Diplomarbeit im Studiengang Biotechnologie. vorgelegt von Dzevrije Sabani Serani Hamburg am

Transkript

1 Experimentelle Prüfung verschiedener Methoden der quantitativen Bestimmung gesamtcoliformer und fäkalcoliformer Bakterien (E. coli) für die qualitative Bewertung von Wasserproben Diplomarbeit im Studiengang Biotechnologie vorgelegt von Dzevrije Sabani Serani Hamburg am Gutachter: Prof. Dr. Birger Anspach Dr. Klaus Roch Fachhochschule Hamburg Fachamt für Umweltuntersuchungen, Umweltbehörde Hamburg Die Diplomarbeit wurde betreut und erstellt im Fachamt für Umweltuntersuchungen Hamburg, Marckmannstr. 129 b, Hamburg

2 Danksagungen Diese Arbeit wurde erstellt mit freundlicher Unterstützung der Mitarbeiter im Fachamt für Umweltuntersuchungen Hamburg. Ein ganz besonderer Danke gilt dabei Frau Keitel für ihre tatkräftige Unterstützung bei den praktischen Arbeiten im Labor. Für die freundliche Unterstützung bei der paktischen und theoretischen Arbeit möchte ich mich herzlich bei Herrn Dr. Roch bedanken. Für die umfassende Betreuung der Diplomarbeit danke ich Herrn Prof. Dr. Anspach.

3 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Bakteriologische Wasseruntersuchung 1 2. Material und Methoden Definition coliformer und fäkalcoliformer Bakterien Plattenmethoden Allgemeines Unterscheidung der Ausstriche bei den Plattenmethoden Selektiv-Nährböden zur Bestimmung von coliformen und fäkalcoliformen Bakterien (E. coli) Gerätschaften und Materialien Oberflächenausstrich Einmischverfahren (Plattengussverfahren) Membranfiltration Weitere Differenzierungen von coliformen und fäkalcoliformen Bakterien MPN-Verfahren (Mehrfachansatz) Allgemeines Bestimmung von coliformen Bakterien und fäkalcoliformen Bakterien (E. coli) Durchführung der Untersuchungen MPN-Verfahren mit Miniaturverfahren zur Erfassung von E. coli Allgemeines Durchführung der Untersuchungen Colilert-18 /Quanti-Tray -Verfahren Allgemeines Durchführung der Untersuchungen Prüfung biochemischer Merkmale von Mikroorganismen durch die Lange Bunte Reihe Membranfiltationsverfahren Allgemeines Durchführung der Untersuchungen 32

4 2.3.6 Zusammenfassung der unterschiedlichen Nährböden Mikrobiologische Referenzmaterialien Durchführung der Kultivierung von Kontrollstämme Einsatz der Gebrauchskulturen Statistische Prüfverfahren Statistik für die Qualitätssicherung in der Wassermikrobiologie Grundberechnungen Arithmetisches Mittel Varianz, Standardabeichung und Variationskoeffizienten Ergebnisse Vergleich verschiedener Untersuchungsverfahren Durchführung der Plattenmethoden Durchführung der MPN-Verfahren Ergebnisse der Untersuchungen auf coliformen Bakterien mit den Plattenmethoden Differenzierungen der coliformen Bakterien von Chromocult- Coliformen-Agar, Endo-C-Agar und Desoxycholat-Agar Ergebnisse der Untersuchungen coliformen Bakterien mit den MPN-Verfahren und Colilert -18-Verfahren Differenzierung der Colilert -18-Verfahren mit der Langen Bunten Reihe Ergebnisse der Untersuchungen auf Escherichia coli mit den Plattenmethoden Differenzierung der Escherichia coli von Chromocult-Coliformen- Agar, Endo-C-Agar und Desoxycholat-Agar Ergebnisse der Untersuchungen auf Escherichia coli mit den MPN-Verfahren und Coliler -18-Verfahren Ergebnisse der Untersuchungen auf Escherichia coli und coliformen Bakterien mit dem Membranfiltrationsverfahren Miniaturverfahren zur Zählung von Escherichia coli Ergebnisse der quantitativen Erfassung von coliformen Bakterien mit den einzelnen Verfahren 57

5 3.5.1 Chromocult-Coliformen-Agar Endo-C-Agar Desoxycholat-Agar MPN-Verfahren und Colilert -18-Verfahren Ergebnisse der quantitativen Erfassung von Escherichia coli mit den einzelnen Verfahren Desoxycholat-Agar Endo-C-Agar Fluorocult-ECD-Agar Chromocult-Coliformen-Agar MPN-Verfahren und Colilert -18-Verfahren Membranfiltrationsverfahren zur quantitativen Erfassung von Escherichia coli und coliformen Bakterien Miniaturverfahren zur Zählung von Escherichia coli Statistische Prüfverfahren zur quantitativen Erfassung der Ergebnisse Anwendung statistischer Prüfverfahren auf die Ergebnisse der Untersuchungen mit coliformen Bakterien Ergebnisse der E. coli mit den statistischen Prüfverfahren Untersuchungen von Umweltproben Vergleich von Ergebnissen der Alster- und Elbeproben Vergleich der Alsterproben mit den MPN-Verfahren Vergleich der Elbeproben mit verschiedene Verfahren Vergleich der Elbeproben aus der Kleine Elbe Vergleich der Elbeproben aus der Großen Elbe Schlussfolgerungen Analytische Qualitätssicherung für coliforme Bakterien Analytische Qualitätssicherung für fäkalcoliforme Bakterien (E. coli) Bewertung der Bestimmungsmethoden Zusammenfassung Literaturverzeichnis 76

6 Kapitel 1: Einleitung 1.Einleitung 1.1 Bakteriologische Wasseruntersuchung Die bakteriologische Untersuchung hat den Zweck, festzustellen, wie viele Bakterien einer Wasserprobe auf einem Nährboden bestimmter Zusammensetzung zur Vermehrung zu bringen sind. Zur Erhaltung einer bestimmten Gewässerqualität sind nationale Gesetze und Verordnungen sowie internationale Richtlinien erlassen worden. Die EG-Richtlinien enthalten Qualitäts- bzw. Gewässergüteziele, die aquatische Schutzgüter sichern, wenn die Grenzwerte eingehalten werden. In der EG-Richtlinie 76/160/EWG vom über die Qualität der Badegewässer werden z. B. für die Nutzung von natürlichen Gewässern als Badegewässer bakteriologisch-hygienische Anforderungen gestellt (Tab. 1.1). In Deutschland gilt auf der gesamtstaatlichen Ebene das Wasserhaushaltsgesetz (WHG). Das WHG dient als Rahmengesetz, durch das der Bund einen Regelungsrahmen vorgibt, den die Länder durch eigene Gesetze (Landeswassergesetze) auszufüllen haben. In den einzelnen Bundesländern führte dies z. B. zum Erlass von Badegewässerverordnungen. Die Überwachung des Wasserrechtes obliegt den zuständigen Behörden. [1] Tabelle 1.1: Leit- und Grenzwerte der EG-Richtlinie über die Qualität der Badegewässer vom bei denen die Werte nicht überschritten werden dürfen. Parameter Volumen Leitwert Grenzwert Coliforme 100 ml 500 (80) (95) 1 Fäkalcoliforme 100 ml 100 (80) 2000 (95) Zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von coliformen und fäkalcoliforme Bakterien Escherichia coli wurden daher verschieden bewährte und neuartige Verfahren eingesetzt. Neben verschiedenen Palettenverfahren wie zum Beispiel Desoxycholat-Agar-Verfahren, Chromocult-Coliformen-Agar, Endo-C-Agar, Fluorocult-ECD-Agar wurde die Most- Probable-Number -Methode (MPN) als Dreifachansatz angewendet. Darüber hinaus wurde ein MPN -Miniaturverfahren der Firma BIO RAD, bei dem die Probe mit sogenannten Mikrotiterplatten untersucht wird, eingesetzt. Ein weiteres Verfahren ist der Membranfiltrationsverfahren, die als Alternativverfahren für das Colilert-18-Verfahren zugelassen ist. Die Zielsetzung dieser Arbeit umfasst somit nicht nur auf die Einführung einer anerkannten qualitätssichernden Maßnahmen für den Bereich der bakteriologischen Wasseruntersuchung, sonder auch den Vergleich verschiedener Methoden mit dem Ziel, die optimale Bestimmungsmethode zu finden. 1 Probenzahlen in % 1

7 Kapitel 2: Material und Methoden 2. Methoden zur Bestimmung von coliformen und fäkalcoliformen Bakterien 2.1. Definition coliformer und fäkalcoliformer Bakterien Der direkte Nachweis von Krankheitserregern ist aufgrund der Vielzahl der Organismen und ihrer meist geringen Dichte zeitlich und arbeitstechnisch sehr aufwendig und in den meisten Fällen nicht durchführbar. Deshalb führt man bei der bakteriologischen Gewässerüberwachung in der Regel nicht unmittelbar den direkten Nachweis von potentiell pathogenen Organismen durch, sondern den von leichter erfassbaren Indikatorkeimen. Es handelt sich dabei um Bakterien, die aus dem Darm von Menschen und warmblütigen Tieren stammen und mit den Fäkalien bzw. dem gereinigten Abwasser in die Gewässer gelangen. Als Fäkalindikatoren werden die coliformen Bakterien (Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Escherichia) und insbesondere fäkalcoliforme Bakterien der Art Escherichia coli herangezogen. Das Vorkommen von coliformen Bakterien kann jedoch nur als Hinweis auf eine fäkale Verunreinigung dienen, da Vertreter dieser Gruppe auch im Boden und im Oberflächenwasser leben und damit nicht zwangsläufig fäkalen Ursprungs sein müssen. Eine eindeutige Aussage kann somit nur über den Nachweis des obligaten Darmbewohners Escherichia coli als Indikator einer fäkalen Verunreinigung gemacht werden. [1] Escherichia coli und coliforme Bakterien gehören zur Familie der Enterobacteriaceae. Sie sind sporenlose gramnegative Stäbchen, die Glucose und andere Kohlenhydrate unter Säureund Gasbildung metabolisieren. Die fakultativen Anaerobier sind auf den üblichen Nährmedien leicht anzüchtbar. [4] Die Verunreinigung von Gewässern durch Fäkalien und damit einhergehend mit Krankheitserregern kann zu einer weitgehenden Einschränkung der Nutzung führen. Betroffen sind dabei unter anderem die Trinkwassergewinnung oder die Landwirtschaft sowie Freizeit und Erholung des Menschen. 2.2 Plattenmethoden Bei der Plattenmethoden werden verschiedene Nährböden auf coliforme und fäkalcoliforme Bakterien untersucht Allgemeines Unter der Plattenmethode ist die Kultivierung von Bakterien in einem festen Nährmedium zu verstehen. Dieses feste Medium besteht aus Gelatine, Agar-Gel oder Natriumsilikat, das Nährstoffe und weitere selektive Substanzen enthält. Je nach Untersuchungsziel werden die Bakterien auf verschiedenen Nährböden unterschiedlich kultiviert. Man unterscheidet hauptsächlich folgende Medien: 2

8 Kapitel 2: Material und Methoden Selektivmedien, die das Wachstum einer bestimmten Gattung fördern und möglichst alle andere Arten hemmen, aber auch Anreicherungsmedien, mit denen das Wachstum einer Bakterienart in einer Mischprobe gegenüber anderen Keimen beschleunigt wird. Differenzierungsmedien zur Bestimmung mehrer Bakterienarten nebeneinander durch Bildung charakteristischer Unterschiede im Koloniewachstum. In der bakteriologischen Wasseruntersuchung sind vor allem selektive Nährböden von Bedeutung, deren Inhaltsstoffe und Zusammensetzung das Wachstum des nachzuweisenden Organismus fördern und gleichzeitig unerwünschte Begleitorganismen hemmen. Das Festmedium wird üblicherweise in einer sterilen Petri-Schale angewendet. Es wird mit einer geringen Menge an Probematerial beimpft und anschließend im Brutschrank bei einer konstanten Temperatur bebrütet. Nach einer bestimmten Inkubationszeit entwickeln sich durch die Vermehrung der Bakterien Kolonien. Jedes Bakterium braucht neben verschiedenen, oft spezifischen Nährstoffen eine bestimmte Temperatur zum optimalen Wachstum. Durch die Temperatur lassen sich bereits bestimmte Bakterien qualitativ differenzieren. So wird bei einer Methode zur Gewässeruntersuchung beispielsweise zur Bestimmung der coliformen Bakterien der Desoxycholat-Agar bei 37 C bebrütet, zur Bestimmung der fäkalcoliforme Bakterien wird die Temperatur auf 44 C erhöht. Somit wird die Tatsache genutzt, dass fäkalcoliforme Bakterien eine größere Thermotoleranz besitzen. Die eindeutige Identifizierung eines Bakteriums erfolgt durch Form, Größe und Farbe der Kolonien. Je nach Spezies können typische Kolonienformen entstehen. Durch den Zusatz von chromogenen Substanzen kann ein weiteres Erkennungsmerkmal geschaffen werden, da diese durch spezifische Stoffwechselprodukte der Bakterien in Farbkomplexe umgesetzt werden und die Kolonien anfärben Unterscheidung der Ausstriche bei den Plattenmethoden Bei der Plattenmethode läßt sich eine Vielzahl von unterschiedlichen Verfahren zur Beimpfung unterscheiden. Oberflächenausstrich Beim Ausplattieren wird das Inokulum (0,1-0,5 ml) mit einer Impfschlinge auf dem festen Nährboden ausgestrichen. Somit wachsen die Bakterien nur auf der Oberfläche des Nährbodens. Diese Methode wird immer dann eingesetzt, wenn es sich um einen Indikator-Agar handelt, bei dem eine eindeutige Farbreaktion mit den Kolonien stattfinden muss. Abweichende Färbungen entstehen vor allem bei eingemischten Kolonien, da beispielsweise unter der Oberfläche andere Sauerstoffverhältnisse herrschen können. Verdünnungsausstrich (fraktionierter Ausstrich) Benötigt man einzelne, gut isolierte Kolonien, die aus einer Probe mit hoher Keimdichte entstehen sollen, wird das Inokulum schrittweise verdünnt, so dass in einigen Zonen der Platte einzelne Kolonien zurückbleiben. 3

9 Kapitel 2: Material und Methoden Einmischverfahren Die Kolonien wachsen besser, wenn man zunächst das Inokulum in die leere Petri-Schale pipettiert und anschließend mit zuvor verflüssigtem Nährboden übergießt. Dieses Einmischverfahren ist vor allem bei beweglichen Bakterien anzuwenden, da diese sonst an der Oberfläche schwärmen und einzelne Kolonien schwer zu erkennen sind. Auch bei hoher Keimdichte der Proben bietet sich dieses Verfahren an, da die eingeschlossenen Keime wesentlich kleinere und kompaktere Kolonien bilden als auf der Oberfläche. Dadurch können viele Kolonien deutlich erkennbar nebeneinander wachsen, ohne dass diese zusammentreffen und zu größeren Einheiten zusammenwachsen. Membranfiltration Bei der bakteriologische Untersuchungen wird das Inokulum durch einen bakterienundurchlässigen Membranfilter (Porengröße 0,45 µm, 50mm) mittels eines Filtrationsgerätes filtriert. Das Filter wird auf einen geeigneten Agar gelegt und inkubiert. Aus dem Nährboden diffundieren die Nährstoffe durch die Porenstruktur des Filters, so dass sich einzelne Organismen vermehren können. Das Auszählen der Kolonien wird durch eine entsprechende Farbe des Filters und durch das eingedruckte Gitternetz erleichtert. Zur quantitativen Bestimmung der Keimzahl werden die Kolonien unter einem Keimzählgerät mit 6-8facher Vergrößerung ausgezählt. Das Ergebnis der Koloniezählung wird in Koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (KBE/ml) angegeben. Die Zahl der Kolonien pro Platte sollte zwischen 30 und 300 liegen. Bei hoher Keimdichte zählt man nur einige zufällig ausgewählte Quadrate im Sichtfeld und bestimmt mit dem Mittelwert dieser Einzelzählungen die Gesamtzahl pro Platte. Das Fachamt für Umweltuntersuchungen Hamburg gibt zur Auswertung der Koloniezahl vor, dass bei starkem Bewuchs der Platte fünf zufällig ausgewählte Quadrate (á 1 cm 2 ) ausgezählt werden. Der aus diesen fünf Einzelzählungen gebildete Mittelwert wird dann mit einem Faktor multipliziert, so dass man die Gesamtkoloniezahl erhält. Ist die Keimdichte auf der Platte zu hoch (>>300/Platte) muss der Ansatz mit höheren Verdünnungen wiederholt werden. Die Verdünnung erfolgt in der Regel in Zehnerpotenzen Selektiv-Nährböden zur Bestimmung von coliformen und fäkalcoliformen Bakterien (E.coli) Es werden bestimmte Selektiv-Nährböden wie Desoxycholat-Agar, Endo-C-Agar, Chromocult-Coliformen-Agar und Fluorocult-ECD-Agar für die Bestimmung von coliformen und fäkalcoliformen Bakterien angewendet. 4

10 Kapitel 2: Material und Methoden Gerätschaften und Materialien Zur Durchführung der verschiedenen Plattenmethoden und für die Zubereitung der Nährboden werden folgende Materialien und Geräte benötigt: Sterile Petri-Schalen (BIOPUR, Art-Nr. 391K3660) Elektrische Heizplatte Wasserbad Brutschränke Memmert, thermostatisiert, 37 C und 44 C Eppendorf-Pipette 1 ml, 100 µl, 10 µl Sterile Pipettenspitzen µl (z. B. EPPENDORF BIOPUR) Einmal-Impfösen, steril, Standard 10 µl (VWR, Art. Nr.: 631Q2211) Membranfilter 0,45µm ( ME 25/21, SCLEICHER & SCHUELL) Vakuumpumpe (VACU USOG, Firma GERHARDT) Einmalbecher Waage (SARTORIUS BP 8100) Kolonienzählgerät mit Lupe (Keimzählgerät WTW BZG 28) Oxidase-Teststreifen, MERCK (Art. Nr.: ) Kovac s Reagenz für Indol-Test, MERCK Art. Nr.: Desoxycholat-Agar Dieser spezielle Desoxycholat-Citrat-Nährboden der Firma OXOID (Art. Nr.: CM 163) ist zur Isolierung und Keimzählung von coliformen und fäkalcoliformen Bakterien (Escherichia coli) in Milch, Speiseeis und Wasser entwickelt. Er wird im Fachamt für Umweltuntersuchungen Hamburg zum routinemäßigen Nachweis von coliformen und fäkalcoliformem Bakterien (E. coli) in Oberflächengewässern verwendet. Zusammensetzung der Bestandteile des Nährbodens in g je Liter: Pepton 10,0 Laktose 10,0 Natriumdesoxycholat 1,0 Natriumchlorid 5,0 di-kaliumhydrogenphosphat 2,0 Eisen(III)-Citrat 1,0 Natriumcitrat 1,0 Neutralrot 0,3 Technischer Agar 15,0 5

11 Kapitel 2: Material und Methoden Die Laktose dient den coliformen Bakterien als fermentierbare Kohlenstoffquelle. Der Abbau von Laktose zu Säure wird durch einen Farbumschlag des ph-indikators Neutralrot nach rosa und durch einen gleichzeitigen Präzipitalhof von Gallensäure angezeigt. Die Kolonien von Escherichia coli erscheinen somit rot und haben einen Präzipitalhof. Die Selektivität des Agars wird durch Desoxycholat und Citrat erhöht, wodurch die grampositive Begleitflora gehemmt wird. Die Selektivität wird bei anderen Desoxycholat-Nährböden mit größeren Anteilen an Natriumdesoxycholat noch gesteigert. Endo-C-Agar Es handelt sich um einen Selektivnährboden nach ENDO(1904) zum Nachweis von coliformen und fäkalcoliforme Bakterien (Escherichia coli) in den verschiedensten Materialien. Der Endo-C-Agar von MERCK (Art. Nr.: ) hat folgende Zusammensetzung in g je Liter: Pepton 10,0 Laktose 10,0 di-kaliumhydrogenphosphat 2,5 Natriumsulfit, wasserfrei 3,3 Pararosanilin (Fuchsin) 0,3 Agar-Agar 12,5 Natriumsulfit und Fuchsin hemmen grampositive Bakterien. E. coli und Coliforme verwerten Laktose unter Bildung von Aldehyd und Säure. Aldehyd setzt Fuchsin aus der Fuchsin-Sulfid- Verbindung frei, welches dann die Kolonien rot anfärbt. Bei E. coli ist diese Reaktion so intensiv, dass das Fuchsin auskristallisiert und dadurch den Kolonien einen grünschimmernden, beständigen Metallglanz (Fuchsinglanz) verleiht. Die Coliformen zeigen keinen Fuchsinglanz. Fuchsin gilt als potenziell krebserzeugend. Deshalb darf man Farbstoff und Nährboden nicht mit der Haut in Berührung bringen. Durch Sauerstoffeinwirkung wird der aufgegossene Nährboden infolge der Oxidation des Sulfits allmählich rot und damit unbrauchbar. Selbst in Dunkelheit und bei Kühlschranktemperaturen ist er nur wenige Tage haltbar. Chromocult-Coliformen-Agar Der von MERCK entwickelte Coliformen-Agar (Art. Nr.: /0500) gehört zur Produktgruppe der Chromocult-Trockennährböden. Die Bestimmung von Bakterien durch diese speziellen Nährböden erfolgt mittels chromogener Substrate. Sie ermöglichen eine schnelle Identifizierung von Bakterien durch den Nachweis charakteristischer Enzyme. Beim Chromocult-Coliformen-Agar handelt es sich um einen Selektivagar zum gleichzeitigen Nachweis von coliformen und fäkalcoliformen Bakterien (E. coli) bei der bakteriologischen 6

12 Kapitel 2: Material und Methoden Untersuchung von Wasser und Lebensmitteln. Der Coliformen-Agar setzt sich wie folgt zusammen in g je Liter: Pepton 3,0 Natriumchlorid 5,0 di-natriumhydrogenphosphat 2,7 Natriumpyruvat 1,0 Natrium-di-hydrogenphosphat 2,2 Tryptophan 1,0 Agar-Agar 10,0 Sorbit 1,0 Tergitol-7 0,15 Chromogenmischung 0,4 (Enthält u.a. Salmon-GAL und X-Glucuronid) Durch die Kombination von geeigneten Peptonen, Pyruvat, Sorbit und Phosphatpuffer wird ein schnelles Anwachsen auch von subletal geschädigten coliformen Bakterien gewährleistet. Der Gehalt an Tergitol-7 hemmt weitgehend das Wachstum grampositiver und einiger gramnegativer Bakterien, ohne Einflüsse auf das Wachstum der Coliformen zu haben. Der simultane Nachweis von Coliformen und E.coli wird durch die neue Kombination von zwei chromogenen Substanzen möglich. Das Substrat Salmon-GAL wird durch die Coliforme charakteristische ß-D-Galactosidase gespalten und bewirkt eine rosa-rote Färbung der Coliformen-Kolonien. Der Nachweis der für E. coli charakteristischen ß-D-Glucuronidase erfolgt über das Substrat X-Glucuronid, das eine Blaufärbung der positiven Kolonien bewirkt. Da E. coli sowohl Salmon-GAL als auch X-Glucuronid spaltet, färben sie sich dunkelblauviolett. Somit sind sie leicht von den übrigen, rosaroten coliformen Bakterien zu differenzieren. Fluorocult-ECD-Agar Der von MERCK für den Nachweis von E. coli entwickelte Fluorocult-ECD-Agar (Art.Nr /0500) gehört zur Produktgruppe der Fluorocult-Trockennährböden. Der Nährboden wird in der üblichen Weise mittels Oberflächenausstrich beimpft. Der Nährboden besteht aus (Angaben in g/l): Pepton aus Casein 20,0 Laktose 5,0 Natriumchlorid 5,0 7

13 Kapitel 2: Material und Methoden Gallesalzmischung 1,5 di-kaliumhydrogenphosphat 4,0 Kaliumdihydrogenphosphat 1,5 Agar-Agar 15,0 Tryptophan 1,0 4-Methylumbelliferyl-ß-D-glucuronid 0,07 Die Gallesalzmischung diese E. coli-direkt-agars hemmt weitgehend die nicht obligat im Darm vorkommende Begleitflora. Die Kolonien, die durch Spaltung des 4- Methylumbelliferyl-ß-D-glucuronids) hellblau fluoreszieren, werden mittels einer UV-Lampe abgelesen. Zusätzlich wird durch eine positiven Indolprobe, die eine Rotfärbung hervorruft, die Anwesenheit von E.coli bestätigt. Der Fluorocult-ECD-Agar wurde als Trockensubstanz geliefert und im Labor angesetzt. Es werden 53,1 g des Pulvers eingewogen und in einem Liter destillierten Wasser gelöst. Die Lösung wird mit Hilfe eines ph-meters auf ph 7,0 eingestellt und 15 Minuten bei 121 C autoklaviert. Nach dem Abkühlen (ca C) der Lösung im Wasserbad wird die Lösung in sterilen Petri-Schalen gegossen. Bei den vier verwendeten Nährböden wurden zwei unterschiedliche Beimpfungsmethoden angewendet. Die jeweilige Methode ergibt sich aus den in der Literatur empfohlenen Anwendungsverfahren. Bei Nährböden, für die mehrere Beimpfungsmethoden in Betracht kommen, wurde entweder die im Labor bereits bewährte Methode übernommen oder in Vorversuchen das geeignetste Verfahren ermittelt Oberflächenausstrich Im Oberflächenausstrich wurden folgende Nährböden beimpft: Endo-C-Agar (coliforme Bakterien bei 37 C, E. coli bei 44 C) Chromocult-Coliformen-Agar (coliforme Bakterien und E. coli bei 37 C) Fluorocult-ECD-Agar (E. coli bei 44 C) Die fertigen Platten mit dem festen Nährboden für Endo-C-Agar und Chromocult- Coliformen-Agar werden gekühlt vorrätig gehalten. Vor der Benutzung werden die Nährböden mit geöffnetem Deckel im Brutschrank bei 37 C für ca. 15 Minuten vorgewärmt. Dadurch wird eventuell in den Schalen vorhandenes Kondenswasser entfernt und der Nährboden eignet sich anschließend besser zum Ausstreichen der Keime. Die vorgewärmten Platten werden mit einem bestimmten Volumen der Probe befüllt. Die geeignetste Probenmenge wurde bei den Vorversuchen ermittelt. Bei der Endo-C- Agarplatte konnte kein großes Volumen gewählt werden, da der Nährboden für größere Volumen sich nicht als saugfähig festgestellt hat. Aber bei der Fluorocult-ECD-Agarplatte 8

14 Kapitel 2: Material und Methoden war wiederum ein kleines Volumen als nicht geeignet gefunden. Da bei den Vorversuchen kaum Kolonien abzulesen waren. Für den Chromocult-Coliformen-Agar haben sich beide Probenmengen als geeignet herausgestellt. Direkt im Anschluss werden die vorgewärmten Platten mit der flüssigen Probe beimpft und mit Hilfe eines Spatels ein gleichmäßiger Ausstrich durchgeführt. Durch Drehen der Platte im Licht kann man die Verteilung der Flüssigkeit auf der Platte beobachten. Nachdem die ausgestrichenen Platten getrocknet sind, werden sie mit dem Deckel nach unten in Brutschränke für 37 C (Endo-C-Agar, Chromocult- Coliformen-Agar) und 44 C (Endo-C-Agar, Fluorocult-ECD-Agar) gestellt Einmischverfahren (Plattengussverfahren) Das Einmischverfahren wurde nur bei Desoxycholat-Agar für coliforme Bakterien bei 37 C und fäkalcoliforme Bakterien bei 44 C angewendet. Um die Ergebnisse besser zu präsentieren und eine Grundlage für einen Vergleich zu bilden wurden bei diesem Verfahren Parallelansätze durchgeführt, d. h. mit eine beliebige Probe A wurde das Einmischverfahren mit Desoxycholat-Agar, 4x als Parallelansatz durchgeführt. Der Nährboden ist in Kulturröhrchen abgefüllt und wird kühl gelagert. Für jede Platte werden zwei Kulturröhrchen in einem lebecher auf einer elektrischen Heizplatte solange aufgekocht, bis sich der gesamte Inhalt verflüssigt hat. Anschließend wird das Röhrchen im Wasserbad auf C abgekühlt. Von der gut homogenisierten, geschüttelten Probe wird ein definiertes Volumen in eine sterile Petri-Schale gegeben. Der flüssige, auf C abgekühlte Agar eines Kulturröhrchens wird nun in die Petri-Schale gegossen. Durch Bewegen der Schale wird der Agar mit der Probe sorgfältig vermischt. Nach Erstarren dieser Mischung wird die Petri-Schale mit dem zweiten verflüssigtem Agar aufgegossen. Nach Erstarren dieser Schicht wird die Petri-Schale mit dem Deckel nach unten gerichtet in die Brutschränken gegeben Membranfiltration Die Membranfiltration wurde beim Tergitol-7-Agar angewendet. Bei der Membranfiltrationsverfahren werden die steril gelieferten Membranfilter auf die Filtrationsanlage gelegt. Es ist darauf zu achten, dass zwischen den einzelnen Arbeitsgängen die Filtrationsanlage per Flammensterilisation entkeimt wird. Das Inokulationsvolumen von 0,1 ml Referenzsuspension wird mit sterilem Wasser auf 100 ml gefüllt. Dieser Vorgang wird in einem sterilen Erlenmeyerkolben vorbereitet. Nach der Filtration wird das Filter mit einer sterilen Pinzette auf den Agar gelegt. Die Platten werden ebenfalls mit dem Deckel nach unten gerichtet in den Brutschrank bei 37 C gestellt (siehe Kapitel ). 9

15 Kapitel 2: Material und Methoden Weitere Differenzierung von coliformen und fäkalcoliformen Bakterien Eine weitere Bearbeitung und Bewertung der relativ schwach selektiven Desoxycholat-Platten erfolgt durch die Identifizierung der Kolonien mit einer kleinen Bunte Reihe. Während der experimentellen Tätigkeiten ist die Koloniezahl eine von den höchsten Werten, die eine Vermutung auf falsch-positive Ergebnisse liefert. Deshalb wird für die weiteren Proben eine Auswertung mit biochemischen Reaktionen Bunte Reihe beschlossen. Diese sind bei allen 4 Parallelansätzen durchzuführen. Die Bunte Reihe setzt sich aus Glucose-Röhrchen, Laktose-Röhrchen, Indol-Röhrchen und Citrat-Röhrchen zusammen. Nach der Bebrütungszeit der Desoxycholat-Agarplatten werden die Kolonien mit einen Keimzählgerät ausgewertet und dokumentiert. Dann werden die einzelnen Kolonien (neutralrot-rot) mit ausgeglühter Impfnadel in einem Indol-Röhrchen (Tryphtophan-Bouillon) suspendiert und 3-6 h 2 bei 36 C bebrütet. Von dieser Flüssigkeitskultur werden die zur weiteren biochemischen Identifizierung dienenden Nährböden und Nährlösungen beimpft. Das Glucose-Röhrchen wird bei 44 C, die anderen drei Röhrchen bei 36 C für 24 h bebrütet. Glucose-Röhrchen Positiv: Gasbildung und Gelbfärbung des grünen Agars, sonst negativ. Laktose-Röhrchen Positiv: Gasbildung und Gelbfärbung, sonst negativ. Indol-Röhrchen Positiv: Abbau des Tryptophans. Die farblose Lösung wird ca. 0,2 ml Kovacs-Reagenz überschichtet. Das zugefügte Reagenz färbt rot, sonst negativ. Citrat-Röhrchen Positiv: Blaufärbung des grünen Agars, sonst negativ. Oxidase-Reaktion Mit eine sterilen Impföse wird eine kleine Menge der verdächtigen Kolonien (rot-rosa) auf der markierten Stelle des Oxidasen-Teststreifens verrieben. Wird an der Stelle das Teststäbchen blau bis blau-violett, ist die Reaktion positiv, sonst ist sie negativ. Dieser Oxidase-Test wurde auch bei der Endo-C-Agarülatte durchgeführt und die Ergebnisse dokumentiert. 2 Stunden 10

16 Kapitel 2: Material und Methoden Die Zusammensetzungen der Nährböden und Nährlösung werden in dokumentiert. Dort folgt eine Lange Bunte Reihe mit 36 Komponenten. 2.3 MPN-Verfahren (Mehrfachansatz) Allgemeines Das Most-Probable-Number-Verfahren (MPN) ist eine Methode zur Keimzahlbestimmung in Flüssigmedium, bei der das Bakterienwachstum im Mehrfachansatz bei verschiedenen Verdünnungen Rückschlüsse über die vermeintlich in der Probe enthaltene Keimzahl zulässt. Die Grundlage des Verfahrens ist ein flüssiges Selektivnährmedium, in dem durch bestimmte Substrate bei Anwesenheit eines Bakteriums eine spezifische enzymatische Reaktion stattfindet, die zu einem optischen Erkennungsmerkmal führt. Dies kann zum Beispiel ein Farbumschlag der Nährlösung nach entsprechender Inkubationszeit oder ein fluoreszierendes Reaktionsprodukt sein. Zur Bestimmung der wahrscheinlichsten Keimzahl werden parallele Verdünnungsreihen von einer Probe erstellt. Bei der Auswertung werden die jeweils positiven Röhrchen in den einzelnen Verdünnungsstufen gezählt und die MPN-Kennzahl aufgestellt. Mit Hilfe einer Statistiktabelle kann man aufgrund der vorliegenden Röhrchenkombination die wahrscheinlichste Keimzahl ablesen. Beim MPN-Verfahren wird demnach nicht direkt die sichtbare Koloniezahl bestimmt, sondern die wahrscheinlichste Keimzahl statistisch ermittelt. Die statistische Sicherheit der Ergebnisse nimmt mit der Anzahl der Parallelansätze zu. Je mehr Parallelansätze verwendet werden, desto höher ist die Genauigkeit der Tabellenwerte. Die Anwendung der MPN-Methode kann in verschiedenen Fällen von Vorteil sein. Einerseits gibt es Bakterien, die nicht auf festen Medien kultiviert werden können und somit nur mit Flüssigmedien nachgewiesen werden können. Andererseits wird das Verfahren bevorzugt, wenn die Kinetik des Wachstums verschiedener Bakterien in der Probe stark variiert. Wenn zum Beispiel einige Keime sofort anfangen zu wachsen, sich ausbreiten und schließlich große Kolonien bilden, können dabei die Kolonien der Bakterien, die von Interesse sind und die sich erst später ausbilden, verdeckt werden. MPN-Verfahren mit 3er- Ansatz Bei z. B. 3 Parallelen führt ein Unterschied von einem positiven Röhrchen in der Kennzahl (3-3-0 und 3-3-1) bereits zu einer Verdopplung der Keimzahl (24 und 46 KBE/ml). Damit können Keimzahldifferenzen von weniger als 50% nicht quantitativ bestimmt werden. Dagegen ist z. B. bei 10 Parallelen die Differenz der Tabellenwerte zweier aufeinanderfolgender Kennzahlen wesentlich kleiner, es können Unterschiede von ca. 10% bestimmt werden. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgt anhand der MPN-Statistiktabellen nach MC CRADY(siehe Anhang), die für Auswertungen von 3er- und 5er-MPN verwendet werden. Bei diesen mathematischen Ansätzen wird die Wahrscheinlichkeit berechnet, mit einer Anzahl 11

17 Kapitel 2: Material und Methoden bestimmter Volumina in verschiedenen Verdünnungsstufen eine gewisse Kombination an positiven und negativen Röhrchen zu erhalten. Die Tabelle von MC CRADY wird zur Auswertung der routinemäßigen Untersuchung der Oberflächengewässer mittels MPN- Methode im Fachamt für Umweltuntersuchungen Hamburg verwendet. Die Anwendung der Tabelle von MC CRADY beinhaltet genaue Vorgaben in bezug auf die Verdünnungsstufen und Parallelansätze. Die Volumina, durch die bei gleichem Volumen der Nährlösung die einzelnen Verdünnungen erreicht werden, sind bei MC CRADY festgelegt. Die Tabelle gilt nur dann, wenn die erste Verdünnung (10-1 ) mit 1 ml, die zweite (10-2 ) mit 0,1 ml und die dritte(10-3 ) mit 0,01 ml angesetzt wird. Auch die Zahl der Parallelansätze ist nicht frei wählbar, sondern mit 3 oder 5 ebenfalls vorgegeben. Die Wahrscheinlichkeit für das Vorkommen einzelner Röhrchenkombinationen ist in Kategorie zwischen 1 (am wahrscheinlichsten) und 3 (wenig wahrscheinlich) angegeben. Im Einzelnen bedeuten die Kategorien folgendes: Kategorie 1: Am wahrscheinlichsten vorkommende Röhrchenkombinationen. Andere Kombinationen werden mit einer Wahrscheinlichkeit von höchstens 5% erhalten. Kategorie 2: Weniger wahrscheinlich als in Kategorie 1 vorkommende Röhrchenkombinationen. Andere Kombinationen als in Kategorie 1 und 2 werden mit einer Wahrscheinlichkeit vom höchsten 1 % erhalten. Kategorie 3: noch weniger wahrscheinlich als in Kategorie 2 vorkommende Röhrchenkombinationen. Andere Kombinationen als in Kategorie 1 bis 3 werden mit einer Wahrscheinlichkeit von höchstens 0,1 % erhalten. Beispiel: Oberflächengewässer für eine beliebige Probe A Bei einem Oberflächengewässer und einem MPN-Ansatz mit 3 Parallelansätzen d.h. 9 Kulturröhrchen, hat sich für beliebige Probe A folgendes Schema ergeben: Tabelle 2.1: Ermittlung der MPN-Kennzahl = positive Röhrchen Parallelansätze Impfvolumen[ml] Verdünnungen Positive 1 1:10 3 0,1 1: ,01 1: Um die MPN-Kennzahl zu ermitteln, wird diejenige Verdünnungsreihe für die letzte Ziffer der Kennzahl ausgewählt, in der noch positive Röhrchen zu finden sind. Das wäre in diesem Fall ein MPN-Kennzahl von (Tab.: 2.1). In der Statistiktabelle von MC CRADY für 3 Parallelansätze findet man die entsprechend dieser speziellen Zahlenkombination wahrscheinlichste Keimzahl. In diesem Beispiel würde sich aus der entsprechende Tabelle ein Wert von 4600 Keimen pro 100 ml, beziehungsweise 1 ml der Probe entsprechen 46 Keime. 12

18 Kapitel 2: Material und Methoden Bestimmung von coliformen Bakterien und fäkalcoliformen Bakterien (E. coli) Zur quantitativen Bestimmung der Keimzahl von Escherichia coli mit Hilfe der MPN- Methode wurde Fluorocult-Laurylsulfat-Bouillon verwendet. Der Nährboden von MERCK (Art.-Nr.: /0500) entspricht der DIN-Norm zur Untersuchung von Milch, den Vorschriften nach 35 LMBG (06.00/36) zur Untersuchung von Lebensmitteln und dem ISO Standard 6391 (1996) zur Untersuchung von Milch und Milchprodukten. Weiterhin wird die MUG-Laurylsulfat-Bouillon als geeignete Methode von Gesamtcoliformen und Fäkalcoliformen nach der Badegewässerrichtlinie 76/160/EWG empfohlen. Zur Differenzierung der Gesamtcoliformen und der Fäkalcoliformen wird ein fluoreszenzoptischer Test durchgeführt. Das 4-Methylumbelliferyl-ß-D-Glucuronid wird nur von den Fäkalcoliformen (E. coli) gespalten und das Spaltprodukt Methylumbelliferon entsteht. Diese Substanz erzeugt Fluoreszenz im UV-Licht bei 366 nm. Die MUG- Laurylsulfat-Bouillon wird insbesondere für die Most-Probable-Number-Methode (MPN) eingesetzt. Der Nährboden enthält folgende Bestandteile in g/l: Tryptose 20,0 Laktose 5,0 Dikaliumhydrogenphosphat 2,75 Laurylsulfat-Natriumsalz 0,1 L-Tryptophan 1,0 4-Methylumbelliferyl-ß-D-Glucuronid(MUG) 0,1 Der Gehalt an Laurylsulfat hemmt weitgehend das Wachstum von Begleitorganismen, insbesondere Pseudomonaden. Zum Nachweis der Gesamtcoliformen werden die Kulturröhrchen mit Gärröhrchen nach DURHAM versehen. Nach einer Inkubationszeit von 48 h bei 37 C führt die Laktosegärung der Gesamtcoliformen zur Gasbildung im DURHAM- Röhrchen Durchführung der Untersuchungen Bei der Durchführung der MPN-Methode wurden folgende Materialien und Geräte benötigt: Brutschränke 37 C Eppendorf-Pipetten 1 ml, 100µl, 10µl Sterile Pipettenspitzen 1 ml, 100 µl (EPPENDOEF BIOPUR) Sterile Pipettenspitzen 10µl (EPPENDORF EUROTIPS) Reagenzständer UV-Lampe 366 nm 13

19 Kapitel 2: Material und Methoden Für das Most-Probable-Number-Verahren wurden die Kulturröhrchen für die Proben A 4x als Parallelansatz vorbereitet, d.h. für Probe A wurde jeweils 36 Röhrchen mit der flüssigen Bouillon in drei Verdünnungsreihen zu je 3 Röhrchen im Reagenzständer aufgestellt. Die drei Verdünnungen wurden mit 1:10, 1:100 und 1:1000 festgelegt, dementsprechend Probenvolumina von 1 ml, 0,1 ml und 0,01 ml pipettiert. Die Suspension wurde den drei Verdünnungsreihen entsprechend mit drei verschiedenen Pipetten zugegeben. Für jede Reihe wurde eine Pipettenspitze benutzt, mit deren Spitze man in die Bouillon eintaucht und die Flüssigkeit ausdrückt. Vor jedem Pipettiervorgang muss die Probe geschüttelt werden. Nach der Bebrütungszeit werden die Kulturröhrchen nach Gasbildung für coliforme Bakterien und Fluoreszenz für Escherichia coli untersucht. Die Auswertung erfolgt durch die Ermittlung der MPN-Kennzahl und das Ablesen des Ergebnisses aus der Statistiktabelle von MC CRADY. Dann wird von den einzelnen Parallelansätzen der Mittelwert gebildet MPN-Verfahren mit Miniaturverfahren zur Erfassung von E. coli Allgemeines Diese miniaturisierte Methode zur Keimzahlbestimmung in Wasserproben beruht auf demselben Prinzip zur Ermittlung der wahrscheinlichsten Anzahl wie das herkömmliche MPN-Verfahren. Die Mikrotiterplatte besteht aus 96 Vertiefungen, in denen sich das Nährmedium in Form von Trockensubstrat befindet. Die Aufteilung der Vertiefungen auf der Platte ergibt sich zu 12 Reihen mit jeweils 8 Vertiefungen. Jede einzelne Vertiefung ist aufgrund eines auf der Platte eingravierten Planquadrates gekennzeichnet, so dass man die Einteilung in verschiedene Verdünnungsstufen problemlos vornehmen kann. Je nach der zu erwartenden Keimzahl werden die 96 Vertiefungen in 2, 4 oder 6 Verdünnungsstufen unterteilt. Die Wahl der geeigneten Probenverdünnung lässt sich anhand der Probenherkunft in drei Kategorien einteilen (Tab.: 2.2). Tabelle 2.2: Verdünnungsstufen in Abhängigkeit der Keimzahl bei Verwendung von Mikrotiterplatten Art der Probe Anzahl der Verdünnungsstufen Anzahl der Vertiefungen je Verdünnungen Badegewässer 2 64 für 1:2 32 für 1:20 Jeweils 24 für 1:2, Oberflächengewässer 4 1:20, 1:200 und 1:2000 Abwässer 6 Jeweils 16 für 1:2 bis 1: Messbereich [Keimzahl/ml] , , ,

20 Kapitel 2: Material und Methoden Zur Bestimmung der wahrscheinlichsten Keimzahl in der Probe werden Statistiktabellen für die einzelnen Anwendungsbereiche vom Hersteller BIO RAD mitgeliefert. Dabei wird zu jeder Kennzahl zusätzlich das 95%-Intervall als Vertrauensbereich angegeben. Die Anzahl positiver Reaktionen je Verdünnungsstufe ergibt die Kennzahl. Bei mehr als drei Verdünnungsstufen sollte die dreistellige Kennzahl, wenn möglich in der dritten Verdünnung keine Positiven mehr haben, also auf null enden. Beispiel: Oberflächengewässer für eine beliebige Probe A Bei Oberflächengewässer werden zwei Verdünnungsstufen angewendet, da dass sich jeweils eine zweistellige Kennzahl ergibt. Zum Beispiel erhält man folgende Werte: Verdünnung 1:2: 25 positive Vertiefungen von 64 Verdünnung 1:200: 3 positive Vertiefungen von 32 Es ergibt sich daraus die Kennzahl 25/3. Aus der Statistiktabelle für zwei Verdünnungen lassen sich folgende Werte ablesen: Tabelle 2.3: Darstellung der charakteristischen Zahl mit den unteren- und oberen Grenzwerten Charakteristische Zahl Statistische Tabellenwert Untere Grenzwert Obere Grenzwert 25/64 3/ In diesem Beispiel erhält die Probe A 524 Keime/100 ml (95%-Vertrauensberiech: ). Der Nachweis der Fäkalindikatoren (E.coli) erfolgt durch eine enzymatische Reaktion der Bakterien mit dem Substrat, das durch die Zugabe von Probe und Probenverdünnungspuffer rekonstituiert wird. Bei positiver Reaktion wird eine fluoreszierende Substanz freigesetzt. Der Nährboden wird als Trockensubstrat in den sterilen, gebrauchsfertigen Mikrotiterplatte der Firma BIO RAD GmbH (Art.-Nr.: ) geliefert. Bei dem Trockensubstrat in den 96 Vertiefungen der Mikrotiterplatte handelt es sich um einen Nährboden, der MUG (4- Methylumbelliferyl-ß-D-Glucuronid) enthält. Das Verfahren basiert auf demselben fluoreszenzoptischen Nachweis von E. coli, der bereits bei der MPN-Methode erläutert wurde (Kapitel 2.3.2) Durchführung der Untersuchungen Für die Anwendung der Mikrotiterplatten wurden folgende Materialien verwendet: Mikrotiterplatte E.coli (Art.-Nr.: ) der Firma BIO RAD GmbH Spezial-Probenverdünnungspuffer SDP (BIO RAD GmbH, Art.-Nr ) Abdeckfolien (Zubehör Mikrotiterplatten) Sterile Röhrchen Vollpipette, 10 ml 15

21 Kapitel 2: Material und Methoden Eppendorf-Pipette, 1 ml Mehrkanal- (8er)- Pipette Sterile Pipettenspitzen 100 µl Reagenz-Reservoirs für Mehrkanalpipetten (V-Form, 60 ml, WILKE und WITZEL, Art.- Nr.: ) UV-Lampe 366 nm Zur Bestimmung der Keimzahl in Proben aus Oberflächengewässern ist ein Ansatz mit zwei Verdünnungsstufen ausreichend, da die zu erwartende Keimzahl im unteren Drittel des Messbereiches für zwei Verdünnungen liegt. Die Probe A, die zu einem besseren Vergleich der Verfahren dienen sollte, war kaum belastet, dass diese Probe beim Mikrotiterverfahren in Parallelansätzen nicht durchgeführt werden konnte. Deshalb sind andere beliebige Proben, die eine höhere Keimzahlwachstum haben untersucht. Sie werden wie folgt durchgeführt: Für jede Mikrotiterplatte werden bei zwei Verdünnungsstufen je zwei Röhrchen à 9 ml Probenverdünnungspuffer (SDP) benötigt. Dieser Verdünnungspuffer wird fertig geliefert und musste nicht selbst hergestellt werden. In das erste Röhrchen werden 9 ml der Probe gegeben. Die Vermischung der Flüssigkeiten im Röhrchen erfolgt durch mehrmaliges Aufziehen mit der Vollpipette. Von dieser ersten Verdünnungsstufe (1:2) wird 1 ml mit der Eppendorf- Pipette entnommen und in das zweite SDP-Röhrchen gegeben (Verdünnung 1:20) Mit diesen Verdünnungen wird die Mikrotiterplatte beimpft. Mit der Acht-Kanal-Pipette werden z.b. die ersten 64 (8 8) Vertiefungen mit je 200 µl der ersten Verdünnung befüllt, die letzten 32 (4 8) Vertiefungen mit der zweiten Verdünnung. Anschließend wird die Platte mit einer Abdeckfolie überklebt und in den Brutschrank für 48 h bei 44 C gestellt. Ausgehend von 10 ml Probensuspension werden 9 ml mit 9 ml SDP vermischt und ergeben damit die erste Verdünnungsstufe für die Mikrotiterplatten (Verdünnung 1:2, 64 Vertiefungen). Von dieser ersten Verdünnung ausgehend wird 1 ml erneut mit 9 ml Probenverdünnungspuffer vermischt und es ergeben sich 10 ml der Verdünnung 1:20 für die zweite Verdünnungsstufe (32 Vertiefungen). Die Aufteilung der Proben in die Mikrotiterplatte mit der Mehrkanalpipette bereitet keine Schwierigkeiten, da die speziellen Reagenz-Reservoirs eine V-Form besitzen und dadurch selbst bei kleinen Flüssigkeitsmengen einen ausreichend hohen Flüssigkeitsspiegel gewährleisten. Tabelle 2.4: Vergleich von vorhandenem und benötigtem Suspensionsvolumen zur Beimpfung der Mikrotiterplatten Mikrotiterplatten: Vorhandenes Volumen Benötigtes Volumen 1. Verdünnung 9 ml Suspension + 9 ml SDP = 18 ml -1 ml für die 2. Verdünnung 64 0,2 ml = 12,8 ml 2. Verdünnung = 17 ml 1 ml Suspension (aus der 1.Verdünnung) + 9 ml SDP = 10 ml 32 0,2 ml = 6,4 ml 16

22 Kapitel 2: Material und Methoden Colilert-18 /Quanti-Tray -Verfahren Allgemeines Der Colilert 18/Quanti-Tray-Verfahren ist ein Schnellverfahren für Wasserproben. Das Verfahren ermöglicht den endgültigen Nachweis von coliformen Bakterien und Escherichia coli in einem einzigen Anreicherungsschritt innerhalb von 18 Stunden. Die qualitative als auch die quantitative Auswertung erfolgt über die Beurteilung der Gelbfärbungen bzw. der Fluoreszenz. Verfahrensprinzip: Coliforme Bakterien metabolisieren innerhalb von 18 Stunden bei 36 C das farblose ortho- Nitrophenol-ß-D-Galaktopyranosid (ONPG), einen Indikatornährstoff, unter Abspaltung des gelben ortho-nitrophenols. Escherichia coli ist zusätzlich in der Lage, 4-Methyl-Umbelliferyl-ß-D-Glukuronid (MUG), einen weiteren Indikatornährstoff, unter Abspaltung des fluoreszierenden 4-Methyl- Umbelliferons zu metabolisieren. Bei Anwesenheit von E. coli wird durch die Aktivität der ß- Glucuronidase aus dem Substrat Methyl-umbelliferyl-ß-D-Glukuronid (MUG) das fluoreszierende 4-Methylumbelliferon freigesetzt. Die Fluoreszenz wird mittels einer UV- Lampe sichtbar gemacht Durchführung der Untersuchungen Für die Anwendung der Colilert-18/Quanti-Tray-Verfahren wurden folgende Materialien verwendet: IDEXX-Geräte, -Nährböden und Testreagenzien Reaktionsgefäß mit Antifoam IDEXX-Bestellnr Quanti-Tray-Sealer IDEXX-Bestellnr Quanti-Tray-Einwegtrays IDEXX- Bestellnr Quanti-Tray-2000 Einwegtrays (MPN=2419) IDEXX-Bestellnr UV-Sichtkasten der Fa. IDEXX-Bestellnr Gummimatte Quanti Tray IDEXX- Bestellnr Gummimatte Quanti Tray 2000 IDEXX-Bestellnr Quanti-Tray-/2000 Comperator IDEXX-Bestellnr Colilert 18/200 Blisterpacks für 100 ml Wasserprobe Bestellnr Einmal-Impfösen, steril, Standard 10 µl (VWR, Art. Nr.: 631Q2211) Steriles demineralisiertes Wasser, falls Verdünnungen erforderlich 17

23 Kapitel 2: Material und Methoden Brutschrank Memmert, thermostatisiert, (36±1) C Kühlschrank Wasserfester Stift Die 100 ml Wasserprobe wird unter sterilen Bedingungen in das versehene 100 ml-colilert- Kulturgefäß überführt. Unter dem Abzug wird der Inhalt einer Packung Colilert-18 (Pulver) vorsichtig dazugegeben. Nach Auflösen des Pulvers (ca. 15 Min.) wird der Ansatz in einen leeren, sterilen Quanti-Tray-Behälter überführt. Hierbei wird der Quant-Tray mit einer Hand angefasst und senkrecht gehalten, wobei die Seite mit den Vertiefungen zur Handfläche zeigen soll. Der obere Teil des Trays wird zusammengedrückt, so dass sich der Träger zur Handfläche hinbiegt. Der Tray wird geöffnet, indem die Folienlasche von der Seite mit den Vertiefungen abgezogen wird. Die vorbereitet Mischung aus Probe und Reagenzien wird direkt in den Tray gegossen, dabei ist eine Berührung der Folienlasche unbedingt zu vermeiden. Somit wird die Sterilität gesichert. Die mit der Probe gefüllten Tray wird auf die Gummi-Trägerunterlage das Quanti-Tray- Versiegelungsgerät gestellt. Die Seite mit den Vertiefungen muss dabei nach unten weisen, damit sie in die Unterlage passt. Die Trägerunterlage wird in das Versiegelungsgerät geschoben bis es vom Transportmechanismus erfasst und ins Gerät gezogen wird. Innerhalb von 15 Sekunden wird der Tray versiegelt und auf der Rückseite des Gerätes ausgeworfen. Der Tray wird aus der Trägerunterlage entnommen und 18 h im Brutschrank bei 36 ± 1 C inkubiert. Hauptsächlich wurde die Verdünnung von 1:10 gewählt. Nur für die Abwasserproben war die Verdünnungsstufe 1:100 sinnvoller. Die Verdünnungen wurden mit sterilem Wasser durchgeführt. Auswertung: Die Proben müssen exakt nach 18 Stunden ausgewertet werden. Nach Ablauf von 18 Stunden können andere heterotrophe Keime das Hemmsystem von Colilert-18 überwinden. Wenn dann eine Gelbfärbung bzw. Gelbfärbung und Fluoreszenz beobachtet wird, gilt dies nicht als positives Ergebnis. Um positive Reaktionen eindeutig von negativen unterscheiden zu können, wird als Referenz die Komparator-Lösung mit dem Ansatz verglichen. Falls bei einem Ansatz ohne Gelbfärbung eine Fluoreszenz auftreten sollte, ist dieser Ansatz als negativ zu betrachten, es handelt sich auf keinen Fall um Escherichia coli. Für Keimzahlen bis zu 200 wird ein Tray mit 51 großen Vertiefungen verwendet, für Keimzahlen bis 2000 ein Tray mit 97 Vertiefung (Quanti-Tray-2000). Die Quanit-Tray-2000 enthält 49 große Vertiefungen und 48 kleine Vertiefungen. Bei einer hohen Keimbelastung wird die Probe, vor der Zugabe des Pulvers, verdünnt. Nach der Bebrütungszeit wird die Keimzahl anhand der Anzahl gelber bzw. fluoreszenter Vertiefungen ermittelt. 18

24 Kapitel 2: Material und Methoden Tabelle 2.5: Qualitativer Nachweis von coliformen und fäkalcoliforme Bakterien (E. coli) Eigenschaften des Ansatzes Ergebnis Farblos oder leichte Verfärbung (geringer Escherichia coli: n.n. 3 als Komparator-Lösung) Coliforme Bakterien: n.n. Gelbfärbung gleich oder intensiver als die Escherichia coli: n.n. Komparator-Lösung, ohne Fluoreszenz Coliforme Bakterien: pos. Gelbfärbung gleich oder intensiver als die Escherichia coli: pos. Komparator-Lösung, mit Fluoreszenz Coliforme Bakterien: pos. Die gelben, positiven Vertiefungen werden für die Coliforme und zusätzlich den fluoreszierenden Vertiefungen für E. coli entsprechend gezählt. Die aus der Anzahl der positiven Reaktionen in den Wells 4 sich ergebende wahrscheinliche Zahl (MPN) wird in der MPN-Tabelle für Quanti-Tray mit 51 Vertiefungen (siehe Anhang) abgelesen. Die erste Spalte beinhaltet die positiven Vertiefungen bei einer 100 ml Probe. Man sucht die Zeile der positiven Vertiefungen und liest den dazugehörigen Wert in der zweiten Spalte ab. Die MPN- Tabelle weist eine obere und untere Vertrauensgrenze von 95% auf. Für die Auswertung des Quanti-Tray 2000 benutzt man die Quanti-Tray 2000 MPN-Tabelle (siehe Anhang). In der ersten Spalte waagerecht sucht man den Zahlenwert der positiven großen Vertiefungen und in der ersten horizontalen Spalte den Wert der positiven kleinen Taschen. Dort wo sich die Spalten treffen, kann die wahrscheinliche Zahl (MPN) abgelesen werden. Falls der Ansatz davor verdünnt wurde, muss der Verdünnungsfaktor mit eingerechnet werden. Beispiel: Oberflächengewässer für eine beliebige Probe A Tabelle 2.6: Darstellung der charakteristischen Zahl für Colilert-18 Positiven großen Vertiefungen Positiven kleinen Vertiefungen Charakteristische Zahl Statistische Tabellenwert / ,1 In diesem Beispiel lautet der statistische Tabellenwert 1553,1/100 ml Wasserprobe. Da in diesem Beispiel eine Verdünnung von 1:10 vorgenommen wurde, ist das Ergebnis 15531/100 ml Wasserprobe oder 1 ml der Probe entsprechen 155,31 Keime. Absicherung der Befunde: Eine weitere Untersuchung der Colilert-18 zur Identifizierung von coliformen und fäkalcoliformen Bakterien ist die Weiterbearbeitung der Anreicherungsflüssigkeit nach der Bebrütungszeit der Colilert-18. Die leichte Verfärbung der Vertiefungen, die nicht geringer sind als der Komparator-Lösung, sollen unter sterilen Bedingungen auf Endo-C-Agar-Platten ausgestrichen werden. 3 Nicht Nachweisbar 4 Vertiefungen 19

25 Kapitel 2: Material und Methoden Die Unterseite der versiegelten Trays wird mit Desinfektionsmittel gereinigt und mit sterilen Impfnadeln gestochen. Die hellgelbe Anreicherungsflüssigkeit wird mit Hilfe einer sterilen Impföse auf Endo-C-Agar-Platte ausgestrichen und bei 37 C bebrütet. Die fluoreszierende Anreicherungsflüssigkeit auch ausgestrichen aber bei 44 C bebrütet. Es war bei früheren Untersuchungen der Verdacht aufgetaucht, dass das Verfahren Colilert-18 falsch-positive Ergebnisse liefert. Die Ergebnisse der Endo-C-Agar-Platten waren negativ. Dieses Ergebnis stellt die These auf, dass das Colilert-18-Verfahren falsch-positive Ergebnisse liefert. Um diese These zu bestätigen, wird eine Lange Bunte Reihe durchgeführt Prüfungen biochemischer Merkmale von Mikroorganismen durch die Lange Bunte Reihe Die Lange Bunte Reihe ist die Prüfung biochemischer Merkmale von Mikroorganismen. Sie besteht aus 36 Komponenten wie zum Beispiel Malonat-Test, Nitrat-Test, Citrat-Test etc. und dient zur Identifizierung der einzelnen Kolonien anhand der positiven bzw. negativen Reaktionen der einzelnen Nährböden. Die Auswertung der Lange Bunte Reihe erfolgt anhand der Table of Biochemical reaction (Biochemical reaction of the nemed species, biogroups, and Enteric Groups of the family Enterobacteriaceae). Indolbildung Gewisse Bakterien haben die Fähigkeit, aus dem Tryptophan abgebauter Eiweiße, Indol zu bilden. Diese Substanz lässt sich im Medium mit einer Testlösung nachweisen. Hierfür verwendete Reagenz ist das KOVACS Reagens. Dieses Reagenz ist z. B. von Merck erhältlich. Das tryptophanreiche Nährmedium wird von der Nährbodenküche geliefert. Technik: Nach Beimpfung wird das Röhrchen h bei 36 C bebrütet. Dann setzt man einige Tropfen (ca. 1 ml) KOVACS Reagenz zu. Bewertung: Positiv: Das zugesetzte Reagenz verfärbt sich an der Oberfläche rot. Negativ: Keine Verfärbung des zugesetzten Reagenzes. Nachweis der Kohlenhydrate Die beim Abbau von Kohlenhydrate entstehende Säure wird durch den Umschlag eines dem Testsubstrat zugesetzten Indikators sichtbar. Der meist hierfür benutzte Farbstoff Bromthymolblau schlägt dabei von blaugrün nach gelb um; Alkalisierung führt zum Umschlag nach blau. Die Reaktion kann nach 24 h Bebrütung abgelesen werden, wenn auch die Säurebildung eingetreten ist. 20