidende Faktor für die Wahl des Lösungsittels ist. Wenn das Enzy in das organishe Lösungsittel gegeben wird, kot es zu eine apf u Wasser zwishen allen oponenten. Das Wasser ist an das Enzy und öglihe Träger zur Iobilisierung gebunden. Es ist gelöst i organishen Lösungsittel und in der Gasphase oberhalb des Reaktionsedius. Die Verteilung des Wassers ist abhängig von dessen Löslihkeit i organishen Lösungsittel. Bei verringerten Wassergehalten entziehen hydrophile organishe Lösungsittel de Enzy das Wasser. Die Löslihkeit ist vor alle von der Polarität des Lösungsittels abhängig. Ein Maß für die Polarität eines Lösungsittels ist der log P-Wert, der den Logarithus des Verteilungskoeffizienten einer ubstanz in eine Wasser/ Otanol-Zweiphasensyste beshreibt. Laane et al. (1985) stellten fest, dass Lösungsittel it eine log P < 2 in der Regel niht als Reaktionsediu für Biotransforationen geeignet sind. Allerdings konnte der Zusaenhang zwishen Aktivität und tabilität niht für alle enzyatishen Reaktionen verallgeeinert werden. Filho et al. (2003) verglihen die Enzyaktivität von isolierter Alkoholdehydrogenase in organish/ wässrige Zweiphasensyste it untershiedlihen Lösungsitteln. o wies das Enzy die höhste Halbwertzeit, tabilität und Aktivität auf in eine tert-butylethylether(mtbe)- Zweiphasensyste (log P 1,0) verglihen it eine Zweiphasensyste it sowohl niedrigere als auh höhere log P-Wert. ie konnten die Enzyaktivität in den untershiedlihen organish/wässrigen Zweiphasensysteen wie folgt beshreiben: k ' dea t At A0 I e (12.66) Wobei A t die zeitabhängige Aktivität, A 0 die Anfangsaktivität, I die sofortige (instantaneous) Inhibierung und k' dea die Desaktivierungsrate für das Enzy ist. I kann bestit werden, inde die Enzyaktivität in der wässrigen Phase geessen wird, bevor das organishe Lösungsittel zugegeben wird, und diese verglihen wird it der Enzyaktivität, geessen fünf Minuten, nahde das Lösungsittel zugegeben wurde. Der Vorteil dieser Methode gegenüber de log P-Wert besteht darin, dass neben der

38 Enzyatishe Prozesse Inhibierung des Enzys durh die Zugabe des Lösungsittels auh die zeitabhängige Desaktivierung, ausgedrükt durh die Desaktivierungsrate k' dea, erfasst wird (Abb ). Da eine orrelation zwishen der Polarität und der Enzyaktivität niht festgestellt werden konnte, nahen Filho et al. (2003) an, dass die lasse der Lösungsittel eine wihtigere Rolle spielt als die Polarität. Es zeigte sih, dass das Enzy i Zweiphasensyste, bestehend aus kurzkettigen Ethern wie MTBE (Diethylether, Diisopropylether und Di-n-buthylether) als organishe Phase, eine vergleihbare Aktivität zu MTBE- Zweiphasensyste aufweist, trotz untershiedliher log P-Werte (Diethylether: log P 0,8; Diisopropylether: log P 1,4; Di-n-buthylether: log P 2,6). Eine allgeeine ysteatik ist hier allerdings auh niht öglih. Auh bei industriellen Biotransforationen haben organishe Lösungsittel it log P-Werten < 2 inzwishen Eingang gefunden, so z. B. bei der Hydroxynitrillyase-katalysierten Addition von Blausäure an einen Aldehyd zur ynthese eines Pyrethroids (Groger 2001). Der Einfluss des Lösungsittels hängt von ehreren Faktoren ab und kann it eine einzelnen Paraeter niht erfasst werden. Da eine systeatishe Wahl des Lösungsittels allerdings ein wihtiger Faktor für die Etablierung enzyatisher Prozesse in der Industrie ist, bedarf es auf diese Gebiet weiterer Untersuhungen Überkritishe Fluide Neuerdings werden auh überkritishe Fluide als Reaktionsedien für enzyatishe ynthesen eingesetzt. Der kritishe Punkt einer ubstanz ist durh eine kritishe Teperatur und einen kritishen Druk harakterisiert (Abb ). Der überkritishe Zustand ist dezufolge erreiht, wenn sowohl Teperatur als auh Druk oberhalb der kritishen Werte dieser ubstanz liegen. Bei Übergang vo flüssigen oder gasförigen Zustand in den überkritishen Zustand wird keine Phasengrenze übershritten, und dait findet keine sprunghafte, sondern eine kontinuierlihe Änderung der physikalishen Eigenshaften statt. Die physikalishen Eigenshaften eines überkritishen Fluids liegen zwishen denen von Gasen und Flüssigkeiten. leine Variationen der Teperatur oder des Druks können zu großen Veränderungen der Viskosität, Diffusivität und Löslihkeit von untershiedlihen oponenten i überkritishen Fluid führen, was eine gute Anpassung der physikalishen Eigenshaften des Reaktionsedius erögliht; das Reaktionsediu kann aßgeshneidert werden für bestite Reaktionen. Das a eisten genutzte yste ist überkritishes ohlendioxid, kritisher Punkt bei 31 C und 73 bar. Weitere Fluide sind Fluorkohlenwasserstoffe (CHF 3 ), Hydroarbonate (Ethan, Ethen, Propan) oder anorganishe ubstanzen (F 6, N 2 O). Die Abb Relative Aktivität eines Enzys als Funktion der Zeit in eine wässrig/organishen Zweiphasensyste. ofortige Inhibierung des Enzys a Anfang nah Zugabe des Enzys Abb Phasendiagra für ohlendioxid. I kritishen Punkt vershwinden die Flüssig- und Gasphase und gehen in eine überkritishe Phase über