Berichte aus der Pharmazie Ulrich Warnke Untersuchungen zur Platin-DNA-Adduktbildung mittels Kapillarelektrophorese Möglichkeiten und Grenzen D 188 (Diss. Freie Universität Berlin) Shaker Verlag Aachen 2001
INHALT 1 Einleitung _ 3 1.1 Kapillarelektrophorese 3 1.1.1 Aufbau eines CE-Systems 4 1.1.2 Prinzipien der Kapillarelektrophorese 5 1.1.2.1 Elektrophorese 5 1.1.2.2 Elektroendosmotischer Fluss 7 1.1.2.3 Effizienz und Peakaufiösung 9 1.2 Therapie maligner Tumoren mit Platinkomplexen ' 12 1.2.1 Maligne Tumoren 12 1.2.2 Platinkomplexe in der Onkologie 13 1.3 Analytik von Platin-DNA-Addukten 21 1.4 Surrogatfunktion Platin-DNA-Adduktbildung 23 1.5 Besondere Strategien für die Therapie mit Platinkomplexen 23 1.6 Problemstellung und Zielsetzung 27 2 Material und Methoden 31 2.1 Materialien 31 2.1.1 Chemikalien und Reagenzien 31 2.1.2 Verwendete Lösungen und Puffer 32 2.1.3 Verbrauchsmaterialien 34 2.1.4 Geräte 35 2.2 Kapillarelektrophorese 36 2.2.1 Entwicklung eines CZE-Trennsystems 36 2.2.1.1 Messprinzip 36 2.2.1.2 Trennsystem und Detektion 36 2.2.1.3 Methodenentwicklung und-optimierung 37 2.2.2 Validierung 42 2.2.2.1 Spezifität 42 2.2.2.2 Messbereich, Linearität 42 2.2.2.3 Stabilität 43
2.2.2.4 Bestimmungs- und Nachweisgrenze 43 2.2.2.5 Richtigkeit und Präzision 43 2.2.2.6 Qualitäts-Kontroll-Proben (Qualtty Control Samples) AA 2.2.2.7 Kalibrierung - 45 2.2.2.8 Konzentrationsberechnung 45 2.3 Untersuchungen zur Adduktbildung mit Mononukleotiden 46 2.3.1 CZE-Untersuchungen mit Standardnukleotiden 46 2.3.1.1 Inkubationen mit Cisplatin, Carboplatin, Oxaliplatin und Lobaplatin 46 2.3.2 CE/MS-Kopplung 47 2.3.2.1 Aufklärung der Adduktidentität 48 2.3.2.2 Spezielle Untersuchung der 6-O-N(7)-Chelatbildung ' 50 2.4 Untersuchungen zur Adduktbildung mit DNA 52 2.4.1 Untersuchungen mit Kalbsthymus-DNA 52 2.4.2 Isolierung der Leukozyten 53 2.4.3 Untersuchungen mit Leukozyten und Tumorzellen 53 2.4.3.1 Inkubation von Leukozyten mit Cisplatin 53 2.4.3.2 Inkubation von Tumorzell-ünien mit Cisplatin 54 2.4.4 DNA-Isolierung aus Leukozyten und Tumorzellen 55 2.4.5 Bestimmung des DNA-Gehaltes 55 2.4.6 Enzymatischer Abbau isolierter DNA 56 2.4.7 CE mit verdauter DNA 57 2.4.8 Quantifizierung der Platin-DNA-Adduktbildung mittels ELISA 57 2.5 Untersuchungen mit Platin-Albumin-Konjugaten 59 3 Ergebnisse 65 3.1 Entwicklung und Optimierung einer CZE-Bestimmungsmethode 65 3.1.1 Experimentelle Bestimmung der Mobilität von Desoxymononukleotiden 65 3.1.2 Berechnung der Nettoladung 66 3.1.3 Berechnung des Quotienten aus Nettoladung und Masse 67 3.1.4 Korrelation der Modellvorhersagen mit den experimentell bestimmten Mobilitätswerten 69 3.1.5 Einfluss der Konzentration des Trennelektrolyten 69 3.1.6 Einfluss von Trennspannung und Temperatur 71 3.1.7 Zusammenfassung 73
3.2 Vorstudienvalidierung 74 3.2.1 Spezifität 74 3.2.2 Messbereich und Linearität 75 3.2.3 Stabilität ~ 76 3.2.4 Bestimmungs- und Nachweisgrenze 78 3.2.5 Richtigkeit und Präzision 78 3.3 CZE-Untersuchungen zur Adduktbildung von Platinkomplexen 80 3.3.1 Inkubation von Nukleotiden mit Cisplatin 80 3.3.1.1 Elektropherogramme 80 3.3.1.2 Abnahmekinetik der Mononukleotide 82 3.3.1.3 Konzentrationsabhängigkeit der Adduktbildung 84 3.3.1.4 Charakterisierung der Adduktmuster 85 3.3.1.5 Einfluss der Chloridionen-Konzentration 87 3.3.1.6 Bestimmung der Absorptionsquotienten A 2M /A 2 6o 88 3.3.1.7 Untersuchung der Adduktbildung mittels Dioden-Array-Detektion (DAD) 89 3.3.2 Inkubation von Nukleotiden mit Carboplatin 91 3.3.3 Inkubation von Nukleotiden mit Oxaliplatin und Lobaplatin 94 3.4 Identifizierung der Platin-Nukleotid-Addukte mittels CZE/ESI-MS-Kopplung 97 3.4.1 Cisplatin-Addukte 97 3.4.2 6-O-N(7)-Chelatbildung 101 3.4.3 Addukte weiterer Platinkomplexe 106 3.4.3.1 Carboplatin 106 3.4.3.2 Oxaliplatin und Lobaplatin 107 3.5 Untersuchungen zur Adduktbildungskinetik 108 3.5.1 Kinetische Untersuchungen der Cisplatin-Adduktbildung mit dgmp 109 3.5.2 Kinetische Untersuchungen der Cisplatin-Adduktbildung mit damp 109 3.6 Untersuchungen zur Adduktbildung mit DNA 110 3.6.1 CZE-Untersuchungen zur Platin-DNA-Adduktbildung mit Kalbsthymus-DNA 110 3.6.2 Quantifizierung der Platin-DNA-Adduktbildung in Tumorzellen mittels ELISA 112 3.6.3 Quantifizierung der Platin-DNA-Adduktbildung in Leukozyten mittels ELISA 113 3.6.4 CZE-Untersuchungen der Platin-DNA-Adduktbildung in Tumorzellen 114 3.6.5 CZE-Untersuchungen der Platin-DNA-Adduktbildung in Leukozyten 115 3.7 Anwendung der CZE-Methode zur Untersuchung der Adduktbildung von Platin- Albumin-Konjugaten 115
3.7.1 Reaktivität der Platin-Konjugate A-Plat IX und A-Plat X 116 3.7.1.1 Inkubationen in neutralem ph-milieu 116 3.7.1.2 Inkubationen in saurer Umgebung 116 3.7.1.3 Inkubationen in neutralem ph-milieu nach vorangegangener saurer Spaltung 116 3.7.1.4 Untersuchung der Bindung an Albumin 117 3.7.2 Reaktivität aktiver Teilstrukturen von (potenziellen) Platin-Konjugaten 118 4 Diskussion 123 4.1 Kapillarzonenelektrophorese 123 4.1.1 Bestimmungsmethode 123 4.1.2 Adduktbildung verschiedener Platinkomplexe 4.1.3 Änderungen der UV-Absorption durch die Bildung von Addukten 127 4.2 Adduktidentifizierung mittels CZE/ESI-MS-Kopplung 129 4.3 Quantifizierung der zellulären Platin-DNA-Adduktbildung 133 4.4 Anwendung der CZE-Methode im Rahmen von Screening-Untersuchungen mit Platin-Albumin-Konjugaten 137 : 124 4.5 Perspektiven 139 5 Zusammenfassung 143 6 Literatur 149