Medizin Vanessa Schuh Flavonoide in Zitronensaft. Stabilität und antioxidative Wirkung Masterarbeit
UNTERSUCHUNGEN ZUR STABILITÄT UND ANTIOXIDATIVEN WIRKUNG VON FLAVONOIDEN IM ZITRONENSAFT Masterarbeit zur Erlangung des Titels Master of Science im Fach Ernährungswissenschaft vorgelegt von Vanessa Anne Schuh angefertigt im Institut für Ernährungswissenschaft der Universität Potsdam Lehrstuhl für Lebensmittelchemie Heidelberg, den 27. September 2011
INHALTSVERZEICHNIS ABBILDUNGSVERZEICHNIS... V TABELLENVERZEICHNIS... VIII ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS... X 1. Einleitung... 1 2. Theoretischer Hintergrund... 2 2.1 Die Zitrone... 2 2.1.1 Allgemeines... 2 2.1.2 Zusammensetzung... 2 2.1.3 Industrielle Verwendung... 3 2.2 Flavonoide... 3 2.2.1 Struktur und Vorkommen... 3 2.2.2 Metabolismus... 6 2.2.3 Antioxidative Aktivität und gesundheitsfördernde Effekte... 7 2.3 Aminosäuren... 9 2.4 Problemstellung... 10 3. Material und Methoden... 11 3.1 Chemikalien... 11 3.2 Geräte... 12 3.2.1 Chromatographische Anlagen... 12 3.2.2 Sonstige Geräte... 13 3.3 Methoden... 15 3.3.1 Herstellung des Zitronensaftes... 15 3.3.2 Untersuchungen zur Stabilität der Flavonoide... 15 3.3.2.1 Stabilität bei unterschiedlichen Lagerungsbedingungen... 15 3.3.2.2 Stabilität bei Erhitzung... 16 3.3.2.3 Stabilität bei Bestrahlung mit UV-Licht... 17 3.3.2.4 Stabilität bei Veränderung des ph-wertes... 18 3.3.2.5 Qualifizierung der Flavonoide im Zitronensaft... 18 3.3.2.6 Herstellung der Flavonoid-Kalibrierlösungen... 19 3.3.2.7 Quantifizierung der Flavonoide... 20 II
3.3.2.8 Identifizierung der Flavonoide mittels HPLC-MS... 21 3.3.3 Herstellung und Fraktionierung eines aufkonzentrierten Flavonoidextraktes... 22 3.3.4 Bestimmung der antioxidativen Aktivität der Flavonoide im Zitronensaft... 23 3.3.4.1 Messung der antioxidativen Kapazität mittels TEAC-Assay... 23 3.3.4.2 Messung der antioxidativen Kapazität mittels HPLC-online TEAC... 26 3.3.5 Reaktionen der Flavonoide mit Aminosäuren... 27 3.3.5.1 Prinzip der Derivatisierung von Aminosäuren mittels OPA/3-MPA... 27 3.3.5.2 Herstellung der Reagenzien... 28 3.3.5.3 Optimierung einer HPLC-Methode mit Vorsäulenderivatisierung zur Aminosäureanalytik... 28 3.3.5.4 Probenvorbereitung... 31 3.3.5.5 Qualifizierung der Aminosäuren im Zitronensaft... 32 3.3.5.6 Herstellung der Aminosäure-Kalibrierlösungen... 32 3.3.5.7 Quantifizierung der Aminosäuren und Flavonoide... 33 3.3.5.8 Identifizierung möglicher Addukte mittels HPLC-MS... 34 3.4 Statistik... 34 4. Ergebnisse und Diskussion... 36 4.1 Vorversuche... 36 4.1.1 Qualifizierung der Flavonoide im Zitronensaft... 36 4.1.2 Methodenentwicklung zur Extraktion der Flavonoide aus dem Rückstand nach Zentrifugation des Zitronensaftes... 37 4.1.3 Bestimmung der Flavonoid-Gesamtkonzentrationen im Zitronensaft... 40 4.2 Stabilität der Flavonoide... 42 4.2.1 Stabilität bei unterschiedlichen Lagerungsbedingungen... 42 4.2.2 Stabilität bei Erhitzung... 46 4.2.3 Stabilität bei Bestrahlung mit UV-Licht... 50 4.2.4 Stabilität bei Veränderung des ph-wertes... 52 4.3 Flavonoid-Fraktionierung aus einem aufkonzentrierten Flavonoidextrakt... 54 4.4 Antioxidative Aktivität der Flavonoide im Zitronensaft... 56 4.4.1 Bestimmung der antioxidativen Aktivität mittels TEAC-Assay... 56 4.4.2 Bestimmung der antioxidativen Kapazität mittels HPLC-online TEAC... 64 4.5 Reaktionen der Flavonoide mit Aminosäuren... 73 III
4.5.1 Optimierung einer HPLC-Methode mit Vorsäulenderivatisierung zur Aminosäureanalytik... 73 4.5.2 Qualifizierung der Aminosäuren im Zitronensaft... 77 4.5.3 Quantifizierung der Flavonoide und Aminosäuren bei unterschiedlichen Reaktionsbedingungen sowie Identifizierung möglicher Addukte... 78 5. Zusammenfassung und Fazit... 87 LITERATURVERZEICHNIS... XII DANKSAGUNG... XVIII IV
ABBILDUNGSVERZEICHNIS Abbildung 1: Strukturformel des Flavan-Grundgerüsts... 4 Abbildung 2: Molekulare Strukturen der einzelnen Flavonoidklassen... 5 Abbildung 3: Molekulare Strukturen der Zitrusflavonoide... 6 Abbildung 4: Fischer-Projektionsformel von L-α-Aminosäuren... 10 Abbildung 5: Beispielhafter Aufbau des HPLC-online TEAC... 26 Abbildung 6: Reaktionsschema von primären Aminosäuren mit OPA und 3-MPA... 28 Abbildung 7: Chromatogramme dreier Flavonoidextrakte von SPE-Nullproben... 36 Abbildung 8: Ermittelte Konzentrationen durch sechsmalige Extraktion der Flavonoide aus dem Zentrifugationsrückstand... 37 Abbildung 9: Chromatogramme der sechs Extrakte aus dem Rückstand der Saftproben nach Zentrifugation... 39 Abbildung 10: Ermittelte Flavonoidkonzentrationen in einer Zitronensaft-Nullprobe... 40 Abbildung 11: Veränderung der Gesamtflavonoidkonzentrationen durch Lagerung des Zitronensaftes bei Raumtemperatur... 42 Abbildung 12: Veränderung der Gesamtflavonoidkonzentrationen durch Lagerung des Zitronensaftes bei 4 C... 42 Abbildung 13: Veränderung der Flavonoidkonzentrationen im Saft durch Lagerung des Zitronensaftes bei Raumtemperatur... 44 Abbildung 14: Veränderung der Flavonoidkonzentrationen im Saft durch Lagerung des Zitronensaftes bei 4 C... 45 Abbildung 15: Veränderung der Konzentrationen von Flavonoid-Standardsubstanzen durch Erhitzung... 46 Abbildung 16: Veränderung der Gesamtflavonoidkonzentrationen im Zitronensaft durch Pasteurisierung... 47 Abbildung 17: Veränderung der Gesamtflavonoidkonzentrationen im Zitronensaft nach Langzeiterhitzung... 47 Abbildung 18: Vergleich der Flavonoidextraktion über SPE und durch Direktextraktion mittels Ethylacetat... 50 Abbildung 19: Veränderung der Konzentrationen von Flavonoid-Standardsubstanzen bei einer Bestrahlung mit UV-Licht... 51 Abbildung 20: Veränderung der Gesamtflavonoidkonzentrationen durch UV-Bestrahlung des Zitronensaftes... 51 Abbildung 21: Veränderung der Gesamtflavonoidkonzentrationen durch Neutralisation des Zitronensaftes... 53 V
Abbildung 22: Chromatogramm zur Flavonoid-Fraktionierung aus dem aufkonzentrierten SPE-Flavonoidextrakt... 54 Abbildung 23: Chromatogramm zur Flavonoid-Fraktionierung aus dem aufkonzentrierten Rückstands-Flavonoidextrakt... 55 Abbildung 24: Vergleich der antioxidativen Aktivität des Gesamt-Zitronensaftes und der Flavonoidextrakte... 57 Abbildung 25: Antioxidative Kapazitäten der untersuchten Zitrusflavonoide... 57 Abbildung 26: Veränderung der antioxidativen Aktivität des Flavonoidextraktes durch Lagerung des Zitronensaftes... 59 Abbildung 27: Veränderung der antioxidativen Aktivität des Flavonoidextraktes durch Pasteurisierung des Zitronensaftes... 60 Abbildung 28: Veränderung der antioxidativen Aktivität des Flavonoidextraktes durch Langzeiterhitzung des Zitronensaftes... 61 Abbildung 29: Veränderung der antioxidativen Aktivität des Flavonoidextraktes durch UV- Bestrahlung des Zitronensaftes... 62 Abbildung 30: Veränderung der antioxidativen Aktivität des Flavonoidextraktes durch Neutralisation des Zitronensaftes... 63 Abbildung 31: Chromatogramm des HPLC-online TEAC eines Flavonoid-Standards (Eriocitrin, Hesperidin, Rutin)... 65 Abbildung 32: Chromatogramm-Ausschnitt des HPLC-online TEAC eines Flavonoid- Standards (Diosmin)... 66 Abbildung 33: Chromatogramm-Ausschnitt des HPLC-online TEAC eines SPE- Flavonoidextraktes... 67 Abbildung 34: Chromatogramm-Ausschnitt des HPLC-online TEAC eines Rückstands- Flavonoidextraktes... 68 Abbildung 35: Durch HPLC-online TEAC ermittelte antioxidative Aktivität von Eriocitrin. 69 Abbildung 36: Veränderung der antioxidativen Aktivität von Eriocitrin in den SPE- Flavonoidextrakten bei Lagerung des Zitronensaftes... 70 Abbildung 37: Veränderung der antioxidativen Aktivität von Eriocitrin in den SPE- Flavonoidextrakten Pasteurisierung des Zitronensaftes... 71 Abbildung 38: Veränderung der antioxidativen Aktivität von Eriocitrin in den SPE- Flavonoidextrakten bei Langzeiterhitzung des Zitronensaftes... 71 Abbildung 39: Veränderung der antioxidativen Aktivität von Eriocitrin in den SPE- Flavonoidextrakten bei UV-Bestrahlung des Zitronensaftes... 72 VI
Abbildung 40: Veränderung der antioxidativen Aktivität von Eriocitrin in den SPE- Flavonoidextrakten bei Neutralisation des Zitronensaftes... 72 Abbildung 41: Chromatogramm des Aminosäurestandard-Mixes unter den HPLC- Methodenbedingungen der Originalmethode an der Shimadzu-Anlage... 74 Abbildung 42: Chromatogramm des Aminosäurestandard-Mixes unter den optimierten HPLC-Methodenbedingungen an der Shimadzu-Anlage... 75 Abbildung 43: Chromatogramm aller detektierbaren Aminosäuren unter den optimierten HPLC-Methodenbedingungen an der Jasco-Anlage... 76 Abbildung 44: Chromatogramm der 1. Fraktion einer SPE-Nullprobe zur Qualifizierung der Aminosäuren im Zitronensaft... 77 Abbildung 45: Beeinflussung der Flavonoid- und Alaninkonzentrationen der Einzel- Modellproben durch Erhitzung und ph-wert-änderung... 78 Abbildung 46: Chromatogramm der HPLC-Analyse der Eriocitrin-Modellprobe... 79 Abbildung 47: Veränderung der Eriocitrin- bzw. Hesperidin- und Alaninkonzentration durch Reaktion bei unterschiedlichen Bedingungen... 80 Abbildung 48: Veränderung der Rutin- bzw. Diosmin- und Alaninkonzentration durch Reaktion bei unterschiedlichen Bedingungen... 80 Abbildung 49: Veränderung der Flavonoidkonzentrationen bei Erhitzung und ph-wert- Änderung des Zitronensaftes... 81 Abbildung 50: Veränderung der Aminosäurekonzentrationen im Zitronensaft durch Erhitzung und ph-wert-änderung... 83 Abbildung 51: Chromatogramm-Ausschnitt der 1. Fraktion einer SPE-Nullprobe (Dreifachbestimmung)... 84 VII
TABELLENVERZEICHNIS Tabelle 1: Hauptbestandteile von frischgepresstem Zitronenmuttersaft... 2 Tabelle 2: Antioxidative Strukturmerkmale der Zitrusflavonoide Eriocitrin, Hesperidin, Rutin und Diosmin... 8 Tabelle 3: Aminosäuregehalte in Citrus medica L.... 10 Tabelle 4: Verwendete Chemikalien mit Angabe des Reinheitsgrades und Hersteller... 11 Tabelle 5: HPLC-Anlage mit UV/VIS- und Fluoreszenzdetektor (Aminosäure- und Flavonoidanalytik)... 12 Tabelle 6: HPLC-Anlage mit UV/VIS- und Fluoreszenzdetektor (Aminosäureanalytik)... 13 Tabelle 7: HPLC-Anlage mit Diodenarray-Detektor (DAD) und Massenspektrometer (MS) 13 Tabelle 8: HPLC-Anlage mit UV/VIS-Detektor und online TEAC-Messung... 13 Tabelle 9: Verwendete Geräte mit Angabe des Herstellers... 13 Tabelle 10: HPLC-Methodenbedingungen für Flavonoidanalytik... 19 Tabelle 11: Pipettierschema für Herstellung der Kalibrierlösungen zur Flavonoidanalytik... 20 Tabelle 12: Pipettierschema für Herstellung der Diosmin-Kalibrierlösungen zur Flavonoidanalytik... 20 Tabelle 13: HPLC-Methodenbedingungen für Flavonoididentifizierung... 21 Tabelle 14: HPLC-Methodenbedingungen für Flavonoid-Fraktionierung... 23 Tabelle 15: Pipettierschema für Herstellung der Trolox-Kalibrierlösungen... 25 Tabelle 16: Methodenbedingungen für HPLC-online TEAC... 27 Tabelle 17: HPLC-Methodenbedingungen für Aminosäureanalytik (Originalmethode) an Shimadzu-Anlage... 29 Tabelle 18: Optimierte HPLC-Methodenbedingungen für Aminosäureanalytik an Jasco- Anlage... 30 Tabelle 19: Pipettierschema für Herstellung der Stammlösung (Standard 4) für Kalibrierung zur Aminosäureanalytik... 33 Tabelle 20: Pipettierschema für Herstellung der Kalibrierlösungen 1-3 zur Aminosäureanalytik... 33 Tabelle 21: HPLC-Methodenbedingungen zur Identifizierung möglicher Aminosäure- Flavonoid-Addukte... 34 Tabelle 22: Ermittelte Konzentrationen durch sechsmalige Extraktion der Flavonoide aus den Zentrifugationsrückstand einer Nullprobe... 38 Tabelle 23: Vergleich der Hesperidinkonzentrationen in den Rückständen zweier Nullproben durch sechsmalige Extraktion... 39 VIII