Analyse der transportgesteuerten Genregulation anhand des Mlc-PtsG Systems von Escherichia coli

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1 Analyse der transportgesteuerten Genregulation anhand des Mlc-PtsG Systems von Escherichia coli Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) vorgelegt von Sabine Seitz Universität Konstanz mathematisch-naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Biologie Lehrstuhl für Mikrobiologie Konstanz, April 2005 Tag der mündlichen Prüfung: Referent: Prof. Dr. W. Boos 2. Referentin: PD. Dr. C. Schlatterer

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3 Danksagung Danksagung Herzlich bedanken möchte ich mich bei meinem Betreuer Winfried Boos. Nicht nur dafür, dass er mir ermöglichte diese Arbeit durchzuführen, sondern auch dafür, dass ich auf meine Art mit den Aufgaben wachsen konnte, indem er eigene Wege ebenso zuließ, so wie er stets mit Rat und Tat zur Seite stand. Es war schön an ihrem Beispiel mitzuerleben, dass man auch in langen Berufsjahren die Begeisterung für das Forschen nicht über die alltäglichen Dinge verliert. Und, wenn man es auch nicht immer gerne hören wollte, Danke für die humorvolle und direkte Art, mit der man so manches Mal einen Schubs in die richtige Richtung bekommen hat. Ein Danke an Michael Dahl, im Gedenken, und an Uli Dahl, im Besonderen, dafür, dass sie mir die ersten Schritte in Konstanz um so vieles schöner und leichter gemacht haben. Meinen Kollegen in M1040 möchte ich sagen, es ist einfach klasse eine von euch zu sein. Danke, nicht nur für die Hilfe, die Diskussion, sondern auch für die Freundschaft, den Einblick in ferne Kulturen, und dafür dass auch die langen Stunden im Labor mit Leben und Freude ausgefüllt waren. Ein herzliches Danke Schön an alle in der AG Boos, mit denen ich in den vergangenen Jahren zusammengearbeitet habe, für viele wertvolle Ratschläge, praktische Hilfe oder einfach nur für geduldiges Zuhören. Ein besonderes Danke geht an Angie, Tina, Pari, Stefan und Daniel. Zu sagen weshalb würde noch mal ein Werk der Größe dieser Arbeit erfordern. Mein Dank gilt auch allen Praktikanten und HiWis für die einerseits motivierte Unterstützung bei den verschiedenen Projekten und die vielen erfrischenden Fragen. Und zum Schluss möchte ich auch die nicht vergessen, die durch ihren Beitrag zum Gelingen und zur Vollendung dieser Arbeit beitrugen wie Jacqueline Plumbridge in Paris, Ann-Katrin Becker und Knut Jahreis in Osnabrück, Tino Pohlen und Volker Wendisch in Jülich, Uwe Völker in Greifswald für die Zusammenarbeit, den fleißigen Korrekturlesern in der AG Boos und Christina Schlatterer dafür, dass sie die Aufgabe der Zweitgutachterin übernommen hat.

4 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Zusammenfassung I V VIII X 1. Einleitung Einführung Das Phosphotransferasesystem (PTS) Die Aufnahme von Glukose über das PTS Katabolitenrepression und Induktorausschluss Glukose - vermittelte Katabolitenrepression und Induktorausschluss Stimulation der Adenylatcyclase-Aktivität durch EIIA Glc Katabolitenrepression und Induktorausschluss durch Nicht-PTS- Substrate Mlc Ein globaler Regulator zuckerverwertender Systeme Durch Mlc regulierte Gene Glukoseinduktion der pts Gene Die Inaktivierung des Repressors Mlc Das Protein YeeI beeinflusst die Mlc regulierten Gene Zielsetzung Material und Methoden Abkürzungen Verwendete Bakterienstämme, Phagen, Plasmide und Oligonukleotide Medien und Wachstumsbedingungen Medien Medienzusätze und Kohlenstoffquellen Kulturbedingungen Zelldichtemessung Genetische und molekularbiologische Methoden Standardmethoden mit Nukleinsäuren Konstruktion von Plasmiden Stammkonstruktionen Transkriptomanalyse... 33

5 Inhaltsverzeichnis II Präparation von RNA aus Bakterien Formaldehyd Agarose Gelelektophorese Chip-Herstellung Auswertung der Arraydaten EMSA Electromobility Shift Assay Biochemische Mehtoden SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Westernblot Bestimmen der Proteinkonzentration Bestimmen der β-galaktosidase-aktivität Bestimmen der Aktivität der Alkalischen Phosphatase Reinigung von Protein Affinitätschromatographie Gelfiltration Bestimmen des Polymerisierungsgrades von Mlc und YeeI mittels Gelfiltration Reinigen des Komplexes aus Mlc und IIB Glc (Koelution) Bindetests zwischen Mlc und EIICB Glc (PtsG) Bindetests zwischen Mlc und YeeI (Surface Plasmone Resonace) Bindetests zwischen EIIA Glc und CyaA (Adenylatcyclase) Zellextrakte für 2D-Gelelektrophorese Ergebnisse Mlc und PtsG Analyse verschiedener Mlc- und EIIB Glc -Varianten bezüglich ihrer Rolle bei der Bindung der Proteine und des Einflusses auf die Mlc regulierten Gene Der C-Terminus von Mlc Membranbindetests mit PtsG (EIICB Glc ) enthaltenden Membranen und den Mlc-Varianten Membranbindetests mit unterschiedlichen IIB Glc -Varianten und MlcWT Die Mlc-Varianten und ihr Einfluss auf die Mlc regulierten Gene Die DNA-Bindung der Mlc-Varianten mit C-terminaler Deletion Bestimmen der Quartiärstruktur von Wildtyp Mlc und den Mlc- Varianten... 69

6 Inhaltsverzeichnis III Koelution von MlcWT mit der löslichen B-Domäne von PtsG Überblick zu den Untersuchungen an den Mlc- und der EIIB Glc - Varianten Bindung zwischen Mlc und YeeI Bestimmen des Oligomerisierungsgrades von YeeI Oberflächenresonanzspektroskopie Beeinflusst YeeI die Bindung von Mlc an PtsG? Einfluss von Zuckerphosphaten auf die Interaktion zwischen EIIA Glc und der Adenylatcyclase Nachweis der Interaktion zwischen EIIA Glc und der Adenylatcyclase Analyse der Interaktion zwischen EIIA Glc und den Domänen der Adenylatcyclase Nachweis der Interaktion zwischen EIIA Glc und der Adenylatcyclase bei Zugabe von Zuckerphossphat Auswirkungen der EIIA Glc Phosphorylierung auf die Interaktion zwischen EIIA Glc und Adenylatcyclase Identifizieren weiterer Mlc regulierter Gene DNA-Microarray Überprüfung der Chipdaten Proteonomanalyse Muster der in der Zelle synthetisierten Proteine im mlc Hintergrund verglichen mit der Mlc-Überproduktion Diskussion Untersuchungen zur Interaktion zwischen Mlc und dem EIICB Glc (PtsG) Die Rolle des C-Terminus von Mlc Der Widerspruch: Mlc-Dimere in der Kristallstruktur und Tetramer unter nativen Pufferbedingungen Die Regulation der Mlc abhängigen Gene durch unterschiedliche Mlc-Varianten Membranassoziation ist die Voraussetzung für die Inaktivierung von Mlc Die Phosphorylierungsabhängige Bindung von EIIB Glc und Mlc Die Wechselwirkung zwischen Mlc und YeeI

7 Inhaltsverzeichnis IV 4.3 Die Interaktion zwischen EIIA Glc und der Adenylatcyclase Das Mlc-Regulon Literatur Anhang

8 Abbildungsverzeichnis V Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Bestandteile des PTS (Phosphotransferasesystem)... 3 Abbildung 2: Glukose-PTS Regulatorische Funktion der PTS-Komponenten... 6 Abbildung 3: HTH-Motiv von Mlc und NagC Abbildung 4: DNA-Bindemotive von NagC und Mlc Abbildung 5: Mlc regulierte Gene Abbildung 6: Inaktivierung von Mlc Abbildung 7: Aufsicht auf die amphipatische α-helix Abbildung 8: Mlc-Varianten Abbildung 9: Membranbindungstest von Mlc mit PtsG enthaltenden Membranen Abbildung 10: Membranbindetests mit den Mlc-Varianten Abbildung 11: Bindung von MlcWT an Gp8-IIB Glc Abbildung 12: Bindung von MlcWT an die Gp8-IIB Glc Varianten unter nicht phosphorylierenden Bedingungen Abbildung 13: Bindetests unter phosphorylierenden Bedingungen mit Membranen aus dem Stamm IT1168 und MlcWT Abbildung 14: Auswirkung von MlcWT, Mlc 9, Mlc 18 und Mlc110 auf die maltlacz Expression Abbildung 15: Auswirkung von MlcWT, Mlc 9 und Mlc 18 auf die ptsg-lacz Expression Abbildung 16: Auswirkung von MlcWT, MlcH52, Mlc_AYA und Mlc_SYS auf die ptsg-lacz Expression Abbildung 17: Auswirkung von Wachstum auf Glukose auf die Derepression der malt-lacz Expression Abbildung 18: Auswirkung von Wachstum auf Glukose auf die Derepression der ptsg-lacz Expression Abbildung 19: Electromobility Shift Assay 68 Abbildung 20: Elutionsprofile zur Bestimmung der Quartiärstruktur der Mlc- Varianten Abbildung 21: Bestimmen des Molekulargewichtes von MlcWT und Mlc 9, Mlc Abbildung 22: Elutionsprofile zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcH52 in Tris-Puffer... 72

9 Abbildungsverzeichnis VI Abbildung 23: Elutionsprofil zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcH52 in Tris-Puffer mit ß-Mercaptoethanol Abbildung 24: Elutionsprofil zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcH52 in Glycinpuffer Abbildung 25: Elutionsprofil zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcH52 in Kristallisationspuffer Abbildung 26: Bestimmen des Molekulargewichtes von MlcH52 in Kristallisationspuffer Abbildung 27: Analyse augewählter Peakfraktionen bei der Gelfiltration zur Bestimmung des Molekulargewichtes von MlcH Abbildung 28: Elutionsprofil der Koelution von Mlc und IIB Glc (His6x) Abbildung 29: Koelution von Mlc und IIB Glc (His6x) Abbildung 30: Elutionsprofile zur Bestimmung der Quartiärstruktur von YeeI Abbildung 31: Bestimmen des Molekulargewichtes von YeeI Abbildung 32: Oberflächenresonanzspektroskopie; Bindung von an den Chip gebundenen Mlc mit YeeI Abbildung 33: Bindung der Mlc-Varianten an chipgebundenes YeeI Abbildung 34: Membranbindetests mit Mlc, YeeI und mit PtsG angereicherten Membranvesikeln Abbildung 35: Überproduktion der Adenylatcyclase (CyaA) Abbildung 36: Bindung von EIIA an die Adenylatcyclase (CyaA) Abbildung 37: Bindetests zwischen Adenylatcyclase mit N-terminalem His-tag und gereinigtem EIIA Glc Abbildung 38: Bindetests zwischen den Domänen der Adenylatcyclase mit N- terminalem His-tag und gereinigtem EIIA Glc Abbildung 39: Wachstum der Adenylatcyclase-Varianten auf Minimalmedium mit Glycerin als einziger Kohlenstoffquelle Abbildung 40: Bindetests zwischen der katalytischen Domäne der Adenylatcyclase und gereinigtem EIIA Glc Abbildung 41: Einfluss von Zuckerphospat auf die Bindung zwischen der Adenylatcyclase und EIIA Glc in Zellextrakten Abbildung 42: Bindetests mit (His6x)Adenylatclyse und gereinigtem nicht phosphoryliertem EIIA Abbildung 43: 2D-Gele des Vergleiches mlc-mutante gegen Mlc-Überproduktion

10 Abbildungsverzeichnis VII Abbildung 44: Struktur des MlcH52 Dimer Abbildung 45: Aktivierung/Inaktivierung der Adenylatcyclase

11 Tabellenverzeichnis VIII Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Bakterienstämme Tabelle 2: Phagen Tabelle 3: Plasmide Tabelle 4: Oligonukleotide Tabelle 5: Medienzusätze Tabelle 6: Kohlenstoffquellen Tabelle 7: Plasmide - Überproduktion von Protein Tabelle 8: Plasmide für die Überproduktion von EIIBC Glc und IIB-Varianten Tabelle 9: Plasmide - Überproduktion der Adenylatcyclasevarianten für Membranbindungstests Tabelle 11: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcWT, Mlc 9 und Mlc Tabelle 12: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcH52 in Trispuffer Tabelle 13: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcH52 intrispuffer mit ß-Mercaptoethanol Tabelle 14: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcH52 in Glycinpuffer Tabelle 15: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcH52 in Kristallisationspuffer Tabelle 16: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von YeeI Tabelle 17: Statistische Auswertung der DNA-Microarray-Daten Tabelle 18: Auswertung der 2D-Gelelektrophorese. Vergleich der synthetisierten Proteine einer mlc-mutante mit denen bei Mlc-Überproduktion Tabelle 19: Vergleich der durch die Microarrays erhaltenen Daten, mit denen der 2D-Gelelektrophorese Tabelle 20: Liste von Gram negativen Bakterien mit zu Mlc und YeeI ähnlichen Proteinen Tabelle 21: Gemeinsamkeiten und Charakteristika der möglicherweise durch Mlc regulierten Gene Tabelle 22: Normalisierte Ratio of Median WT gegen mlc Teil Tabelle 23: Normalisierte Ratio of Median WT gegen mlc Teil

12 Tabellenverzeichnis IX Tabelle 24: Normalisierte Ratio of Median mlc gegen Mlc-Überproduktion Teil Tabelle 25: Normalisierte Ratio of Median mlc gegen Mlc-Überproduktion Teil

13 Zusammenfassung X Zusammenfassung Mlc, von Escherichia coli, ist ein globaler, transkriptioneller Regulator, der die Expression verschiedener Systeme zur Aufnahme und Verwertung von Kohlenstoffen repremiert. Die Mlc regulierten Gene werden andererseits durch den camp/cap Komplex aktiviert. Unter den durch Mlc repremierten Genen befinden sich solche, deren Genprodukte Komponenten des PEP abhängigen Phosphotransferasesystems (PTS) darstellen. Die PTS-Komponenten selbst haben ebenfalls regulatorische Funktion. So beeinflusst das EIIA Glc die Aktivität des Enzyms Adenylatcyclase, welches camp aus ATP bildet. Mlc selbst wird durch Bindung an PtsG, dem Glukose spezifischen EIICB, inaktiviert. Mlc wird an dephosphoryliertes PtsG gebunden wie man es bei aktiven Transport von Glukose vorfindet. So ist die Bildung des Aktivators camp/cap und die Aktivität des Repressors Mlc im Mlc-PtsG-System in Abhängigkeit von dem Transport von Glukose über PtsG reguliert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass für die Bindung von Mlc an PtsG, die lösliche, cytoplasmatische B-Domäne von PtsG ausreicht, auch wenn diese unabhängig vom Rest des Proteins als separates Polypeptid exprimiert wird. Jedoch nur, wenn die B-Domäne mittels eines Membranankers membrangebunden ist und der Repressor Mlc dadurch an der Membran fixiert wird, wird zusätzlich eine Derepression der Mlc-regulierten Gene erreicht. Dabei kann IIB Glc an ein Membranprotein fusioniert sein, das keine Ähnlichkeit zur C-Domäne von PtsG hat. Gezeigt wurde zudem, dass Mlc an Bereiche der B-Domäne bindet, die mit der Bindestelle des EIIA Glc überlappen und die sich in unmittelbarer Nähe der Phosphorylierungsstelle der B-Domäne, dem Cystein 421, befinden. Das auch an der Stabilisierung der Phosphatbindung beteiligte Arg424 von PtsG ist für die Mlc-Bindung unbedingt erforderlich. Die Bestimmung des Molekulargewichtes von Mlc ergab, dass das Protein unter nativen Bedingungen als Tetramer vorliegt. Die C-terminalen 18 Aminosäuren von Mlc bilden möglicherweise eine amphipatische α-helix. Die hier durchgeführten Experimente ergaben, dass die Helix eine wichtige Funktion bei der Ausbildung der korrekten Tertiär und Quartiärstruktur des Proteins hat. Eine um die 18 Aminosäuren verkürzte Mlc-Variante bildete unter nativen Bedingungen lediglich ein Dimer und hatte die Fähigkeit verloren an PtsG oder an die DNA zu binden.

14 Zusammenfassung XI In weiteren Bindetests wurde bewiesen, dass Mlc neben PtsG auch an YeeI bindet. YeeI ist ein lösliches Protein, dass bei Überproduktion die Expression der Mlc regulierten Gene positiv beeinflusst. Für YeeI konnte unter nativen Bedingungen die Bildung eines Dimers nachgewiesen werden. In den in vitro Bindetests konnte die Mlc-PtsG-Bindung auch nicht durch Zugabe eines Überschusses an YeeI gelöst werden. Ebenfalls wurde eine direkte Protein-Protein-Interaktion zwischen der Adenylatcyclase und dem EIIA Glc nachgewiesen. Entgegen dem vorherrschenden Modell, das die Bindung von phosphoryliertem EIIA Glc propagierte, erfolgte die Bindung von dephosphoryliertem EIIA Glc. Eine Bindung von phosphoryliertem EIIA Glc konnte weder bewiesen noch ausgeschlossen werden. Für die Bindung von EIIA Glc ist die N-terminale katalytische Domäne der Adenylatcyclase ausreichend. Eine genomweite Suche nach weiteren Mlc regulierten Genen wurde mit Hilfe von DNA- Microarrays durchgeführt. Durch die nachfolgende Analyse der erhaltenen Daten mittels transkriptioneller Reportergenfusionen, konnten einige der falsch positiven Ergebnisse ausgeschlossen werden, aber keine weiteren Zielgene der Mlc-Regulation ermittelt werden.

15 1. Einleitung 1 1. Einleitung 1.1 Einführung Escherichia coli, ein Gram-negatives, stäbchenförmiges, fakultativ anaerobes Eubakterium zeichnet sich durch eine große Variabilität seiner Lebensräume aus. Es kann neben seinem normalen Lebensraum im Darm von Mensch und Tier auch in deren Umgebung überleben. Optimale Wachstumsbedingungen im Labor, die sich im schnellen Wachstum wiederspiegeln, sollten in den natürlichen Ökosystemen kaum vorkommen. Hier herrschen Mangel (Nährstoffe, Phosphat-, Stickstoffquellen, usw.) und Stress (O 2, ph, Temperatur, osmotischer Druck, usw.) vor (59, 69). Das wiederum erfordert eine fein abgestimmte, koordinierte Kontrolle sämtlicher zellulärer Vorgänge um die Anpassung an diese veränderlichen Umweltbedingungen zu erreichen und im Konkurrenzkampf mit anderen Organismen zu bestehen. Komplexe regulatorische Netzwerke bewirken, dass nur der Teil an zellulären Systemen gebildet wird oder aktiv ist, der eine Anpassung an die jeweilige Lebenssituation erlaubt. Beispielhaft ist die Fähigkeit von Bakterien ein energetisch hochwertigeres Substrat unter anderen zu erkennen, sich daraufhin zuzubewegen und Systeme für den Transport und Metabolismus der vorhandenen Substrate einer Hierarchie entsprechend zu exprimieren und aktivieren. Glukose stellt für E. coli eine der bevorzugten Kohlenstoffquellen dar, da sie gekoppelt an den Transport in die Zelle über ein von Phosphoenolpyruvat abhängiges Phosphotransferasesystem (PTS) zu Glukose-6-Phosphat phosphoryliert wird und ohne weitere Modifizierungen in Stoffwechselwege wie beispielsweise der Glykolyse eingehen kann. Die Expression des PTS wird abhängig von der Verfügbarkeit des Substrates durch unterschiedliche Mechanismen reguliert, während wiederum die Proteine selbst die Aktivität anderer Systeme beeinflussen (42, 99). Einen Teil dieses umfangreichen regulatorischen Netzwerkes stellt das Mlc-PtsG- System dar. Mlc als globaler Regulator bewirkt eine koordinierte Kontrolle von Genen, die für PTS- Komponenten kodieren. Diese Kontrolle erfolgt selbstreguliert, da die Aktivität von Mlc durch den Transport von Glukose über das Glukose-spezifische EIICB Glc (PtsG) reguliert wird (119). Im folgenden werden die an diesem regulatorischen Netzwerk beteiligten Komponenten beschrieben.

16 1. Einleitung Das Phosphotransferasesystem (PTS) Das PTS zeichnet sich dadurch aus, dass durch den Mechanismus der Gruppenübertragung, ein Phosphatrest, ausgehend von PEP (Phosphoenolpyruvat), in unmittelbare Nähe einer Permease übertragen wird. Ermöglicht wird dies durch die Phosphorylierung und Dephosphorylierung verschiedener allgemeiner oder Substrat spezifischer Proteine. Das aufgenommene Substrat kann gekoppelt an den Transport phosphoryliert und somit energetisiert werden. (124, 136) Die allgemeinen und löslichen Komponenten des PTS sind HPr (heatstable oder Histidin carrying protein, ptsh) und EI (EnzymI, ptsi), welche von allen Substrat spezifischen PTS- Komponenten in E. coli genutzt werden (siehe Abb.1). Eine Ausnahme bildet das Fruktose- PTS, dass ein HPr ähnliches Protein beinhaltet, welches bei konstitutiver Expression HPr funktionell komplementieren kann (46). EI wird am Histidin-189 durch PEP phosphoryliert. Voraussetzung für die Phophorylierbarkeit von EI ist die Dimerisierung des Proteins und das Vorhandensein zweiwertiger Kationen. Das phosphorylierte Dimer zerfällt in Monomere, welche dann HPr an dessen in Position 15 befindlichen Histidin phosphorylieren. Ein limitierender Schritt der Phosphorylierungskaskade ist die Reassoziation der dephosphorylierten Monomere (166, 168, 169). HPr überträgt das Phosphat auf die EIIA der Zucker spezifischen Transportkomplexe (siehe Abb. 1). Die Zucker spezifischen Transportkomplexe, auch EII (EnzymII) genannt, bestehen aus drei bis vier funktionellen Komponenten, bezeichnet mit IIA, IIB, IIC und gelegentlich IID. Sie sind entweder einzelne Proteine und dann als Untereinheiten eines Komplexes anzusehen, oder Teil eines aus mehreren Domänen bestehenden Proteins. Die Domänen sind dann durch flexible Linker miteinander verbunden. EIIA und EIIB sind hydrophile Proteine oder Domänen. EIIC und D sind Membranproteine (siehe Abb. 1). Aufgrund der Verteilung der Domänen auf ein oder mehrere Proteine und der Anordnung der Domänen innerhalb der Proteine wurden für E. coli und S. typhimurium mehrere PTS- Familien definiert. Funktionelle Komplementation zwischen Domänen der gleichen Familie ist möglich, nicht aber zwischen den Familien (124, 136, 145).

17 1. Einleitung 3 Abb. 1: Bestandteile des PTS (Phosphotransferase System) Phosphatgruppenübertrag von PEP über die allgemeinen, löslichen PTS-Komponenten EI und HPr auf die zuckerspezifischen EII. Beispielhaft dargestellt sind die EII zur Aufnahme von Mannose, Glukose und N-Acetyl- Glukosamin mit unterschiedlicher Anzahl 3-4 und unterschiedlicher Verbindung der Komponenten als Domänen von einem oder zweier Proteine. Die Dimerisierung von EI ist eine Voraussetzung für dessen Phophorylierbarkeit. Die Phosphorylierung/Dephosphorylierung der PTS-Komponenten ist reversibel Die Aufnahme von Glukose über das PTS Das Glukose-spezifische PTS gehört zur Glukose-Sucrose Familie. Bei all diesen PTS sind IIC und IIB Domänen eines Proteins. EIIA liegt frei (Glukose) oder gebunden vor (EIICBA Nag, N-Acetyl-Glukosamin). Verschiedene Systeme haben kein eigenes EIIA und nutzen das des Glukose-PTS. Die Phosphorylierung der aufgenommenen Zucker erfolgt am C-6 des Glukopyranosidringes (124, 133). Glukose wird transportiert und über eine Kaskade von Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsreaktionen der PTS-Komponenten von PEP ausgehend phosphoryliert (siehe Abb. 2). Das EIIA Glc wird dabei durch die allgemeine Komponente HPr am Histidin 90 phosphoryliert (35, 126). EIIA Glc wiederum überträgt das Phosphat auf ein Cystein (Cys 421) in der B-Domäne von EIICB Glc (ptsg) (91). Die über IIC aufgenommene Glukose wird schließlich ausgehend von IIB phosphoryliert (siehe Abb. 2).

18 1. Einleitung 4 Die pts-gene werden abhängig vom Substratvorkommen, Metabolismus, Stressfaktoren und vom Redox-Zustand der Zelle durch unterschiedliche Mechanismen reguliert. Sowohl die Transkription des Operons ptshicrr (HPr, EI, EIIA Glc ), als auch die von ptsg (EIICB Glc ) wird negativ durch Mlc und positiv durch den camp/cap Komplex reguliert (115, 116). Daneben beeinflussen weitere Regulatoren die Transkription der pts-gene. So werden die pts- Gene als Teil des Hitzeschockregulons, vermittelt durch den alternativen Sigmafaktor σ 32, bei Hitzestress vermehrt expremiert (144). Auch FruR (oder Cra: catabolite repressor activator), der Repressor des Fruktose-spezifischen PTS, repremiert neben Genen der Glykolyse zudem schwach ptsh (119). Am ausgeprägtesten jedoch zeigen sich die vielfältigen Regulationsmechanismen bei der Kontolle der ptsg Transkription. ArcA bindet bei Veränderungen des Redoxzustandes der Zelle (70) an die ptsg Promotoren und das Nukleoid assoziierte Protein Fis verstärkt sowohl die Repression durch Mlc als auch die Aktivierung durch camp/cap (143). Neben der Regulation auf Ebene der Transkription wird ptsg zusätzlich posttranskriptionell reguliert. Die Anhäufung von Zuckerphosphaten, sei es durch Blockieren der Glykolyse oder durch Zugabe eines nicht abbaubaren Substratanalogons, bewirkt einen schnellen Abbau der ptsg mrna durch einen RNaseE abhängigen Prozess. So könnte die Anhäufung von Zuckerphosphaten darauf hinweisen, dass der Abbau des Substrates langsamer abläuft als dessen Aufnahme. Durch den Abbau der ptsg mrna könnte verhindert werden, dass durch die nachfolgende Translation noch mehr Transporter gebildet wird, der die Transportrate zusätzlich erhöhen würde (73, 76, 96, 163). Allein durch das Zusammenspiel dieser Regulatoren bei der Expression der pts-gene, ist das Glukose-PTS in diverse regulatorische Netzwerke eingebunden, die eine Anpassung an verschiedenste Umweltfaktoren erlauben. Dieses Bild erweitert sich um ein Vielfaches, wenn man die regulatorischen Funktionen mit einbezieht, die die PTS-Proteine selbst ausüben. Bedingt durch die zuckerabhängige Dephosphorylierung beziehungsweise der PEP abhängigen Phosphorylierung, liegen die PTS-Proteine entweder vermehrt in ihrer dephosphorylierten oder vorwiegend in der phosphorylierten Form vor. Eine merkbare zuckerabhängige Dephosphorylierung der PTS-Komponenten erfolgt letztendlich dadurch, dass, wie zuvor beschrieben, die Dimerisierung der Komponente EI eine Voraussetzung für

19 1. Einleitung 5 deren Phosphorylierbarkeit und somit der Geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Phosphorylierungskaskade ist. Auf diese Weise nehmen das nicht phosphorylierte EI und PEP über CheA Einfluss auf die Chemotaxis (88, 124). Phosphoryliertes EI dagegen kann das Phosphat auf die Acetatkinase übertragen. Dies könnte eine Verbindung zwischen PTS und dem TCA (Tricarbonsäure)- Zyklus darstellen (45). Das Protein HPr kann den Antiterminator BglG des bglgfb Operons phosphorylieren (49). Zusätzlich vermittelt HPr, durch Interaktion mit der Glykogenphosphorylase, möglicherweise eine Abstimmung zwischen der Substrataufnahme und dem Aufbau des Kohlehydratspeichers (142). Die Bindung von nicht phophoryliertem EIIA Glc an FrsA (fermentation/respiration switch) beeinflusst die Rate von oxidativen Abbau und Vergärung der Glukose (79). Dephophoryliertes EIIA Glc verursacht außerdem Induktorausschluss (siehe Kap ), während EIIA Glc -Phosphat durch Aktivierung der Adenylatcyclase die Bildung des Aktivators camp/cap steigert, wodurch die Transkription der pts-gene selbst und die anderer Gene aktiviert wird (siehe Kap1.3.1). Letztendlich hat auch der Transportkomplex (EIICB Glc = PtsG) an sich positive Auswirkung auf die Expression der pts-gene und die weiterer Transportsysteme, da der globale Regulator Mlc durch nicht phosphoryliertes PtsG inaktiviert wird (siehe Kap. 1.4).

20 1. Einleitung 6 Abb. 2: Glukose-PTS Regulatorische Funktion der PTS-Komponenten Überblick über die am Transport von Glukose beteiligten PTS-Proteine (gelb) und die Phosphorylierungsreaktionen ausgehend von PEP über EI, HPr, EIIA auf EIIB. Phosphat wird von EIIB auf die transportierte Glukose übertragen. Der Regulator Mlc (orange) bindet an dephosphoryliertes EIICB. Dephosphoryliertes EIIA Glc bindet an LacY, MalK und GlpK. Positive und negative Einflüsse der PTS-Proteine auf andere Transportsysteme und Enzyme (türkis) werden mit (+) und (-) dargestellt. (P) kennzeichnet die Phosphorylierung eines Proteins.

21 1. Einleitung Katabolitenrepression und Induktorausschluss Katabolitenrepression ist ein Mechanismus, bei dem die Transkription von Genen kataboler Systeme durch die Aufnahme und Verwertung einer bevorzugten Kohlenstoffquelle gehemmt wird. In E. coli beruht dies auf der fehlenden Aktivierung camp/cap abhängig transkribierter Gene. Die direkte Bindung von dephosphoryliertem EIIA Glc an Permeasen oder Enzyme verschiedener kataboler Systeme, verhindert die Aufnahme oder die Bildung des Induktors dieser Systeme und wird als Induktorausschluss bezeichnet.(137) Da beide Mechanismen von dem Transport von Glukose über das EIICB Glc (PtsG) abhängig sein können und der camp/cap Komplex der Aktivator der Mlc regulierten Gene ist, sind auch die Katabolitenrepression und der Induktorausschluss als Parameter der transportgesteuerten Genregulation im Mlc-PtsG System mit einzubeziehen Glukose - vermittelte Katabolitenrepression und Induktorausschluss Glukose und andere PTS-Zucker werden im Anschluss an den Transport mit einer energiereichen Phosphatgruppe versehen. Derartige Kohlenstoffquellen werden von E. coli präferenziell aufgenommen und inhibieren den Transport und die Verwertung anderer (42, 137). Der Transport von Glukose über das PTS bewirkt, wie zuvor beschrieben, dass die PTS- Proteine vorwiegend in ihrer dephosphorylierten Form vorliegen. Dephosphoryliertes EIIA Glc hemmt die Aufnahme oder die Bildung des Induktors anderer kataboler Systeme (siehe Abb.2), indem es direkt an Permeasen oder Enzyme dieser Systeme bindet. Die Bindung erfolgt jedoch nur in Anwesenheit des Substrates des jeweiligen Systemes. Vermutlich bewirkt die Substratbindung eine Änderung der Konformation der betroffenen Proteine, welche die EIIA Glc Bindung ermöglicht. Auf diese Weise wird verhindert, dass EIIA Glc austitriert wird, wenn die Substrate dieser Systeme nicht vorhanden sind und diese Regulation unnötig ist. Dieser Mechanismus wird als Induktorausschluss bezeichnet (124).

22 1. Einleitung 8 Beispielsweise bindet EIIA Glc an LacY, die Laktosepermease, und verhindert den Transport von Laktose, bei gleichzeitiger Anwesenheit von Glukose im Medium (101, 107, 108, 149). Induktorausschluss ist der maßgebliche Mechanismus der die Glukose-Laktose-Diauxie bedingt. Ein weiteres Beispiel ist die Bindung von EIIA Glc an die ATPase MalK, die Teil des Maltose/Maltodextrin ABC(ATP-binding-cassette)-Transportsystemes ist (33, 81). Im Falle der Bindung von EIIA Glc an GlpK (Glycerinkinase) wird die Bildung des Inuktors Glycerin-3- Phosphat aus Glycerin blockiert (67, 123). Andererseits wird die Adenylatcyclase, welche die Bildung von camp aus ATP katalysiert, unter Bedingungen aktiviert unter denen EIIA Glc phosphoryliert ist (siehe Kap ). camp wird durch CAP (catabolite activator protein; crp) gebunden. Die daraus resultierende Konformationsänderung ermöglicht es dem Regulator spezifisch an DNA-Sequenzen, den CAP-Boxen, zu binden (90, 167). Die Ähnlichkeit der Sequenzen der CAP-Boxen zu einem 22 bp langen, palindromen Konsensusmotiv (5 -AAATGTGATCT+AGATCACATTT- 3 )(10), die Lage der CAP-Boxen bezüglich des Transkriptionsstartes oder kooperative Bindung mit weiteren transkriptionellen Regulatoren, bewirkt eine unterschiedliche Affinität des camp-cap-komplexes zu den Operatoren. Dies geht einher mit einer unterschiedlich starken Beeinflussung der Transkription an den Promotoren der katabolitsensitiven Gene. Daraus ergibt sich zudem, ob camp/cap als positiver oder negativer Regulator wirkt.(2, 3, 23, 24, 78) Unter Bedingungen, unter denen EIIA Glc hauptsächlich dephosphoryliert vorliegt, wie etwa bei dem Transport von Glukose, erfolgt keine Aktivierung der Adenylatcyclase. Der niedrige camp und camp/cap Spiegel reicht nicht aus um die meisten der camp/cap abhängigen Gene zu aktivieren. Unter diesen Genen sind solche, die für Proteine kodieren, die für den Transport und den Abbau alternativer Kohlenstoffquellen gebraucht werden. Dieser Effekt wird als Katabolitenrepression bezeichnet.

23 1. Einleitung Stimulation der Adenylatcyclase-Aktivität durch EIIA Glc Die Adenylatcyclase (cyaa) ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 95 kda, das aus zwei Domänen besteht, einer N-terminalen katalytischen- und einer C-terminalen regulatorischen Domäne. Ein Modell, entwickelt aus genetischen Untersuchungen, besagt, dass die regulatorische Domäne die Aktivität der katalytischen Domäne hemmt (63, 135). Der Phosphorylierungszustand der PTS-Proteine ist ausschlaggebend für die Regulation der Aktivität der Adenylatcyclase. Ein niedriger camp Spiegel findet sich in Zellen mit verringerter Phosphorylierung der PTS-Proteine. Entweder verursacht durch eine Unterbrechung der Phosphorylierungskaskade mittels Mutation von ptsh, ptsi (78, 124) oder crr (44, 100) oder durch den Transport von Glukose. Ein vergleichbarer Effekt wird durch eine Mutation in EIIA Glc erreicht, die dessen Phosphorylierung verhindert, oder bei einer Insertion in cyaa (58). Nur unter Bedingungen, unter denen EIIA Glc überwiegend phosphoryliert vorliegt, erfolgt eine Aufhebung des inhibitorischen Effektes der regulatorischen Domäne und damit ein Anstieg des camp-spiegels in der Zelle (113). Dass die C-terminale regulatorische Domäne der Adenylatcyclase für diesen Prozess von Bedeutung ist, zeigt sich darin, dass bei Mutanten, denen die regulatorische Domäne fehlt, die Aktivität der Adenylatcyclase konstitutiv vorhanden ist und nicht mehr durch Glukoseaufnahme oder crr-deletion inhibiert wird (113, 135). Bislang ist nicht bekannt, ob die negative Ladung von EIIA Glc -P (P: Phosphat) (130) oder eine direkte Interaktion zwischen EIIA Glc und der Adenylatcyclase oder beides die Aktivierung der Adenylatcyclase bewirken. Man weiß ebenfalls wenig darüber, inwieweit weitere Faktoren daran beteiligt sind. So wurde diskutiert, ob auch eine Phosphorylierung der Adenylatcyclase durch EIIA Glc -P möglich ist, da sich um das Histidin-609 der Adenylatcyclase eine potentielle Phosphorylierungsstelle befindet (31). Auch das CAP-Protein ist an der Regulation der Adenylatcyclase-Aktivität beteiligt. Mutanten ohne CAP-Protein produzieren große Mengen an camp. Die gesteigerte Produktion ist abhängig von EIIA Glc, da sie bei zusätzlicher crr-mutation unterbleibt (31, 68, 125, 155). Weitere Faktoren, die bekanntermaßen die Aktivität der Adenylatcyclase positiv beeinflussen, sind das Vorkommen von anorganischem Phosphat (P i ) (5) und die Verfügbarkeit von ATP (131).

24 1. Einleitung Katabolitenrepression und Induktorausschluss durch Nicht-PTS- Substrate Auch die Nutzung von Nicht-PTS-Substraten ist aufeinander abgestimmt reguliert. Ebenfalls werden schneller verwertbare Substrate bevorzugt genutzt und inhibieren die Expression und Aktivität weiterer kataboler Systeme. Nicht-PTS-Substrate, wie Glukose-6-P, Glukonat, Laktose, Glycerin, Glycerin-3-P bewirken im unterschiedlichen Ausmaß Katabolitenrepression (62). Im Falle von Glukose-6-P entspricht die Reduktion von camp und die Dephosphorylierung von EIIA Glc der bei Transport von Glukose herbeigeführten (61). Durch die Bestimmung der Aktivität von chromosomal kodierter ß-Galaktosidase (LacZ), die im Operon laczya camp/cap abhängig exprimiert wird, sieht man, dass die Katabolitenrepression durch Glukose-6-P nicht von EIIA Glc abhängig ist. Sie ist aber abhängig von camp/cap. Die Expression von lacz mit veränderter Promotorsequenz erfolgt unabhängig von der Aktivierung durch camp/cap. In diesem Stamm bewirkt Glukose-6-P nur eine geringe Repression von lacz. Sowohl die CAP, als auch die camp Konzentration wird durch Glukose-6-P erniedrigt. Letzteres bedingt durch eine verringerte Adenylatcyclaseaktivität (62). Es wird postuliert, dass die camp-konzentration mit der Transportaktivität korreliert, da der Transport des nicht abbaubaren 2-Deoxy-Glukose-6-P eine Abnahme der Adenylatcyclaseaktivität zur Folge hat (36). Die fehlende Aktivierung der Adenylatcyclase, verbunden mit einer niedrigen Konzentration des camp/cap-komplexes, ist auch hier der Mechanismus der Katabolitenrepression. Auch im Falle von Glukose-6-P wird die Inhibierung anderer Zucker verwertender Systeme durch Induktorausschluss mittels dephosphoryliertem EIIA Glc erreicht. Anders als bei Glukose bewirkt der Transport von Glukose-6-P keine Veränderung im Verhältnis von phosphoryliertem zu nicht phosphoryliertem EIIA Glc. Es wird jedoch vermutet, dass der weitere Stoffwechsel über die Glykolyse das PEP zu Pyruvat Verhältnis verändert, welches dann zu einer verringerten Phosphorylierung der PTS-Proteine führt (61). Im Gegensatz dazu kommt es bei der Aufnahme von Glycerin und Glycerin-3-P zu keiner wesentlichen Dephosphorylierung von EIIA Glc (39, 61). Untersuchungen zum mal-regulon zeigen aber, dass die Expression dieser Gene bei Wachstum auf den beiden Kohlenstoffquellen sehr wohl repremiert wird. Verursacht wird diese Repression durch das Auftreten von Glycerin-3-P. Die Produkte weiterer Stoffwechselschritte sind dafür nicht nötig. Untersuchungen mit transkriptionellen und translationellen Reportergenfusionen zu

25 1. Einleitung 11 malt, dessen Genprodukt MalT der transkriptonelle Aktivator der mal-gene ist, weisen auf die Möglichkeit hin, dass zwei unterschiedliche Mechanismen diese Repression bewirken. Einer betrifft die Transkription und ist abhängig von camp/cap und EIIA Glc, während ein posttranskriptioneller Mechanismus von camp/cap und EIIA Glc unabhängig ist. Weitere Experimente führten zu einem Modell, nach dem das Signal für die Anwesenheit eines Nicht- PTS-Substrates das daraus resultierende Zuckerphosphat ist. EIIA Glc ist der Rezeptor für dieses Signal und wird direkt oder indirekt daran gehindert die Adenylatcyclase zu aktivieren. Dies bewirkt wie bereits zuvor erläutert Katabolitenrepression. Die translationale Regulation geschieht vermutlich in Folge einer ph-wert Erniedrigung in Kulturen, denen eine Kohlenstoffquelle im Überschuss zur Verfügung steht. Der weitere Mechanismus ist bislang nicht aufgeklärt.(39-41) 1.4 Mlc Ein globaler Regulator zuckerverwertender Systeme Mlc (making large colonies) wird durch ein offenes Leserater bei 35,9 min des E.coli Chromosoms kodiert. In seiner Rolle als Regulator für Systeme zur Aufnahme und Verwertung von diversen Kohlenstoffquellen wurde es auf unterschiedlichen Wegen entdeckt, was sich auch in einer unterschiedlichen Namensgebung wiederspiegelt. So wurde es zunächst bei der Untersuchung von E. coli Stämmen mit einer ptsg-mutation (EIICB Glc ) und einer Suppressormutation entdeckt. Unter anaeroben Bedingungen nehmen diese Mutanten Glukose und das Substratanalogon 2-Deoxyglukose über die Mannose spezifischen EII auf. Das Gen, in dem sich die Suppressormutation befindet wird dgsa (deoxy-glucose-sensitive) genannt (134). Davon unabhängig entdeckte man es, als man das Wachstum von E. coli auf Vollmedium mit Glukose optimieren wollte. Die Überexpression eines unbekannten Genes, später mlc genannt, bewirkte eine langsame Verwertung der Glukose und verhinderte die dabei auftretende Akkumulierung von Acetat. Im Vergleich zu Wildtypzellen bilden Zellen, die plasmidkodiertes Mlc überproduzieren große Kolonien (66). Mlc und DgsA sind identisch.

26 1. Einleitung 12 Mlc ist der ROK (repressor, open reading frame, kinases)-familie zugeordnet. Darin sind drei Klassen von Proteinen zusammengefasst (57, 159). Eine Klasse (O), die durch bislang nicht charakterisierte offene Leseraster kodiert ist, eine Klasse (R) von transkriptionellen Repressoren und eine (K), in der Fruktose- oder Glukose-Kinasen zusammengefasst sind. Letzteren fehlen im Vergleich zu den Repressorproteinen 100 Aminosäuren am N-Terminus, welche bei den Regulatoren das HTH (helix-turn-helix)-motiv, die DNA-Bindedomäne, enthalten. Mlc und der ebenfalls zur ROK-Familie gehörende Regulator NagC weisen 40% Identidät und 80% Ähnlichkeit zueinander auf (34, 118). NagC ist der transkriptionelle Repressor der N-Acetyl-Glucosamin (GlcNAc) spezifischen EII und von Enzymen des GlcNAc-Abbaus. Am markantesten ist diese Übereinstimmung zu Mlc auf Proteinebene bezüglich des HTH-Motives. Die Aminosäuresequenz der Erkennungshelix (Helix 2) des HTH-Motivs von Mlc und NagC ist nahezu identisch (siehe Abb.3). Abb.3:HTH-Motiv von Mlc und NagC. Vergleich des N-terminalen DNA-Bindemotivs von NagC (AS: 33-56) und Mlc (AS: 31-54) mit Helix 1 und der Erkennungshelix 2. Beide Regulatorproteine erkennen nahezu identische Operatoren. Um eine zentrale Position 0 führt die Anordnung GCGC an Position 4 bis 1/+1 bis +4 zu einer erhöhten Bindung an den Operator. Aber auch bei Abweichungen dazu ist der Abstand von 9 Basenpaaren zwischen den absolut konservierten Basen TT bei 5/-6 und AA bei +5/+6 unbedingt erforderlich. An Position 7 bis 10/+7 bis +10 befinden sich ausschließlich die Basen T oder A. Einziger Sequenzunterschied zwischen einem Mlc und einem NagC Operator sind die Basen G oder C an Position 11/+11 bei NagC bzw. A/T bei Mlc. Beide Proteine binden in vitro mit unterschiedlicher Affinität an die Bindestellen des jeweils anderen, wobei unter

27 1. Einleitung 13 physiologischen Regulatorkonzentrationen in vivo keine übergreifende Regulation beobachtet werden kann (118). Abb.4: DNA-Bindemotive von NagC und Mlc Auswahl von DNA-Bindestellen von NagC bzw. Mlc regulierten Genen: S steht für die Basen Guanin/Cytosin (G/C), W für die Basen Adenin/Thymin (A/T), N für A, T, C, oder G; Durch Mlc regulierte Gene Mlc repremiert die Transkription des Operons ptshicrr, das für HPr und EI, den allgemeinen PTS-Komponenten, und das EIIA Glc kodiert (74, 116). Ebenfalls reguliert durch Mlc ist ptsg, das für das EIICB Glc kodiert (75, 115) und das Operon manxyz (114), das die Mannose spezifischen PTS-Komponenten kodiert. Des weiteren repremiert Mlc die Expression von malt, das für den Aktivator der mal-gene kodiert. Über letzteren beeinflusst Mlc die Expression sämtlicher MalT regulierten Gene. Mlc selbst ist schwach autoreguliert (34). Der mlc p2 Promotor (siehe Abb. 5) wird sowohl durch den Sigmafaktor σ 70, als auch durch σ 32 erkannt, wodurch die mlc Transkription als ein Teil des Hitzeschockregulons bei erhöhter Temperatur gesteigert wird (144).

28 1. Einleitung 14 Der Vergleich der regulatorisch wichtigen DNA-Regionen von Mlc und NagC regulierten Genen zeigt, dass die NagC-Bindestelle bevorzugt die 35 Region ersetzt, und dass bei der Regulation eine Schleifenbildung der DNA und somit die kooperative Bindung von zwei NagC-Bindestellen erforderlich ist. Mlc Bindestellen findet man meist überlappend mit oder in unmittelbarer Nähe des Transkriptionsstarts. Eine Bindestelle scheint für den repressorischen Effekt ausreichend. Auch wenn man bei ptsg (sowohl bei Promotor p1, als auch bei p2) zwei Bindestellen findet, konnte eine kooperative Bindung nicht nachgewiesen werden (siehe Abb. 5). Alle Mlc regulierten Gene werden durch die Überproduktion von Mlc stark repremiert. Die Expression der Gene ist unter dieser Bedingung nahezu nicht mehr detektierbar. Dies zeigt auch, dass Mlc unter physiologischen Bedingungen limitiert ist und die vorhandenen Bindestellen möglicherweise nur partiell besetzt sind. Dennoch zeigen sich Unterschiede in der Regulation der Gene, die mit der unterschiedlichen Affinität des negativen Regulators Mlc und des Aktivatorkomplexes camp/cap zu den jeweiligen Bindestellen zu erklären sind (34, 74, 75, ). Mlc beeinflußt die Expression der man-gene, von malt und mlc in vergleichbarer Weise. Bei Wachstum auf Glycerin führt die Deletion von mlc zu einer um das 2 5 fach gesteigerten Expression dieser Gene. Das Wachstum eines mlc + aber auch eines mlc Stammes auf Glukose resultiert in einer merkbaren aber erniedrigten Expression der oben genannten Gene. Das ist bedingt durch die fehlende Aktivierung durch den bei Wachstum auf Glukose niedrigen camp/cap Spiegel. Die Expression beispielsweise der man-gene lässt sich bei Wachstum auf Glycerin durch Zugabe von camp auch in einem mlc + Stamm um das 14-fache erhöhen. Zusammengefasst stehen diese Gene unter der durch Glukose vermittelten Katabolitenrepression, werden negativ durch Mlc reguliert und aktiviert durch camp/cap, wobei der camp/cap Effekt den Mlc Effekt überwiegt (34, 114).

29 1. Einleitung 15 Abb.5: Mlc regulierte Gene Vergleich der Promotorregion der Mlc regulierten Gene mit der des durch NagC regulierten nage-bacd Operons, abgewandelt nach (34, 74, 75, ). Die Mlc Bindestellen, gekennzeichnet mit Mlc, erscheinen als graue Rechtecke; die CAP Bindestellen, gekennzeichnet mit CAP, als weiße Rechtecke. Die Bindestellen werden bezüglich ihrer Lage zum Transkriptionsstart (+1) der genannten Gene gezeigt.

30 1. Einleitung 16 Die Expression der pts-gene (ptsg, ptshi) wird positiv durch camp/cap reguliert, wobei der repremierende Effekt von Mlc dem aktivierenden durch camp/cap entgegen gerichtet ist. Bei Wachstum auf Glycerin, weist die mlc-mutante im Vergleich zum mlc + Stamm eine um das 20-fache höhere ptsg-expression und eine 3-4 fach höhere ptshi-expression auf. Bei Wachstum auf Glukose werden sowohl im mlc, als auch im mlc + Stamm die Expression von ptsg etwa 8-fach und die Expression von ptshi 3-4 fach erhöht. Die pts-gene werden durch Glukose induziert. Bei Wachstum einer cyaa-mutante (Adenylatcyclase) auf Glycerin und unter Zugabe von camp zeigt sich keine signifikante Erhöhung der ptsg-expression, bei zusätzlicher mlc-mutation aber ein 23-facher Anstieg (74, 75, 115, 116). Die Zugabe von Glukose führt zu einer Derepression der Mlc-regulierten Gene, aber auch zu Katabolitenrepresion durch die Abnahme des Aktivators camp/cap. Die Expression der Mlc-regulierten Gene ist abhängig von der verbleibenden Menge an camp/cap und der Affinität des Komplexes zu seinen Bindestellen (119). Die relative Affinität der zwei regulatorischen Proteine (camp/cap und Mlc) zu ihren Bindestellen und die Lokalisierung der Bindestellen bestimmt die unterschiedlichen Effekte von Glukose auf die Expression der verschiedenen Operone und Gene Glukoseinduktion der pts Gene Wie im vorangegangenen Kapitel angedeutet, hat der Transport von externer Glukose Einfluss auf die Expression der pts Gene. Bewirkt wird dies durch eine Modulation der Mlc- Aktivität. Bezieht man sich auf die Übereinstimmungen zwischen Mlc und NagC würde man erwarten, dass in gleicher Weise wie GlcNAc-6-P NagC inaktiviert (121), Mlc durch Glukose oder ein Glukose-Derivat inaktiviert wird. Diese Erwartung besteht schon im Hinblick darauf, dass durch Mlc Operone und Gene reguliert werden, deren Produkte mit dem Glukosestoffwechsel verknüpft sind. Allerdings konnte kein derartiger Induktor identifiziert werden (34, 75, 115). Bezüglich der Glukoseinduktion gibt es Hinweise aus genetischen Studien, dass die PTS- Proteine eine Rolle bei der Signaltransduktion spielen. Mutationen in ptshicrr, ptsicrr oder ptsi alleine, die zum Verlust der allgemeinen PTS-Komponenten HPr, EI und des Glukose-

31 1. Einleitung 17 spezifischen EIIA führen, bewirken eine konstitutive Expression der pts-gene (32, 116). Wie bereits beschrieben bewirken auch Mutationen in Mlc eine konstitutive Expression der pts- Gene. Mutationen in ptsg hingegen sind dominant. Sowohl der Glukosetransport, als auch die Induktion der pts-gene werden verhindert. Des weiteren konnte gezeigt werden, dass auch die Aufnahme anderer PTS-Zucker, die eine Dephosphorylierung der PTS-Komponenten bewirken, die Expression der pts Gene erhöht. Diese Form der Induktion erfolgt ebenfalls nur in Anwesenheit von intaktem PtsG. Das über PtsG transportierte, phosphorylierte, aber nicht verwertbare Substratanalogon α-methyl- Glukosid bewirkt die Dephosphorylierung der PTS-Komponenten und wirkt als Induktor der Transkription der pts-gene. All diese Versuche zusammengefasst bedeuten, dass PtsG bei der Glukoseinduktion eine entscheidende Rolle spielt, wobei der Phosphorylierungszustand ausschlaggebend ist. Die Unterbrechung der Phosphorylierungskaskade zwischen PEP und PtsG und der Transport von Glukose führen zur Dephosphorylierung von PtsG und zu einer erhöhten Expression der pts-gene. Transport von Glukose über PtsG und die damit verbundene Dephosphorylierung des Proteins ist das induzierende Signal. (32, 74, 75, 115, 116, 158) Es wurde diskutiert, ob durch externe Glukose ein Signal vergleichbar einem Zwei- Komponent-Systems (60) auf Mlc übertragen wird. Der die B-Domäne enthaltende C- terminus von EIICB Glc hat 39% Ähnlichkeit zum Transmitter Konsensus Motiv von Sensor- Kinasen (77). Demnach könnte Mlc durch PtsG phosphoryliert werden und wie verschiedene andere Antwort-Regulatoren das Signal auf die Mlc regulierten Gene übertragen. Dem widerspricht, dass das Signal durch nicht phosphoryliertes PtsG übertragen wird, und dass eine Phosphorylierung von Mlc nicht nachgewiesen werden konnte (74) Die Inaktivierung des Repressors Mlc Durch Bindetests mit PtsG enthaltenden Membranvesikeln (84, 98) und durch Koprezipitation von gereinigtem PtsG mit daran gebundenen Mlc (157), kann gezeigt werden, dass Mlc mit PtsG eine direkte Protein-Protein Interaktion eingeht. Die Experimente beweisen, dass Mlc an

32 1. Einleitung 18 nicht phosphoryliertes PtsG bindet und zeigen somit einen neuen Weg der Inaktivierung eines Repressors durch Protein-Protein-Interaktion mit einem Membranprotein. Beide Ansätze führen zu einem Modell nach dem PtsG bei Aufnahme von externer Glukose hauptsächlich in der dephosphorylierten Form vorliegt. Mlc wird durch dephosphoryliertes PtsG an der Membran gebunden, was zu einer Derepression der Mlc regulierten Gene führt. Bei Abwesenheit von Glukose oder anderen PTS-Zuckern sollte PtsG hauptsächlich phosphoryliert vorliegen. Mlc wird dann nicht an PtsG gebunden und bindet an die jeweiligen Bindestellen an den Promotoren der Mlc regulierten Gene (84, 98, 157) (siehe Abb. 6). Abb.6: Inaktivierung von Mlc Dem Modell zufolge ist PtsG (EIICB) vorwiegend phosphoryliert wenn keine Glukose transportiert wird (rechte Bildseite). Mlc bleibt an seine Operatoren gebunden. Die Expression Mlc regulierter Gene unterbleibt. Während des Transports von Glukose ist PtsG überwiegend dephosphoryliert (linke Bildseite). Mlc wird an PtsG gebunden und von den DNA-Bindestellen hin zur Membran abgezogen. Die Mlc regulierten Gene sind derepremiert. Schematische Darstellung mit Veränderungen nach (84). Während die lösliche B-Domäne von PtsG ausreicht um Mlc zu binden (84, 98), ist die Überproduktion der löslichen B-Domäne nicht ausreichend, um eine Derepression der Mlc regulierten Gene zu bewirken. Um herauszufinden, welche Bereiche von PtsG für die Mlc Bindung benötigt werden, wurden verschiedene Deletionsmutanten von PtsG getestet. Eine trunkierte Variante von PtsG (AS: ) umfast den C-terminalen Bereich der C-Domäne, den Linker zwischen C- und B-Domäne und die lösliche IIB-Domäne von PtsG (84). Die genannten Bereiche werden minimal benötigt um sowohl die Bindung von Mlc an die IIB-

33 1. Einleitung 19 Domäne zu erhalten und um zusätzlich die Derepression der Mlc regulierten Gene erreichen. Nicht geklärt ist, ob diese Bereiche von PtsG alle eine direkte Interaktion mit Mlc eingehen. Es könnte aber ebenfalls sein, dass der verbleibende Rest der C-Domäne bewirkt, dass die getestete trunkierte Variante von PtsG (AS: ) membrangebunden ist und somit Mlc in Richtung Membran von der DNA abgezogen wird. Nach einem Modell von Buhr und Erni (1993) (21) werden die acht Transmembranhelices des PtsG von den Aminosäuren gebildet. Diesem Bereich folgen eine lösliche cytoplasmatische Region (AS: ), ein konservierter Linker (AS: ) und die lösliche B-Domäne (AS: ). Die trunkierte PtsG-Variante (AS: ) ist nach diesem Model nicht membrangebunden. Bei Bindetests zwischen Mlc und dieser Variante, konnte Mlc aber in den Membranfraktionen nachgewiesen werden (84). Nach einem Modell von Lengeler et al. (1994) (85) befindet sich die 8. Helix von PtsG zwischen den Aminosäuren 354 und 372 wodurch die trunkierte PtsG-Variante einen Membrananker besitzt (84). Mlc würde in diesem Fall durch die trunkierte PtsG- Variante an die Membran gebunden. Das wäre ein Hinweis darauf, dass die Bindung von Mlc an weitere Bereiche außerhalb der B-Domäne nicht ausschlaggebend ist für die Derepression der Mlc reguliert Gene, wohl aber die Titration des Repressors an die Membran. In vitro Tests mit PtsG enthaltenden Membranen zeigen, dass die PEP abhängige Phosphorylierung von PtsG reduziert wird, sobald Mlc an die Membranen gebunden ist. In vergleichbaren Ansätzen wird auch die Phosphorylierung des Substratanalogons α-methyl- Glukosid reduziert (84). Dies könnte für die Zelle eine Möglichkeit sein, die, durch erhöhte Expression des Transporters PtsG, ansteigende Glukoseaufnahme zu regulieren. Unklar ist, ob dieser Effekt unter physiologischen Bedingungen auch auftritt oder nur artifiziell bei einem Überschuss an Mlc im in vitro Test (84). Die Dissoziationskonstante K D für die Interaktion von Mlc mit seinen Operatoren (ptsg p1; ptshi p0 ~10-8 ; mlc ~10-7 ) ist nur etwa 10x niedriger als die von Mlc zum EIICB glc (~10-7 ). Bedenkt man aber, dass in vivo etwa 100x mehr PtsG als Mlc vorhanden ist, sollte Mlc während des Transportes von Glukose komplett von den Operatoren abgelöst werden (98). Andererseits sollte in vivo genug Transporter von Mlc ungebunden vorliegen um den Transport von Glukose nicht zu beeinträchtigen (84). Neben dem bekannten Modell der Inaktivierung eines Repressors durch ein Induktormolekül, kann der Mechanismus der Inaktivierung von Transkriptionsfaktoren durch Bindung an die Membran durch weitere Beispiele belegt werden. In gleicher Weise wird der Aktivator des mal-regulon, MalT, abhängig von der Transportaktivität, von der membranständigen ATPase

34 1. Einleitung 20 MalK gebunden (111). Gezeigt werden kann dies auch am Beispiel des AmtB-GlnK-Systems, bei welchem GlnK(P II Signaltransduktions-Protein) über den Ammoniumtransporter AmtB an die Membran gebunden wird und dabei der Transport von extrazellulären Ammonium auf die intrazelluläre Verfügbarkeit von Stickstoff abgestimmt wird (30). 1.5 Das Protein YeeI beeinflusst die Mlc regulierten Gene Ein Hinweis darauf, dass weitere Faktoren die Aktivität von Mlc beeinflussen könnten, ergab bei der Suche nach Genen, deren Produkte die Aktivität oder die Expression von Komponenten des Glukose-PTS beeinflussen. Einer dieser Faktoren ist das Protein YeeI. Eine yeei Mutante zeigt im Vergleich zum Wildtyp (i) eine verlängerte Generationszeit bei Wachstum auf Glukose oder Mannose, (ii) eine früher einsetzende und kontinuierlich ansteigende Expression von lacz während des Wachstums auf Glukose und Laktose und (iii) eine reduzierte Expression von malt, mlc, ptsg und manxyz. Die aufgeführten Effekte sind durch eine zusätzliche mlc Deletion suppremierbar. Überproduktion von YeeI bewirkt eine Erhöhung der Menge an Mlc, PtsG, MalT und ManXYZ. Möglicherweise greift auch YeeI in die Regulation der Mlc regulierten Gene ein, indem es Mlc durch Protein-Protein-Interaktion inaktiviert (8, 9).

35 1. Einleitung Zielsetzung Die Aufnahme von Glukose in E. coli K-12 erfolgt hauptsächlich über ein Glukosespezifisches PTS. Die Regulation der Expression der beteiligten Komponenten erfolgt durch Mlc, camp/cap, sowie weiterer unter anderem posttranskriptioneller Mechanismen. Mlc ist ein transkriptionaler Regulator, der neben ptsg (EIICB Glc ) und den Genen der allgemeinen PTS Komponenten ptshi (HPr, EI), auch die Gene manxyz (Mannose spezifische PTS- Komponenten) und malt (transkriptioneller Aktivator der mal-gene) repremiert. Die Aktivität von Mlc und die Konzentration von camp/cap ist abhängig vom Phosphorylierungszustand der PTS Komponenten und damit von dem Transport von Glukose über PtsG. Zum einen wird Mlc durch die Bindung an dephosphoryliertes PtsG inaktiviert. Zum anderen aktiviert phosphoryliertes EIIA die Adenylatcyclase, was zur Bildung von camp und nachfolgend zu der des camp/cap-komplexes führt, der die Expression der oben genannten Gene positiv reguliert. Die Regulation der Gene, die für die am Transport beteiligten Komponenten kodieren, ist somit wiederum abhängig vom Transport des Substrates. Thema dieser Arbeit ist die Analyse der transportgesteuerten Genregulation anhand des Mlc-PtsG Systems von Escherichia coli. Ein erster Ansatzpunkt ist, die Interaktion zwischen PtsG (EIICB Glc ) und Mlc weiter zu charakterisieren. Es sollen die Bereiche in Mlc und PtsG gefunden bzw. näher charakterisiert werden, die für die Bindung der beiden Proteine aneinander benötigt werden. Bei dem Protein YeeI könnte es sich um einen zusätzlichen Faktor handeln, der Mlc in seiner Funktion als Repressor inaktiviert. Es soll daher überprüft werden, ob eine direkte Interaktion von YeeI mit Mlc besteht. Die Aufnahme von Glukose und anderen PTS Zuckern führt zur Dephosphorylierung von EIIA Glc. Unter dieser Bedingung ist der camp/cap Spiegel in der Zelle niedrig, da aufgrund der fehlenden Aktivierung der Adenylatcyclase nahezu kein camp gebildet wird. Da die Transkription vieler kataboler Systeme eine Aktivierung durch den camp/cap-komplex benötigt, hat dies die Katabolitenrepression von Genen zur Folge, die für Komponenten zur Aufnahme und des Abbaus anderer Kohlenstoffquellen kodieren. Daneben können auch Nicht PTS Zucker Katabolitenrepression hervorrufen. Gezeigt wurde dies unter anderen anhand des Glycerineffektes auf die Expression der mal-gene. Hier zeigt sich, dass Glycerin-

36 1. Einleitung 22 3-Phosphat die Aktivierung der Adenylatcyclase durch EIIA Glc beeinflusst. Es sollte deshalb die Frage geklärt werden, ob eine Bindung zwischen EIIA Glc und der Adenylatcyclase möglich ist und, ob diese durch Glycerin-3-Phosphat oder andere Zucker-Phosphate unterbunden werden kann. Durch Mlc werden Gene reguliert, deren Genprodukte Teile von Transportsystemen darstellen und zum Teil auch Enzyme für den Abbau der transportierten Substrate. In all diesen Fällen wirkt Mlc als transkriptioneller Repressor. Hingegen bei der anaeroben Lactatdehydrogenase (ldha) wirkt Mlc vermutlich indirekt als Aktivator (71). Die daraus resultierenden Fragen sind. (i) Lassen sich weitere Mlc regulierte Gene finden? (ii) Wenn ja, wirkt Mlc stets als Repressor? (iii) Sind nur Gene betroffen, die für Proteine kodieren, die für die Aufnahme und dem Metabolismus von Kohlenstoffquellen benötigt werden? Dies sollte über die Anwendung von DNA-Microarrays geklärt werden und durch die anschließende Verifizierung dieser Ergebnisse mittels weiterer Methoden.

37 2. Material und Methoden Material und Methoden 2.1 Abkürzungen ABC ATP binding cassette AS Aminosäure(n) Amp Ampicillin APS Ammoniumperoxidsulfat bp Basenpaare ß-Gal ß-Galaktosidase BSA Albumin aus Rinderserum camp 3,5 -cyclo-adenosinmonophosphat CAP camp receptor protein cat chloramphenicol acetyl transferase; verleiht Cm-Resistenz Cm, Cam Chloramphenicol c. p. m. counts per minute Da, kda Dalton, Kilodalton DEPC Diethylpyrocarbonat DMSO Dimethylsulfoxid DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendiamin-Tetraessigsäure (Dinatriumsalz) g Erdbeschleunigung (9,81 m/s2) Glc Glucose GlcNAc N-Acetyl-Glucosamin Glyc Glycerin IPTG Isopropyl-ß-D-Thiogalaktopyranosid Kan Kanamycin LB Luria Bertani Broth Mal Maltose MMA Minimalmedium A MOPS 3-[N-Morpholino] Propansulfonsäure NZA NZ-Amine ODx optische Dichte bei der Wellenlänge x nm ONPG Orthonitrophenyl ß-D-Galaktopyranosid PCR Polymerasekettenreaktion psi pound-force per square inch (1 psi = 6,895 kpa) PTS Phosphotransferasesystem rpm [engl.] Umdrehungen pro Minute r resistent SDS [engl.] Natrium Dodecyl Sulfat Spec Spectinomycin TEMED N, N, N, N -Tetramethylethylendiamin Tet Tetracyclin Tris Trishydroxymethylenaminomethan U Units X-Gal 5-Bromo-4-Chloro-3-Indoyl-ß-D-Galaktopyranosid XP 5-Bromo-4-Chloro-3-Indoyl-Phosphat

38 2. Material und Methoden Verwendete Bakterienstämme, Phagen, Plasmide und Oligonukleotide Stammname relevanter Genotyp Referenz oder Quelle DHB4 F laci q pro (ara-leu)7697 arad139 lacx74 (127) gale galk rpsl phor phoa (PvuII) malf3 thi IT1168 F - lam - IN(rrnD-rrnE)1 rph-1 deoc (154) ptsg::tn5(kan) JM-G2 JM101(supE thi-1 (lac-proab) [F trad36 (115) proab laci q Z M15] ) ptsg + ptsg-lacz mlc::tet JM-G77 JM101(supE thi-1 (lac-proab) [F trad36 (115) proab laci q Z M15] ) ptsglacz(transkriptionale Fusion) ptsg::cat ptshicrr::kan MC4100 F- arad139 (argf-lac) U169 (27) rpsl150 rela1deoc1 ptsf25 rbsr flbb5301 TG1 F [laci q lacz M15 proab trad36] hsdd5 supe thi (lac-pro) (pro-lac) (26) DH5α F - Θ80d lacz M15 (laczya-argf)u169 (56) reca enda1 hsdr17 (r K m + K ) sup E44 λ - thi-1 gyra rela1 ET104 arad139 deoc1 flbb5301 ptsf25 rbsr rela1 (39) rpsl150 (argf-lac)u169 øp[(malt-lacz) (λ placmu50)] cya crp* ilv+ mlc::kan ET25 MC4100; Φ(malT-lacZ) cya crp* ilv+ (39) KD413 MC4100; mlc::tet Katja Decker; Doktorarbeit, Uni- Konstanz Bre2071 arad139 deoc1 flbb5301 θ(prov-lacz) hyb2 Bremer, 1992 (λ placmu15) osmz200 ptsf25 rbsr rela1 rpsl150 (argf-lac)u169 MV198 agn`-lacz (agn=flu) (55) SH10 F - arac-lacz leu - str - lac arad - Jennifer Ross, John Hopkins University SE40 MC4100 trp-1 ssue`-lacz ssuadcb (161) SE70 MC4100 Θ(tauC-lacZ) (λ placmu9) (161) MC1061 hsdr mcrb arad139 (araabc-leu)7679 (27) lacx174 galu galk rpsl thi HA18 arad139 deoc1 flbb5301 ptsf25 rpsl150 A. Hartmann, Diplomarbeit Uni- (argf-lac)u169 (phoa20) Konstanz CH4 arad139 flbb5301 øp[malk-lacz] ptsf25 Christiane Braun rbsr rela1 rpsl150 (argf-lac)u169 cya Vertiefungskurs Uni-Konstanz RD15 arad139 deoc1 flbb5301 ptsf25 rbsr rela1 Renate Dippel, Uni-Konstanz rpsl150 (argf-lac)u169 øp[(malt-lacz)(λ placmu50)] cya::kan DG102 HfrKL16 thi ptshicrr Epstein, 1989 CV5200 MG1655 lac X74 P sgrs -lacz (163) SA1 MC4100 ptsg ::TN5(kan) diese Arbeit SA2 KD413 ptsg ::TN5(kan) diese Arbeit SA5 Bre2071 mlc::tet diese Arbeit SA6 MV198 mlc::tet diese Arbeit

39 2. Material und Methoden 25 Stammname relevanter Genotyp Referenz oder Quelle SA7 SH10 mlc::kan diese Arbeit SA12 SE70 mlc::tet diese Arbeit SA13 SE40 mlc::tet diese Arbeit SA14 MC1061ptsG::TN5(kan) diese Arbeit SA15 ET25 ptsg::tn5(kan) diese Arbeit SA17 CH4 ptsg ::Tn5(kan) diese Arbeit SA19 HA18mlc ::Tn10(tet) diese Arbeit SA20 SA19 arab + arab-phoa diese Arbeit SA21 SA19 yabm + yabm-phoa diese Arbeit SA22 HA18 arab + arab-phoa diese Arbeit SA23 HA18 yabm + yabm-phoa diese Arbeit SA24 KS413 yeer + yeer-lacz diese Arbeit SA25 KD413 tbpa + tbpa-lacz diese Arbeit SA 26 KD413 arac + arac-lacz diese Arbeit SA27 KD413 arac + arac-lacz diese Arbeit SA28 KD413 yabn + yabn-lacz diese Arbeit SA29 KD413 arac + arac-lacz diese Arbeit SA30 MC1061 arac + arac-lacz diese Arbeit SA31 MC4100 arac + arac-lacz diese Arbeit SA32 MC4100 yabn + yabn-lacz diese Arbeit SA33 MC4100 yeer + yeer-lacz diese Arbeit SA34 MC4100 arac-lacz diese Arbeit SA35 MC4100 tbpa + tbpa-lacz diese Arbeit SA36 MC1061 cya::kan diese Arbeit Tabelle1. Bakterienstämme Die Nomenklatur entspricht der von Bachman (1990). Bei den Reportergenfusionen der Stämme SA20 bis SA35 handelt es sich um transkriptionelle Fusionen. Phage Eigenschaften/bekannter Genotyp Referenz P1vir transduzierender Phage Laborsammlung λ InCH 1 lytischer und lysogener Zyklus möglich; (18) homologe Berreiche zu pbr322; ermöglicht das einfügen stabiler lacz-fusionen in die λ att -site von E. coli; Tabelle 2. Phagen Plasmid Eigenschaften/bekannter Genotyp Referenz pgdr11 pqe31 Derivat, laci q Ap (IPTG induzierbar; (112) Expressionsvektor; N-term. His-tag-Fusion) psl104 pgdr11 + orf: mlc (BamHI/PstI) (84) pmlc410 pgdr11 + orf: mlc (BamHI/PstI) 18bp diesearbeit pmlc401 pgdr11 + orf: mlc (BamHI/PstI) 36bp diese Arbeit pmlc110 entspricht psl104; mlc Basen diese Arbeit; (103) pcs19 pqe60 Derivat, laci q, AP ; IPTG induzierbar; (150)

40 2. Material und Methoden 26 Plasmid Eigenschaften/bekannter Genotyp Referenz Expressionsvektor; C-terminale His-tag- Fusion psl105 pcs19 + orf: mlc (NcoI/BamHI) (84) ptsg11 P lac, laci,ap R, gesammter orf von ptsg (22) ptz19r P lac, laci, CAP binding site; bla;entwickelt aus GenBank/EMBL accession puc19 number Y14835 ptz-gp8 ptz19 + Gp8 des Phagen M13 J. Plumbridge in(141) ptz-gp8-iib ptz-gp8- IIB(Cys421Ser) ptz-gp8- IIB(Cys421Asp) ptz-gp8- IIB(Arg424Ala) ptz-gp8- IIB(Arg424His) ptz-gp8- IIB(Arg424Lys) ptz-gp8- IIB(Arg426Ala) ptz-gp8- IIB(Asp419Ala) psa1 ptac3575 psa2 psa3 psa4 psa5 prs415 psa6 ptz19 + Gp8 des Phagen M13 + Sequenz der J. Plumbridge in(141) B-Domäne des Enzyms IIBC (PtsG); entsprechend Aminosäure ptz-gp8-iib (Aminosäureaustausch Cys421 J. Plumbridge in(141) zu Ala) ptz-gp8-iib (Aminosäureaustausch Cys421 J. Plumbridge in(141) zu Asp) ptz-gp8-iib (Aminosäureaustausch Arg424 J. Plumbridge in(141) zu Ala) ptz-gp8-iib (Aminosäureaustausch Arg424 J. Plumbridge in(141) zu His) ptz-gp8-iib (Aminosäureaustausch Arg424 J. Plumbridge in(141) zu Lys) ptz-gp8-iib (Aminosäureaustausch Arg426 J. Plumbridge in(141) zu Ala) ptz-gp8-iib (Aminosäureaustausch Asp419 J. Plumbridge in(141) zu Ala) pqe60 Derivat, laci q, AP ; IPTG induzierbar; diese Arbeit Expressionsvektor; ermöglicht transkriptionelle lacz und phoa- (6) Fusionen; AP R ptac potentielle Promotorregion 5`zu diese Arbeit yabn ptac potentielle Promotorregion 5`zu diese Arbeit arac ptac regulatorische Region zwischen diese Arbeit arac und arab ptac potentielle Promotorregion 5`zu diese Arbeit tbpa ermöglicht transkriptionelle lacz-fusionen; (147) AP R prs415 + potentielle Promotorregion 5`zu diese Arbeit yeer pbcp206 crr unter P tac ; laci q ;AP R (162) pjfbh ColE1ori laci P tac, Sequenz kodierend für (22) Aminosäure von ptsg in frame an His-tag kodierende Region (C-Terminaler Histag) psa9 pgdr11 + crr (EIIA E.coli) diese Arbeit pbad18 Expressionsvektor, Indukton durch Arabinose, (54) AP R, arac, P arab psa8 pbad18 + cyaa diese Arbeit

41 2. Material und Methoden 27 Plasmid Eigenschaften/bekannter Genotyp Referenz psa12 pbad18 + cyaa (Adenylatcyclase E.coli); diese Arbeit katalytische Domäne (AS:0-535 von wt AC.) Expression mit Arabinose induzierbar pqe32 Expressionsvektor, Indukton durch IPTG, P tac, (129) AP R ; N-term. His-tag-Fusion psa11 pqe32 + cyaa (Adenylatcyclase E.coli) diese Arbeit psa16 pqe32 + cyaa (Adenylatcyclase E.coli); diese Arbeit regulatorische Domäne (AS: von wt AC.) pqe31 Expressionsvektor, Indukton durch IPTG, P tac, (129) AP R ;N-term. His-tag-Fusion psa13 pqe31 + cyaa (Adenylatcyclase E.coli); diese Arbeit katalytische Domäne (AS: von wt AC.); prep4 laci q, Kan R (129) phiho101 =prep4 Austausch von Kan R gegen Spec R Markus Hinderhofer; Uni- Konstanz pqe60 Expressionsvektor, Indukton durch IPTG, P tac, AP R ; pmlc_wt pqe60 + Wildtyp mlc Kinga Gerber, Uni-Konstanz pmlc_aya pqe60 + mlc mit Austausch in Kinga Gerber, Uni-Konstanz Metallbindestelle Cystein-Tyrosin-Cystein(AS: ) nach Alanin-Tyrosin-Alanin pmlc_sys pqe60 + mlc mit Austausch in Kinga Gerber, Uni-Konstanz Metallbindestelle Cystein-Tyrosin-Cystein(AS: ) nach Serin-Tyrosin-Serin ptz19r ptz-c9 ptz19r + C9 (NagC-Bindesequenz) (118) ptz-m26 ptz19r + C9 (Mlc-Bindesequenz) (118) ptz-m120 ptz19r + C9 (Mlc-Bindesequenz mit Veränderung (118) dh. Negativkontrolle) Tabelle 3: Plasmide Oligonukleotid Leserichtung Sequenz BamHI_yab psa2-for 5`- aaagaggcggatccagaaag-3 HindIII_yab psa2-rev 5`- ccagttcgttaagctttgtgt 3` arac_psti psa3_for 5`- gtaaacccactgcagataccattc-3 arac_bamhi psa3-rev 5`-gcgtcaggtaggatccgctaatc 3` BglII_ara psa4_for 5`- cgacgctaagatctgcaagc-3 HindIII_ara psa4-rev 5`-gtgagattgagaatataagctttcattcc 3` XbaI_tbp psa5_for 5`- cgccatcttctagagccacc-3 SalI_tbp psa5-rev 5`- caactaatctggtcgacttcgc 3 BamHI_yeeR psa6_for 5`- aggggaggatccagcagacc-3 EcoRI_yeeR psa6-rev 5`-tttggcgaattcacctcatcc 3` BamH1-mlc pmlc410-for 5 -cggatccgatggttgctgaaaaccagcc-3

42 2. Material und Methoden 28 Oligonukleotid Leserichtung Sequenz mlc PstI pmlc410-rev 5 -aactgcagttaaccgttatacatcgcgtcttttacc-3 BamH1-mlc pmlc401-for 5 -cggatccgatggttgctgaaaaccagcc-3 mlc PstI pmlc401-rev 5 -aactgcagttatgcacgcgcctgccatcgtgc -3 crr_bglii psa7-for 5`-gcaagaaagatctcttgatgcg -3 crr_ncoi psa7-rev 5`-ggagaagaccatgggtttgttc 3` cyaa_kpni psa8-for 5`-gaaaagtggtaccggttacctttg -3 crr-bamhi psa9-for 5'-actgcttaggaggatcccatg-3' crr-psti psa9-rev 5'-catttttcactgcagcaagaattac-3' SphI_cya psa10-for 5'-CGATACGGCATGCACCTCTATATTG-3' PstI_cya psa10-rev 5'-GCTAAGACTGCAGGCCGGATAAG-3' cyaa_kpni psa12-for 5'-GAAAAGTGGTACCGGTTACCTTTG-3' SphI_cya_katDom psa12-rev 5'- tgtgcatgcaggtcagcgcag -3' BamHI_cya_regDom psa15-for 5'- gcacggatcccgaaggcgc -3' PstI_cya psa15-rev 5'- gctaagactgcaggccggataag -3' Tabelle4. Oligonukleotide Die über die Oligonukleotide eingefügten Schnittstellen für Restriktionsenzyme wurden unterstrichen. 2.3 Medien und Wachstumsbedingungen Medien Die Zusammensetzung der Medien erfolgte nach Miller (92) und Silhavy (146). Abgesehen von hitzelabilen Substanzen, wurden sie durch autoklavieren (20 min, 120 C, 1 bar) sterilisert. Hitzelabile Substanzen wurden sterilfiltriert und den Medien nach dem Abkühlen auf 50 C zugegeben. Zur Herstellung von Festmedien wurde vor dem Autoklaviern zusätzlich 15 g/l Difco Bactoagar eingewogen. Flüssigmedien wurden bei Raumtemperatur, Festmedien bei +4 C gelagert. eingewogene Menge auf 1l deionisiertes Wasser: LB Bacto-Trypton 10 g NZA NZA 10 g Hefeextrakt 5 g Hefeextrakt 5 g NaCl 10 g NaCl 7,5 g

43 2. Material und Methoden 29 MMA K 2 HPO 4 10,5 g KH 2 PO 4 4,5 g (NH 4 ) 2 SO 4 1 g Natriumcitrat 0,5 g MgSO 4 10 mm [getrennt autoklaviert] Kohlenstoffquelle 0,2 bzw.0,4% (w/v) [sterilfiltriert] Medienzusätze und Kohlenstoffquellen Die folgenden Substanzen wurden sterilfiltriert (1) oder gesondert autoklaviert (2) und den unter genannten Medien nach dem Abkühlen zugegeben. Substanz Lösungsmittel Endkonzentraion Ampicillin (1) H2O 100 µg/ml Chloramphenicol (1) 70% Ethanol 25 µg/ml IPTG (1) H2O 10 µm-1 mm Kanamycin (1) H2O 100 µm Natriumcitrat (2) H2O 20 mm Spectinomycin (1) H2O 100 µg/ml Tetracyclin (1) 70% Ethanol 5-25 µg/ml Tryptophan (1) H2O 10 µg/ml X-Gal Dimethylformamid 40 µg/ml XP Dimethylformamid µg/ml Tabelle5. Medienzusätze Substanz Lösungsmittel Endkonzentraion Arabinose (1) H2O 0,4 % (w/v) CAA (2) H2O 1-1,5% (w/v) Glukose (2) H2O 0,2 % (w/v) Glukose-6-P (1) H2O 0,4 % (w/v)

44 2. Material und Methoden 30 Glycerin (2) H2O 0,4 % (w/v) Maltose (1) H2O 0,2 % (w/v) Tabelle6. Kohlenstoffqellen Kulturbedingungen Die Bakterienkulturen wurden bei 28 C bzw. 37 C, aber stets aerob angezogen. Flüssigkulturen wurden in Reagenzgläsern im Reagenzglasroller oder in Erlenmeyerkolben auf dem Schütteltisch oder im Schüttelwasserbad inkubiert. War eine stärkere Durchlüftung der Kultur erforderlich, wurden Schikanekolben verwendet. Die Inkubation auf Festmedium erfolgte im 28 C bzw. 37 C oder 42 C Brutschrank. Die langfristige Aufbewahrung erfolgt in Form von DMSO Dauerkulturen (126µl DMSO auf 1,7 ml Kultur) bei 70 C Zelldichtemessung Das Wachstum einer Bakterienkultur wurde durch das Messen der optischen Dichte bei 578nm (OD 578 ) verfolgt. Nach Miller (92)entspricht einer OD 578 von 1 bezogen auf 1 ml Kultur in etwa 8 x 10 8 Zellen und 107 µg Gesamtprotein. 2.4 Genetische und molekularbiologische Methoden Standardmethoden mit Nukleinsäuren Zur Präparation von Plasmiden wurde der QIAprep Spin Miniprep-Kit (Qiagen, Hilden) bzw. GFX TM Micro Plasmid Prep-Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg), je nach Angaben des Herstellers verwendet oder eine STET-Lyse durchgeführt (64). Zur Präparation von chromosomaler DNA wurde der QIAamp Tissue-Kit (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers verwendet oder ein Protokoll zur Präparation von chromosomaler DNA aus gram - /gram + Bakterien(122) angewandt.

45 2. Material und Methoden 31 Die Durchführung von Methoden wie PCR, Restriktionsverdau, Ligation und Agarosegelelektrophorese folgten den Anleitungen in Sambrook (138) und Maniatis (89) unter einbeziehen der Herstellerangaben für die entsprechenden Enzyme. DNA-Fragmente wurden zur Reinigung über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und mittels QiaQuick Gel Extraction-Kit (Quiagen, Hilden) eluiert. Die Herstellung kompetenter Zellen und Transformation von Bakterien erfolgte chemisch mittels der Rubidiumchlorid-Methode (129) oder PEG-DMSO-Methode (29). Die Sequenzierung von DNA wurde von der Firma GATC (Konstanz) durchgeführt Konstruktion von Plasmiden Die Plasmide in Tabelle 3 wurden konstruiert, indem die eingefügten Sequenzen mittels der in Tabelle 4 genannten Primer an chromosomaler DNA amplifiziert wurden und über Restriktion (siehe markierte Schnittstellen) und Ligation in die entsprechenden Vektoren eingefügt wurden. Oder durch Umklonieren, indem Sequenzen über Restiktionsverdau aus einem Plasmid ausgeschnitten wurden und in einen Vektor mit entsprechenden Schnittstellen durch Ligation eingefügt wurden Stammkonstruktionen Alle für diese Arbeit verwendeten E.coli Stämme, außer denen, denen eine Reportergenfusion eingefügt wurde, wurden mit Hilfe von P1-Transduktion (92, 93) hergestellt. Nach der Konstruktion wurden die Stämme auf das Vorhandensein des jeweilige Phänotyps getestet. Stämme mit Reportergenfusion wurden mittels des Phagen λ InCH (18) hergestellt. Hierbei wurde die Promotor-Reportergenfusion zunächst in ein Plasmid kloniert. Die verwendeten Plasmide waren aus dem Plasmid pbr322 hervorgegangen. Auch die DNA des Phagen enthält Bereiche, die mit pbr322 übereinstimmen. Ein mit dem jeweiligen Plasmid transformierter Stamm wurde mit Phagen infiziert. Dieser Stamm war nun

46 2. Material und Methoden 32 Kanamycinresistent (Phage) und Ampicillinresistent (Plasmid). Zu einem gewissen Anteil findet eine homologe Rekombination zwischen Phagen- und Plasmid-DNA statt und ein Teil der aus diesen Bakterien präparierten Phagen trug nun das Reportergenkonstrukt. Dadurch ging unter anderen die Kanamycinresistenzkassette des Phagen verloren. Der Phage nahm aber mit der Plasmid-DNA nicht nur das Reportergenkonstrukt, sondern auch die kodierende Sequenz (bla) für eine ß-Lactamase auf, die Ampicillinresistenz vermittelte. Mit diesem Phagenlysat wurde ein weiterer Bakterienstamm infiziert und die Selektion erfolgte auf die Lysogene, die Phagen mit dem Reportergenkonstrukt enthielten. Dabei inserierte die Phagen- DNA in die att-site des bakteriellen Chromosoms. Wachstum bei 28 C stellte sicher, dass kein weiterer lytischer Phagenzyklus ablief, der zur Lyse der Bakterienzelle führen würde. Die Phagen-DNA enthält zudem Sequenzen, die mit Bereichen des Bakterinchromosoms in unmittelbarer Nähe der att-site übereinstimmen. Rekombination zwischen diesen DNA- Bereichen führte zum Verlust der meisten Phagen spezifischen Gene. Auch bei einem Temperaturwechsel nach 42 C fand kein lytischer Phagenzyklus statt. Das Reportergenkonstrukt war stabil in das bakterielle Chromosom integriert. Zusätzlich wurde dies über PCR überprüft. Mit den gleichem Primerpaar würden durch PCR an der DNA des Ausgangsstammes, des Lysogens und der stabil integrierten Fusion DNA-Fragmente mit unterschiedlicher Länge amplifiziert werden. Auf diese Weise wurden merodiploide, transkriptionelle Reportergenfusionen hergestellt, da die Fusion an einer definierten Stelle in das Chromosom integriert wurde und das Ausgangsgen dabei nicht deletiert wurde. Primer für Test-PCR: gal_f 5 -CTTGCTGAGTACGTGAGTTC-3 att_r 5 -AAGCAGGCTTCAACGGATTC-3 int_r 5 -GGACACCATGGCATCACAGT-3 IG_r 5 -ACGTTGGAGTCCACGTTCTT-3 Längen der amplifizierten PCR-Fragmente: Primerpaar PCR-Fragment in: Primer1 Primer2 Ausgangsstamm Lysogen Stamm mit Reportergenfusion gal_f att_r 977 bp 977 bp gal_f int_r bp gal_f IG_r bp

47 2. Material und Methoden Transkriptomanalyse Die Transkriptomanalyse wurde mit DNA-Microarrays durchgeführt. Die Präparation der dazu benötigten RNA wurde in Konstanz durchgeführt. Die Herstellung der DNA-Chips, das Umschreiben der RNA in cdna, die Hybridisierung der cdna mit dem Chip und die Auswertung der Signale wurden von Dr. Tino Polen und Dr. Volker Wendisch am Forschungszentrum in Jülich durchgeführt. Da es ein besseres Verständnis der erhaltenen Daten zur Folge hat, werden auch die nicht selbst durchgeführten Methoden in Kürze beschrieben. Für die Herstellung von RNase-freien Wassser wurde Millipore-gefiltertes oder entsalztes Wasser mit 0,1% DEPC versetzt, geschüttelt und über Nacht bei 37 C inkubiert. Um das DEPC wieder zu entfernen, wurde für mindestens eine Stunde gekocht oder autoklaviert. DEPC wird dabei hydrolysirt Präparation von RNA aus Bakterien Unterschiedliche E. coli Kulturen wurden in 50 ml MMA (Minimalmedium A nach Miller) (93) mit 0,4% Glycerin angezogen. Antibiotika wurden soweit erforderlich zugegeben. Bei den Ansätzen mit KD413 pcs19 bzw. psa1 wurde die Überexpression bei OD 578 = 0,1 durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 10 µm) induziert. 35 ml einer exponentiell wachsenden Kultur (OD 578, 0,5 0,6) wurde mit 70 ml RNA Bacteriaprotect Reagent (Qiagen) vermischt und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden bei Raumtemperatur für 10 Minuten bei 4000 x g abzentrifugiert und die Pellets in 350 µl Puffer RTL des RNeasy Mini Kits (Qiagen, Hilden) resupendiert. Alternativ wurden 35 ml Zellen zu 15 ml gefrorenen Killingbuffer (20 mm Tris/HCl ph7,5; 5 mm MgCl 2, 20 mm NaN 3 ) gegeben und für 10 Minuten bei 4000 x g und 4 C abzentrifugiert. Die Pellets wurden sofort in 350 µl Puffer RTL gelöst. Für den Zellaufschluss wurden die Proben zu 0,5 g 0,1 mm Zirconia/Silica Glasbeads (Roth, Karlsruhe) gegeben und fünfmal für 30 Sekunden gevortext. Dies mit Pausen von Sekunden. Die so aufgeschlossenen Zellen inklusive der Glasbeads wurden für eine Minute bei x g zentrifugiert. Die Überstände wurden auf Säulen des RNeasy Mini Kits

48 2. Material und Methoden 34 gegeben und die weitere RNA-Präparation erfolgte nach Angabe des Herstellers. Die RNA wurde mit zweimal 50 µl Millipore (ph 7,3) eluiert. Reinheit und Konzentration der Proben wurde spektrometrisch bestimmt. Die hier meist noch in den Proben enthaltene DNA würde bei den Folgeexperimenten zu falschen Ergebnissen führen. Deshalb wurde nochmals 350 µl Puffer RTL zu dem Eluat gegeben, dieses auf ein frisches RNeasy Mini Kit Säulchen geladen und das Protokol für RNA-Präparation mit On column DNaseI digestion (Qiagen) angewandt. Die Reinheit und Konzentration der RNA wurde nun sowohl spektrometrisch als auch mittels Formamid Agarose Gelelektophorese bestimmt. Präpariert wurde die gesamte RNA der Zellen, die unter anderen die mrna enthält, die als Maß für die Expression in den Zellen in cdna umgeschrieben werden soll Formaldehyd Agarose Gelelektophorese Puffer 10x FA Puffer 1x FA Laufpuffer (1 l) 200 mm MOPS 100 ml 10x FA Puffer 50 mm Natriumacetat 20 ml 37% (12,3 M) Formaldehyd 10 mm EDTA 880 ml Rnase-freies Wasser ph 7,0 mit NaOH 1,2% FA-Gel für ein Gel der Größe: 10 x 14 x 0,7 cm 1,2 g Agarose 10 ml 10x FA Puffer auf 100 ml mit Rnase-freiem Wasser auffüllen Die Mischung wurde in der Mikrowelle erhitzt bis die Agarose geschmolzen war und auf 65 C abgekühlt. Dann wurden 1,8 ml 37% (12,3 M) Formaldehyd zugegeben und das Gel gegossen. Das fertige Gel wurde vor dem Beladen für 30 Min. in 1x FA-Puffer äquillibriert. 5x RNA Ladepuffer 16 µl gesättigte, wässrige Bromphenolblau-Lösung 80 µl 500 mm EDTA, ph 8,0 720 µl 37% (12,3 M) Formaldehyd

49 2. Material und Methoden 35 2 ml 100% Glycerin 3,084 ml Formamid 4 ml 10x FA Puffer mit Rnase-freiem Wasser auf 10 ml auffüllen. Elektrophorese Die Proben wurden vor dem Auftragen für 3 5 Min. bei 65 C denaturiert. Die Elektrophorese erfolgte bei 4 5V/cm Chip-Herstellung PCR-Produkte aufbringen Glasobjektträger werden mit einer Polylysinschicht überzogen. Dies ermöglicht eine Bindung zwischen den ε-aminogruppen des Lysins und dem Phosphaten der DNA. DNA-Spots werden an definierten Positionen aufgebracht, die in einer Anordnung in Reihen, Säulen und Blöcken resultiert, was später die Zuordnung von Signalen zu bestimmten Genen ermöglicht. Von 4844 möglichen Plätzen wurden 80 mit genomischer DNA aus E. coli LJ110 und MG1655 belegt. Dies ist die Positivkontrolle, da hier stets cdna, die ja aus RNA von E.coli hergestellt wurde, hybridisieren sollte. Weitere 443 Plätze sind mit DNA belegt, die unterschiedlichen offenen Leserastern von Corynebakterium gluthamicum entspricht. Dies ist die Negativkontrolle. Hier sollte nur wenig cdna hybridiseren. Die restlichen Plätze wurden mit PCR-Produkten belegt, die den bekannten offenen Leseratern in E. coli K12 entsprechen. Davon waren bei allen hier verwendeten Arrays 4210 belegt. An 111 Plätzen fehlte ein Spot, war fehlerhaft belegt oder war zu schwach. Die beschichteten und mit Spots versehenen Arrays wurden rehydratisiert und für wenige Sekunden bei 130 C getrocknet. Durch UV- Cross-Linking (65mJ Stradalinker) wurden die Spots letztendlich fixiert. Freie ε- Aminogruppen werden nach dem Aufbringen der DNA-Spots mit Bernsteinsäureanhydrid behandelt, um zu verhindern, dass DNA unspezifisch an den Chip bindet. cdna Die mrna je zweier Zellkulturen wurde durch reverse Transkription in cdna umgeschrieben. Dafür wurde je 25 µg einer RNA-Präparation verwendet. Dabei wurde der

50 2. Material und Methoden 36 Kontrollansatz mit dem floureszierenden Farbstoff Cy3 markiert und der zu analysierende Ansatz mit dem Farbstoff Cy5 und umgekehrt. Diese werden als FlouroLink TM Cy3-dUTP bzw. FlouroLink TM Cy5-dUTP (Amersham Pharmacia) in die entstehende cdna eingebaut. Um möglichst die mrna aller expremierten ORFs umzuschreiben wurden Zufallsprimer (Hexamere) verwendet. Hybridisierung Um die cdna mit den PCR-Produkten des Chips hybridisieren zu können, wird die Cy3- cdna und die Cy5-cDNA vermischt, mit einem Kompetitor (Poly(A) oder E.coli rrna) versetzt und einem Puffergemisch aus HEPES, Natiumcitrat und NaCl. Die Lösung wird auf 100 C erhitzt, abgekühlt und bei 65 C für 5h zur Hybridisierung auf den Chip gegeben. Dem folgen mehrere Waschschritte und das Trocknen des Chips Auswertung der Arraydaten In den Tabellen 23 bis 26 (Kap. 6.4) wird die normalisierte Ratio of Median gezeigt. Für jeden Vergleich war wie in Kapitel beschrieben die cdna des einen Stammes mit dem fluoreszierenden Farbstoff Cy3, die des anderen mit Cy5 markiert und das Gemisch mit den Spots auf dem Chip hybridiesiert worden. Die Fluoreszenz bei 532 nm (Cy3-dUTP) und 635 nm (Cy5-dUTP) wurde bei einer Auflösung von 10 µm mit Hilfe des Axon Inc.GenePix 4000 Laser Scanner ermittelt. Die Fluoreszenzdaten wurden als TIFF Image gespeichert und dieses mit Hilfe der GenePix Pro 3.0 software (Axon) ausgewertet. Jede Spotregion besteht aus etwa 100 Pixeln und einem Hintergrund von etwa 600 Pixeln. Der Median des Cy3 und des Cy5 Signals wurde verwendet um den Hintergrund vom Signal abzuziehen und daraus die Cy5(Signal-Hintergrund)/Cy3 (Signal-Hintergrund) Ratio of Median für jeden Spot zu berechnen (7). Berechnung der Ratio of Median. P,λ2 = Pixelintensitäten gemessen bei der einen Wellenlänge; P,λ1 = Pixelintensitäten gemessen bei der anderen Wellenlänge; B,λ = Pixelintensitäten der Hintergrundpixel; n/m = Anzahl der gemessenen Pixel; med = Median;

51 2. Material und Methoden 37 Die Ratio of Median der 80 E. coli Kontrollgene wurde herangezogen, um den Normalisierungsfaktor zu berechnen. Der Mittelwert aller detektierbaren Signale wird benutzt, um ein einzelnes Signal zu normalisieren. So sollen Variationen ausgeglichen werden, die z.b. auf der Methode der Hybridisierung beruhen oder dem unterschiedlichem Ausbleichen der Farbstoffe. Die zugrundeliegende Idee ist, dass es keine gravierenden Änderungen in der Expression der meisten Gene gibt. Diese würden das durchschnittliche Signal verändern. Dazu wurden diejenigen Spots herangezogen, bei denen die Hybridisierung erfolgreich war. Bei den durchgeführten Experimenten waren das jeweils Die Signal zu Hintergrund Ratio sollte sowohl für das Cy3, als auch das Cy5 Signal größer drei sein. Das traf je nach Array auf Spots zu. Aus der Ratio of Median dieser Spots wurde der Mittelwert berechnet. 1 geteilt durch den Mittelwert ergibt den Normalisierungsfaktor. Die Ratio of Median der Kontrollspots wurde mit dem Normalisierungsfaktor multipliziert. Bildet man nun zur Kontrolle den Mittelwert von den normalisierten Ratios of Median ist dieser 1. Die normalisierten Ratios of Median werden nun herangezogen um zu berechnen, welche Werte als signifikant gelten und welche nicht, indem zunächst die Standardabweichung und daraus die Signifikanz (2x1+Standardabweichung) berechnet wird. Mit den 4210 zu analysierenden Spots, die als Einzelspots den Offenen Leserastern des E. coli Genoms entsprechen, wird nun ähnlich verfahren. Spots mit unzureichender Hybridisierung werden aussortiert. Nur solche Spots werden betrachtet, bei denen entweder die Signal zu Hintergrund Ratio des Cy3 Signals oder des Cy5 Signals größer drei ist. Die Ratio of Median wird mit den Normalisierungsfaktor multipliziert. Am Ende wird nach den normalisierten Ratios of Median gesucht, die als signifikant gelten. Das sind die Gene, deren Expression nach dem oben berechneten Wert vermutlich signifikant verändert war.

52 2. Material und Methoden EMSA Electromobility Shift Assay Im EMSA wird die Bindung von Protein an DNA sichtbar, indem ein an Protein gebundenes Operatorfragment im Vergleich zu freier DNA im Gel verzögert wird. Dazu wurden die Ansätze einmal im 1,5 % Agarose-Gel aufgetrennt und die DNA mit Ethidiumbromid gefärbt. Zum anderen wurde die DNA mit [γ- 32 P]-ATP markiert und im nativen 8 % Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die getesteten Operatorfragmente waren C9 (ptz-c9), das einer NagC-Bindestelle entspricht, M26 (ptz-m26), das eine Mlc-Bindestelle beinhaltet und M120 (ptz-m120), eine Negativkontrolle. Die Fragmente wurden mit den oben genannten Plasmiden als Template und den Primern N14E und N15B (118) mittels PCR amplifiziert. Für die im Ethidiumbromid gefärbten Gel aufgetrennten Ansätze wurde je 1 µg der Mlc- Varianten (MlcWT, Mlc 9 und Mlc 18) mit ng Operatorfragment und einer entsprechenden Menge von 2x Bindepuffer (25 mm HEPES; 100 mm Kaliumglutamat; 0,5 mg/ml BSA; ph 8,0) gemischt. Die Ansätze wurden für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, dann 10 min bei rpm (Minifuge, Eppendorf) abzentrifugiert. Die Proben wurden mit einer adäquaten Menge Probenpuffer (2x Bindepuffer in 40 % Glycerin) versetzt und auf das 1,5 % Agarosegel aufgetragen. Zur Herstellung der 32 P-markierten DNA wurden die Operatorfragmente wie oben beschrieben amplifiziert und das Phosphat an das 5 -Hydroxyl-Ende angefügt. Die Markierungsreaktion erfolgte mittels [γ- 32 P]-ATP und einer T4 Polynukleotidkinase (MBI Fermentas), die Reinigung der DNA-Fragmente mit den Mini Quick Spin Columns (Roche); beides je nach Herstellerangabe. Die Operatorfragmente (7000 c.p.m), 500 ng der jeweiligen Mlc-Variante, 0,5 µg Poly di dc (Roche) als Kompetitor-DNA und 5 µl 2x Bindepuffer wurden vermischt und mit Milliporewasser auf 10 µl aufgefüllt. Die Ansätze wurden für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und für 10 min bei rpm (Minifuge, Eppendorf) abzentrifugiert. Die Proben wurden wie oben mit Probenpuffer versetzt und mittels eines nativen 8 % Polyacrylamidgeles aufgetrennt. Um aufgetrennten Banden sichtbar zu machen wurde ein Röntgenfilm aufgelegt. Die Exposition erfolgte bei Raumtemperatur und über Nacht.

53 2. Material und Methoden Biochemische Methoden SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Proteine wurden unter denaturierenden Bedingungen über SDS-PAGE nach Laemmli, 1970 (82) aufgetrennt. Zur Orientierung wurde ein Gemisch von Proteinen bekannter Größe aufgetragen (Low molecular weight marker, Pharmacia: 94, 67, 43, 30, 20,1, 14,4 kda). Proteine wurden mit Coomassie Brilliant Blue G250 (Fluka) gefärbt und sichtbar gemacht (43, 146). Bei Ganzzellextrakten, beispielsweise Induktionskontrollen, wurde 1 ml Zellen abzentrifugiert, das Pellet in 2x Auftragepuffer (140 mm TrisHCl, 16 % ß-Mercaptoethanol, 4 % SDS, 0,1 % Bromphenolblau, 40 % Glycerin, ph6,8) gelöst und dabei eine OD von 13,5 eingestellt (146). Die Proben wurden für 10 min gekocht und je 20 µl auf das Gel aufgetragen. Gereinigtes Protein bzw. Membranpräparationen wurden im Verhältnis 1:2 mit 2x Auftragepuffer vermischt Westernblot Diese Methode ermöglicht den Nachweis bestimmter Proteine mittels polyklonaler Antikörper (138). Die im SDS-Gel aufgetrennten Proteine wurden im Semi-Dry-Verfahren auf eine Polyvinyliden-Difluorid-Membran (PVDF von Pall mit einer Porengrösse von 0,2µm) geblottet. Die spätere Zuordnung der Signale ermöglichte ein vorgefärbter Proteinstandard (Precision Plus Protein Standard Biorad: 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15, 10 kda). Die Membran wurde in TBS Puffer (10 mm Tris/HCl ph 7,5; 150 mm NaCl) gewaschen und in Puffer TBS-Tween/Triton (20 mm Tris/HCl ph 7,5; 500 mm NaCl; 0,05 % [v/v] Tween; 0,2 % [v/v] Triton X-100) mit 2 % BSA geblockt. Der primäre Antikörper zur Bindung an das zu analysierende Protein wurde entsprechend den Herstelleranweisungen bzw. Qualität in der Blocking-Lösung verdünnt und 1h bis über Nacht mit dem Blot inkubiert. Die Membran wurde zweimal in TBS-Tween/Triton Puffer gewaschen und in TBS- Tween/Triton mit 2% BSA und sekundärem Antikörper für mindestens 1h inkubiert. Als sekundärer Antikörper wurde Anti-Mouse bzw. Anti-Rabbit IgG mit gekoppelter Alkaliner Phosphatase (Sigma) verwendet. Dieser Antikörper wurde in Verdünnung 1:10000 zugesetzt. Danach wurde die Membran dreimal in TBS-Tween/Triton Puffer und einmal in Puffer A

54 2. Material und Methoden 40 (100 mm Tris/HCl ph 9,5; 100 mm NaCl; 5 mm MgCl 2 ) gewaschen. Die Farbreaktion erfolgt durch Zugabe einer Lösung von NBT (Nitro Blue Tetrazolium) und XP (5-Bromo-4- Chloro-3-Indolyl-Phosphat) in Puffer A. Zum Abstoppen der Farbreaktion wurde die Membran mit deionisiertem Wasser gewaschen (Methode verändert nach Qiagen (128)) Bestimmen der Proteinkonzentration Proteinkonzentrationen wurden mit dem Coomassie Protein Assay Reagent (Biorad) nach der Methode von Bradford (19) bestimmt Bestimmen der β-galaktosidase-aktivität Die β-galaktosidase (LacZ) aus E. coli spaltet neben seinem natürlichen Substrat auch das Substratanalogon ONPG (Ortho-Nitrophenyl-ß-Galaktopyranosid). Es wird Ortho- Nitrophenol abgespalten, das im alkalischen Milieu einen gelben Farbstoff mit Absorptsmaximum bei 405 nm ergibt. Ein promotorloses lacz-gen wurde an die potentielle Promotorregion zu analysierender Genes fusioniert. Die Gelbfärbung im Assay ist als Maß für die Expression dieses Genes unter Versuchsbedingung anzusehen. Die Messungen wurden meist mit über Nacht-Kulturen (Wachstum für 18 +/- 1h) durchgeführt, aber auch Wachstumsphasenabhängig. Dafür wurden von der wachsenden Kultur alle 60 min 1ml Aliquots für den Assay entnommen. Die Zellen wurden in Minimalmedium A nach Miller (93) unter Zusatz verschiedener Kohlenstoffquellen (siehe Tabelle 6), falls nicht anders angegeben bei 37 C inkubiert. War die Induktion der Expression eines plasmidkodierten Genes erforderlich, wurden die Kulturen bis zu einer OD 578 = 0,5 (+/- 0,05) angezogen, geteilt, nur einem Teil µm IPGT zugegeben und über Nacht weiter inkubiert. Abweichungen zu dieser Standardprozedur werden je nach Experiment gesondert angegeben. Der Test erfolgte mit Veränderungen nach der Methode nach Miller (92). Das Pellet von 1ml Kultur wurde in 1ml Z-Puffer (Na 2 HPO 4 60 mm, NaH 2 PO 4 40 mm, KCl 10

55 2. Material und Methoden 41 mm, MgSO 4 1 mm) resuspendiert und davon bzw. einer Verdünnung in Z-Puffer die OD bei 578 nm bestimmt. Zu 0,8 ml dieser Zellen wurden je 25 µl 0,1% SDS und Chloroform gegeben, für 10 sek. gevortext und für 10 min bei RT inkubiert. Zu den nun permeabilisierten Zellen wurde 140 µl ONPG (4 mg/ml in Z-Puffer) gegeben (= Start der Reaktion). War bei einem Ansatz eine leichte Gelbfärbung zu erkennen, wurde die Reaktion mit Na 2 CO 3 (1M) abgestoppt. Die Zeit zwischen Start und Stop der Reaktion wurde gemessen. Der Ansatz wurde für 10 min. (14500 rpm, RT, Eppendorf Minifuge Plus) abzentrifugiert und von 1ml Überstand die Absorption bei 405 nm gemessen. Die Enzymaktivitäten wurden wie folgt berechnet (11, 92): - Menge an umgesetztem ONPG pro Zeit in U[µmol x min -1 ] - spezifische Aktivität (U bezogen auf die Menge an Protein im Ansatz = U x mg -1 ) Alle Messungen wurden mindestens zweimal mit voneinander unabhängigen Kulturen durchgeführt.

56 2. Material und Methoden Bestimmen der Aktivität der Alkalischen Phosphatase Bakterienkulturen für diesen Test wurden analog denen in Kapitel für den ß- Galaktosidase-Test kultiviert. 0,2 ml einer Kultur wurden mit 0,8 ml TN-Puffer (10 mm Tris/HCl ph8,0; 150 mm NaCl) vermischt. Die Verdünnung wurde abzentrifugiert ( 1 min, RT, rpm, Ependorf Minifuge Plus) und zweimal in 1 ml TN-Puffer gewaschen. Das Pellet wurde erneut in 1 ml TN-Puffer resuspendierd. 900 µl wurden zur Bestimmung der OD bei 600 nm herangezogen, 100 µl wurden mit 900 µl Puffer2 (1 M Tris/HCl ph8,0; 0,1 M ZnCl 2 ) verdünnt und in den Test eingesetzt. Die Zellen wurden durch Zugabe von je 25 µl 0,1 % SDS und Chloroform, 10 sek vortexen und 10 minütiger Inkubation bei RT permeabilisiert. Der folgende Enzymtest wurde bei 28 C durchgeführt. Zum starten der Reaktion wurde 100 µl des Substrates pnpp (para-nitrophenyl Phosphat; 0,4 %) zugegeben und gevortext. Bei Eintreten einer leichten Gelbfärbung wurde die Reaktion durch Zugabe von 120 µl 2,5 M K 2 HPO 4 gestoppt. Die Zeit zwischen Start und Stop der Reaktion wurde gemessen. Der Ansatz wurde für 10 min bei rpm, RT zentrifugiert und danach 1 ml zum Bestimmen der OD bei 405 nm abgenommen. Die Azymaktivität wurde in Miller Units und wie folgt berechnet (92):

57 2. Material und Methoden Reinigung von Protein Die Proteine Mlc, EIIA Glc und IIB Glc wurden unter nativen Bedingungen mittels Affinitätschromatographie und Gelfiltration gereinigt. E. coli DHB4 wurde mit den in Tabelle 7 genannten Plasmiden transformiert und je nach Effektivität der Überproduktion in 1-8 l LB- bzw. NZA-Medium bei 28 C bzw. 37 C angezogen. Bei allen Plasmiden handelt es sich um Derivate von pqe-vektoren der Firma Qiagen, denen das laci q -Gen, das für den Lamda-Repressor kodiert, eingefügt wurde (siehe Tabelle 3). Die Überexpression wurde durch Zugabe von IPTG ( µm/ml) zum in Tabelle 7 genannten Zeitpunkt induziert. Nach weiteren 3 5 h wurden die Kulturen geerntet (4000 x g; 10 min; 4 C) und die Pellets bei 70 C eingefroren. Plasmid überproduziertes Protein Induktion bei OD 578 = Wachstum bei x C psl104 Mlc mit N-terminalem His-tag 0,8 37 pmlc410 Mlc mit einer Deletion von 9 AS am C- 0,8 37 terminalem Ende; mit N-terminalem His-tag pmlc401 Mlc mit einer Deletion von 18 AS am C- 0,8 37 terminalem Ende; mit N-terminalem His-tag psa9 EIIA Glc mit N-terminalem His-tag 1,0 28 pjfbh IIB Glc mit C-terminalem His-tag 0,8 28 Tabelle 7. Plasmide - Überproduktion von Protein Affinitätschromatographie Die mit einem His-tag fusionierten Proteine wurden durch Ni 2+ -Affinitätschromatographie gereinigt. Dazu wurde einerseits die Biorad Workstation und Säulen mit 2 5 ml Ni-NTA- Superflow-Resin (Qiagen, Hilden) benutzt, anderseits der Äkta Purifier (Pharmacia) und 1ml bzw. 5 ml HiTrap Chelating HP -Säulen (Ammersham Pharmacia, Freiburg). Diese Säulen wurden vor der Reinigung mit Ni 2+, in Form von einem Säulenvolumen 0,1M NiSO 4, beladen.

58 2. Material und Methoden 44 Die gefrorenen Zellpellets (siehe 2.5.6) wurden in ml Lysispuffer (50 mm NaH 2 PO 4, 300 mm NaCl, 10 mm Imidazol) gelöst und die Zellen mit Hilfe der French Pressure Cell (20K) aufgeschlossen. Zellbruchstücke wurden bei x g, 45min und 4 C abzentrifugiert. Die Überstände wurden daraufhin filtriert (Porengröße 0,45 µm) oder nochmals mit der Ultrazentrifuge mit xg, 30min, 4 C abzentrifugiert. Die Überstände mit löslichem Protein wurden dann auf die Säule geladen. Die Säulen wurden zuvor mit 5 Säulenvolumen Millipore-Wasser gewaschen und mit 5 Säulenvolumen Lysispuffer äquillibriert. Nach dem Laden der Zellextrakte wurde mit Waschpuffer (50 mm NaH 2 PO 4, 300 mm NaCl, 20 mm Imidazol) nicht gebundenes Protein von der Säule gewaschen bis die Absorption bei 280 nm unter 20 mau (Milli-Absorption- Units) sank. An der Biorad Workstation wurde das gebundene Protein mit verschiedenen Elutionspuffern mit steigendem Imidazolanteil eluiert: Elutionspuffer 50 mm NaH 2 PO mm NaCl + Elutionspuffer1 Elutionspuffer2 Elutionspuffer3 50 mm Imidazol 250 mm Imidazol 500 mm Imidazol jeweils 3 5 Säulenvolumen Am Äkta Purifier wurde durch Mischen des Wasch- und des Elutionspuffers (50 mm NaH 2 PO 4, 300 mm NaCl, 500 mm Imidazol) ein ansteigender Imidazolgradient erzeugt. Die Flussrate betrug 1 ml/min und wurde bei sehr zähflüssigen Zellextrakten entsprechend reduziert. Während des Ladens und Waschens wurden 5 ml-fraktionen gesammelt, während der Elution 0,5 ml-fraktionen. Aliquots (10 15 µl) der Elutionsfraktionen wurden auf SDS- Gele aufgetragen und analysiert.

59 2. Material und Methoden Gelfiltration Elutionsfraktionen, die das gesuchte Protein enthielten, wurden vereinigt und weiter durch Gelfiltration gereinigt. Dabei wurden die Proteine entsprechend ihrer Größe aufgetrennt und damit konnten Proteine, die zuvor unspezifisch an die Ni-Säule gebunden hatten, abgetrennt werden. Ein positiver Nebeneffekt ist, dass das Protein dabei umgepuffert und entsalzt wird. Verwendet wurden die Biorad Workstation mit der Säule Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia, Freiburg) und der Äkta Purifier mit den Säulen Superdex 200 HR 10/30 und HiLoad Superdex 200 HR 16/60 (Pharmacia, Freiburg). Die Säulen wurden mit 1 Säulenvolumen Millipore-Wasser und 1 Säulenvolumen 0,5 M NaOH regeneriert und mit 1,5 Säulenvolumen Laufpuffer (50 mm Tris, 300 mm NaCl, ph 7,5) äquillibriert. Die Säule Superdex 200 HR 10/30 wurde mit bis zu 250 µl beladen, die Säule HiLoad Superdex 200 HR 16/60 mit bis zu 5 ml Proteinlösung. Die Elution erfolgte über weitere 1,5 Säulenvolumen mit Laufpuffer. Dabei wurden Fraktionen von 1,0 1,2 ml gesammelt. Fraktionen mit erhöhter Absorption bei 280 nm wurden mittels SDS-PAGE analysiert Bestimmen des Oligomerisierungsgrades von Mlc und YeeI mittels Gelfiltration (4) Die Methode der Gelfiltration (Größenausschlußchromatographie) kann verwendet werden um das Molekulagewicht und die Größe eines Proteins abzuschätzen. Bei der Verwendung vergleichbarer Moleküle mit unterschiedlicher Größe besteht eine Verbindung zwischen dem Elutionsvolumen bzw. verschiedenen Elutionsparametern wie der Diffusionskonstanten K av und dem Logarithmus der Molekulargewichte. Dabei werden größere Moleküle weniger leicht in der Säule zurückgehalten und eluieren vor kleineren Molekülen. Um einen möglichst korrekte Bestimmung der Molkulargewichte der zu untersuchenden Proteine zu erhalten, sollten die Vergleichssubstanzen, also die Proteine, mit denen die Säule geeicht wird, eine vergleichbare Relation zwischen Molekulargewicht und molekularer Größe aufweisen. Da dies gerade bei dem Vergleich von Proteinen unter nativen Bedingungen nicht immer der Fall ist, liegt hierin eine gewisse Ungenauigkeit der Methode begründet.

60 2. Material und Methoden 46 Um das Molekulargewicht und den Polymerisierungsgrad von Mlc und YeeI unter nativen Bedingungen zu bestimmen wurde wiederum die Methode der Gelfiltration wie oben beschrieben angewandt. Es wurde der Äkta Purifier mit der Säule Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia; Säulenvolumen = 23,56 ml) verwendet. Die Säule wurde zunächst mit Standardproteinen des HMW und LMW Calibration Kits (Pharmcia, Freiburg) geeicht. Das Leervolumen der Säule wurde mit der Substanz Blue Dextran 2000 (2000 kda) bestimmt. Unter Einbeziehen des Elutionsvolumens, des Säulenvolumens und des Leervolumens wurde für jedes Protein die entsprechende Diffussionskonstante K av ermittelt. Aus den Molekulargewichten (y-achse, logarithmische Skalierung) und Diffusionskkonstanten (x- Achse, lineare Skalierung) der Calibration Kit Proteine wurde eine Eichgerade erstellt. Das zu untersuchende Protein wurde unter gleichen Bedingungen auf der Säule analysiert. Über das Elutionsvolumen wurde der K av -Wert berechnet und mit diesem und der Eichgerade das Molekulargewicht des zu untersuchenden Proteins abgeschätzt Reinigen des Komplexes aus Mlc und IIB Glc (Koelution) Die Reinigung der B-Domäne (IIB Glc ) von PtsG mit C-terminalem His-tag erfolgte wie in Kapitel beschrieben. Eingesetzt wurden Zellen aus 8 l Bakterienkultur, was einen Zellpellet von etwa 5 g entsprach. Das Protein wurde zwischen Affinitätschromatographie und Gelfiltration mit einem 3 kda-filter konzentriert. Zur Herstellung von Zellextrakten mit überproduziertem Mlc ohne His-tag wurde Stamm IT1168 (ptsg::kan) transformiert mit Plasmid psa1 verwendet. Die Zellen wurden in 2 l LB- Medium (Amp 100µg/ml ) bei 37 C inkubiert. Bei einer OD 578 von 0,7 wurde mit 100 µm IPTG induziert und anschließend für weitere 5 h inkubiert. Die Zellen wurden bei 4000 x g, 4 C, 10

61 2. Material und Methoden 47 min geerntet und die Pellets bei 70 C eingefroren. Für den Test wurden die Zellen in 10 ml Lysispuffer (20 mm HEPES, 0,8 mm NaH2PO4, 5 mm KCl, 137 mmnacl, ph 7,0) resuspendiert und mittels French Pressure Cell (20K) aufgeschlossen. Die Koelution wurde am Äkta Purifier (Amersham, Pharmacia, Freiburg) mit der 5 ml HiTrap Chelating HP -Säule durchgeführt. Gereingtes IIB Glc wurde erneut über den His-tag an die Säule gebunden. Dies geschah bei niedrigen Flussraten von 0,1 0,3 ml/min. Der Durchfluss wurde nochmals geladen um auch noch Reste von IIB Glc an die Säule zu binden. Danach wurde der Mlc Zellextrakt, ebenfalls bei niedrigen Flussraten (0,1 0,3 ml/min) geladen. Der Durchfluss wurde noch zweimal wieder über die Säule gegeben um den im Zellextrakt enthaltenen Mlc die Möglichkeit zu geben an das an der Säule gebundene IIB Glc zu binden. Dem Laden der Proteine folgte das Auswaschen von nicht gebundenen Proteinen mit Waschpuffer (Lysispuffer mit 10 mm Imidazol) bei einer Flussrate von 1 ml/min. Dies erfolgte solange bis die Absorption bei 280 nm unter 100 mau (Milli-Absorption-Units) gesunken war. Durch Mischen von Waschpuffer und Elutionspuffer (Lysispuffer mm Imidazol) wurde ein steigender Imidazolgradient bis hin zu 500 mm Imidazol angelegt und damit die an der Säule gebundenen Proteine eluiert. Die Flussrate von 1 ml/min wurde beibehalten. Während des Ladens der Protein und des Waschens der Säule wurden 5 ml Fraktionen gesammelt, während der Elution Fraktionen von 0,5 ml. Fraktionen, die eine erhöhte Absorption bei 280 nm aufwiesen wurden mittels SDS-PAGE analysiert Bindetests zwischen Mlc und EIICB Glc (PtsG) Für die Bindetests zwischen Mlc und PtsG wurde Mlc mit N-terminalem His-tag und auch die Mlc-Varianten (Mlc 9 und Mlc 18) mit N-terminalem His-tag wie unter und beschrieben gereinigt. Für die Herstellung der invertierten Membranvesikel, die überproduziertes PtsG oder die überproduzierten Fusionsproteine aus Gp8 und der IIB-Domäne von PtsG bzw.gp8-iib- Varianten mit Punktmutationen, enthielten wurde folgende Methode angewandt. Der Stamm IT1168 (ptsg::tn5(kan)) oder Stamm JM-G77 ( ptsg ptshicrr) wurde mit den entsprechenden Plasmiden transformiert (siehe Tabelle 8). Die Zellen wurden in MMA 0,4 %

62 2. Material und Methoden 48 Glycerin bei 37 C angezogen. Die Induktion mit µm IPTG erfolgt bei OD 578 = 0,5 (+/- 0,05) und über Nacht. Die Zellen wurden geerntet (4000 x g; 4 C; 10 min) und die Pellets bei 70 C eingefroren. Die Zellen wurden zweimal mit 0,9 % NaCl gewaschen, und ein Pellet aus 500 ml Zellkultur wurde in 5 ml Bindepuffer (20 mm HEPES, 0,8 mm Na 2 HPO 4, 5 mm KCl, 137 mm NaCl, ph 7,0) resuspendiert. Die Zellen wurden mittels French press aufgebrochen und Zellbruchstücke bei xg, 4 C, 15 min abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen, auf Eis aufbewahrt und die Proteinkonzentration nach Bradford bestimmt. Die Menge an Überstand, die 2 mg an Gesamtprotein enthielt, wurde bestimmt und in 170 µl Schritten mit der Airfuge (Beckmann) bei x g; RT; 1 min abzentrifugiert. Das so erhaltene Pellet wurde in 100 µl Bindepuffer resuspendiert. Dieser Ansatz enthält nun Membranen, jedoch keine löslichen Proteine. Enthielten die Membranen PtsG gesamt wurde 2 µg gereinigtes Mlc zugegeben, enthielten sie die IIB-Domäne; versehen mit einem Membrananker, wurde 1 µg Mlc zugegeben. Die Ansätze wurden 10 min bei RT inkubiert und darauf nochmals für 1 min, RT, x g abzentrifugiert. Die Überstände, die lösliches Protein, folglich auch nicht gebundenes Mlc, enthielten, wurden abgenommen und auf Eis aufbewahrt. Die Pellets, die Membranen, Membranproteine und daran gebundene Proteine (auch an PtsG gebundenes Mlc) enthielten, wurden erneut in 100 µl Bindepuffer resuspendiert. Je 5 10 µl der Pellet und Überstandsfraktionen wurde auf 12 %ige SDS-PAA- Gele aufgetragen und anschließend mittels Westernblots mit Anti-IIB, Anti-Mlc oder Anti- Penta-His-Antikörpern analysiert. Als Negativkontrolle dienten Membranpräparationen von Stamm IT1168 oder von JM-G77, die mit keinem Plasmid transformiert waren. Plasmid klonierte EIIB-Variante ptz-gp8 Gp8-Protein des Phagen M13 ptz-gp8-iib Gp8 + Sequenz der B-Domäne des Enzyms IIBC (PtsG) des Glukose PTS (Phosphotransferasesystem); entsprechend Aminosäure ptz-gp8-iib(cys421asp) Gp8 + IIB-Domäne(Aminosäureaustausch Cystein421 zu Aspartat) ptz-gp8-iib(arg424ala) Gp8 + IIB-Domäne(Aminosäureaustausch Arg424 zu Ala) ptz-gp8-iib(arg424his) Gp8 + IIB-Domäne(Aminosäureaustausch Arg424 zu His)

63 2. Material und Methoden 49 Plasmid klonierte EIIB-Variante ptz-gp8-iib(arg424lys) Gp8 + IIB-Domäne(Aminosäureaustausch Arg424 zu Lys) ptz-gp8-iib(arg426ala) Gp8 + IIB-Domäne(Aminosäureaustausch Arg426 zu Ala) ptz-gp8-iib(asp419ala) Gp8 + IIB-Domäne(Aminosäureaustausch Asp419 zu Ala) ptz-gp8-iib(cys421ser) Gp8 + IIB-Domäne(Aminosäureaustausch Cys421 zu Ala) ptsg11 PtsG gesamt Tabelle 8. Plasmide für die Überproduktion von EIIBC Glc und IIB-Varianten Die Plasmide mit den kodierenden Sequenzen der Gp8-IIB-Varianten wurden von J. Plumbridge (Institut de Biologie Physico-Chimique; Paris) bereitgestellt Bindetests zwischen Mlc und YeeI (Surface Plasmone Resonace) (13, 14) Um zu testen ob eine Bindung zwischen Mlc und YeeI möglich ist wurde die Methode der Messung der Oberflächenplasmonresonanz angewandt. Verwendet wurde dafür die BiacoreX (Pharmacia) und der CM5 Sensorchip. Bei dem optischen Biosensor handelt es sich um einen Basis-Chip mit einer 50 nm dicken Goldfolie auf einer Glasplatte, an deren Oberfläche eine Carboxylierte Dextranmatrix aufgebracht ist. Proteine können über eine Amidbindung direkt an die Carboxygruppen gekoppelt werden. Nicht gebundene Carboxygruppen werden mit Ethanolamin abgesättigt. Im Gerät ergeben sich über dem Chip zwei von einander unabhängige Flusszellen, die Rerferenzzelle (Flusszelle 1/F1) und die Messzelle (Flusszelle 2/F2). Das ermöglicht die Bindung eines Kontrollproteins in F1. Hier sollte ein später zugegebener Analyt nicht binden. Der zu untersuchende Ligand wird in Flusszelle 2 gekoppelt. Der potentielle Bindepartner (=Analyt) des gebundenen Liganden wird in HBS- EP-Puffer (0,01 M HEPES, 0,15 M NaCl, 3 mm EDTA, 0,005 % Polysorbat) gelöst. Der ph- Wert des Puffer sollte dabei eins unter dem theoretisch ermittelten pi des Analyten liegen. Der Analyt wird mit konstanter Flussgeschwindigkeit durch beide Flusszellen geleitet. Die Bindung eines Proteins, sei es die Kopplung des Liganden oder die Bindung des Analyten,

64 2. Material und Methoden 50 entspricht einer Massenzunahme auf dem Chip, die mittels einer optischen Einheit detektiert wird und in Responseunits (RU) angegeben wird RU entsprechen 1 ng Massenzunahme. Indem die erhaltene Signalhöhe der Referenzzelle, von der der Messzelle abgezogen wird, erhält man ein Differenzsensorgramm, in welchen die möglicherweise unspezifischen Bindungen des Analyten berücksichtigt sind. Im Differenzsensorgramm erkennt man die Injektion des Analyten durch einem Anstieg der Signalhöhe, der Assoziationskurve, und das Ende der Injektion in einem Abfall der Signalhöhe, die Dissozialtionskurve (siehe Kap.3.2.1). Die verwendeten Proteine und Flussraten werden zu den jeweiligen Experimenten in Kapitel genannt Bindetests zwischen EIIA Glc und CyaA (Adenylatcyclase) Dieser Test wurde vergleichbar dem Bindetest zwischen EIICB Glc und Mlc durchgeführt (Kapitel 2.5.9). Es wurde davon ausgegangen, dass eine ausreichende Menge Adenylatcyclase membranassoziert war. Von Stämmen, die die Adenylatcyclase oder deren Domänen überproduziert hatten wurden Membranen präpariert, die unter in vitro Bedingungen invertierte Membranvesikel bildeten. Die Membranen wurden mit gereinigtem EIIA Glc oder mit Zellextrakten, die überproduziertes EIIA Glc enthielten inkubiert. Die Ansätze wurden 10 min bei RT inkubiert und darauf für 1 min, RT, x g abzentrifugiert. Die Überstände, die lösliches Protein, folglich auch nicht gebundenes EIIA Glc enthielten, wurden abgenommen und auf Eis aufbewahrt. Die Pellets, die Membranen, Membranproteine und daran gebundene Proteine enthielten, wurden erneut in 100 µl Bindepuffer resuspendiert. Ein Unterschied zum voherigen Test bestand darin, dass die Membranpellets P1 des ersten Zentrifugationsschrittes nach der Inkubation der Membranen mit EIIA Glc nochmals in 100 µl Bindepuffer gelöst und wieder abzentrifugiert wurden. Daraus hervor gingen Membranpellet 2 (P2) und Überstand 2 (S2). Für die Membranpräparationen wurden die Stämme (SA14; SA17; SA36) ohne Adenylatcyclase ( cyaa) bzw. ohne PtsG ( ptsg) mit Plasmiden transformiert, die entweder die Sequenz für die gesamte Adenylatcyclase trugen oder für deren Domänen (siehe Tabelle 9). Die Stämme wurden in MMA mit 0,4 % Glycerin und 0,5 % CAA angezogen. Die Induktion der Expression mit 50 µm IPTG erfolgte sofort mit Beginn der Kultivierung der Zellen und dann für 2-3 h oder je nach Plasmid mit 0,2 % Arabinose (siehe Tabelle 9), dann bei OD 578 =0,8 und für 5h. Die Zellpellets wurden nach dem Waschen in einem modifizierten

65 2. Material und Methoden 51 Bindepuffer (siehe Kapitel 2.5.9, aber ph 8,5 und mit 5 mm ATP, 2 mm MgCl 2, 1 mm ß- Mercaptoethanol) gelöst. Für den Bindetest wurde, je nach Qualität der Überproduktion, eine Menge an Überstand verwendet, die 5 6 mg Gesamtprotein enthält. Als Negativkontrolle dienten Membranpräparationen von Stamm SA15 (ptsg::tn5(kan), cya crp*). Als Bindepartner wurde, wie unter beschrieben, gereinigtes EIIA Glc mit N-terminalem Histag verwendet oder Zellextrakte, die überproduziertes EIIA Glc ohne His-tag (Stamm DHB4/JJ3 cya crr bzw. DG102 ptshicrr mit Plasmid pbcp206) enthielten. Membranen wurden durch Ultrazentrifugation bei x g, 8 C und 30 min entfernt. Für den Bindetest wurde 2 µg gereinigtes Protein oder eine Menge an EIIA-Zellextrakt verwendet, die 5 bzw. 10 mg Gesamtprotein enthält. Pellet- und Überstandfraktionen wurden mittels Westernblot mit Anti-Penta-His und Anti-EIIA Glc -Antikörpern analysiert. Stamm Plasmid Induktion mit SA14 psa8 (cyaa) Arabinose SA17 psa12 (cyaa) Arabinose psa11 (cyaa mit N-terminalem His-tag) IPTG psa16 (cyaa; regulatorische Domäne mit N-terminalem Histag) IPTG psa13 (cyaa ; katalytische Domäne mit N-terminalem IPTG His-tag) Tabelle 9. Plasmide - Überproduktion der Adenylatcyclasevarianten für Membranbindungstests

66 2. Material und Methoden Zellextrakte für 2D-Gelelektrophorese (39) Die 2D-Gelelektrophorese-Analysen und MALDI-Experimente wurden im Labor von Prof. Dr. U. Völker in Greifswald durchgeführt. Stamm KD413 mit pcs19 bzw. psa1 wurde wie in Kapitel beschrieben kultiviert. Die Zellen wurden abzentrifugiert, zweimal in TE-PMSF (10 mm Tris ph7,5; 1 mm EDTA; 0,3mg/ml PMSF) gewaschen und das Pellet in 3ml TE-PMSF resuspendiert. Die Zellen wurden mittels French pressure Cell aufgebrochen und Zelltrümmer bei x g, 4 C für 10 min abzentrifugiert. Dem folgte ein weiterer Zentrifugationsschritt für 1 h bei x g. Die Gesamtproteinkonzentration im Zellextrakt wurde nach Bradford bestimmt und der Extrakt bei 70 C eingefroren bis er auf Trockeneis verschickt wurde.

67 3. Ergebnisse Ergebnisse 3.1 Mlc und PtsG Analyse verschiedener Mlc- und EIIB Glc -Varianten bezüglich ihrer Rolle bei der Bindung der Proteine und des Einflusses auf die Mlc regulierten Gene Der C-Terminus von Mlc Frühere Untersuchen ergaben, dass eine Variante von Mlc, die einen C-terminalen His-tag besitzt, weniger gut an PtsG enthaltende Membranen gebunden wurde als eine andere Variante, die einen N-terminalen His-tag besitzt (Sung-Jae Lee, persönliche Mitteilung). Ein weiterer Hinweis, dass der C-Terminus von Mlc eine gewisse Bedeutung für die Bindung von Mlc an PtsG haben könnte, erfolgte durch S. Roseman, der bemerkte, dass durch die letzten 18 Aminosäuren des C-Terminus von Mlc eine möglicherweise amphipatische α-helix gebildet wird (siehe Abb.7). Derartige Helices besitzen eine vorwiegend polare, hydrophile Seite und eine unpolare, hydrophobe Seite und spielen eine wichtige Rolle bei der Membranassoziation verschiedener Proteine (12, 165). In vergleichbarer Weise könnten die hydrophoben Bereiche der Helix auch an der Interaktion von Mlc mit PtsG beteiligt sein. Dementsprechend wurden zwei C-terminal trunkierte Varianten von Mlc hergestellt. Mlc 9 besitzt einen um 9 Aminosäuren verkürzten C-Terminus, was der Hälfte der potentiellen amphipatischen α-helix entspricht. Mlc 18 besitzt einen um 18 Aminosäuren verkürzten C- Terminus, was der gesamten α-helix entspricht (siehe Abb. 8). Alle 3 Proteine, die C- terminal trunkierten Varianten und MlcWT, besitzen einen N-terminalen His-tag und können mittels Ni 2+ -Affinitätschromatographie gereinigt werden (siehe Kap ).

68 3. Ergebnisse 54 Abb. 7: Aufsicht auf die amphipatische α-helix. Gezeigt sind die 18 Aminosäuren des C-Terminus von Mlc, die die potentielle amphipatische α-helix bilden. Geladene Aminosären wurden mit +/- gekennzeichnet und befinden sich auf der linken Seite der Helix, während sich auf der rechten Seite vorwiegend hydrophobe Aminosäuren befinden. Abb. 8: Mlc-Varianten Schematische Darstellung der überproduzierten Mlc-Varianten. Die mit Hilfe von pmlc410 und pmlc401 exprimierten Proteine weisen einen im Vergleich zum Wildtyp Mlc um 9 bzw. 18 Aminosäuren (AS) verkürzten C-Terminus auf. Alle drei Proteine besitzen einen N-terminalen His-tag Membranbindetests mit PtsG (EIICB Glc ) enthaltenden Membranen und den Mlc-Varianten Bindungstests mit Membranen, angereichert mit PtsG, und den Mlc-Varianten zeigten, dass die 9 AS Variante von Mlc vergleichbar zu MlcWT durch PtsG an die Membran gebunden wird, während die 18 AS Variante diese Fähigkeit verloren hat. Die mit PtsG angereicherten invertierten Membranvesikel wurden wie in Kapitel beschrieben hergestellt. Durch Zugabe von 2 µg der jeweiligen Mlc Variante wurde der Bindetest (siehe Kap.2.5.9) gestartet. Nach dem Abzentrifugieren in der Ultrazentrifuge

69 3. Ergebnisse 55 befinden sich alle Membranen, Membranproteine und daran gebundene Proteine im Pellet. Lösliche Proteine befinden sich wiederum im Überstand. In Abbildung 9 ist der Westerblot dargestellt, der mit Antikörpern gegen Mlc durchgeführt wurde und der die spezifische Bindung von Mlc an PtsG zeigt. Nur an die mit PtsG angereicherten Membranen ist Mlc gebunden. Die Bindung von Mlc geschieht folglich über PtsG und erfolgt nicht unspezifisch an die Membran. Fehlt PtsG, befindet sich Mlc ungebunden als lösliches Protein im Überstand. Abb. 9: Membranbindungstest von Mlc mit PtsG enthaltenden Membranen. Bindungstests mit MlcWT und invertierten Membranvesikeln, die links kein PtsG enthalten (---) und rechts mit PtsG (EIICB) angereichert sind. Die Überproduktion von PtsG erfolgte mit Stamm IT1168 (ptsg::tn5(kan)), tranformiert mit Plasmid ptsg11 (EIICB Glc = PtsG). Membranen wurden aus einem Volumen Zellextrakt präpariert, das 2 mg Gesamtprotein enthielt. In welchen Fraktionen Mlc vorhanden ist, wurde mittels Antikörpern gegen Mlc detektiert. Mlc ist nur in den Membranpellets (P) der mit PtsG angereicherten Membranen vorhanden. Es bindet nicht an Membranen ohne PtsG und ist dann als lösliches Protein in der Überstandfraktion (S) zu finden. Zu sehen ist die 37 und die 50 kda Bande des Precision Plus All Blue Standardes von Biorad (std). Abbildung 10 zeigt den Bindetest zwischen PtsG und den Mlc Varianten. Wildtyp Mlc war wie zuvor vorwiegend in der Pelletfraktion zu finden, ebenso die 9AS Variante von Mlc. Beide Proteine wurden durch PtsG an die Membran gebunden. Die 18AS Variante von Mlc befand sich im Überstand und wurde folglich nicht mehr durch PtsG an die Membran gebunden.

70 3. Ergebnisse 56 Abb. 10: Membranbindetests mit den Mlc-Varianten MlcWT, Mlc 9, und Mlc 18 wurden bezüglich ihrer Fähigkeit an PtsG haltige Membranen zu binden getestet. Mlc wurde mit Mlc-Antikörpern detektiert. Pelletfraktionen sind mit P gekennzeichnet, Überstandfraktionen mit S. Zu sehen ist die 50 kda Bande des Precision Plus All Blue Standardes von Biorad (std) in der ersten Spur und zur Kontrolle eine zu den Bindetests vergleichbare Menge gereinigtes Mlc ohne Zugabe von Membranpräparationen in der äußersten rechten Spur. Membranen wurden aus einem Volumen Zellextrakt präpariert, das 2 mg Gesamtprotein enthielt Membranbindetests mit unterschiedlichen IIB Glc -Varianten und MlcWT Die Bindetests ergaben, dass die lösliche cytoplasmatische B-Domäne von PtsG ausreicht, um Mlc zu binden und die Derepression der Mlc regulierten Gene zu bewirken, aber nur wenn die B-Domäne mittels eines Membranankers an die Membran gebunden ist. Untersuchungen an IIB-Mutanten mit einem Aminosäureaustausch in der exponierten Oberfläche in und um das phosphorylierbare Cys421 zeigen, dass die Aminosäure Arg424 für die Bindung von Mlc essenziell ist. Es war bereits bekannt, dass die lösliche IIB-Domäne von PtsG genügt, um Mlc zu binden (98). Dennoch wird Mlc in seiner Funktion als Repressor durch die Überproduktion der IIB- Domäne nicht inaktiviert und die Expression der Mlc regulierten Gene unterbleibt (84). Eine bereits in Kapitel beschriebene deletierte Variante von PtsG vermittelt aber wieder beides, die Bindung von Mlc und die Derepression der Mlc regulierten Gene. Bei dieser Variante blieben Teile der C-Domäne von PtsG und der Linker zwischen B- und C-Domäne

71 3. Ergebnisse 57 erhalten. Eine Frage, die geklärt werden sollte, war, ob eine potentielle neunte Helix von PtsG und der Linker zur B-Domäne für die B-Domäne einen Membrananker darstellen und Mlc deshalb von der DNA abtitriert wurde, oder ob diese Sequenzen eine Erkennungssequenz für Mlc darstellen. Um dies zu testen wurde die löslichen IIB-Domäne mit ihren N-Terminus an das Gp8 Protein des Phagen M13 fusioniert. Gp8 wird mittels einer Transmembranhelix in die Cytoplasmamembran von E. coli eingelagert. Die B-Domäne von PtsG erhält dadurch einen Membrananker, der keinerlei PtsG ähnliche Sequenzen enthält (50). Die Bindetests mit dem Fusionsprotein ergaben, dass Mlc nur an die Membranen gebunden wurde, die mit PtsG oder dem Fusionsprotein Gp8-IIB angereichert waren, nicht an jene, die keines der Proteine oder nur den Membrananker enthalten. Das bedeutet: (I) Mlc bindet nicht unspezifisch an die Membran an sich oder den Membrananker Gp8. (II) Die IIB-Domäne von PtsG, ohne die ptotentielle neunte Helix und dem Linker, ist für die Bindung von Mlc ausreichend (siehe Abb. 11). Abb. 11: Bindung von MlcWT an Gp8-IIB Glc. Die Membranen wurden aus Stamm JM-G77( ptsg ptshicrr) präpariert, der aufgrund der Deletion der pts- Gene PtsG und EIIB Glc nicht phosphorylieren konnte. Zu sehen sind die Bindetests mit Membranvesikeln, die kein überproduziertes Protein enthalten (----), PtsG (EIICB Glc ) von ptsg11, das Gp8-Protein des Phagen M13 (ptz-gp8) oder das GP8-IIB Fusionsprotein (ptz-gp8-iib). Oben Westernblot mit Antikörpern gegen Mlc, unten mit Antikörpern gegen IIB. Pelletfraktionen sind mit P gekennzeichnet, Überstandfraktionen mit S. Zu sehen sind die 37 und die 50 kda Standardbande (oben) oder die im Bild benannten Standardbanden (unten).

72 3. Ergebnisse 58 Obwohl für die Membranpräparation gleiche Mengen an Zellextrakt verwendet wurden, ob nun EIICB Glc oder das Fusionsprotein Gp8-IIB Glc überproduziert wurde, ist im Falle des Gp8- IIB-Fusionsproteins eine sättigende Mlc Bindung früher erreicht, so dass nur 1 µg Mlc, statt wie bei Bindetests zu PtsG 2 µg, eingesetzt wurde. Die Kontrolle der Membranfraktionen mit gegen EIIB Glc gerichteten Antikörpern zeigt ein Signal in den Spuren, in denen PtsG oder das Fusionsprotein enthaltende Membranpellets aufgetragen waren. Das Fusionsprotein Gp8-IIB wird in die Membran eingebaut und in etwa gleicher Menge gebildet wie PtsG, wobei dies, bedenkt man die Färbung der Blots mit Alkaliner Phosphatase, nur eine grobe Schätzung darstellt (siehe Abb. 11). Mlc bindet nur an dephosphoryliertes PtsG, wie man es bei aktiven Transport von Glukose vorfindet. Es könnte sein, dass Mlc überlappend mit der Phosphorylierungsstelle von PtsG, dem Cystein421 im Bereich der B-Domäne, an PtsG bindet. In einer durch NMR Spektroskopie ermittelten Struktur der löslichen IIB-Domäne findet man das Cys421 innerhalb einer konvexen Oberfläche. Es ist Teil eines polaren Bereichs, der von hydrophoben Aminosäureresten und einem Halbkreis aus hydrophilen Aminosäureresten umgeben ist (25, 37). Es konnten weitere Aminosäuren ermittelt werden, die an der Stabilisierung des gebundenen Phosphates, sowie am Phosphattransfer beteiligt sind. Diese Aminosäuren befinden sich in der erwähnten Region um das Cys421 (25, 47). Deshalb wurden B-Domäne Varianten überprüft, die jeweils einen Aminosäureaustausch in oder um die Phosphorylierungsstelle enthielten. Es sollte einerseits der Frage nachgegangen werden, ob Mlc möglicherweise die Thiolgruppe des Cys421 für die Bindung an PtsG nutzt. Deshalb wurde Cys421 durch Aminosäuren ohne Thiolgruppe ausgetauscht. Andererseits sollte überprüft werden, ob die negative Ladung, des an PtsG gebundenen Phosphates, die Bindung von Mlc verhindert. Der Austausch von Cys421 nach Serin(Ser) bzw. Aspartat(Asp) soll die dephosphorylierte und die phosphorylierte Spezies des Proteins imitieren. Dabei orientierte man sich an den Bacillus subtilis Proteinen HPr (170) und LicT (160). Bei den beiden Proteinen führte der Austausch von Serin (Ser/ bei HPr) oder His (bei LicT) nach Aspartat (Asp) dazu, dass die Proteine aufgrund der negativen Ladung des Aspartats die Charakteristika eines phosphorylierten Proteins besitzen. Mlc bindet jedoch nach wie vor an beide IIB-Varianten (siehe Abb. 12a). Weder die zusätzlich negative Ladung, noch der Verlust der Thiolgruppe des Cysteins verhinderten die Bindung an die Gp8-EIIB Glc -Varianten.

73 3. Ergebnisse 59 Die Bindung von Mlc an die IIB-Variante mit dem Austausch Asp419Ala konnte ebenfalls nachgewiesen werden (siehe Abb. 12a). Für Argenin 424 und Argenin (Arg)426 von PtsG wurde postuliert, dass sie eine Stabilisierung der Phosphatbindung an PtsG bewirken, und dass sie für den Phosphattransfer von EIIB auf Glukose benötigt werden (83). Im Bindetest wurde Mlc nach wie vor an die IIB-Variante mit dem Austausch Arg426Ala gebunden. Im Gegensatz dazu erfolgt keine Bindung von Mlc an die IIB-Variante mit dem Austausch Arg424Ala. Arg 424 scheint daher an der Mlc Bindung beteiligt zu sein (siehe Abb. 12 a). Bei dem Austausch von Arg 424Ala oder Arg424 gegen Lysin (Lys) befand sich im Bindetest alles Mlc als lösliches Protein im Überstand. Wurde Arg424 hingegen durch Histidin (His) ausgetauscht blieb ein Rest von Bindungsaktivität erhalten. Diese Bindung war aber weniger stabil und lies sich durch nochmaliges abzentrifugieren und lösen des Membranpellets auswaschen, was vor allem in den S2- Fraktionen (Überstand 2, nach dem Waschen der Pellets) in Abbildung 12b zu sehen ist. Die Bindetests wurden zudem mit Membranen aus Stamm IT1168 durchgeführt, in dem die PTS abhängige Phosphorylierung der IIB-Varianten möglich ist. Aufgrund der Kulturbedingungen (siehe Kap.2.5.9) kann man davon ausgehen, dass sowohl phosphorylierte, als auch dephosphorylierte IIB-Varianten in den Membranen vorhanden waren. Im Vergleich zu obigen Bindetests zeigte sich kein Unterschied in der Bindung von Mlc an die IIB-Varianten mit dem Cys421 und dem Arg424Ala Austausch. Die Bindung zu IIB ohne Mutation und dem Austausch Arg426Ala ist jedoch reduziert (siehe Abb. 13). IIB ohne Mutation wurde jedoch durch IT1168 weniger überproduziert als durch JM-G77, so dass hier vermutlich die zu geringe IIB Menge der Grund für die reduzierte Bindung ist (siehe Abb. 13).

74 3. Ergebnisse 60 Abb. 12: Bindung von MlcWT an die Gp8-IIB Glc Varianten unter nicht phophorylierenden Bedingungen. Die Membranen wurden aus Stamm JM-G77 ( ptsg ptshicrr) präpariert, der aufgrund der Deletion der pts- Gene PtsG und EIIB Glc nicht phosphorylieren konnte. In a) sind die Bindetests mit Membranvesikeln gezeigt, die überproduzierte GP8-IIB Fusionsproteine enthalten, welche je einen im Bild gekennzeichneten Aminosäureaustausch besitzen. Die Überproduktion erfolgte mittels ptz-gp8-iib mit der entsprechenden Mutation in IIB (siehe Tabelle 3 und Kap ). Oben Westernblot mit Antikörpern gegen Mlc, unten mit Antikörpern gegen IIB. Bei den Bindetests in b) wurde ein zusätzlicher Waschschritt der Membranpellets durchgeführt. Daraus resultieren die Fraktionen P2 (Pellet2) und S2 (Überstand2). Pelletfraktionen sind mit P gekennzeichnet, Überstandfraktionen mit S und der Standard (Precision Plus All Blue Standards von Biorad) mit std.

75 3. Ergebnisse 61 Abb. 13: Bindetests unter phosphorylierenden Bedingungen mit Membranen aus dem Stamm IT1168 und Mlc WT. Bindetest mit Membranvesikeln, die überproduzierte GP8-IIB Fusionsproteine enthalten, welche je einen im Bild gekennzeichneten Aminosäureaustausch besitzen. Membranen wurden von Stamm IT1168 (ptsg::tn5(kan)), transfomiert mit den entsprechenden Plasmiden, präpariert.in diesem Stamm ist die PTS abhängige Phosphorylierung der IIB-Varianten möglich. Oben Westernblot mit Antikörpern gegen Mlc, unten mit Antikörpern gegen IIB. Pelletfraktionen sind mit P gekennzeichnet, Überstandfraktionen mit S. Zu sehen sind die 37 und die 50 kda (oben) Bande und die im Bild benannten Banden (unten) des Precision Plus All Blue Standardes von Biorad(std). Die Fähigkeit der IIB-Varianten Mlc zu inaktivieren wurde zudem durch Messung der ptsglacz Reportergenfusion (ß-Galaktosidase Test) überprüft. Stamm JM-G77, der neben den Deletionen von ptsg und ptshicrr auch noch eine transkriptionelle ptsg-lacz-fusion besitzt, wurde mit den entsprechenden Plasmiden transformiert. Da in diesem Stamm die PTS abhängige Phosphorylierung nicht stattfinden kann, liegen die IIB-Varianten dephosphoryliert vor. Die Bindung von chromosomal kodiertem Mlc sollte, sofern möglich, sehr effektiv erfolgen und einen deutlichen Anstieg der Expression von ptsg-lacz bewirken. Zellen, welche jene IIB-Varianten überproduzierten, die im in vitro Bindetest fähig waren Mlc zu binden, zeigten eine um fach erhöhte ß-Galaktosidaseaktivität im Vergleich zu den Zellen, die die IIB-Varianten überexpremierten, die den Austausch des Arg424 nach Ala, His oder Lys besitzen und nicht mehr fähig waren Mlc zu binden (J. Plumbridge, persönliche Kommunikation und in (141)). Mlc wurde durch das Gp8-EIIB Glc Fusionsprotein nicht nur an die Membran gebunden, sondern auch in seiner Funktion als Repressor inaktiviert.

76 3. Ergebnisse Die Mlc-Varianten und ihr Einfluss auf die Mlc regulierten Gene Die für die Bindetests verwendeten Mlc-Varianten, MlcWT, Mlc 9, Mlc 18 und zudem Mlc110 wurden bezüglich ihrer Fähigkeit die Mlc-regulierten Gene zu repremieren getestet. Getestet wurde der Einfluss auf eine transkriptionelle malt- und eine transkriptionelle ptsglacz-fusion. Mlc 9 repremierte die Transkription der Reportergenfusionen vergleichbar zu MlcWT. Mlc 18 und Mlc110 haben ihre Funktion als Repressor komplett eingebüst und zeigten keinerlei Repression der Reportergenfusionen. Eine Mlc-Variante mit einem Aminosäureaustausch im HTH-Motiv zeigte die Charakteristika des MlcWT, während der Austausch von Aminosäuren in einem potentiellen Zink-Bindemotiv (Mlc_AYA und Mlc_SYS) zu einem Mlc mit stark eingeschränkter Repressorfunktion führte. Die Expression von plamidkodiertem MlcWT und Mlc 9 vermittelte eine starke Repression der Reportergenfusionen, bis zu 24 fach bei malt-lacz (siehe Abb. 14) und bis zu 112-fach bei ptsg-lacz (siehe Abb. 15). Mlc 18 nahm keinen Einfluss auf die Transkription der Mlcregulierten Gene. Die ß-Galaktosidaseaktivität bei Überproduktion dieser Variante entsprach der der Vektorkontrolle. Ebenfall keine Auswirkung auf die malt-lacz Transkription hatte eine weitere Mlc-Variante, Mlc110. Eine in frame Deletion führt bei dieser Variante zum Verlust der Aminosäuren von Mlc. Diese Mutation in Mlc entstand spontan bei Wachstum von E. coli unter Glukoselimitation im Chemostaten (103). Die Sequenz dieser Mlc-Mutante wurde amplifiziert und ebenfalls in einen Expressionsvektor kloniert. Für die C- terminal trunkierte Variante Mlc 18 sah man nach der Reinigung des Proteins im SDS-Gel eine definierte Proteinbande, die der Größe eines Monomers entsprachen. Es waren keine Abbauprodukte zu erkennen. Im Gegensatz dazu gelang es bislang nicht Mlc110 zu reinigen, da das Protein stets schon vor dem Zellaufschluss abgebaut wurde. Die fehlende Repressorfunktion von Mlc110 lässt sich daher mit dem schnellen Abbau des Proteins erklären (Daten nicht gezeigt). Eine kristallisierte Mlc-Variante (MlcH52) besitzt eine Mutation im HTH (Helix-turn-Helix) Motiv, einen Austausch des Arginin an Position 52 gegen Histidin (48, 139). Um zusätzliche Hinweise über die Zuverlässigkeit der Kristallstruktur zu erhalten, sollte überprüft werden, ob MlcH52 gleiche Charakteristika wie MlcWT besitzt. Im Zusammenhang mit der Kristallstruktur wurde eine Metallbindestelle identifiziert. Durch diese wird ein Zinkion gebunden. Das Motiv CYC (Cystein-Tyrosin-Cystein) befindet sich an Position

77 3. Ergebnisse 63 und wurde einmal verändert zu AYA (Alanin-Tyrosin-Alanin) oder zu SYS (Serin-Tyrosin- Serin). Wie zuvor wurden die Auswirkungen auf die Transkription einer ptsg-lacz-fusion gemessen. MlcH52 repremierte die Expression von ptsg-lacz in vergleichbarer Weise wie MlcWT. Im Vergleich zur Vektorkontrolle war die ß-Galaktosidaseaktivität bei MlcWT und MlcH52 um fach reduziert. Beide Varianten mit Mutation im Metallbindemotiv, Mlc_AYA und Mlc_SYS, bewirkten dagegen nur noch eine stark eingeschränkte Repression um den Faktor 2,7-2,9 (siehe Abb. 16). Abb. 14: Auswirkung von MlcWT, Mlc 9, Mlc 18 und Mlc110 auf die malt-lacz Expression. Stamm ET104, der eine Mutation in mlc, cyaa, crp* und eine transkriptionelle malt-lacz-fusion besitzt, wurde mit den Plasmiden psl104 (MlcWT), pmlc410 (Mlc 9), pmlc401 (Mlc 18), pmlc110 (Mlc110) und zur Kontrolle mit dem Vektor pgdr11 transformiert. Die crp*-mutation hat die Expression eines CAP-Proteins zur Folge, das unabhängig von camp aktiv ist. So kann der Effekt der Mlc-Überproduktion auf malt-lacz ohne Beeinflussung durch die Katabolitenrepression gemessen werden. Die Zellen waren in Minimalmedium mit 1% CAA gewachsen und je eine Hälfte der Ansätze wurde mit 50 µm IPTG induziert (schwarze Balken). Die ß- Galaktosidaseaktivität wird als spezifische Aktivität in U/mg Gesamtprotein angegeben. Gezeigt sind die Mittelwerte aus drei unabhängigen Messungen.

78 3. Ergebnisse 64 Abb. 15: Auswirkung von MlcWT, Mlc 9 und Mlc 18 auf die ptsg-lacz Expression. Stamm JM-G2, der eine Mutation in mlc und eine transkriptionelle ptsg-lacz-fusion besitzt, wurde mit den Plasmiden psl104 (Mlc WT), pmlc410 (Mlc 9 AS), pmlc401 (Mlc 18 AS) und zur Kontrolle mit dem Vektor pgdr11 transformiert. Die Zellen wurden in Minimalmedium mit 1% CAA inkubiert und je eine Hälfte der Ansätze wurde mit 50 µm IPTG induziert (schwarze Balken). Die ß-Galaktosidaseaktivität wird als spezifische Aktivität in U/mg Gesamtprotein angegeben. Gezeigt sind die Mittelwerte aus drei unabhängigen Messungen. Abb. 16: Auswirkung von MlcWT, MlcH52, Mlc_AYA und Mlc_SYS auf die ptsg-lacz Expression. Stamm JM-G2, der eine Mutation in mlc und eine transkriptionelle ptsg-lacz-fusion besitzt, wurde mit den Plasmiden pmlc_wt, pmlc_h52, pmlc_aya, pmlc_sys und zur Kontrolle mit dem Vektor pqe60 transformiert. Die Zellen wurden in Minimalmedium mit 1% CAA inkubiert. Die ß-Galaktosidaseaktivität wird als spezifische Aktivität in U/mg Gesamtprotein angegeben. Gezeigt sind die Mittelwerte aus zwei unabhängigen Messungen.

79 3. Ergebnisse 65 Bei der Aufnahme von externer Glukose ist PtsG überwiegend dephophoryliert (siehe Kap. 1.3 und 1.4). Ergänzend zu den Bindetests sollte gezeigt werden, in wie weit die Bindung der Mlc-Varianten an das durch Glukosetransport dephosphoryliertes PtsG zu einer Derepression der Mlc regulierten Gene führt. Geringe Mengen der plasmidkodierten Mlc-Varianten werden auch ohne zusätzliche Induktion durch IPTG expremiert (siehe Abb. 14 und 15). Um die Derepression der Reportergenfusion bei Wachstum auf Glukose zu untersuchen, wurde die mlc-transkription nicht mit IPTG induziert um die Mlc Mengen niedrig zu halten und es damit zu ermöglichen, dass Mlc komplett von der DNA abgezogen und an PtsG gebunden wurde. Bei den Zellen, die MlcWT oder Mlc 9 exprimierten, zeigte sich eine etwa 2,2-2,6 fach höhere ß-Galaktosidaseaktivität, wenn die Zellen auf Glukose gewachsen waren. Ansätze von Zellen mit Mlc 18 haben eine vergleichbare ß-Galaktosidaseaktivität wie jene von Zellen, die mit Vektor ohne Insert transformiert waren. Wobei zu bemerken ist, dass auch bei der Vektorkontrolle die ß-Galaktosidaseaktivität der auf Glukose gewachsenen Zellen um 1,5 fach erhöht ist. Diese ist aber bei Mlc WT oder Mlc 9 AS mit 2,2 2,6 fach stärker erhöht. Zellen, die MlcWT oder Mlc 9 exprimierten, bewirkten die Repression der Mlc abhängigen malt-lacz Fusion, welche durch Wachstum auf Glukose derepremiert wurde (siehe Abb. 17). Das Messen der ß-Galaktosidaseaktivität nach Wachstum auf Glukose gab einen Hinweis darauf, dass Varianten mit Mutation im Metallbindemotiv vermutlich nicht mehr oder nur noch eingeschränkt an PtsG gebunden werden, da die verbleibende Repression nicht weiter aufgehoben wird. Ein deutlicheres Ergebnis könnte in diesem Fall ein in vitro Bindetest zu PtsG liefern. Im Gegensatz dazu führt die durch Glukose herbeigeführte Derepression von MlcWT und MlcH52 zu einer um fach erhöhten ß-Galaktosidaseaktivität (siehe Abb. 18).

80 3. Ergebnisse 66 Abb. 17: Auswirkung von Wachstum auf Glukose auf die Derepression der malt-lacz Expression. Stamm ET104, transformiert mit den Plasmiden psl104 (MlcWT), pmlc410 (Mlc 9), pmlc401 (Mlc 18) und dem Vektor pgdr11 wurde auf Minimalmedium mit 1% CAA (graue Balken) und mit 0,5% CAA + 0,2% Glukose (schwarze Balken) angezogen. Die Expression von mlc wurde nicht zusätzlich durch IPTG induziert. Die ß-Galaktosidaseaktivität wird als spezifische Aktivität in U/mg Gesamtprotein angegeben. Gezeigt sind die Mittelwerte aus zwei unabhängigen Messungen. Abb. 18: Auswirkung von Wachstum auf Glukose auf die Derepression der ptsg-lacz Expression. Stamm JM-G2, transformiert mit den Plasmiden pmlc_wt, pmlc_h52, pmlc_aya, pmlc_sys und pqe60 wurde auf Minimalmedium mit 1% CAA (graue Balken) und mit 0,5% CAA + 0,2% Glukose (schwarze Balken) angezogen. Die Expression von mlc wurde nicht zusätzlich durch IPTG induziert. Die ß-Galaktosidaseaktivität wird als spezifische Aktivität in U/mg Gesamtprotein angegeben. Gezeigt sind die Mittelwerte aus zwei unabhängigen Messungen.

81 3. Ergebnisse Die DNA-Bindung der Mlc-Varianten mit C-terminaler Deletion Obwohl aus den Experimenten mit den Reportergenfusionen schon deutlich wird, dass Mlc 18 AS vermutlich nicht mehr an die Promotoren der Mlc-regulierten Gene binden kann, wurden noch EMSA (Electromobility shift assays) mit drei unterschiedlichen DNA- Fragmenten und den C-terminal deletierten Mlc-Varianten durchgeführt. Die DNA- Fragmente gingen aus einem SELEX-Experiment hervor (118), mit dem die Konsensussequenz eines Mlc bzw. eines NagC Operators bestimmt werden sollte. M26 (ptz- M26) enspricht einer idealen Mlc-Bindestelle, C9 (ptz-c9) einer NagC-Bindestelle und M120 (ptz-m120) einer Negativkontrolle. Die DNA-Fragmente wurden zusammen mit den MlcVarianten inkubiert und die Proben auf ein 1,5% Agarosegel aufgetragen. Zur Kontrolle wie weit ungebundene DNA in das Gel einläuft, wurde auch diese aufgetragen. Migriert ein DNA-Fragment weniger weit durch das Gel, hat es ein höheres Molekulargewicht, da es durch den Repressor gebunden wurde. Weder das DNA-Fragment C9 noch M120 wurde durch eine der Mlc-Varianten gebunden. Es gibt also keine unspezifische Bindung an die NagC-Bindestelle oder die Negativkontrolle. Für M26 zeigt sich eine Verzögerung der Bande für Ansätze, denen MlcWT und Mlc 9 zugegeben wurde. MlcWT und Mlc 9 binden an die DNA, nicht aber Mlc 18 (siehe Abb. 19 a). Da die DNA im ersten Versuch nicht komplett geshiftet war, wurde das Experiment wiederholt. Diesmal wurden die DNA-Fragmente radioaktiv markiert. Auch hier zeigt sich: MlcWT und Mlc 9 binden an die DNA nicht aber Mlc 18 (siehe Abb. 19 b).

82 3. Ergebnisse 68 Abb. 19: Electromobility Shift Assay. Bindung von MlcWT und den Mlc-Varianten (Mlc410=Mlc 9 und Mlc401=Mlc 18) an das Mlc-Operator- Fragment M26 und die Negativkontrollen M120 und C9 a) im 1,5 % Agarosegel mit Ethidiumbromidfärbung der DNA und b) im nativen 8 % PAA-Gel mit 32 P-markierter DNA. Bindet Protein an DNA entsteht ein Molekül mit größeren Molekulargewicht, welches nicht so weit in das Gel einlaufen kann und als Shift der DNA-Bande sichtbar wird.

83 3. Ergebnisse Bestimmen der Quartiärstruktur von Wildtyp Mlc und den Mlc- Varianten Mlc bindet über das N-terminale HTH-Motiv an eine palindrome DNA-Bindesequenz. Dies ist nur möglich, wenn Mlc zumindest ein Dimer aus zwei Mlc Monomeren bildet, wobei jedes an eine Halbseite des Operators bindet (110). Die Bestimmung der Quartiärstruktur unter nativen Bedingungen ergab, dass MlcWT und die 9 AS Variante Tetramere bilden. Die 18 AS Variante von Mlc eluiert mit der Größe, die einem Dimer entspricht, von der Säule. MlcH52, wurde unter verschiedenen Pufferbedingungen getestet. Auch für diese Variante konnte gezeigt werden, dass unter den meisten Pufferbedingungen eine Tetramerisierung stattfindet. In einem Puffer (0,8 M MgSO 4 ) wie er für die Kristallisation von MlcH52 verwendet wurde (48), zeigen sich jedoch verschiedene Oligomerisierungszustände von MlcH52. Im Vergleich zu den Eichproteinen eluiert ein Teil des Proteins mit der Größe eines Tetramers, Trimers oder Dimers, während der Hauptteil mit der Größe eines Monomers eluiert. Zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcWT und den Mlc-Varianten, wurde das Molekulargewicht von Mlc mittels Gelfiltration unter nativen Bedingungen, wie in Kapitel beschrieben, bestimmt. Aus dem Elutionsvolumen (siehe Abb. 20) wurde die Diffusionskonstante K av verschiedener Eichproteine ermittelt und gegen den Logarithmus der Molekulargewichte aufgetragen (siehe Abb. 21). Aus der damit erhaltenen Eichgerade und der für die Mlc-Varianten ermittelten K av wurde das Molekulargewicht der Mlc-Varianten abgeschätzt (siehe Tab. 11). Das Monomer des gereinigten Mlc mit N-terminalem His-tag hat ein vorhergesagtes und mittels SDS-PAGE bestätigtes Molekulargewicht von 46 kda. Geht man von maximal einem Tetramer aus hätte dieses ein Molekulargewicht von 184 kda. Für Mlc WT ergab sich aus der Gelfiltration ein Molekulargewicht von 183 kda und für Mlc 9 eines von 173 kda, was in beiden Fällen für ein Tetramer aus vier Mlc Monomeren spricht. Mlc 18 eluierte als ein Protein mit dem Molekulargewicht von 94 kda, was in etwa der Größe eines Dimers entspricht (siehe Abb. 20 und Tab. 11). Dass Mlc unter nativen Bedingungen als Tetramer vorliegt, war auch schon von Nam et. al. (2001) (98) bestätigt worden.

84 3. Ergebnisse 70

85 3. Ergebnisse 71 Abb. 20: Elutionsprofile zur Bestimmung der Quartiärstruktur der Mlc-Varianten. Gezeigt sind die Elutionsprofile (von oben nach unten) von Bluedextran2000, der Eichproteine Catalase, Albumin und ChymotrypsinogenA, der Eichproteine Aldolase und Ovalbumin, von MlcWT, Mlc 9 und Mlc 18. Die Proteinkonzentration wurde durch Messen der Arbsorption bei 280 nm bestimmt und ist in mau (Milli-Absorption-Units/ Y-Achse) dargestellt. Die X-Achse zeigt das Elutionsvolumen in ml ab der Zugabe des jeweiligen Proteins (Markierung Inject). Das für die Proteine ermittelte Elutionsvolumen ist in der Abbildung angegeben. Abb. 21: Bestimmen des Molekulargewichtes von MlcWT und Mlc 9, Mlc 18. Die Gelfiltrationssäule Superdex 200 HR10/30 (Pharmacia) wurde mit Calibration Kit Proteinen mit einen Molekulargewicht von kda geeicht (Vierecke/siehe Abb. 20 und Tab.11). Die aus dem Elutionsvolumen ermittelten K av -Werte wurden gegen den Logarithmus der Molekulargewichte aufgetragen. Die Molekulargewichte der Mlc-Varianten (Kreise) wurden mit Hilfe der K av -Werte und der Eichgerade ermittelt. Die entsprechenden Werte sind in Tab. 11 aufgeführt. Protein eingesetzte Menge Elutionsvolumen K av Molekulargewicht [mg/ml] [kda] Catalse 5 10,673 0, Aldolase 2 11,949 0, Albumin 7 12,5 0, Ovalbumin 7 13,39 0, Chymotrypsinogen A 3 15,962 0, MlcWT 2,56 10,9 0, ,97 Mlc ,03 0, ,88 Mlc 18 2,3 12,4 0, ,91 Tab. 11: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcWT, Mlc 9 und Mlc 18

86 3. Ergebnisse 72 MlcH52 ist die Mlc-Variante, die kristallisiert werden konnte. In einer Einheitszelle des Kristalls befinden sich zwei Mlc Dimere. Um zu klären, ob dieser Widerspruch, Dimer im Kristall und Tetramer in Lösung, durch die Mutation im HTH-Motiv dieser Variante oder durch den bei der Kristallisation verwendeten Puffer zustande kommt, wurde das Molekulargewicht von MlcH52 mit Hilfe der Gelfiltration mit unterschiedlichen Puffern untersucht. Zunächst wurde es unter nativen Bedingungen in Tris-Puffer wie MlcWT zuvor untersucht. Für MlcH52, dessen Monomer ein Molekulargewicht von 44 kda hat, lies sich ein Molekulargewicht von kda ermitteln und liegt ebenfalls als Tetramer vor (siehe Abb. 22 und Tab. 12). Gereinigtes MlcH52 wurde von K. Gerber (Uni-Konstanz) bereitgestellt. Abb. 22: Elutionsprofile zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcH52 in Tris- Puffer. Gezeigt sind die erste und zweite Größenbestimmung von MlcH52 unter nativen Bedingungen (Puffer: 50 mm Tris/HCl ph 7,5; 300 mm NaCl). Die Proteinkonzentration wurde durch Messen der Arbsorption bei 280 nm bestimmt und ist in mau (Milli-Absorption-Units/ Y-Achse) dargestellt. Die X-Achse zeigt das Elutionsvolumen in ml ab der Zugabe des jeweiligen Proteins (Markierung Inject). Das für die Proteine ermittelte Elutionsvolumen und Molekulargewicht ist in der Abbildung angegeben.

87 3. Ergebnisse 73 Protein Elutionsvolumen [ml] Thyroglobolin 9,68 0, Ferritin 11,08 0, Aldolase 12,92 0, Albumin 14,24 0, Ovalbumin 15,15 0, MlcH52 12,35 0, ,88 MlcH52 12,39 0, ,84 Tab. 12: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcH52 in Trispuffer K av Molekulargewicht [kda] Das Experiment wurde wiederholt mit selbigem Puffer, der jedoch nun 10 mm ß- Mercaptoethanol enthielt. Damit wurden reduzierende Bedingungen geschaffen wie man sie im Zellinneren vorfindet. Das ermittelte Molekulargewicht von 203 kda entsprach noch einem Tetramer. An der Oligomerisierung scheinen keine Cysteine beteiligt zu sein, da diese unter den Pufferbedingungen reduziert werden würden (siehe Abb. 23 und Tab. 13). Abb. 23: Elutionsprofil zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcH52 in Tris- Puffer mit ß-Mercaptoethanol. Gezeigt ist die Größenbestimmung von MlcH52 unter reduzierenden Bedingungen (Puffer: 50 mm Tris/HCl ph 7,5; 300 mm NaCl, 10 mm ß-Mercaptoethanol). Die Proteinkonzentration wurde durch Messen der Arbsorption bei 280 nm bestimmt und ist in mau (Milli-Absorption-Units/ Y-Achse) dargestellt. Die X-Achse zeigt das Elutionsvolumen in ml ab der Zugabe des jeweiligen Proteins (Markierung Inject). Das ermittelte Elutionsvolumen und Molekulargewicht ist in der Abbildung angegeben.

88 3. Ergebnisse 74 Protein Elutionsvolumen [ml] Ferritin 11,24 0, K av Molekulargewicht [kda] Aldolase 12,82 0, Albumin 14,16 0, MlcH52 12,44 0, ,6 Tab. 13: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcH52 intrispuffer mit ß- Mercaptoethanol Als nächstes wurde das Laufverhalten von MlcH52 in dem Glycinpuffer getestet, in dem das Protein vor der Kristallisation gereinigt wurde. Das ermittelte Molekulargewicht von 246 kda liegt zwischen einem Penta- und einem Hexamer (siehe Abb. 24 und Tab. 14). Abb. 24: Elutionsprofil zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcH52 in Glycinpuffer. Gezeigt ist die Größenbestimmung von MlcH52 in Glycinpuffer (10 mm Glycin/NaOH, 50 mm NaCl; ph 9,5). Die Proteinkonzentration wurde durch Messen der Arbsorption bei 280 nm bestimmt und ist in mau (Milli- Absorption-Units/ Y-Achse) dargestellt. Die X-Achse zeigt das Elutionsvolumen in ml ab der Zugabe des jeweiligen Proteins (Markierung Inject). Das ermittelte Elutionsvolumen und Molekulargewicht ist in der Abbildung angegeben.

89 3. Ergebnisse 75 Protein Elutionsvolumen [ml] Ferritin 10,68 0, Aldolase 12,82 0, Albumin 14,41 0, MlcH52 11,87 0, ,7 Tab. 14: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcH52 in Glycinpuffer K av Molekulargewicht [kda] Zusätzlich wurde das Laufverhalten im Kristalisationspuffer überprüft. Im Elutionsprofil war eine Vielzahl an Peaks zu sehen, die zum Teil ineinander übergingen (siehe Abb. 25 und Tab. 15). Der zuerst erscheinende Peak bei einem Elutionsvolumen von 12,55 ml entspricht, verglichen mit den Eichproteinen, einem Mlc Tetramer mit einer Größe von 201 kda, der größte Peak bei 15,74 ml einem Monomer der Größe von 46 kda. Die Peaks mit einem Elutionsvolumen größer als 15,74 ml würden, im Vergleich mit den Eichproteinen, Proteine kleiner als ein Monomer ergeben (siehe Abb. 26 und Tab. 15). Trägt man jedoch Aliquots aus den gesammelten Fraktionen dieser Peaks auf ein SDS-PAA-Gel auf, erhält man stets ein Mlc Monomer mit einer Größe von 44 kda. Es sind keine kleineren Banden zu erkennen, die auf einen Abbau des Proteins hinweisen würden (siehe Abb. 27). Eine möglich Erklärung wäre, dass Mlc in diesem Puffer leicht als Komplex ausfällt, wenn es konzentriert wird. Letzteres geschieht zunächst beim Laden des Proteins auf die Säule, und vermutlich kann deshalb nicht alles Protein, das geladen wurde, gleichzeitig in die Säule einlaufen. Dieses wurde dann nach und nach freigesetzt, so dass sich im Grunde verschiedene Elutionsprofile überlagern. Deshalb ist es fraglich, ob man bei dem Lauf in diesem Puffer wirklich eine Mischung unterschiedlicher Oligomere erhalten hat.

90 3. Ergebnisse 76 Abb. 25: Elutionsprofil zur Bestimmung der Quartiärstruktur von MlcH52 in Kristallisationspuffer. Gezeigt ist die Größenbestimmung von MlcH52 in Kristallisationspuffer (0,8 M MgSO 4 ; 50 mm MES; 25 mm NaCl; ph 6,3). Die Proteinkonzentration wurde durch Messen der Arbsorption bei 280 nm bestimmt und ist in mau (Milli-Absorption-Units/ Y-Achse) dargestellt. Die X-Achse zeigt das Elutionsvolumen in ml ab der Zugabe des jeweiligen Proteins (Markierung Inject). Die ermittelte Elutionsvolumina und Molekulargewichte sind teilweise ist in der Abbildung angegeben (vgl. Tab. 15). Abb. 26: Bestimmen des Molekulargewichtes von MlcH52 in Kristallisationspuffer. Die Gelfiltrationssäule Superdex 200 HR10/30 (Pharmacia) wurde mit Calibration Kit Proteinen mit einen Molekulargewicht von kda geeicht (Vierecke/siehe Tab. 15). Die für die Eichproteine berechneten K av - Werte wurden gegen den Logarithmus der Molekulargewichte aufgetragen. Die Molekulargewichte von MlcH52 (Kreise) wurden mit Hilfe der K av -Werte und der Eichgerade ermittelt. Gezeigt sind die Werte für einige beispielhaft herausgegriffene Peaks (vgl. Abb. 25).

91 3. Ergebnisse 77 Protein Elutionsvolumen[ml] K av Molekulargewicht [kda] Thyroglobulin 10,17 0, Ferritin 10,46 0, Aldolase 13,6 0, Albumin 14,64 0, Ovalbumin 15,83 0, Peak 1 (MlcH52) 12,55 0, ,2 - Tetramer Peak 2 (MlcH52) 12,66 0, ,2 Peak 3 (MlcH52) 12,9 0, ,2 Peak 4 (MlcH52) 13,42 0, ,7 - Trimer Peak 5 (MlcH52) 15,6 0, ,3 Peak 6 (MlcH52) 15,74 0, ,2 - Monomer Peak 7 (MlcH52) 17,74 0, ,4 Peak 8 (MlcH52) 18,59 0, ,4 Peak 9 (MlcH52) 19,54 0,7426 8,02 Peak 10 (MlcH52) 20,26 0,7887 5,75 Tab. 15: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von MlcH52 in Kristallisationspuffer. Abb. 27: Analyse augewählter Peakfraktionen bei der Gelfiltration zur Bestimmung des Molekulargewichtes von MlcH52. Analyse der Peakfraktionen, die zur Berechnung der Mlc-Molekulargewichte herangezogen wurden. Die dazugehörigen Chromatogramme sind in Abb. 22 (Puffer1/Tris), in Abb. 23 (Puffer2/Tris+ß-Mercaptoethanol), in Abb. 24 (Puffer3/Glycin) und in Abb. 25 (Puffer4/0,8 M MgSO 4 /Kristallisation) gezeigt. Alle ausgewählten Peaks enthalten Mlc, mit einer Größe von 44 kda im 12% SDS-PAA-Gel.

92 3. Ergebnisse Koelution von Mlc WT mit der löslichen B-Domäne von PtsG Die lösliche B-Domäne von PtsG reicht aus, um Mlc zu binden (98). Dann sollte es auch möglich sein, den Komplex aus Mlc und EIIB Glc zu reinigen, einerseits für die mögliche Kristallisation des Komplexes, andererseits als zusätzlichen Beweis, dass Mlc wirklich effektiv durch die IIB-Domäne gebunden werden kann, auch wenn diese nicht membranassoziiert ist. Wie in Kapitel beschrieben, wurde die gereinigte IIB-Domäne von PtsG, versehen mit einem C-terminalen His-tag, an eine HiTrap Chelating Säule (Ni 2+ -Affinität Chromatographie) gekoppelt. Die Säule wurde dann langsam mit Zellextrakten, die überproduziertes Mlc ohne His-tag enthielten, beladen. EIIB Glc bindet über den His-tag an die Säule. Mlc bleibt nur an die Säule gebunden, wenn es an EIIB Glc bindet. Die ungebundenen Proteine wurden ausgewaschen und die an die Säule gebundenen Proteine mit einem steigenden Imidazolgradienten eluiert. Ausgewählte Fraktionen (siehe Abb. 28) wurden mittels SDS-PAGE analysiert (siehe Abb. 29). Die Aliquots der letzten Waschschritte vor der Elution enthalten kein Mlc oder IIB (siehe Spur 9 in Abb. 29/Fraktion 45 in Abb.28). Beide Proteine sind an die Säule gebunden und eluieren erst bei steigender Imidazolkonzentration. Man erhält Elutionsfraktionen mit drei oder zwei dominanten Proteinen. Bei der, relativ zu den anderen, höher im Gel laufenden Bande handelt es sich um Mlc mit einem Molekulargewicht von 44 kda, bei der am weitesten in das Gel eingelaufenen Bande um IIB (His 6x) mit einem Molekulargewicht von 12 kda (Spur in Abb. 29). Bei der mittleren Bande könnte es sich um EIIA Glc handeln, welches ebenfalls an IIB binden kann und das entsprechende Molekulargewicht von etwa 20 kda besitzt (Spur 20 und in Abb. 29). Die Fraktionen enthalten nur Mlc und IIB(His6x), welche erst bei erhöhter Imidazolkonzentration gemeinsam von der Säule eluierten. Das bedeutet, dass Mlc und IIB(His6x) in diesen Fraktionen aneinander gebunden hatte.

93 3. Ergebnisse 79 Abb. 28: Elutionsprofil der Koelution von Mlc und IIB Glc (His6x). Das gesamte Elutionsprofil der Koelution von Mlc und IIB(His6x) wird in der oberen Bildhälfte und ein Ausschnitt (Elutionsfraktionen) aus diesem wird in der unteren Bildhälfte gezeigt. Die Proteinkonzentration (blaue Kurve) wurde durch Messen der Arbsorption bei 280 nm bestimmt und ist in mau (Milli-Absorption- Units/ linke Y-Achse) dargestellt. Die X-Achse zeigt das Elutionsvolumen in ml. Die Konzentration an Puffer B (in %: Elutionspuffer mit 500 mm Imidazol) im Gemisch mit dem Laufpuffer (mit 10 mm Imidazol) ist grün dargestellt (rechte Y-Achse). Abb. 29: Koelution von Mlc und IIB Glc (His6x). Wie in Kapitel beschrieben, wurde ein Komplex aus EIIB Glc mit C-terminalem His-tag und Mlc ohne Histag von einer HiTrap Chelating Säule koeluiert. EIIB wurde mit Stamm IT1168, transformiert mit Plasmid pjfbh, überproduziert. Das dazugehörige Elutionsprofil ist in Abb. 28 zu sehen. Ausgewählte Fraktionen wurden auf ein 12% SDS-PAA-Gel aufgetragen und die Gele nach dem Lauf mit Coomassie gefärbt. Spur 1-9: Auswaschen von ungebundenen Protein ab Spur 10: Elution gebundener Proteine mit steigenden Imidazolgradienten. Spur 22-25: gemeinsame Elution von Mlc und EIIB Glc ;

94 3. Ergebnisse Überblick zu den Untersuchungen an den Mlc- und der EIIB Glc - Varianten Kapitel 3.1 zusammengefasst bedeutet, dass Mlc an membrangebundenes PtsG bindet (3.1.2). Die lösliche IIB-Domäne von PtsG ist ausreichend um Mlc zu binden (3.1.3 und 3.1.7). Die Derepression der Mlc kontrollierten Gene und damit die Inaktivierung von Mlc erfolgt nur, wenn die IIB-Domäne durch einen Membrananker membrangebunden ist (3.1.3). Der Membrananker muss dabei keine Ähnlichkeit zu PtsG aufweisen. Arg424 eine der Aminosäuren, die in einer exponierten Region um die Phosphorylierungstelle (Cys421) von PtsG zu finden ist, scheint für die Mlc-Bindung essenziell zu sein (3.1.3). Das C-terminal deletierte Mlc 9 bindet an PtsG (3.1.2), repremiert die Mlc regulierten Gene (3.1.4 und 3.1.5) und bildet wie MlcWT ein Tetramer (3.1.6), während Mlc 18 weder an PtsG (3.1.2), noch an DNA bindet und somit die Mlc regulierten Gene nicht mehr repremiert (3.1.4 und 3.1.5). Mlc 18 bildet im Gegensatz zu den anderen Varianten nur noch ein Dimer (3.1.6). Der C-Terminus von Mlc bewirkt direkt die Tetramerisierung oder wird für den Erhalt der Gesamtstruktur benötigt, welche dann die Tetramerisierung ermöglicht. Die Bildung des Tetramers ist eine Voraussetzung für die Bindung an die DNA und an PtsG. Die Mlc-Variante MlcH52, mit einem Aminosäureaustausch im HTH-Motiv, zeigt zu Mlc WT identische Eigenschaften (3.1.4 und 3.1.6). Die Varianten Mlc_AYA und Mlc_SYS, mit Veränderungen in der Metallbindestelle, repremieren die Mlc regulierten Gene nur noch stark eingeschränkt (3.1.4). Mlc110, die Variante mit einer in frame Deletion, die zum Verlust von drei Aminosäuren führt, zeigt keine Repression und lässt sich nicht als intaktes Protein reinigen (3.1.4).

95 3. Ergebnisse Bindung zwischen Mlc und YeeI Mit diesen Experimenten konnte gezeigt werden, dass Mlc nicht nur durch dephosphoryliertes PtsG, sondern auch durch das vermutlich lösliche Protein YeeI gebunden wird. An PtsG gebundenes Mlc konnte nicht, auch nicht durch einen Überschuss an YeeI, von PtsG abtitriert werden. Unter nativen Pufferbedingungen liegt YeeI als Dimer vor Bestimmen der Quartiärstruktur von YeeI Dies wurde, wie bereits unter Kapitel und Kapitel beschrieben, durch Gelfiltration unter nativen Bedingungen untersucht. Für die Kalibrierung der Säule wurden die in Tabelle 16 genannten Eichproteine verwendet. Die K av Werte wurden, wie in Kapitel beschrieben, berechnet und gegen den Logaritmus der Molekulargewichte in ein Diagramm eingetragen (siehe Abb. 31). Mittels dieser Eichgerade und den für YeeI ermittelten K av Werten (Tab. 16), wurde das Molekulargewicht für YeeI bestimmt. Die ermittelten Molekulargewichte von kda sind etwas kleiner als zweimal das aus der Primärstruktur von YeeI abgeleitete Molekulargewicht von 31 kda, weisen aber dennoch auf die Bildung eines Dimers hin (siehe Abb. 30/31 und Tab. 16). Protein Elutionsvolumen[ml] K av Molekulargewicht [kda] Aldolase 11,99 0, Albumin 13,24 0, Ovalbumin 14,5 0, Chymotrypsinogen A 15,9 0, YeeI - Elution 1 14,17 0,405 51,55 YeeI - Elution 2 14,19 0,407 50,8 Tab. 16: Parameter zur Berechnung des Molekulargewichtes von YeeI.

96 3. Ergebnisse 82 Abb. 30: Elutionsprofile zur Bestimmung der Quartiärstruktur von YeeI. Gezeigt sind die Elutionsprofile (von oben nach unten) der Eichproteine Aldolase, Albumin, Ovalbumin und ChymotrypsinogenA, und von zwei verschiedenen Läufen mit gereinigtem YeeI. Die Proteinkonzentration wurde durch Messen der Arbsorption bei 280 nm bestimmt und ist in mau (Milli-Absorption-Units/ Y-Achse) dargestellt. Die X-Achse zeigt das Elutionsvolumen in ml ab der Zugabe des jeweiligen Proteins (Markierung Inject). Das für die Proteine ermittelte Elutionsvolumen und Molekulargewicht ist in der Abbildung angegeben.

97 3. Ergebnisse 83 Abb. 31: Bestimmen des Molekulargewichtes von YeeI. Die Gelfiltrationssäule Superdex 200 HR10/30 (Pharmacia) wurde mit Calibration Kit Proteinen mit einen Molekulargewicht von kda geeicht (Vierecke). Die aus dem Elutionsvolumen berechneten K av -Werte wurden gegen den Logarithmus der Molekulargewichte aufgetragen. Die Molekulargewichte von YeeI (überlagerte Kreise) wurden mit Hilfe der K av -Werte und der Eichgerade ermittelt. Bezogen auf das Elutionsprofil siehe Abb Oberflächenresonanzspektroskopie Die Durchführung der Bindetests zwischen Mlc und YeeI (siehe Kap ) erfolgte unter Anleitung von Kerstin Mahr (FAU Erlangen-Nünberg) und in Kooperation mit Ann-Katrin Becker (Universität Osnabrück). Die Kontrollproteine Bld (Streptomyces coelicolor), CcpA (Lactobacillus cassei) und HPr (Streptomyces coelicolor) wurden von Kerstin Mahr zur Verfügung gestellt, YeeI (E. coli) von Ann-Katrin Becker. Dargestellt sind die Versuche mit gereinigtem Protein (für Mlc siehe Kap ). Im ersten Experiment wurde Mlc mit C-terminalen His-tag in Flusszelle 2 (F2) an den Chip gekoppelt und als Kontrolle Bld aus Streptomyces coelicolor in Flusszelle 1 (F1). YeeI mit N- terminalen His-tag wurde mit einer Flussrate von 20 µl/min über den Chip geleitet. Die Differenz zwischen F2 und F1 betrug 230 RU (Responseunits) (Abb.32). Die in F2 höhere Massenzunahme als in F1 gibt einen Hinweis auf eine Bindung zwischen Mlc und YeeI. Der Chip wurde durch Zugabe von 0,5 M NaCl regeneriert. Als weitere Kontrolle, ob die Bindung von YeeI an Mlc spezifisch erfolgte, wurde Bld aus Streptomyces coelicolor und CcpA aus Lactobacillus cassei durch die Flusszellen geleitet. Für diese Proteine wurde keine Bindung an Mlc nachgewiesen.

98 3. Ergebnisse 84 Abb. 32: Oberflächenresonanzspektroskopie; Bindung von an den Chip gebundenen Mlc mit YeeI. Mlc WT wurde an einen CM5 Sensorchip gebunden (siehe Kap ) und YeeI darübergeleitet. Zu sehen ist das Differenzsensorgramm der gemessenen Responseunits (RU) in Flusszelle2 Flusszelle1. Gezeigt ist die Veränderung der Responseunits (y-achse) bezogen auf die Zeitspanne, zu der der Analyt (YeeI) zugegeben wurde (min/x-achse). Die Differenz der RU in F2-F1 steht für die Massenzunahme durch an Mlc gebundenes YeeI. Diese beträgt 230 RU. Letzteres weist auf eine Bindung zwischen beiden Proteinen hin. In einem zweiten Experiment wurde YeeI in F2 an den Chip gekoppelt und in F1 zur Kontrolle CcpA aus Lactobacillus cassei. Danach wurde in drei aufeinanderfolgenden Schritten je 20 µl einer 50 nm Lösung von MlcWT mit N-terminalen His-tag, Mlc 9 und Mlc 18 mit N-terminalen His-tag als Analyt durch die Flusszellen geleitet. Zwischen den Schritten wurde der Chip mit 0,5 M NaCl regeneriert. Die Flussrate betrug auch hier 10 µl/min. Die Differenz der Massenzunahme (F2-F1) betrug für MlcWT 2490 RU, für Mlc RU und für Mlc 18 0 RU. MlcWT bindet an YeeI, die Bindung von Mlc 9 an YeeI ist stark reduziert und Mlc 18 ist nicht mehr fähig an YeeI zu binden (siehe Abb. 33). Als zusätzliche Kontrollen wurden Bld und Hpr aus Streptomyces coelicolor durch die Flusszellen geleitet. Damit konnte keine unspezifische Bindung an YeeI dedektiert werden.

99 3. Ergebnisse 85 Abb. 33: Bindung der Mlc-Varianten an chipgebundenes YeeI. YeeI (30 µl von 0,2 mg/ml Protein) wurde in Flusszelle 2 gebunden, CcpA (Lactobacillus cassei) (10 µl von 0,13 mg/ml Protein) in Flusszelle1. Dargestellt ist die Veränderung der Responseunits (y-achse) bezogen auf die Zeitspanne, zu der der Analyt (Mlc-Varianten/je 20 µl einer 50 nm Lösung) zugegeben wurde (min/x-achse). Die Differenz der Massenzunahme in Flusszelle 2 und 1 (F2-F1) beträgt für MlcWT 2490 RU, für Mlc RU und für Mlc 18 0 RU Beeinflußt YeeI die Bindung von Mlc an PtsG? Um diese Frage zu klären, wurden, wie zuvor beschrieben (Kap und ), Bindetests zwischen mit PtsG angereicherten Membranvesikeln und gereinigtem Mlc durchgeführt. Zu diesen Ansätzen wurde, während der Phase der Inkubation von Mlc mit den PtsG-Membranen, gereinigtes YeeI in unterschiedlichen Konzentrationen gegeben. Die nachfolgenden Zentrifugationsschritte wurden wie bei den Bindetests zuvor durchgeführt. Die Konzentration von PtsG in den Membranen lässt sich nicht leicht bestimmen. Deshalb wurden die eingesetzten Mengen der Monomere der gereinigten Proteine, Mlc und YeeI miteinander verglichen. Bedenkt man die Größe eines Monomers von MlcWT mit N-terminalen His-tag (= 46,263 kda) und die Konzentration der Proteinreinigung (= 0,75 µg/µl) so hat man 16,2 µmol Mlc in 1 µl Lösung. Für 16,2 µmol YeeI mit N-terminalen His-tag ( 31 kda) benötigt

100 3. Ergebnisse 86 man 0,42 µl der Reinigung mit einer Konzentration von 1,2 µg/µl. Es wurde stets 1 µl Mlc in den Tests eingesetzt. Auf diese Art und Weise wurden Mlc und YeeI in den verschiedenen Ansätzen bis hin zu einem 72-fachen Überschuss von YeeI über Mlc zugegeben. Betrachtet man Mlc als Tetramer und YeeI als Dimer, so hätte man einen 141- fachen Überschuss an YeeI. In keinem dieser Ansätze wurde die Bindung von Mlc an PtsG beeinträchtigt. Kein Mlc ist in der Überstandfraktion zu finden, wo es sein müsste, falls es an das ebenfalls lösliche YeeI gebunden hätte bzw. wenn YeeI die Bindung von Mlc an PtsG ansonsten gemindert hätte (siehe Abb. 34). Abb. 34: Membranbindetests mit Mlc, YeeI und mit PtsG angereicherten Membranvesikeln. Westernblot mit Antikörpern gegen Mlc. Membranen für die Bindetests wurden aus Stamm IT1168 (ptsg::kan) transformiert mit ptsg11 (EIICB Glc ) präpariert. Für die Membranpräparation wurde ein Volumen an Zellextrakt verwendet, der 2 mg Protein enthielt. P steht für Pelletfraktion, die Membranen und an die Membran gebundene Proteine enthält. S steht für Überstand (Supernatant), der die löslichen Proteine enthält. 19,2 µg (16 µl), 24 µg (20 µl) und 36 µg (1170 µmol - 30 µl) YeeI wurde zugegeben. Es wurde 16,2 µmol Mlc (0,75 µg/1µl) eingesetzt. Im Bild sind als Beispiel für alle durchgeführten Bindetests, die mit den höchsten YeeI Konzentrationen gezeigt. std.: Precision Plus Protein standard (All blue/biorad);

101 3. Ergebnisse Einfluß von Zuckerphosphaten auf die Interaktion zwischen EIIA Glc und der Adenylatcyclase Der camp/cap Komplex ist der positive Regulator aller bekannten durch Mlc regulierten Gene. Nicht nur die Aufnahme von Glukose, sondern auch die Aufnahme und Verwertung von Nicht-PTS-Substraten bewirkt einen niedrigen camp Spiegel in der Bakterienzelle. Die aus den Substraten entstehenden Zuckerphosphate nehmen Einfluss auf die Interaktion zwischen der Adenylatcyclase (cyaa) und EIIA Glc (crr). Die Aktivierung der Adenylatcyclase unterbleibt (siehe Kap ). Zunächst sollte ein Test entwickelt werden, mit dessen Hilfe die Einflussnahme der Zuckerphosphate gezeigt werden könnte. Dafür sollte in einem ersten Schritt geklärt werden, ob eine direkte Protein-Protein-Interaktion zwischen EIIA Glc und der Adenylatcyclase besteht, und in einem zweiten Schritt, ob diese Interaktion durch die Zugabe von Zuckerphosphaten unterbunden werden kann. Die Protein-Protein-Interaktion zwischen EIIA Glc und der Adenylatcyclase konnte gezeigt werden. Sie erfolgte unabhängig davon, ob die phosphorylierte und die dephosphorylierte Form von EIIA Glc zusammen vorlagen, oder ob ausschließlich die dephosphorylierte Form zugegeben wurde. Eine Bindung konnte auch nachgewiesen werden, wenn die katalytische Domäne der Adenylatcyclase als separates Polypeptid exprimiert wurde. Die Zugabe von Zuckerphosphaten zu dem in vitro Bindetest hatte keinen Einfluss auf die Bindung zwischen den beiden Proteinen Nachweis der Interaktion zwischen EIIA Glc und der Adenylatcyclase Es gibt unterschiedliche Informationen über die Löslichkeit der Adenylatcyclase und die Möglichkeit, das Protein unter nativen Bedingungen zu reinigen. Im Gegensatz zu früheren Behauptungen (134) scheint nur ein sehr geringer Prozentsatz der Adenylatcyclase membranassoziiert zu sein, wobei nicht geklärt ist wie der Kontakt zu der Cytoplasmamembran zustande kommt (170). Da durch die Überproduktion von plasmidkodierter Adenylatcyclase auch die Menge an Protein erhöht sein dürfte, die membranassoziiert ist, wurde versucht, die Bindung zu EIIA Glc

102 3. Ergebnisse 88 in Membranbindungstests, vergleichbar zu denen mit Mlc und PtsG, zu untersuchen (siehe Kap und ). Die Überproduktion der Adenylatcyclase wurde getestet, indem während des Wachstums der Bakterien 1 ml Proben aus der Kultur entnommen und mittels SDS-PAGE analysiert wurden (siehe Abb. 35). Spezifische Antikörper für den Nachweis durch einen Westernblot waren nicht verfügbar. Abb. 35: Überproduktion der Adenylatcyclase (CyaA). Überproduktion der Adenylatcyclase erfolgte mit Stamm SA14, transformiert mit psa8. Die Adenylatcyclase wurde hier mit der Shine Dalgarno Sequenz und dem Startcodon (TTG) von cyaa kloniert. Die Expression ist durch Arabinose induzierbar Die Induktionskontrollen (1 ml Probe der Bakterienkultur) wurden vor (v I) und 5 h nach (n I) der Induktion genommen. Das Pellet von 1ml Bakterienkultur wurde mit 2xPAP (Proteinauftragepuffer) auf eine OD=13,5 eingestellt und je 10 µl auf das Gel aufgetragen. Eine Bande bei etwa 94 kda ist leicht verstärkt. Dies würde in etwa dem kalkulierten Molekulargewicht der Adenylatcyclase entsprechen. Std.: LMW (low molecular weight) Standard, Pharmacia. Da EIIA Glc auch an PtsG binden kann, wurden die Membranen grundsätzlich von Stämmen präpariert, bei denen ptsg deletiert war. Die Bindung von EIIA Glc an solche Membranen wurde verglichen, die, aufgrund einer Mutation in cyaa, keine Adenylatcyclase exprimierten (Cya - ) mit denen, die die Adenylatcyclase plasmidkodiert überexprimierten (Cya + ).

103 3. Ergebnisse 89 Die in Abbildung 36 a gezeigten Bindetest mit gereinigtem EIIA Glc wurden wie in Kapitel beschrieben durchgeführt. Dass EIIA Glc nur in den Membranpellets (P2) der Cya + Ansätze erhalten blieb, zeigt deutlich, dass EIIA Glc an die membranassoziierte Adenylatcyclase gebunden hatte. Um zu sehen, ob EIIA Glc unter den Versuchsbedingungen Komplexe bildet und ausfällt bzw. deshalb abzentrifugiert wird, wurde gereinigtes EIIA Glc, ohne die Zugabe von Membranen, wie die Bindetests behandelt. Die Membranfraktionen (Pellet1/P1) des ersten Zentrifugationsschrittes nach der Inkubation mit EIIA Glc enthielten sowohl im Cya - als auch im Cya + Ansatz EIIA Glc. In Pellet 1 der Kontrolle ohne Membranen war kein EIIA Glc bzw. eine kaum detektierbare Bande zu sehen. In Überstand 1 (S1) aller Ansätze war ungebundenes EIIA Glc vorhanden. Das Membranpellet 1 (P1) wurde nochmals resuspendiert (gewaschen) und abzentrifugiert. EIIA Glc war im Pellet 2 (P2) der Cya - Membranen nicht mehr zu detektieren und wurde folglich ausgewaschen. Ebenfalls kein EIIA Glc befand sich im Pellet 2 der Ansätze ohne Membranen. EIIA Glc blieb jedoch im Pellet 2 der Membranen des Cya + Ansatzes erhalten (siehe Abb. 36 a). Stämme ohne Adenylatcyclase besitzen das crp* Allel. Durch letzteres wird ein CAP Protein gebildet, dass unabhängig von camp aktiv ist. So wurde sichergestellt, dass auch im cya-stamm alle camp/cap abhängigen Gene transkripiert wurden, obwohl keine Adenylatcyclase vorhanden ist und, dass die ausbleibende EIIA Glc -Bindung nur auf das Fehlen der Adenylatcyclase zurückzuführen ist und nicht auf das Fehlen einer camp/cap abhängigen transkripierten Membrankomponente. Da unterschiedlichste Faktoren an der Regulation der Aktivität der Adenylatcyclase beteiligt sind (siehe Kap ), könnte es sein, dass weitere lösliche Faktoren benötigt werden, um den Einfluss der Zuckerphosphate auf die Bindung zwischen EIIA Glc und der Adenylatcyclase zu bewirken und nachzuweisen. Deshalb wurde versucht die Bindetests mit Zellextrakten durchzuführen, die überproduziertes EIIA Glc ohne His-tag enthielten (siehe Abb. 36 b). Der zugegebene EIIA Glc -Zellextrakt enthielt nur lösliche Proteine. Es zeigt sich, dass bei dem Einsatz von Zellextrakten die Membranfraktion ein weiteres Mal gewaschen werden müsste, da in Pellet 2 (P2) der Cya - Membranen noch EIIA Glc enthalten ist. An Membranpellet 2 (P2) des Cya + Stammes ist aber deutlich mehr EIIA Glc gebunden, so dass auch dieses Experiment auf eine direkte Interaktion zwischen EIIA Glc der Adenylatcyclase hinweist.

104 3. Ergebnisse 90 Abb. 36: Bindung von EIIA an die Adenylatcyclase(CyaA). Westernblot mit Antikörpern gegen EIIA. Der Bindetest wurde wie in Kap beschrieben durchgeführt. P1: Membranpellet der ersten Ultrazentifugation nach der Inkubation von EIIA Glc mit den Membranen; S: Überstand 1; P2: entsteht aus Membranpellet 1, das nochmals resuspendiert und abzentrifugiert wurde. Die Überproduktion der Adenylatcyclase (Cya+) erfolgte in Stamm SA14, transformiert mit psa8 (=pbad_cya). Gezeigt sind in a)die Membranbindetests mit gereinigtem EIIA Glc an: (i) oben (----) Kontrolle ohne Membranen, (ii) Mitte (cya -- ) Membranen von einem Stamm ohne Adenylatcyclase (CyaA) und (iii) unten (cya + ) Membranen von einem Stamm mit CyaA. In b) wurden Zellextrakte mit überproduziertem EIIA Glc zugegeben.

105 3. Ergebnisse 91 Die Adenylatcyclase mit N-terminalem His-tag (99 kda) konnte im Westernblot mit Penta- His-Antikörpern in den Membranfraktionen des Cya + Stammes nachgewiesen werden (siehe Abb. 37 a). Zusätzlich wurde mit dem Penta-His-Antikörper eine Bande bei etwa 30 kda detektiert. Es handelt sich hierbei nicht um ein Abbauprodukt der Adenylatcyclase, sondern um ein Membranprotein ohne His-tag, da man das Signal auch in der Cya - Kontrolle erhielt, in der kein His-tag-Protein enthalten war. Der Bindetest wurde mit gereinigtem EIIA Glc durchgeführt, das ebenfalls einen N-terminalen His-tag besitzt. Im Westernblot, der wie in den Experimenten zuvor zur Auswertung der Bindetests genutzt wurde, konnten somit beide Proteine mit dem Penta-His-Antikörper detektiert werden. Wiederum blieb das EIIA Glc -Signal im Membranpellet P2 des Cya+ Stammes erhalten, während es in der Cya - Kontolle ausgewaschen wurde. EIIA Glc bindet an Membranen, die überproduzierte Adenylatcyclase enthalten (siehe Abb. 37 b). Abb. 37: Bindetests zwischen Adenylatcyclase mit N-terminalem His-tag und gereinigtem EIIA Glc. Westernblot mit Penta-His-Antikörper. P1: Membranpellet der ersten Ultrazentifugation; S1: Überstand 1; P2: entsteht aus Membranpellet 1, das nochmals resuspendiert und abzentrifugiert wurde; S2: Überstand zu Pellet 2. Die Adenylatcyclase wurde in Stamm Sa17 ( cya ptsg), transformiert mit psa11, überproduziert. In a) erfolgt der Nachweis, dass die (His6x)-Adenylatcyclase (99 kda) in den Membranen enthalten ist und auch in P2 erhalten bleibt. Dieser Test erfolgte ohne Zugabe von EIIA Glc. Auf Höhe der 100 kda Standard Bande, erscheint ein Signal ( ) in den Membranfraktionen des Cya + Stammes, nicht aber im Cya - Stamm. Bei der unteren Bande( ), die in allen Membranpellets erscheint, handelt es sich um ein Membranprotein ohne Histag, das durch den Antikörper erkannt wird. In b) wurde sowohl EIIA Glc ( ) als auch die Adenylatcyclase ( ) mit dem Penta-His-Antikörper nachgewiesen. Verwendet wurde ein vorgefärbter Proteinstandard (Presion All Blue; Biorad).

106 3. Ergebnisse Analyse der Interaktion zwischen EIIA Glc und den Domänen der Adenylatcyclase Eine weitere Frage, die geklärt werden sollte, war, an welche der Domänen der Adenylatcylase EIIA Glc bindet. Die Adenylatcyclase ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 95 kda, das aus einer N-terminalen katalytischen (AS: 1-535) und einer C-terminalen regulatorischen Domäne (AS: ) besteht (134). Bei Fehlen der regulatorischen Domäne hat die mit dem Transport von Glukose zusammenhängende Dephosphorylierung von EIIA Glc keine negativen Auswirkungen mehr auf die Aktivität des Enzyms. Einem Modell zufolge inhibiert die regulatorische Domäne die Aktivität der Katalytischen. Die Anwesenheit von phosphoryliertem EIIA Glc hebt diese Inhibition auf (siehe Kap ). EIIA Glc könnte demnach an die regulatorische Domäne binden und so deren inhibitorischen Effekt verhindern. Aber auch in der katalytischen Domäne konnten drei Aminosäuren (Arg188, Asp414, Glycin463) identifiziert werden, bei deren Austausch gegen eine andere Aminosäure die Regulation der Adenylatcyclaseaktivität durch CAP verändert wird (31). Da die CAP abhängige Reduktion der Adenylatcyclase-Aktivität wiederum EIIA Glc benötigt, könnte es also auch möglich sein, dass EIIA Glc an die katalytische Domäne bindet. Die getrennt voneinander klonierten Domänen wurden zur Expression gebracht und von diesen Stämmen, wie zuvor, Membranen präpariert. Beide Domänen waren membranassoziiert. Es erfolgte keine Bindung von EIIA Glc an die regulatorische Domäne. Von der katalytischen Domäne wurden zwei unterschiedliche Varianten getestet. Bei einer Variante wurden zusätzlich die N-terminalen 86 AS entfernt. Diese Variante zeigte ebenfalls keine EIIA Glc Bindung. Jedoch eine Variante, ohne N-terminale Deletion, konnte wie CyaA gesamt EIIA Glc binden. Abbildung 38 a zeigt, dass beide Domänen membranassoziiert sind. Die Bindetests erfolgten mit gereinigtem EIIA Glc mit N-terminalen His-tag. Es erscheint so, als bestünde kein Unterschied zwischen den Membranfraktionen P2 der Membranen, die die Adenylatcyclasedomänen enthalten und dem P2 der Negativkontrolle. EIIA Glc bindet an keine der beiden Domänen, wenn diese als separate Polypeptidketten gebildet werden (siehe Abb. 38 b).

107 3. Ergebnisse 93 Abb. 38: Bindetests zwischen den Domänen der Adenylatcyclase mit N-terminalem Histag und gereinigtem EIIA Glc Westernblot mit Penta-His-Antikörper. P1: Membranpellet der ersten Ultrazentifugation; S1: Überstand 1; P2: ensteht aus Membranpellet 1, das nochmals resuspendiert und abzentrifugiert wurde; S2: Überstand zu Pellet 2. Die Adenylatcyclase-Domänen wurden in Stamm Sa17 ( cya ptsg), transformiert mit psa13 und psa16, überproduziert. In a) erfolgte der Nachweis, dass die Domänen der Adenylatcyclase in den Membranen enthalten sind. Hier wurde kein EIIA Glc zugegeben. Bei der unteren Bande, die in allen Membranpellets erscheint, handelt es sich nicht um ein Abbaubauprodukt der His-tag-Proteine, sondern um ein Membranprotein, an das der Penta-His- Antikörpers ebenfalls bindet, auch in der Kontrolle ohne Adenylatcyclase (Hisa6x). In b) wurde sowohl EIIA Glc als auch die Adenylatcyclase mit dem Penta-His-Antikörper nachgewiesen. Verwendet wurde ein vorgefärbter Proteinstandard (Presion All Blue; Biorad).

108 3. Ergebnisse 94 Da ein Protein seine Tertiär-/Quartiärstruktur unter anderen durch die Interaktion der Seitenketten der Aminosäuren untereinander aufrecht erhält, könnte es sein, dass die Domänen, wenn separat exprimiert nicht korrekt gefaltet werden und deshalb die Bindung von EIIA Glc unterbleibt. Zwar ist bekannt, dass die katalytische Domäne ohne die regulatorische Domäne aktiv ist (62, 134) und deshalb korrekt gefaltet sein muss, dennoch wurde dies für die klonierten Fragmente nochmals überprüft. E. coli Zellen, die keine Adenylatcyclase besitzen, sind nicht mehr fähig auf Glycerin als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen, da die Transkription der Gene des Glycerintransporters und der Glycerinkinase camp/cap abhängig ist (65). Wird in diesen Bakterien plasmidkodierte Adenylatcyclase oder deren katalytische Domäne zur Expression gebracht, sollten sie wieder auf Glycerin wachsen können, vorausgesetzt das Protein oder die Domäne ist korrekt gefaltet und aktiv. Abbildung 39 zeigt die daraus erhaltenen Wachstumskurven. Zellen, die die Adenylatcyclase gesamt oder die katalytische Domäne exprimierten, zeigten vergleichbares Wachstum. Zellen, die die regulatorische Domäne exprimierten oder mit der Vektorkontrolle transformiert waren, zeigten kein Wachstum. Eine ausreichende Menge Adenylatcyclase gesamt oder der katalytischen Domäne schien korrekt gefaltet und aktiv zu sein. Der bislang getesteten His-tag Variante der katalytischen Domäne fehlen zusätzlich 86 Aminosäuren des N-Terminus. Dass diese Variante noch katalytisch aktiv ist, deckt sich mit den Ergebnissen von Holland et al. (63). Bei den dort gezeigten Experimenten ging aus dem Trypsinverdau der Adenylatcyclase ein Fragment hervor, das den Aminosäuren , des aus 848 Aminosäuren bestehenden Proteins, entsprach. Dieses Fragment war noch immer katalytisch aktiv. Eine weitere klonierte Variante der katalytischen Domäne, die im Rahmen dieser Arbeit getestet wurde, umfasst die Aminosäuren und hat also keine N-terminale Deletion. Wurden die Membranen von E. coli Zellen präpariert, die diese Variante der katalytischen Domäne überproduzierten, konnte eine Bindung von EIIA Glc nachgewiesen werden (siehe Abb. 40). Das Signal in Membranpellet P2 bleibt erhalten, wenn diese katalytische Domäne (KatDom) exprimiert wird, nicht aber bei den Membranen ohne Adenylatcyclase ( cya).

109 3. Ergebnisse 95 Abb. 39: Wachstum der Adenylatcyclase-Varianten auf Minimalmedium mit Glycerin als einziger Kohlenstoffquelle. Stamm CH4 ( cya), transformiert mit Plasmid phiho101(laci q ) und den Plasmiden psa11(=ges; Adenylatcyclase gesamt) oder mit psa13(=kd; katalytischen Domäne) oder mit psa16(=rd; regulatorische Domäne) oder pqe32(= Vektor), wurde auf Minimalmedium mit 0,4% Glycerin bei 37 C angezogen und die Transkription der Adenylatcyclase-Varianten mit 50 µm IPTG induziert. In regelmäßigen Abständen wurden Aliquots entnommen und das Wachstum durch Messung der OD bei 578 nm verfolgt. Abb. 40 Bindetests zwischen der katalytischen Domäne der Adenylatcyclase und gereinigtem EIIA Glc Westernblot mit Penta-His-Antikörper. P1: Membranpellet der ersten Ultrazentifugation nach der Inkubation von EIIA Glc mit den Membranen; S1: Überstand 1; P2: ging aus Membranpellet 1 hervor, das nochmals resuspendiert und abzentrifugiert wurde. Im Vergleich zu Abbildung 38 wurde hier die gesamte katalytische Domäne (AS: 0 535) kloniert (psa12) und in Stamm SA17 überproduziert. Verwendet wurde ein vorgefärbter Proteinstandard (Presion All Blue; Biorad).

110 3. Ergebnisse Nachweis der Interaktion zwischen EIIA Glc und der Adenylatcyclase bei Zugabe von Zuckerphosphat Da der von mir erstellte Test geeignet war, eine Bindung zwischen der Adenylatcyclase und EIIA Glc nachzuweisen, sollte nun getestet werden, ob diese Bindung durch die Zugabe von Zuckerphosphaten beeinflusst werden konnte. Abb. 41: Einfluss von Zuckerphospat auf die Bindung zwischen der Adenylatcyclase und EIIA Glc in Zellextrakten. Westernblot mit Antikörper gegen EIIA Glc. Der Bindetest wurde wie in Kap beschrieben durchgeführt. P1: Membranpellet der ersten Ultrazentifugation nach der Inkubation von EIIA Glc mit den Membranen; S1: Überstand 1; P2: Membranpellet 1 wurde nochmals resuspendiert und abzentrifugiert. Die Adenylatcyclase wurde in Stamm SA14 ( ptsg), transformiert mit psa8, überproduziert. EIIA Glc wurde mittels Stamm DHB4 und pjfbh überproduziert. Bei dem Bindetest wurden während der Inkubation von EIIA Glc und der Adenylatcyclase die oben angegebenen Zuckerphosphate zugegeben und danach der Assay wie in den Versuchen zuvor fortgesetzt. Verwendet wurde ein vorgefärbter Proteinstandard (Presion All Blue; Biorad). Wieder wurden Membranvesikel präpariert. Einmal von einem Stamm, der die Adenylatcyclase überproduziert hatte. Zum anderen von einem Stamm ohne Adenylatcyclase. Im Bindetest wurden Zellextrakte zugegeben, die überproduziertes EIIA Glc enthielten. Zu diesen Ansätzen wurden die Zuckerphosphate (50 mm) gegeben. In Abb. 41 ist beispielhaft der Ansatz gezeigt, dem Glukose-6-P zugegeben wurde. Wieder zeigt sich ein Problem bei

111 3. Ergebnisse 97 der Verwendung von EIIA Glc -Zellextrakten. Es wäre ein weiterer Wasch/Zentrifugationsschritt nötig, um noch in Membranpellet P2 der Kontrolle gebundenes EIIA Glc weiter zu entfernen. Dennoch zeigt ein Vergleich der Membranfraktion P2 der Cya - Kontrolle und des Cya + Stammes, dass das Signal für EIIA Glc in der Fraktion des Cya + Stammes intensiver ist, was für eine Bindung von EIIA Glc an die Cya + Membranen spricht. Es kann also davon ausgegangen werden kann, dass die Bindung zwischen der Adenylatcyclase und EIIA Glc nicht durch die verwendeten Zuckerphosphate beeinträchtigt wurde (siehe Abb 41) Auswirkungen der EIIA Glc Phosphorylierung auf die Interaktion zwischen EIIA Glc und Adenylatcyclase Abb. 42: Bindetests mit (His6x)Adenylatclyse und gereinigtem nicht phosphoryliertem EIIA. Westernblot mit Penta-His-Antikörper. P1: Membranpellet der ersten Ultrazentifugation nach der Inkubation von EIIA Glc mit den Membranen; S1: Überstand 1; P2: Membranpellet 1 wurde nochmals resuspendiert und abzentrifugiert; S2: Überstand 2. Die Adenylatcyclase wurde in Stamm Sa17 ( ptsg cya), transformiert mit psa11, überproduziert. EIIA Glc wurde mittels Stamm DG102 ( ptshicrr) und psa9 überproduziert. Beide Bindepartner wurden mit dem Penta-His-Antikörper detektiert. Die Adenylatcyclase wurde mit 1, das EIIA Glc mit 2 markiert. - std.: Prestained Protein marker/biorad (Precision Plus Dual colour). Die nächste Frage war, ob EIIA Glc nur dann an die Adenylatcyclase binden kann, wenn es phosphoryliert ist oder ob auch nicht phosphoryliertes EIIA Glc binden kann. Dafür wurden wie

112 3. Ergebnisse 98 im Experiment zuvor Membranvesikel präpariert, mit Adenylatcyclase mit N-terminalem Histag oder ohne Adenylatcyclase. EIIA Glc wurde in einem Stamm überproduziert, in dem die Deletion des Operons ptshicrr zum Verlust der allgemeinen PTS-Komponenten HPr und EI und des chromosomal kodiertem EIIA Glc führt. Die PTS-abhängige Phosphorylierung von plasmidkodiertem EIIA Glc war nicht mehr möglich. Auch in diesem Experiment lies sich das EIIA Glc aus den Membranpellets der Negativkontrolle ( cya) auswaschen und blieb in Membranpellet (P2) des Cya + Stammes gebunden (siehe Abb. 42). Entgegen der überwiegend vertretenen Meinung (siehe Kap ), dass dephosphoryliertes EIIA Glc keine Wirkung auf die Adenylatcyclase hat, hatte, das in diesem Ansatz ausschließlich dephosphorylierte EIIA Glc, an die membranassoziierte Adenylatcyclase gebunden. 3.4 Identifizieren weiterer Mlc regulierter Gene Alle durch Mlc regulierten Gene, die bisher identifiziert werden konnten, werden negativ durch Mlc und positiv durch camp/cap reguliert. Ihnen ist gemeinsam, dass ihre Genprodukte für die Aufnahme und die Verwertung einer Kohlenstoffquelle benötigt werden, und dass als Folge des Stoffwechsels ein Glukose-Phosphat oder Glukose selbst entsteht (119). Eine Ausnahme bildet die positive, jedoch indirekte Regulation von ldha, das für die anaerobe Laktatdehydrogenase kodiert (71). Zwei unterschiedliche Methoden führten zum Auffinden neuer, möglicherweise durch Mlc regulierter Gene. Zum einen wurden Transkriptomanalysen mit Hilfe von DNA-Microarrays durchgeführt (siehe Kap und (17)). Die Durchführung und Auswertung der Microarrays erfolgte am Forschungszentrum Jülich durch T. Polen und V. Wendisch, die Präparation der benötigten RNA wurde von mir durchgeführt. Zum anderen wurde das Proteom mittels zweidimensionaler Protein- Gelektrophorese untersucht. Hierfür präparierte ich die Zellextrakte. Die Gelelektrophorese und deren Auswertung wurde durch U. Völker und Mitarbeiter in Marburg/Greifswald durchgeführt. Beide Methoden ergaben Hinweise auf eine Vielzahl möglicherweise ebenfalls durch Mlc regulierter Gene. Bislang konnte zwar für einen Teil dieser Gene ausgeschlossen werden, dass sie durch Mlc reguliert werden. Aber es konnten noch keine weiteren Gene identifiziert werden, deren Transkription tatsächlich durch Mlc reguliert ist, wobei eine Überprüfung aller erhaltenen Daten noch nicht abgeschlossen ist.

113 3. Ergebnisse DNA-Microarray Das Transkriptom, der mrna-spiegel je zweier unterschiedlicher Bakterienstämme sollte verglichen werden. Dieses wurde wie im Kapitel beschrieben erstellt. Der Vergleich des Wildtyps (WT) mit einer mlc-mutante wurde dreimal durchgeführt (Tab. 22/23 S ). Bei dem Wildtyp handelt es sich um E. coli MC4100. Der Vergleich einer ptsg-mutante mit einer ptsg/mlc-doppelmutante erfolgte ebenfalls dreimal (Tab. 22/23, S ) und zweimal der Vergleich einer mlc-mutante mit der mlc-überexpression (siehe Tab. 24/25 S ). Die Frage war, für welche Gene der RNA-Spiegel im mlc-hintergrund signifikant erhöht bzw. erniedrigt sein würde. Das gibt Aufschluss darüber, ob die Transkription eines Genes durch Mlc beeinflusst ist. Ob dieser Einfluss von Mlc durch direkte Bindung des Proteins in der regulatorisch wichtigen Region dieser Gene erfolgt, oder indirekt über weitere Faktoren, kann damit nicht geklärt werden. Zunächst wurden deshalb die normalisierten Ratios of median der Gene in den Einzelexperimenten betrachtet (siehe Kap ). Die Tabellen im Anhang (S ) zeigen die Gene deren Werte der normalisierten Ratios of median über oder unter einer vorher anhand von Kontrollgenen ermittelten Signifikanzgrenze lagen. Für die mlc-mutante erhält man in allen acht Experimenten erhöhte Signale für die meisten der bekannten Mlc regulierten Gene. Dies kann positiv für die Aussagekraft der Chipergebnisse gewertet werden. Es wurden 39 Gene identifiziert, deren Transkription in den mlc-mutanten erhöht war (Tab. 23 S. 146), also negativ durch Mlc reguliert werden könnten. Zudem wurde für 28 Gene gezeigt, dass deren Transkription in der mlc-mutante erniedrigt ist (Tab. 22 S. 144). Das weist auf die Möglichkeit hin, dass Mlc, vergleichbar dem homologen transkriptionellen Regulator NagC (121), sowohl als Repressor, als auch als Aktivator fungieren könnte. Bei den meisten, der so identifizierten Gene, lies sich jedoch keine Konsensus-DNA-Bindestelle für Mlc finden (siehe Tab und Kap ). Betrachtet man die Werte in den Tabellen zeigt sich eine große Übereinstimmung zwischen den Vergleichen des WT mit der mlc-mutante und den Vergleichen der ptsg- Mutante mit der ptsg/mlc-doppelmutante. Für den Vergleich der mlc-mutante mit mlc- Überexpression zeigt sich eine große Variation in den Werten, zunächst schon in den beiden Arrays dieses Experiments, aber ebenso zu den Ergebnissen der anderen Vergleiche. Die mlc- Überexpression simuliert demnach eher einen Ausnahmezustand der Zelle. Die Arrays, mit Hilfe derer das Transkription des Wildtyps mit dem der mlc-mutante verglichen wurde, lieferten die zuverlässigeren und wiederholbaren Ergebnisse. Sie scheinen eher geeignet neue Zielgene der Mlc-Regulation zu finden, als die Ergebnisse der mlc-

114 3. Ergebnisse 100 b# Name Vergleich: mlc- Überexpression gegen mlc- Mutante (2 Arrays) Durchschnitt n Signifikanz Vergleich: mlc- Mutante gegen Wildtyp (3 Arrays) Durchschnitt Signifikan n z Vergleich: mlc/ptsg- Mutante gegen ptsg- Mutante (3 Arrays) Produkt Durchschnitt n Signifikan z b0061 arad 0,85 1 0,24 2 * 0,24 3 ** L-Ribulose-5-Phosphate 4-Epimerase b0064 arac 0,74 2 3,73 2 5,85 3 ** transkriptioneller Regulator für das ara Operon b0065 yabi 1,35 2 7,87 2 6,21 3 ** pot. Membranprotein b0066 yabj 0,91 2 ** 7,63 2 7,01 3 * Thiamin Transp. pot. ATPase b0067 yabk 0,74 2 3,51 2 3,33 3 * Thiamin Transp. Permease b0069 yabn 0,96 1 0,31 3 * 0,26 3 ** pot.transportprotein b0459 maa 0,50 2 * 0,81 1 1,19 3 * Maltosetransacetylase b1056 ycei 0,57 2 2,43 3 * 2,72 3 ** Periplasmatisches Protein b1101 ptsg 0,10 2 ** 5,54 3 * 2,30 3 ** PTS, Glucose-spezifisches IIBC b1339 abgr 0,63 2 * 2,44 2 * 3,34 3 * pot. transcriptioneller Regulator LysR-Typ b1498 yden 0,33 2 ** 0,92 2 1,11 3 pot. Sulfatase b1505 ydet 0,49 2 ** 0,95 1 0,99 3 pot. Protein der äußeren Membran b1593 ynfk 0,84 1 0,70 1 0,57 3 * pot. Dethiobiotin Synthase b1594 mlc 39,34 2 * 0,59 3 * 0,67 3 * transkriptioneller Regulator b1817 manx 0,04 2 4,53 3 * 5,04 3 ** PTS(Mannose) EIIAB b1818 many 0,06 2 3,63 3 * 4,06 3 ** PTS(Mannose) EIIC b1819 manz 0,09 2 ** 3,04 3 * 3,32 3 ** PTS(Mannose) EIID b1820 yobd 0,23 2 2,27 2 2,06 3 ** Pot. Membranprotein b2000 flu 0,55 1 2,82 1 2,64 3 ** Außenmembran Fluffing Protein, ähnlich zu Adhesin b2001 yeer 0,82 2 4,61 1 3,09 3 * Pot. Membranprotein b2028 ugd 0,37 2 ** 1,24 1 1,24 2 UDP-Glukose 6-Dehydrogenase b2045 wcak 0,51 2 * 1,10 1 0,86 2 pot. Galactokinase (EC ). b2053 gmd 0,08 2 * n.d. 0,83 1 GDP-D-Mannose Dehydratase b2062 wza 0,23 2 * 1,39 1 0,98 2 pot. Polysaccharide Export Protein b2091 gatd 0,42 2 * 1,03 3 1,23 3 Galactitol-1-Phosphate Dehydrogenase b2094 gata 0,47 2 ** 0,96 3 1,15 3 PTS, Galactitol-spezifisches EIIA b2095 gatz 0,49 2 * 1,02 3 1,21 3 pot. Tagatose 6-Phosphate Kinase b2253 yfbe 0,47 2 ** 0,86 2 1,00 3 pot. Enzym b2415 ptsh 0,32 2 * 1,63 2 2,65 3 * Phosphocarrier Protein Hpr b2416 ptsi 0,25 2 * 2,56 2 2,94 3 ** Phosphocarrier Protein EI b2669 stpa 0,37 2 * 0,62 1 1,71 3 DNA-Bindeprotein StpA b3417 malp 0,18 2 2,58 3 * 2,97 3 * Maltodextrinphosphorylase b3418 malt 0,13 2 ** 2,68 3 * 3,64 3 ** positiver Regulator des mal Regulon b3419 yhgj 0,22 2 * 2,30 3 3,46 3 * RNA 3'-terminal Phosphatcyclase b3561 yiah 0,40 2 * 0,89 1 1,06 2 unbekannt b3903 rhaa 0,41 2 ** 1,61 2 2,25 3 * L-Rhamnoseisomerase Maltosetransport Membrankomponente(ABCb4032 malg 0,39 2 2,05 2 ** 2,04 3 ** Transporter) b4033 malf 0,15 2 ** 3,10 3 * 4,06 3 * Maltosetransport Membrankomponente(ABC- Transporter) b4035 malk 0,19 2 2,67 3 * 4,22 3 ** ATB-Bindeprotein Maltose ABC-Transporter b4037 malm 0,10 2 3,17 3 ** 4,35 3 * Periplasmatisches Protein b4062 soxs 1,12 2 1,29 3 1,81 3 * Regulator

115 3. Ergebnisse 101 Tabelle 17: Statistische Auswertung der DNA-Microarray-Daten. Die statistische Auswertung der Microarrays entspricht einer Liste von Genen, die in einem der acht Experimente einen RNA-Spiegel (Ratio of median) <0,5 oder > 2 aufwiesen. Die Ratios of Median der Gene in den Wiederholungen (je 2-3 Arrays) eines Vergleichs wurden zu einem Mittelwert zusammengefasst. Die Signifikanz wurde mittels des Student s t-test bestimmt und ist für p<0,05 mit einem Stern (*) markiert, für p<0,005 mit zwei Sternen (**). Die Mittelwerte der RNA-Spiegel sind dann rot hervorgehoben, wenn für diese gilt, dass der RNA-Spiegel >2 und die Signifikanz p <0,05 ist. Die Mittelwerte der RNA-Spiegel sind grün hervorgehoben, wenn für diese gilt, dass der RNA-Spiegel <0,5 und die Signifikanz p <0,05 ist. Überexpression. Im zusätzlich durchgeführten Vergleich WT mit einer ptsg-mutante zeigten sich keine signifikanten Unterschiede (Daten nicht gezeigt). Da man mit dieser Methode auch fälschlicherweise positive Ergebnisse erhält, müssen diese Ergebnisse durch weitere Methoden wie Reportergenfusionen, Real Time PCR oder Northernblots verifiziert werden. Eine weitere Möglichkeit bietet die mehrmalige Wiederholung der Arrays mit anschließender statistischer Auswertung. Die statistische Auswertung der acht Microarrays ist in Tabelle 17 dargestellt. / Überprüfung der Chipdaten Zur Überprüfung der Microarray-Daten wurden folgende Reportergenfusionen im mlc + und im mlc Hintergrund bzw. mit und ohne Mlc-Überproduktion getestet: - prov-lacz - agn(=flu)-lacz - taua-lacz - ssue-lacz - yabn(=sgrr)-lacz - yeer-lacz - arab-phoa - arac-lacz - tbpa-lacz - yabm-phoa

116 3. Ergebnisse 102 Bei den ß-Galaktosidasetests (siehe Kap.2.5.4) bzw. den PhoA-Tests (siehe Kap ) konnten keine signifikante Änderung der Aktivitäten gemessen werden, so dass eine Regulation dieser Gene durch Mlc nicht wahrscheinlich ist. Bezogen auf die Arraydaten, ergab sich für die meisten dort genannten Gene, nur eine 2-5 fache Änderung des Signals. Eventuell eignen sich in diesem Fall Methoden wie der Northernblot oder die RT-PCR, die die Menge der transkripierten mrna nachweisen besser, um die Microarray-Daten zu überprüfen, als wie bisher Reportergenfusionen zu testen. Dies auch im Hinblick darauf, dass Mlc womöglich indirekt über weitere Faktoren auf die Transkription der Gene einwirkt. Ein derartiger Faktor könnte beispielsweise eine srna sein (51). Diese binden nicht in der Promotorregion eines Genes, sondern an Bereiche der mrna und verändern deren Stabilität. Mit einer Reportergenfusion zu der Promotorregion eines Genes können solche Effekte nicht überprüft werden. Es erscheint nicht sinnvoll die Ergebnisse der Einzelexperimente (Tab S ) zu überprüfen. Besser ist es, sich im weiteren an der statistischen Auswertung in Tabelle 17 (S. 100) zu orientieren Proteonomanalyse Muster der in der Zelle synthetisierten Proteine im mlc Hintergrund verglichen mit der Mlc-Überproduktion Um die aus den DNA-Microarrays erhaltenen Daten zu überprüfen und um einen Einblick zu bekommen, an welcher Stelle zusätzlich zur transkriptionellen Regulation posttranskriptionelle Mechanismen wirksam sind, sollte untersucht werden, welche Proteine in Abwesenheit von Mlc bzw. bei Mlc-Überproduktion vermehrt vorkommen. Dies geschah mit der Einschränkung, dass nur die löslichen Proteine untersucht wurden. Transporter und sonstige Membranproteine wurden nicht erfasst. Die mlc-mutante und Zellen, die Mlc überproduzierten wurden unter vergleichbaren Bedingungen wie für die RNA-Präparation der Microarrays angezogen. Die Zellextrakte wurden wie in Kapitel beschrieben präpariert. Abbildung 43 zeigt das 2D-Gel, mittels dessen die Proteine in den Zellextrakten aufgetrennt wurden. Tabelle 18 zeigt die bislang identifizierten Proteine, die bei der mlc-mutante oder die

117 3. Ergebnisse 103 bei Mlc-Überproduktion vermehrt vorkamen. Tabelle 19 zeigt die Gene/Proteine, deren Expression sowohl bei den Microarrays, als auch im Experiment mit der 2D- Gelelektrophorese verändert war. In beiden Experimenten erhält man ein Signal für des EIIAB Man (manx), die allgemeine PTS-Komponente EI (ptsi) und für Mlc selbst. Diese sind bekanntermaßen durch Mlc reguliert. Bislang unbekannte Gene/Proteine, die in beiden Experimenten erkannt wurden, sind CysK (cysk), die O-Acetylserine-Lyase A, DanK (dnak), das Chaperon Hsp70, und AroF (arof), eine DAHP Synthetase. Im 2D-Gel erhält man das AroF-Signal in den Extrakten von Zellen, die Mlc überproduzierten, bei den DNA- Microarrays ist arof aber in der mlc Mutante erhöht. Nur die Gene von PtsI, ManX, Mlc, welche ja schon bekanntermaßen Mlc reguliert sind, sind auch in der statistischen Auswertung der Chipdaten enthalten. Vor einer weiteren Auswertung dieser Daten, sollte geprüft werden, welche Proteine eventuell nur deshalb vermehrt gebildet werden, da die Überproduktion von Protein an sich erfolgte, wie man das für DanK vermuten könnte. Da schon die Ergebnisse der Microarrays zeigten, dass der Vergleich Mlc-Überproduktion gegen mlc-mutante sehr unterschiedliche Ergebnisse lieferte, wäre es vermutlich aufschlussreicher, das Proteom des Wildtyps mit dem einer mlc-mutante zu vergleichen. Da die bisherige Erfahrung zeigt, dass Mlc gleichermaßen die Bildung löslicher wie die von Transportproteinen reguliert, wäre ein experimenteller Ansatz vorteilhaft, der auch die Membranproteine mit einbezieht.

118 3. Ergebnisse 104 Abb. 43: 2D-Gele des Vergleiches mlc-mutante gegen Mlc-Überproduktion. Gezeigt ist das 2D-Gel, mittels dessen der Zellextrakt der mlc-mutante (orange ) und des Stammes, der Mlc überproduzierte (blau), aufgetrennt wurden. Proteine, die in einem der Ansätze vermehrt gebildet wurden, wurden markiert (Mlc-x bzw. Mlc+x bzw. Bezeichnung des bereits identifiziertem Proteins). Die davon mittels MALDI-Analysen identifizierten Spots sind in Tabelle 18 aufgelistet.

119 3. Ergebnisse 105 mlc-mutante Mlc-Überproduktion Protein Funktion pi MW(kDa) PtsA/PtsI PEP-Protein PTS EI 4,78 63,522 GapA Glyceraldeyd-3-P Dehydrogenase A 6,61 35,51 TrpS Tryptophan trna Synthetase 6,27 37,14 PtnA/ManX PTS; Mannose spezifisches EIIAB 5,74 34,9 BlaT ß-Laktamase TEM Vorläufer 5,69 31,5 AroG 3-Deoxy-D-Arabinoheptulosonat-7-P- 6,14 37,99 Synthase(DAHP synthetase, durch Phenylalanin repremierbar); Tyr Regulon DnaK Chaperon Hsp70 4,83 69,072 RS1/RspA 30S Ribosomale Untereinheit Protein S1 4,89 61,12 CysK CyteinsynthaseA 5,83 34,468 Protein Funktion pi MW(kDa) GapA Glyceraldeyd-3-P Dehhydrogenase A 6,61 35,51 NagC NagC ähnlicher transkriptioneller 5,8 44,29 Regulator Mlc Transkriptioneller Regulator Alf/FbaA Fructose-bis-P-aldolase; Klasse II 5,52 39,12 AceE Pyruvatdehydrogenase (Decarboxylase); 5,46 99,61 Kofaktor: Thiaminpyrophossphat AdhE CoA-linked Acetaldehyddehydrogenase; 6,32 96,07 Eisenabhängige Alkoholdehydrogenase; Pyruvat-Format-Lyase (bei anaeroben Bedingungen; Stickstoffmangel; Cra Box vorhanden) YcgT N-terminaler Teil der Dihydroxy-Aceton- Kinase(DHAK); ähnlich zu PTS Proteinen 4,93 39,5 TolB periplasmatisches Protein; TonB 6,98 45,93 unabhängige Aufnahme von Colicin A TyrB(AAT) Aspartat Aminotransferase; Tyr Regulon 5,54 43,55 AroF 3-Deoxy-D-Arabinoheptulosonat-7-P- 5,42 38,78 Sythase(DAHP synthetase, durch Thyrosin repremierbar); Tyr Regulon Tab. 18: Auswertung der 2D-Gelelektrophorese. Vergleich der synthetisierten Proteine einer mlc-mutante mit denen bei Mlc-Überproduktion.

120 3. Ergebnisse 106 Microarray manx* ptsi* cysk dnak arof mlc* erhöht in mlc- Mutante erhöht bei Mlc- Überproduktion 2D-Gel ManX PtsI(EI) CysK DnaK Mlc AroF Tab. 19: Vergleich der durch die Microarrays erhaltenen Daten mit denen der 2D-Gelelektrophorese.

121 4. Diskussion Diskussion 4.1 Untersuchungen zur Interaktion zwischen Mlc und EIICB Glc (PtsG) Die Regulation der Mlc regulierten Gene ist nicht nur deshalb ein interessantes Studienobjekt, da Mlc als globaler Regulator die Aufnahme und erste Stoffwechselschritte verschiedener Kohlenstoffe reguliert, sondern auch aufgrund des Mechanismus mit dem der transkriptionelle Regulator inaktiviert wird. Im Gegensatz zu dem klassischen Beispiel, in dem ein Induktormolekül die Konformation des Repressor verändert, wodurch dieser gehindert wird weiter an die DNA zu binden (28), wird Mlc durch die Bindung an ein Membranprotein von den Operatoren abtitriert. Die Inaktivierung des Repressors abhängig vom Transport des Substrates des repremierten Systems erfolgen zu lassen, bewirkt, dass die für den Transport benötigten Komponenten nur dann vermehrt gebildet werden, wenn Glukose extern vorliegt. Dabei handelt es sich nicht um einen Ausnahmefall. Der Vergleich zu analogen Systemen, bei denen ein regulatorisches Protein an ein Protein eines Transportkomplexes gebunden wird, zeigt dass es sich um einen alternativen Mechanismus zur klassischen Induktion handelt. Die Vermutung liegt nahe, dass es sich dabei um eine generelle Methode handelt, mittels derer die Bakterien zudem eine gewisse Kompartimentierung der Zelle erreichen. Vergleichbare Systeme finden sich bei der Bindung von GlnK an den Ammoniumtransporter AmtB (30), bei PutA, das an die Cytoplasmamembran gebunden wird (97, 106), und auch in der Bindung des inaktiven MalT an die ATPase MalK (111) Die Rolle des C-Terminus von Mlc Die in dieser Arbeit erbrachten Ergebnisse zeigen, dass die Sequenzen am carboxy-terminalen Ende von Mlc eine wichtige Rolle bei der Tetramerisierung des Proteins, der DNA-Bindung und der Bindung an den Transportkomplex EIICB Glc (PtsG) einnehmen. Dabei wurde eine 18 Aminosäuren umfassende Sequenz untersucht, durch welche eine α-helix mit möglicherweise amphipatischen Charakter gebildet wird. Es sollte die Frage geklärt werden, ob die Protein- Protein-Interaktion zu PtsG über die hydrophoben Bereiche der Helix erfolgt. In einem ersten Versuch wurden zwei Deletions-Varianten von Mlc hergestellt. Die Variante Mlc 9, der neun

122 4. Diskussion 108 C-terminale Aminosäuren und somit die Hälfte der Helix entfernt wurden, zeigt eine dem Mlc WT vergleichbare Repression der Mlc regulierten Gene und Bindung an PtsG. MlcWT und Mlc 9 bilden unter nativen Pufferbedingungen Tetramere. Die Bildung von Mlc Tetrameren durch MlcWT konnte schon früher durch ein vergleichbares Experiment dargestellt werden (98). Im Gegensatz dazu bildet die Variante Mlc 18 Dimere und besitzt weder die Fähigkeit zur Bindung an PtsG, noch an die DNA. Aus den Ergebnissen in Kapitel ergaben sich keine direkten Hinweise auf eine bestimmte Region von Mlc, die an der PtsG-Bindung beteiligt ist. Vielmehr zeigt sich, dass die C-terminale Region die Struktur von Mlc an sich beeinflusst oder zumindest an der Ausbildung einer korrekten Tertiär und/oder Quartiärstruktur beteiligt sein muss. Letzteres, die Ausbildung des Tetramers, scheint eine Vorraussetzung für die Repressorfunktion des Proteins zu sein. Ein Vergleich zu anderen transkriptionellen Repressoren wie LacI (16) oder dem zu Mlc homologen NagC (120) zeigt, dass diese aufgrund der Tetramerisierung zwei palindrome Operatorsequenzen binden können, was zur Ausbildung einer DNA-Schleife führt, die zu einer effektiven Repression der Zielgene beiträgt. Jedoch nur im Bereich der ptsg Promotoren sind zwei Bindestellen für Mlc zu finden (115) und auch hier findet keine kooperative Bindung dieser Bindestellen statt. Weitere Zielgene werden repremiert, indem Mlc an eine palindrome Bindestelle bindet, die man nahe oder überlappend mit dem Transkriptionsstart vorfindet (34, 114, 116). So betrachtet wäre die Ausbildung eines Mlc Dimers mit der Bindung je eines der HTH-Motive an je eine Operatorhälfte vollkommen ausreichend (110). Die deletierten C-terminalen Bereiche scheinen daher direkt oder über die Stabilisierung anderer Bereiche im Protein für die Stabilität des N-terminalen DNA- Bindemotives nötig zu sein. Betrachtet man die 18 AS Variante von Mlc und setzt deshalb voraus, dass der C-terminale Bereich für die Tetramerisierung des Proteins benötigt wird, so könnte ein ähnlicher Mechanismus der Tetramerisierung wie bei dem Lac-Repressor LacI vorliegen. Bei diesem wird über mehrere C-terminale α-helices ein Dimer aus zwei Dimeren gebildet (86). Die Struktur von kristallisiertem Mlc konnte kürzlich gelöst werden (48, 139). In der asymmetrischen Einheit des Kristalls findet man zwei Mlc Dimere. In Abbildung 44 ist die Struktur eines der Dimere gezeigt. Die C-terminalen 18 Aminosäuren sind rot markiert. Der C-Terminus faltet in diesem Modell zurück auf den N-Terminus. Es entsteht ein Protein mit drei Domänen. Domäne 1 umfasst die Aminosäuren 1 81 und enthält das HTH-Motiv (grün),

123 4. Diskussion 109 Domäne 2 (gelb/rot) die Aminosäuren 82 bis 194 und 381 bis 406. Domäne 3 (blau) enthält die Aminosäuren 195 bis 380. Der Teil der potentiellen Helix, der in der 9 AS Variante deletiert ist, ist in Kontakt mit Domäne 1 und stabilisiert möglicherweise das HTH-Motiv bezüglich der Domäne 2. Die neun zusätzlich deletierten Aminosäuren der 18 AS Variante haben Kontakt zu den hydrophoben Resten eines zentralen ß-Faltblatts in Domäne 2. Eine Tetramerisierung über die C-terminale amphipatische Helix liegt, in Bezug auf diese Struktur, im Bereich des Möglichen, würde aber die Rotation des HTH-Motives erfordern, damit der C- terminale Bereich nach außen falten und den Kontakt zwischen den Dimeren bilden kann. Die Deletion der 18 Aminosäuren könnte zu zweierlei Konsequenzen führen. Einerseits könnte Domäne 2 nicht mehr richtig gefaltet sein, mit Konsequenzen für das HTH-Motiv, andererseits könnte die Flexibilität des HTH-Motivs selbst erhöht werden, was wiederum eine effektive DNA-Bindung verhindert (139). Abb. 44: Struktur des MlcH52 Dimers (138). Die Abbildung zeigt die ermittelte Struktur eines der Dimere, das in der asymmetrischen Einheit des Mlc- Kristalls zu finden ist. Domäne 2 ist gelb (und rot), Domäne 3 ist blau dargestellt. Die N-terminale Domäne 1 mit HTH-Motiv ist mit grün, die C-terminale amphipatische α-helix ist mit rot gekennzeichnet. Ein gebundenes Zn 2+ Ion ist als graue Kugel dargestellt. Den Aminosäuren 1-11 und in Domäne 1 konnte keine definierte Struktur zugeordnet werden und sind deshalb ausgespart worden. Die Dimerkontakte finden über Domäne 3 statt.