Versuch 2 Chromatographie Protokollant: E-mail: Studiengang: Gruppen-Nr: Semester: Betreuer: Wird benotet?: Max Mustermann max@mustermann.de X X X Prof. Dr. Schäfer JA
Gelchromatographische Trennung eines Proteingemischs 1.1 Einleitung Das Ziel dieses Versuchstages war die gelchromatographische Trennung und Identifizierung der Komponenten eines Proteingemischs bestehend aus: Dextranblau, Rinderserumalbumin, Cytochrom-c und Chromat. Es sollten auch die Verteilungskoeffizienten der jeweiligen Proteine für das verwendete Gel bestimmt werden und ein Elutionsdiagramm erstellt werden. Zur Bestimmunng der Konzentrationen in den einzelnen Fraktionen wurde ein Eppendorf-Photometer (wie am Versuchstag 1) verwendet. Auch wurde wieder die Proteinbestimmungsmethode nach Lowry angewandt. 1.2 Material und Methode Die bei diesem Versuch benutzten Materialien sind im Skript auf Seite 7 unter Reagenzien angegeben. Das Verfahren der Photometrie wurde schon im Protokoll zum 1. Versuchstag erläutert. Das Prinzip der Gelfiltration wird nachfolgend beschrieben. Trennprinzip der Gelchromatographie Die Gelchromatographie, die häufig auch als Gelfiltration, Ausschluß- oder Molekularsiebchromatographie bezeichnet wird, ist ein chromatographisches Verfahren, welches eine Trennung gelöster Substanzen nach ihrer Molekülgröße ermöglicht. Dieses Verfahren findet heute sowohl bei der Lösung analytischer, als auch präparativer Aufgaben in den Laboratorien eine breite Anwendung. Das gelchromatographische Trennprinzip wird in der Regel bei der Niederdrucksäulenchromatographie eingesetzt, wobei die Weiterentwicklung der Trennmaterialien auch zunehmend einen Einsatz in der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) gestattet. Als stationäre Phase dient bei der Gelchromatographie ein poröses Material, welches in eine Glassäule gefüllt wird und mit Wasser oder Elektrolytlösung aufgequollen wird (1mL Sephadex reicht für eine ganze Säule Eigenvolumen der Gelmatrix geht gegen Null und wird vernachlässigt). Dabei handelt es sich um kleine Perlen aus hydrophilen Polysacchariden (Dextran, Agarose) oder Polyacrylamid, deren Kettenstruktur zu einem dreidimensionalen Netzwerk verflochten ist. Das verwendete Material (Trägermaterial) und sein Vernetzungsgrad definiert die Porengröße der stationären Phase (Gelmatrix). Durch die Porengröße wiederum wird bestimmt, ob ein Molekül einer bestimmten Größe in das Gel diffundieren kann. Moleküle, die zu groß sind, um in die Poren eindiffundieren, steht nur das Volumen zwischen den Gelpartikeln zur Verfügung, sie werden praktisch ausgeschlossen. Große Moleküle diffundieren um die Gelpartikel herum und werden von der mobilen Phase (Pufferstrom) schnellstmöglich durch die Säule transportiert. Kleine Moleküle
können in die Gelporen eindringen, wodurch ihre Wanderungsgeschwindigkeit in der Säule vermindert wird. Je kleiner ein Molekül, desto größer das zugängliche Porenvolumen und entsprechend länger dauert seine Wanderung durch die Säule: die Auftrennung erfolgt damit nach Molekülgröße. Es gilt: Je kleiner ein Molekül, desto geringer ist seine Wanderungsgeschwindigkeit in der Säule. Moleküle mittlerer Größe können das vorhandene Porenvolumen nur zum Teil ausnutzen. Bei einer Gelfiltration können die zu trennenden Substanzen (unabhängig von ihrer Molekülgröße) nicht vor einem bestimmten Elutionsvolumen die Säule passieren. Dieses Volumen wird als Ausschlußvolumen (Äußeres Volumen) V 0 bezeichnet. Es entspricht dem Volumen des Raumes zwischen den Gelpartikeln. Sehr große Moleküle, die nicht in die Poren der Gelmatrix eindringen können, passieren direkt nach Elution des Ausschlußvolumens die Säule. Damit ist die Bestimmung des Ausschlußvolumens V o experimentell möglich. Das Flüssigkeitsvolumen in den Gelpartikeln wird definitionsgemäß als inneres Volumen Vi bezeichnet. Die kleineren Moleküle, die in die Gelpartikeln eindringen können, treten mit der Elution des inneren Volumens im Eluat auf. Letztlich berechnet sich das Gesamtfüllvolumen Vt einer Gelsäule nach: Vt = V o + V i Aus den Dimensionen der Säule läßt sich Vt auch schon vorab berechnen (Volumen eines Hohlzylinders). Analog zum R f Wert einer Dünnschichtchromatographie definiert man bei der Gelfiltration den Verteilungskoeffizienten K = V el V o / Vt V o Der Verteilungskoeffizient K nimmt einen Wert zwischen 0 und 1 an und macht somit eine Aussage über die Molekülgröße. Ist K klein, so ist das Molekül groß. Sehr große Moleküle können, wie oben bereits erwähnt, nicht in die Gelkugeln eindringen. Sie befinden sich also ausschließlich in V o. Ist nun eine Menge von V o durch die Säule gelaufen, müsste theoretisch die Gesamtheit der großen Moleküle eluiert sein. V i spielt deshalb keine Rolle K = 0. Sehr kleine Moleküle können zusätzlich in das Innere der Gelkugeln eindringen. Da die Moleküle theoretisch in alle Gelkugeln eindringen ist für sie K = 1. 1.3 Versuchsdurchführung Von der im Skript auf den Seiten 7 und 8 angegebenen Versuchsdurchführung wurde nur einmal unwillentlich abgewichen: Die Fraktionen 30 und 31 sind jeweils 5mL statt 2,5mL. 1.4 Ergebnisse Zum Diagramm ist vorneweg zu sagen, dass die y-werte der einzelnen Elutionskurven nicht verglichen werden können, da die Extinktionen bei verschieden Wellenlängen gemessen wurden.
Die Konzentrationen von Dextranblau und Rinderserumalbumin wurden allerdings doch bei gleicher Wellenlänge photometrisch bestimmt (Rinderserumalbumin absorbiert nicht im Wellenlängenbereich in dem man das Eppendorf-Photometer einsetzten kann Anfärben nach Lowry). Das ist auch der Grund für den kleinen peak am Anfang der Kurve vom Rinderserumalbumin. Es handelt sich hier nicht um eine erhöhte Konzentration des Proteins in diesen Fraktionen, sondern um eine Überlagerung durch das Dextranblau. Dies ist auch schön zu erkennen, denn der peak von Dextranblau und der Erste vom Rinderserumalbumin sind von den Konzentrationen der jeweils zugehörigen Proteine kurz vorher aus betrachtet, gleich hoch
Dextranblau (Extinktion gemessen bei 578nm) Fraktion 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Eluiertes Volumen (ml) 2,5 5 7,5 10 12,5 15 17,5 20 22,5 25 27,5 30 32,5 35 Extinktion E 0,060 0,060 0,060 0,068 0,060 0,062 0,063 0,070 0,080 0,105 0,141 0,140 0,092 0,085 Rinderserumalbumin (Lowry) (Extinktion gemessen bei 578nm) Fraktion 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Eluiertes Volumen (ml) 27,5 30 32,5 35 37,5 40 42,5 45 47,5 50 Extinktion 0,235 0,280 0,235 0,230 0,085 0,195 0,250 0,280 0,300 0,170 Cytochrom c (Extinktion gemessen bei 436nm) Fraktion 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Eluiertes Volumen (ml) 45 47,5 50 52,5 55 57,5 60 62,5 65 67,5 70 72,5 Extinktion 0,129 0,135 0,134 0,135 0,142 0,145 0,150 0,155 0,153 0,140 0,157 0,123 Chromat (Extinktion gemessen bei 366nm) Fraktion 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Eluiertes Volumen (ml) 60 62,5 65 67,5 70 72,5 77,5 82,5 85 Extinktion 0,424 0,425 0,510 0,582 0,635 0,695 0,775 0,406 0,170 = Fehlmessung (in Auswertung nicht beachtet) = Höchste Extinktion der jeweiligen Messreihe (peak)
Elutionsdiagramm 0,9 0,8 0,7 0,6 Extinktion 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Eluiertes Volumen (ml) Dextranblau Rinderserumalbumin (Lowry) Cytochrom c Chromat
Berechnung der Verteilungskoeffizienten: Das Ausschlußvolumen V o ist das Volumen V el, das eluiert wurde bis zur höchsten Konzentration von Dextranblau im Eluat (Dextranblau kann nicht in die Gelmatrix eindringen, da es zu groß ist). V o = 27,5,5mL Das Totalvolumen der Säule V t kann man auf zwei verschiedene Weisen bestimmen. Einmal kann man das Säulenvolumen als V t festlegen, da man davon ausgeht, dass es zu keinen Wechselwirkungen zwischen den Proteinen und dem Gel kommt, so dass beim Durchlaufen des gesamten Volumens der Säule alle Moleküle eluiert sind. Säulenvolumen: -Innendurchmesser der Chromatographiesäule Ø = 1,5cm Radius r = 0,75cm -Höhe des Gelbetts h = 35cm Säulenvolumen = π r 2 h = π 0,5625cm 2 35cm = 61,85cm 3 = 61,85mL = V t Andererseits kann man als V t auch das gesamte eluierte Volumen V t = V o + V i nehmen. V t = 77,5mL (Maximum von Chromat) Mit diesen beiden Werten für V t kann man nun nach der Formel K = V el V o / V t V o die Verteilungskoeffizienten K für die verschiedenen Bestandteile des Proteingemischs errechnen. Es ist abzusehen, dass bei Rechnungen mit V t = Säulenvolumen undefinierte Werte für K herauskommen. Dextranblau: peak bei V el = 27,5,5mL = V o K = (27,5mL 27,5mL ) / (77,5mL 27,5mL ) = 0 (mit V t = eluiertes Gesamtvolumen) K = (27,5mL 27,5mL ) / (61,85mL 27,5mL ) = 0 (mit V t = Säulenvolumen) Rinderserumalbumin: peak bei V el = 47,5mL K = (47,5mL 27,5mL) / (77,5mL 27,5mL) = 0,4 (mit V t = eluiertes Gesamtvolumen) K = (47,5mL 27,5mL) / (61,85mL 27,5mL) = 0,58 (mit V t = Säulenvolumen) Cytochrom c: peak bei V el = 62,5mL K = (62,5mL 27,5mL) / (77,5mL 27,5mL) = 0,7 (mit V t = eluiertes Gesamtvolumen) K = (62,5mL 27,5mL) / (61,85mL 27,5mL) = 1,02 (mit V t = Säulenvolumen) Chromat: peak bei V el = 77,5mL = V i K = (77,5mL 27,5mL) / (77,5mL 27,5mL) = 1 (mit V t = eluiertes Gesamtvolumen) K = (77,5mL 27,5mL) / (61,85mL 27,5mL) = 1,46 (mit V t = Säulenvolumen)
1.5 Auswertung Wie erwartet liegt der Verteilungskoeffizient K immer zwischen 0 und 1, wenn Man V t = eluiertes Gesamtvolumen setzt. Rechnet man mit V t = Säulenvolumen so führt dies zu einem Verteilungskoeffizienten K, der sich von dem Verteilungskoeffizienten, welcher V t = eluiertes Gesamtvolumen berechnet wurde, unterscheidet. Jedoch ist klar feststellbar, dass auch diese Verteilungskoeffizienten mit der Molekülgröße umgekehrt proportional sind. Die Verteilungskoeffizienten von Cytochrom c und Chromat liegen mit V t = Säulenvolumen sogar im nicht definierten Bereich. Der Grund dafür ist wahrscheinlich, dass es doch zu Wechselwirkungen zwischen dem Proteingemisch kommt, die die Durchlaufzeit der Substanzen noch weiter verlangsamen. Wenn man die K-Werte betrachtet die mit V t = eluiertes Gesamtvolumen errechnet wurden ist klar, dass K für Dextranblau gleich 0 wird und K für Chromat gleich 1, da ja V el Dextranblau gleich V o gesetzt wurde und V el Chromat = V i. Dies ist erlaubt, da man die Porengröße der Gelmatrix und die Größe dieser beiden globulären Proteine kennt. Dextranblau und Chromat wurden sozusagen als Markerproteine eingesetzt. Vergleicht man die Größe der obigen Moleküle mit deren K- Wert, so zeigt sich, dass der Verteilungskoeffizient K eine Aussage über die Molekülgröße macht. Je kleiner K, desto größer ist das Molekül. Das Diagramm zeigt den gleichen Sachverhalt. Zusammenfassend ist zu sagen, dass die Gelfiltration gut geeignet ist um Proteingemische der Größe nach aufzutrennen. Es darf allerdings nicht angenommen werden, dass es zu keinen Wechselwirkungen zwischen den Proteinen und der Gelmatrix kommt. Literatur -Skript zum Biochemischen Grundpraktikum, Institut für Biochemie, J.-G.-Universität- Mainz -Biochemisches Praktikum, Kleber, Schlee, Schöpp, Verlag: Gustav Fischer, 1997 -Biochemie, Stryer, Verlag: Spektrum, 1994 (2. durchgesehene Auflage)