Tierärztliche Hochschule Hannover

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1 Tierärztliche Hochschule Hannover Anwendung von Stall- und Labortests zur Untersuchung von bovinem Kolostrum auf Milchinhaltsstoffe, Zellgehalt, bakteriologische Qualität und Nachweis von Cloxacillin mittels LC-MS/MS Christiane Eva Freifrau von Münchhausen, Eckernförde

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4 Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über abrufbar. 1. Auflage by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen Printed in Germany ISBN Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße Gießen 0641/

5 Tierärztliche Hochschule Hannover Anwendung von Stall- und Labortests zur Untersuchung von bovinem Kolostrum auf Milchinhaltsstoffe, Zellgehalt, bakteriologische Qualität und Nachweis von Cloxacillin mittels LC-MS/MS INAUGURAL DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. ) vorgelegt von Christiane Eva Freifrau von Münchhausen Eckernförde Hannover 2012

6 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Günter Klein Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Günter Klein 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Martina Hoedemaker, Ph. D. Klinik für Rinder Tag der mündlichen Prüfung: 06. November 2012

7 Meiner kleinen und großen Familie

8 Teilergebnisse dieser Arbeit wurden an folgender Stelle veröffentlicht: C. VON MÜNCHHAUSEN, N. Th. GRABOWSKI u. G. KLEIN (2009) Zum Gehalt von Laktose in Kolostrum hochleistender HF-Kühe unter Berücksichtigung der Zellzahl. In: 50. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, Garmisch- Partenkirchen , Sonderausgabe Amtstierärztlicher Dienst, 208 C. VON MÜNCHHAUSEN, N. Th. GRABOWSKI u. G. KLEIN (2010) Zur Aktivität von N-Acetyl-ß-D-glukosaminidase (NAGase) in Kolostrum hochleistender HF-Kühe unter Berücksichtigung des Zellgehaltes. In: 51. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, Garmisch- Partenkirchen , Sonderausgabe Amtstierärztlicher Dienst, Preis im Wettbewerb um das beste Poster

9 I Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS Christiane Eva Freifrau von Münchhausen Anwendung von Stall- und Labortests zur Untersuchung von bovinem Kolostrum auf Milchinhaltsstoffe, Zellgehalt, bakteriologische Qualität und Nachweis von Cloxacillin mittels LC-MS/MS 1 Einleitung Schrifttum Physiologie der Milchbildung beim Rind Lakto- und Kolostrogenese (Laktopoese) Abwehrmechanismen der bovinen Milchdrüse Blut-Euter-Schranke Physiologische Eigenschaften von reifer Milch und Kolostrum Physikalische Eigenschaften Elektrische Leitfähigkeit ph-wert Fettfreie Trockenmasse Chemische Eigenschaften Protein Fett Laktose Harnstoff Immunologische Eigenschaften Immunglobuline Bioaktive Substanzen Aktivität der N-Acetyl-ß-D-glucosaminidase Anzahl somatischer Zellen Beurteilung der Eutergesundheit Mastitis und Mastitiserreger in reifer Milch... 25

10 Inhaltsverzeichnis II Beurteilung der Eutergesundheit in reifer Milch Normale Sekretion Latente Infektion Unspezifische Mastitis Mastitis Beurteilung der Eutergesundheit in Kolostrum Mastitis und Mastitiserreger in der Kolostralmilchphase und der Frühlaktation Milchmengenleistung Management im peripartalen Zeitraum Rechtliche Einordnung Kolostrum als Lebensmittel Kolostrum als Futtermittel Material und Methoden Material Betrieb und Tiermaterial Haltung Fütterung Melksystem Methoden Probennahmeraster Probennahmeschema Probengewinnung und -konservierung Vorgemelk Viertelanfangsgemelk Viertelhandgemelk Gesamtgemelk Analytik Farbmessung Elektrische Leitfähigkeit California-Mastitis-Test... 40

11 III Inhaltsverzeichnis Mastitiserreger Gesamtkeimzahl Milchinhaltsstoffe Zählung somatischer Zellen Aktivität der N-Acetyl-ß-D-glucosaminidase Milchmenge Rückstandsanalytik mittels LC-MS/MS Statistische Auswertung Ergebnisse Status Erkrankungen im Versuchszeitraum Versuchstiereinteilung nach Laktationsnummern Bakteriologie Zusammenfassung der phsikalischen und chemischen Parameter Untersuchungen des Milchsekrets auf Viertelebene Physiologische Referenz Vergleich gesunder (physiologische Referenz) mit euterkranken Vierteln Gehalt somatischer Zellen im Kolostrum zur Festlegung von Zellzahlgrenzwerten (physiologische Referenz) Einordnung des Probenmaterials in fünf Basiskriterien Trockenstehzeit Laktationsnummer Viertelposition Eutergesundheitskategorie Mastitiserreger Elektrische Leitfähigkeit ph-wert Gefrierpunkt Milchinhaltsstoffe Bestimmung der Präzision... 85

12 Inhaltsverzeichnis IV Verlaufsuntersuchung von Milchinhaltsstoffen Protein Fett Laktose Harnstoff Fettfreie Trockenmasse Gehalt somatischer Zellen im Kolostrum - Fossomatic Zellzahlgehalte an den Versuchtagen K1 - K5 eutergesunder Kühe Referenzmethode nach Prescott und Breed für die Zählung somatischer Zellen in Kolostrum California-Mastitis-Test N-Acetyl-ß-D-glucosaminidase Präzisionskontrolle Vergleich der NAGase-Aktivität mit dem Zellgehalt (Fossomatic ) Beziehungen zwischen den Untersuchungsverfahren (Fossomatic, Prescott und Breed und NAGase) Korrelationen des Gesamtmaterials Gesamtgemelke Kolostrum Milchmengenleistung Milchinhaltsstoffe und physikalische Parameter Somatische Zellen Gesamtkeimzahl in Kolostrum Farbmessung zur Einschätzung der Kolostralmilchqualität Farbmessung der Kolostralmilch (K1 und K2) Einfluss der Güteparameter auf die Kolostrumfarbe Nachweis von Cloxacillin im Kolostrum Validierung Ergebnisse der Rückstandsuntersuchung auf Cloxacillin in der Kolostralmilch

13 V Inhaltsverzeichnis Einflussfaktor Trockenstehzeit Diskussion Material und Methoden Bakteriologische Befunde Neuinfektion Zusammenfassung der Parameter Festlegung der physiologischen Referenz Vergleich der physiologischen Referenz mit euterkranken Vierteln Elektrische Leitfähigkeit, ph-wert und Gefrierpunkt Milchinhaltsstoffe Gehalt somatischer Zellen Kolostralmilchleistung Milchinhaltsstoffe und Zellgehalt in Gesamtgemelken Gesamtkeimzahl Farbmessung Cloxacillinnachweis Schlussfolgerung Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis Gesetze und Normen Anhang Tabellarische Zusammenfassung der Eigenschaften reifer Milch Tabellarische Zusammenfassung der Eigenschaften von Kolostrum Material Geräte, Einmalartikel und Reagenzien Vergleich der physiologischen Referenz Korrelationen der Kolostralmilchparameter

14 Abbildungsverzeichnis VI Abbildung 1: Funktionalität des Abwehrsystems und Neuerkrankungsrisiko während der peripartalen Phase der Milchkuh (DVG 2002) Abbildung 2: Probennahmeschema Abbildung 3: Erkrankungen in Abhängigkeit von der Laktationsnummer Abbildung 4: Verlauf der prozentualen Verteilung von gesunden Vierteln in den vier Eutergesundheitskategorien der Versuchstage T2/T3 (n = 113 Viertelanfangsgemelke) Abbildung 5: Verlauf der mittleren elektrischen Leitfähigkeit [ms/cm] von eutergesunden im Vergleich zu euterkranken Vierteln in Viertelanfangsgemelken Abbildung 6: Elektrischen Leitfähigkeit an den elf Versuchstagen in Abhängigkeit vom bakteriologischen Befund und Darstellung des Grenzwertes für reife Milch bei 6,5 ms/cm Abbildung 7: Verlauf des mittleren ph-wertes von eutergesunden im Vergleich zu euterkranken Vierteln in Viertelanfangsgemelken Abbildung 8: ph-wert an den elf Versuchstagen in Abhängigkeit vom bakteriologischen Befund Abbildung 9: Mittlerer Gefrierpunkt und Standardabweichung für normal sezernierende Viertel in Vierelanfangsgemelken Abbildung 10: Vergleich des mittleren Gefrierpunktes von eutergesunden mit euterkranken Vierteln in Viertelanfangsgemelken Abbildung 11: Verlauf des mittleren Proteingehaltes für eutergesunde Viertel im Vergleich zu euterkranken Vierteln in Viertelanfangsgemelken Abbildung 12: Vergleich des mittleren Fettgehaltes für eutergesunde Viertel mit euterkranken Vierteln in Viertelanfangsgemelken Abbildung 13: Verlauf des mittleren Laktosegehaltes für eutergesunde Viertel im Vergleich zu euterkranken Vierteln in Viertelanfangsgemelken Abbildung 14: Verlauf des mittleren Harnstoffgehaltes für eutergesunde Viertel im Vergleich zu euterkranken Vierteln in Viertelanfangsgemelken

15 VII Abbildungsverzeichnis Abbildung 15: Verlauf der mittleren fettfreien Trockenmasse für eutergesunde Viertel im Vergleich zu euterkranken Vierteln in Viertelanfangsgemelken Abbildung 16: Verlauf des mitteleren Zellgehaltes und der Standardabweichung im Viertelanfangsgemelk, eingeteilt in die vier Eutergesundheitskatorien an den elf Versuchstagen (Fossomatic ) Abbildung 17: Mittlerer Gehalt somatischer Zellen [log 10 (SCC/ml)] und Standardabweichung an den elf Versuchstagen in Abhängigkeit von der bakteriologischen Beschaffenheit (Viertelanfangsgemelk). 108 Abbildung 18: Regressionsgerade für die Zellzahlmessung mittels Fossomatic und Referenzmethode nach Prescott und Breed [log 10 (SCC/ml)] in Viertelanfangsgemelken Abbildung 19: Prozentuale Verteilung der CMT-Reaktionsstufen in der Kolostralmilchphase in Viertelanfangsgemelken Abbildung 20: CMT-Stufen in Viertelanfangsgemelken, abhängig vom Zellgehalt (Fossomatic ) in der Kolostralmilchphase Abbildung 21: CMT-Stufen, abhängig vom Zellgehalt (Prescott und Breed) in der Kolostralmilchphase Abbildung 22: Verlauf des Zellgehaltes (Fossomatic und Prescott und Breed) und Reaktionsstufenergebnis N des California-Mastitis-Tests in Viertelanfangsgemelken Abbildung 23: NAGase-Aktivität [nmol ml -1 min -1 ] für gesunde Euterviertel Abbildung 24: Verlauf der mittleren log 10 -NAGase-Aktivität [nmol ml -1 min -1 ] für eutergesunde Viertel im Vergleich zu euterkranken Vierteln in Viertelanfangsgemelken Abbildung 25: Mittlere NAGase-Aktivität [nmol ml -1 min -1 ] und Standardabweichung in Abhängigkeit vom bakteriologischen Befund in Viertelanfangsgemelken Abbildung 26: Korrelation und Regression der log 10 -NAGase-Aktivität [nmol ml -1 min -1 ] und dem Zellgehalt [log 10 (SCC/ml)], gemessen mittels Fossomatic in Viertelanfangsgemelken

16 Abbildungsverzeichnis VIII Abbildung 27: Verlauf des Zellgehaltes (Fossomatic und Prescott und Breed), der NAGase-Aktivität und Reaktionsstufenergebnis N des California-Mastitis-Tests in der Kolostralmilchphase (Viertelanfangsgemelke) Abbildung 28: Vergleich der täglichen Milchmengenleistung von Kühen und Färsen Abbildung 29: Vergleich zweier SPE-Kartuschen für die Aufarbeitung von Cloxacillin in Kolostrum Abbildung 30: Chromatogramme einer Cloxacillin-positiven Probe (Kuh 687) mit internen Standards für die Versuchstage K1 und K Abbildung 31: Cloxacillingehalte in Kolostrum (Gesamtgemelke), gemessen mit LC-MS/MS Abbildung 32: Vergleich der Cloxacillingehalte an K1 und K2 in Abhängigkeit von der Trockenstehzeit in Tagen (Gesamtgemelke) Abbildung 33: Regression und Korrelation zwischen Cloxacillingehalt und Trockenstehzeit für K Abbildung 34: Regression und Korrelation zwischen Cloxacillingehalt und Trockenstehzeit für K

17 IX Tabellenverzeichnis Tabelle 1: ph-wert der Kolostralmilch in den ersten beiden Tagen p.p. (FOLEY u. OTTERBY 1978)... 9 Tabelle 2: Jahreszeitliche Schwankungen des ph-wertes in den ersten fünf Tagen p.p. (KLIMES et al. 1986) Tabelle 3: ph-wert in Präkolostrum und Kolostrum zu unterschiedlichen Probennahme-zeitpunkten (MAUNSELL et al. 1998) Tabelle 4: Darstellung der Schwankungsbreiten von Komponenten der fettfreien Trockenmasse in reifer Milch (SCHNEIDER 2003) Tabelle 5: Gehalt fettfreier Trockenmasse in Kolostralmilch (MIELKE 1994) Tabelle 6: Gehalt fettfreier Trockenmasse (SNF) in Kolostralmilch in den ersten vier Tagen p.p. (FOLEY u. OTTERBY 1978) Tabelle 7: Proteingehalt in den ersten 5 Tagen p.p. (TSIOULPAS et al. 2007) Tabelle 8: Fettgehalte in den ersten 6 Tagen p.p. (RAUPRICH et al. 2000) Tabelle 9: Vergleich des Fettgehalts infizierter und nicht infizierter Euterviertel (MAUNSELL et al. 1998) Tabelle 10: Korrelation zwischen Zellzahl und Laktose in Viertelanfangsgemelken nach HAMANN (2002) Tabelle 11: Zusammenstellung von Laktosegehalten verschiedener Autoren in den ersten Tagen p.p Tabelle 12: Harnstoffgehalte in den ersten 80 h p.p. (ELFSTRAND et al. 2002) Tabelle 13: Übersicht über das Vorkommen und die Funktion der bioaktiven Substanzen (MALVEN 1977; PALOMA et al. 1991; MARNILA u. KORHONEN 2002) Tabelle 14: NAGase-Aktivität in verschiedenen Gemelksfraktionen (BERNING et al. 1987) Tabelle 15: Einflussfaktoren auf die Anzahl somatischer Zellen in reifer Milch Tabelle 16: Beurteilung zytologisch-mikrobiologischer Befunde im Rahmen der Kategorisierung der Eutergesundheit nach DVG (2002) Tabelle 17: Einflüsse auf die Milchmengenleistung in reifer Milch und im Kolostrum Tabelle 18: Probennahmeraster für den gesamten Versuchszeitraum... 37

18 Tabellenverzeichnis X Tabelle 19: Beurteilungsschema für den California-Mastitis-Test nach MELLENBERGER (2001) Tabelle 20: Nachgewiesene Erreger mit der Mindestanzahl an KbE Tabelle 21: Leistungsdaten des Mittelbereichsinfrarotspektrometers Tabelle 22: Messparameter des Mittelbereichsinfrarotspektrometers für die Zellzahlmessung Tabelle 23: Pipettierschema für die Cloxacillin-Gebrauchslösung zur Rückstandsanalytik im Kolostrum Tabelle 24: Einteilung der drei Rückstandsklassen Tabelle 25: Auswahl der Tiere für die Rückstandsanalytik nach Rückstandsklassen Tabelle 26: Berechnungen mit SAS Tabelle 27: Erkrankungen im Versuchszeitraum (n = 32) Tabelle 28: Einteilung der Versuchskühe nach Laktationsnummern Tabelle 29: Euterpathogene Keime in Viertelgemelksproben im gesamten Versuchszeitraum Tabelle 30: Mischinfektionen in Viertelgemelksproben (n = 43) Tabelle 31: Mastitiserreger differenziert nach minoren und majoren Pathogenen innerhalb der Versuchsabschnitte Tabelle 32: Bakteriologische Befunde aus Viertelanfangsgemelken in der Kolostralmilchphase und deren Einteilung in minore und majore Pathogene Tabelle 33: Verlauf der Neuerkrankungen von 57 Kühen innerhalb des gesamten Versuchszeitraums, differenziert in die elf Versuchstage T1 - L Tabelle 34: Kategorisierung der Euterviertel an den Versuchstagen T2 und T3 zur Darstellung der Neuerkrankungsrate nach Kaplan Meier (n = 113) Tabelle 35: Physikalische Parameter in den Versuchsabschnitten T, K, und L (Viertelanfangsgemelke) Tabelle 36: Milchinhaltsstoffe in den Versuchsabschnitten T, K und L (Viertelanfangsgemelke)... 64

19 XI Tabellenverzeichnis Tabelle 37: Prozentuale Häufigkeit der fünf Reaktionsstufen des California- Mastitis-Tests in den drei Versuchsabschnitten T, K und L (Viertelanfangsgemelke) Tabelle 38: NAGase-Aktivität und Gehalt somatischer Zellen in der T-, K- und L-Phase (Viertelanfangsgemelke) Tabelle 39: Elektrische Leitfähigkeit, ph-wert, Gehalt somatischer Zellen und NAGase-Aktivität in Vierteln der physiologischen Referenz an den Versuchstagen K1 - K5 (Viertelanfangsgemelke) Tabelle 40: Fett-, Protein-, Laktose- und Harnstoffgehalt, Gefrierpunkt und fettfreie Trockenmasse in Vierteln der physiologischen Referenz an den Versuchstagen K1 - K5 (n = 15, Viertelanfangsgemelke) Tabelle 41: Gehalt somatischer Zellen für K1 - K5 (n = 15 Viertelanfangsgemelke) 70 Tabelle 42: Stichprobenverteilung in den Trockenstehgruppen Tabelle 43: Stichprobenverteilung in den Laktationsnummern Tabelle 44: Stichprobenverteilung für Berechnungen zur Viertelposition Tabelle 45: Stichprobenverteilung in den Eutergesundheitskategorien Tabelle 46: Stichprobenverteilung nach zytobakteriologischen Befunden Tabelle 47: Stichprobenverteilung selten nachgewiesener Erreger Tabelle 48: Mittlere elektrische Leitfähigkeit [ms/cm] und Standardabweichung, abhängig von der Laktationsnummer und den Versuchstagen T1 L3 in Viertelanfangsgemelken Tabelle 49: Mittlere elektrische Leitfähigkeit [ms/cm] und Standardabweichung, abhängig von den vier Eutergesundheitskategorien für die Versuchstage T1 L3 in Viertelanfangsgemelken Tabelle 50: Mittlerer ph-wert und Standardabweichung, abhängig von der Laktations-nummer und den Versuchstagen T1 L3 in Viertelanfangsgemelken Tabelle 51: Mittlere ph-werte und Standardabweichungen, abhängig von den vier Eutergesundheitskategorien in Viertelanfangsgemelken Tabelle 52: Präzisionsbestimmung der infrarotspektroskopischen Messung der Milchinhaltsstoffe in Viertelanfangsgemelken... 86

20 Tabellenverzeichnis XII Tabelle 53: Milchinhaltsstoffe Protein, Fett, Laktose, Harnstoff und fettfreie Trockenmasse (SNF) in Viertelanfangsgemelken an den elf Versuchstagen Tabelle 54: Mittlerer Proteingehalt [%] und Standardabweichung, abhängig von den Trockenstehgruppen für die Versuchstage K1 - L3 in Viertelanfangsgemelken Tabelle 55: Mittlere Proteingehalte [%] und Standardabweichungen in den fünf Laktationsnummern, abhängig von den Versuchstagen T1 - L3 in Viertelanfangsgemelken Tabelle 56: Mittlerer Fettgehalt [%] und Standardabweichungen, abhängig von den Trockenstehgruppen für die Versuchstage K1 - L3 in Viertelanfangsgemelken Tabelle 57: Mittlere Fettgehalte [%] und Standardabweichungen für die fünf Laktationsnummern, abhängig von den Versuchstagen T1 - L3 in Viertelanfangsgemelken Tabelle 58: Mittlerer Laktosegehalt [%] und Standardabweichung, abhängig von den Trockenstehgruppen für die Versuchstage K1 - L3 in Viertelanfangsgemelken Tabelle 59: Mittlere Laktosegehalte [%] und Standardabweichungen für die fünf Laktationsnummern, abhängig von den Versuchstagen T1 - L3 in Viertelanfangsgemelken Tabelle 60: Mittlere Laktosegehalte [%] und Standardabweichungen, abhängig von den vier Eutergesundheitskategorien für die Versuchstage T1 - L3 in Viertelanfangsgemelken Tabelle 61: Mittlerer Harnstoffgehalt [mmol/l] und Standardabweichungen, abhängig von den Trockenstehgruppen für die Versuchstage K1 - L3 in Viertelanfangsgemelken Tabelle 62: Mittlere Harnstoffgehalte [mmol/l] und Standardabweichungen für die fünf Laktationsnummern, abhängig von den Versuchstagen T1 - L3 in Viertelanfangsgemelken

21 XIII Tabellenverzeichnis Tabelle 63: Mittlerer fettfreier Trockenmassegehalt [%] und Standardabweichungen für die fünf Laktationsnummern, abhängig von den Versuchstagen T1 - L3 in Viertelanfangsgemelken Tabelle 64: Mittlere Zellgehalte der eutergesunden Viertel an den Versuchtagen K1 K5 (Fossomatic ) in Viertelanfangsgemelken Tabelle 65: Mittlere Zellgehalte [log 10 (SCC/ml)] und Standardabweichungen für die fünf Laktationsnummern, abhängig von den Versuchstagen T1 - L3 in Viertelanfangsgemelken Tabelle 66: Mittlere Zellgehalte eutergesunder Viertel an den Versuchtagen K1 - K5 (P + B) Tabelle 67: Vergleich der Mittelwerte und Standardabweichungen zweier Zellzählmethoden in fünf Zellzahlklassen für die Versuchstage K1 - K5 (Fossomatic, P + B) Tabelle 68: Verteilung der CMT-Reaktionsstufen innerhalb der ersten fünf Kolostralmilchtage in Viertelanfangsgemelken Tabelle 69: Vergleich der CMT-Reaktionsstufen mit den Zellgehalten der fünf Zellzahlklassen (Fossomatic, Prescott und Breed) in Viertelanfangsgemelken Tabelle 70: Präzisionsbestimmung für die Messung der NAGase-Aktivität in Kolostrum und Vergleich mit den Werten der Zellzahlmessung mittels Fossomatic in Viertelanfangs-gemelken Tabelle 71: Mittlere log 10 NAGase-Aktivitäten [nmol ml -1 min -1 ] für eutergesunde Viertel an den Versuchtagen K1 - K5 in Viertelanfangsgemelken Tabelle 72: Vergleich der mittleren NAGase-Aktivität in fünf Zellzahlklassen mit den Zellzahlgehalten (Fossomatic ) für die Versuchstage K1 - K5 in Viertelanfangsgemelken Tabelle 73: Korrelationen zwischen den Zellzählmethoden Fossomatic und Prescott und Breed mit der NAGase-Aktivität aller Euterviertel der Versuchstage K1 - K5 aus Viertelanfangsgemelken Tabelle 74: Kolostralmilchinhaltsstoffe und physikalische Parameter in Gesamtgemelken von 46 Kühen (K1 - K5)

22 Tabellenverzeichnis XIV Tabelle 75: Kolostralmilchinhaltsstoffe und physikalische Parameter in Gesamtgemelken von 26 Färsen (K1 K5) Tabelle 76: Somatische Zellen in Kolostralmilchgesamtgemelk von 46 Kühen, bestimmt mittels Fossomatic Tabelle 77: Somatische Zellen in Kolostralmilchgesamtgemelk von 26 Färsen, bestimmt mittels Fossomatic Tabelle 78: Gesamtkeimzahlen [log 10 KbE/ml] aus Sammelproben in den ersten beiden Tagen p.p Tabelle 79: Gesamtkeimgehalt [log 10 KbE/ml] der Kolostralmilchgemelke der ersten beiden Tage p.p. im Lagerungsversuch Tabelle 80: Ergebnisse der Farbmessung in Viertelanfangsgemelken an K1 und K2, differenziert in die Eutergesundheitskategorien Tabelle 81: Ergebnisse der Farbmessung in Gesamtgemelken an K1 und K2, differenziert in zwei Zellzahlklassen Tabelle 82: Korrelationen zwischen Güteparametern der Gesamtgemelke und den L*a*b*-Farbwerten Tabelle 83: Einteilung der Proben (Gesamtgemelke) anhand ihrer Cloxacillinkonzentrationen an den ersten beiden Tagen p.p. mittels Schnellmethode Tabelle 84: Nachgewiesene mittlere Cloxacillinkonzentrationen und Standardabweichungen in Kolostralmilchgesamtgemelken der ersten beiden Tage p.p., eingeteilt in die drei Nachweiskategorien (negativ, fraglich, positiv, aus Tabelle 83) Tabelle 85: Cloxacillingehalt [μg/kg] an K1 und K2 für 21 Kühe in Abhängigkeit von Laktationsnummer und Trockenstehzeit (n = 40) in Gesamtgemelken Tabelle 86: Höchste Cloxacillingehalte in Kolostralmilchgesamtgemelken in Abhängigkeit von der Trockenstehzeit (n = 10) Tabelle 87: Vergleich der Variationskoeffizenten (VK) für die Messung des Zellgehaltes in Kolostrum

23 XV Tabellenverzeichnis Tabelle 88: Mittlere Zellgehalte in Kolostrum und reifer Milch in Abhängigkeit von der CMT-Reaktionsstufe Anhangstabelle 1-1: Physiologische Werte ausgewählter physikalischer Eigenschaften, Milchinhaltsstoffe, Enzymaktivitäten und zellulärer Bestandteile von reifer Milch Anhangstabelle 1-2: Physiologische Werte ausgewählter physikalischer Eigenschaften, Milchinhaltsstoffe, Enzymaktivitäten und zellulärer Bestandteile von Kolostrum Anhangstabelle 1-3: Vergleich der Parameter ph-wert, Gefrierpunkt und elektrische Leitfähigkeit in Vierteln der physiologischen Referenz, Vierteln gesunder Färsen und gesunden Vierteln euterkranker Kühe. 206 Anhangstabelle 1-4: Vergleich der Parameter Protein, Fett, Laktose und Harnstoff in Vierteln der physiologischen Referenz, Vierteln gesunder Färsen und gesunden Vierteln euterkranker Kühe Anhangstabelle 1-5: Vergleich der Parameter fettfreie Trockenmasse, Gehalt somatischer Zellen, NAGase in Vierteln der physiologischen Referenz, Vierteln gesunder Färsen und gesunden Vierteln kranker Kühe Anhangstabelle 1-6: Vergleich von Vierteln der physiologischer Referenz [n = 15] und euterkranken Vierteln [n = 144] für zehn Milchparameter an den Versuchstagen K1 - K Anhangstabelle 1-7: Vergleich von Vierteln der physiologischen Referenz [n = 15] mit majoren Pathogenen infizierten Eutervierteln [n = 36] für zehn Milchparameter an den Versuchstagen K1 - K Anhangstabelle 1-8: Korrelation der Parameter an Versuchstag K Anhangstabelle 1-9: Korrelation der Parameter an Versuchstag K Anhangstabelle 1-10: Korrelation der Parameter an Versuchstag K Anhangstabelle 1-11: Korrelation der Parameter an Versuchstag K Anhangstabelle 1-12: Korrelation der Parameter an Versuchstag K

24 Abkürzungsverzeichnis XVI Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung ACN Acetonitril Aqua dest. Aqua destillata a.p. ante partum CIE Commission Internationale de l Eclairage Cl Chemische Ionisierung CMT California-Mastitis-Test CRM Referenzmaterial CV Variationskoeffizient d Tag DIN Deutsches Institut für Normierung DNA Desoxyribonukleinsäure DVG Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft E. coli Escherichia coli EGF Epidermal growth factor elf Elektrische Leitfähigkeit ESTD Externer Standard GC Gaschromatographie GG Gesamtgemelk HGC Hefe-Glucose-Chloramphenicol Ig Immunglobulin IgA Immunglobulin A IGF-1 Insulin-like growth factor IgG Immunglobulin G IgM Immunglobulin M ISTD Interner Standard KbE Koloniebildende Einheiten KNS Koagulasenegative Staphylokokken

25 XVII Abkürzungsverzeichnis LAVES Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit LC-MS/MS Liquid chromatography-mass spectrometry LFGB Lebensmittel-, Bedarfsgegenstände- und Futtermittelgesetzbuch LN Laktationsnummer Log 10 Logarithmus zur Basis 10 MeOH Methanol MS Massenspektrometrie MSTD Matrixstandard MRL Maximum Residue Limit: Rückstandshöchstmenge mrna messenger Ribonukleinsäure ms millisiemens MT Mikrotiterplatte n Stichprobengröße NAGase N-Acetyl-ß-D-glucosaminidase NH 3 Ammoniak nmol Nanomol NPN Nicht-Protein-Stickstoffverbindungen ns nicht signifikant PCR Polymerase-Kettenreaktion PMN Polymorphkernige neutrophile Granulozyten P + B Zellgehaltsbestimmung nach Prescott und Breed ph negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffkonzentration p.p. post partum QC Quality Control r Korrelationskoeffizient s signifikant SAS Statistical Analysis System Sc. Streptococcus sp.

26 Abkürzungsverzeichnis XVIII SCC Somatic Cell Count: Anzahl somatischer Zellen/ml Milch SD R Wiederholbarkeit S. aureus Staphylococcus aureus sd Standardabweichung SNF Fettfreie Trockenmasse SPE Solid Phase Extraction, Festphasenextraktion spp. Spezies (Plural) ssp. Subspezies TGF-ß Transforming growth factor ß TNF- Tumornekrosefaktor U/m Umdrehungen pro Minute VA Versuchsabschnitt VAG Viertelanfangsgemelk VG Vorgemelk VHG Viertelhandgemelk VK Variationskoeffizient VMS Voluntary Milking System : Melkroboter VO (EG) Verordnung der Europäischen Gemeinschaft X Mittelwert, arithmetisch X g Mittelwert, geometrisch

27 1 Einleitung 1 Einleitung Kolostrum ist definitionsgemäß das Milchsekret der ersten drei bis fünf Tage nach der Kalbung. Es dient dem Kalb im Wesentlichen als Überträger der passiven Immunität, als lokaler Schutz im Magen-Darm-Trakt und zur Versorgung mit lebensnotwendigen Nährstoffen. Kolostrum ist seit geraumer Zeit auch als Lebensmittel für den menschlichen Verzehr zugelassen. Kolostrumhaltige Lebensmittel für den menschlichen Verzehr werden häufig als Wellness- und Gesundheitsprodukte vermarktet und erfreuen sich immer größerer Beliebtheit. Diese Produkte werden zumeist von immunsupprimierten Menschen und Kindern konsumiert, um die körpereigene Abwehr durch kolostrale Immunstoffe zu verbessern, und bedürfen deshalb einer besonders gründlichen Untersuchung der Rohstoffe. In Deutschland werden jährlich ca. 600 Tonnen Rohkolostrum verarbeitet 1. Die Gewinnung und Verarbeitung wird in der VO (EG) 853/2004 beschrieben, wobei es, anders als für reife Milch, keine Qualitätsnormen für den Zellzahlgehalt und den Keimgehalt gibt, die europaweit gelten. Vielmehr sind einzelstaatliche Kriterien notwendig, die allerdings für Deutschland noch nicht definiert sind. Ziel dieser Arbeit war eine umfassende Darstellung euterbezogener Parameter der Kolostralmilch im Viertelanfangsgemelk und deren Beurteilung in Hinblick auf die Verbrauchergesundheit. Besonderes Augenmerk sollte dabei auf Erkrankungen des Euters und ihre Auswirkungen auf die Kolostralmilchqualität gelegt werden. Anhand von täglichen Verlaufsuntersuchungen von 88 Versuchstieren sollten herkömmliche Stalltests evaluiert und weitere Parameter bestimmt werden, die der Einschätzung der Eutergesundheit dienen. Mit diesen Daten sollten Grenzwerte bestimmt werden, die eine Unterscheidung zwischen Kolostralmilch eutergesunder und euterkranker Kühe möglich machen. 1 Persönliche Mitteilung von Frau C. Adler, Colostrum Technologies GmbH, Königsbrunn, vom

28 Einleitung 2 Darüber hinaus besteht ein erhöhtes Risiko von Antibiotikarückständen in bovinem Kolostrum, da Milchkühe fast immer mit einem lang wirksamen Antibiotikum zum Zeitpunkt des Trockenstellens behandelt werden. Aufgrund kolostraler Hemmstoffe sind übliche mikrobielle Hemmstofftests nicht anwendbar. Deshalb wurde eine empfindlichere Methode zur Detektion von Antibiotika im Kolostrum mittels Quadrupol-Massenspektrometer (LC-MS/MS) validiert und angewendet. Die in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Untersuchungen dienten vor allem der Beschreibung der Zusammensetzung von Kolostrum in Hinsicht auf die Eutergesundheit und unter Aspekten der Qualität als Lebensmittel.

29 3 Schrifttum 2 Schrifttum 2.1 Physiologie der Milchbildung beim Rind Lakto- und Kolostrogenese (Laktopoese) Die nichtlaktierende Phase vor dem Abkalben wird auch als Trockenstehperiode bezeichnet und dauert idealer Weise 60 Tage (ANNEN et al. 2004). Sie wird von SMITH und TODHUNTER (1982) in drei funktionielle Stadien eingeteilt: a) aktive Involution, b) Steady State und c) Laktogenese bzw. Kolostrogenese. Dabei versteht man unter Laktogenese das Einsetzten von Milchsynthese und Milchsekretion gegen Ende der Trächtigkeit (GÜRTLER u. SCHWEIGERT 2006). Der selektive Transport von Immunglobulinen in das Sekret der Alveolen wird in dieser Phase als Kolostrogenese bezeichnet. Die Kolostro- und Laktogenese beginnt etwa Tage ante partum (a.p.) und ist im Gegensatz zur aktiven Involution ein Aufbauprozess, welcher der de-novo-bildung und Speicherung von Kolostrum gilt (SMITH u. TODHUNTER 1982). Im Differenzierungsprozess der Laktogenese werden die Milchzellen aus einem nichtsekretorischen Stadium in ein sekretorisches Stadium überführt ( Zweistufenmechanismus ). Der erste Abschnitt ist durch zytologische und enzymatische Differenzierung der Alveolarzellen gekennzeichnet und fällt mit einer begrenzten Milchsekretion des so genannten Präkolostrums vor der Geburt zusammen. In dieser Phase erhöht sich der Anteil des rauen endoplasmatischen Retikulums und des Golgi-Apparates in den Zellen. Der Anstieg des Gehaltes an messenger Ribonukleinsäure (mrna) ist Ausdruck einer gesteigerten Proteinsynthese (GÜRTLER u. SCHWEIGERT 2006). Sieben Tage vor dem Geburtstermin erreichen 98 % der Alveolen einen sekretorischen Zustand (CAPUCO et al. 1997). Die zweite Phase der Laktogenese beginnt 0 bis 4 Tage vor der Geburt mit verstärkter Kolostralmilchsynthese und endet einige Tage post partum (p.p.) (TUCKER 1981). Ausgelöst wird diese Phase II, die eigentliche Laktation, durch einen Abfall der Konzentration von Progesteron und Östrogenen (d.h. von Inhibitoren

30 Schrifttum 4 der Laktogenese) bei gleichzeitiger Erhöhung der Prolaktin- und Somatotropinkonzentrationen im Blutplasma (GÜRTLER u. SCHWEIGERT 2006), wobei der laktogene Effekt des Prolaktins im Vordergrund steht (NEVILLE 2002). Weiterhin sind Östrogene und Trijodthyronin von Bedeutung (GÜRTLER u. SCHWEIGERT 2006). Beide Phasen lassen sich bei Färsen durch die Messung des Milchproteins -Laktalbumin unterscheiden, das bis 200 Tage vor der Geburt nicht feststellbar ist, aber ab dem 30. Tag a.p. in Mengen bis zu 300 ng/ml Sekret auftritt (AKERS 2006). Das Flüssigkeitsvolumen in den Zisternen steigt in den letzten beiden Wochen vor dem Kalben langsam an und endet 1 bis 4 Tage vor der Geburt mit massenhafter Sekretion. Mit zunehmender Milchsekretion steigt auch die Konzentration der Milchkomponenten wie Fett, Kasein und Laktose. Dieser markante Anstieg der Milchproduktion korreliert außerdem mit der ansteigenden Citratkonzentration, die somit als Vorbote der einsetzenden Laktation gesehen werden kann. Gleichzeitig nimmt die Konzentration von Laktoferrin, einem wichtigen antimikrobiellen Faktor, auf eine Endkonzentration von 2-3 mg/ml im Kolostrum ab (SMITH u. TODHUNTER 1982). Während der Kolostrogenese ist das Bild der Alveolen vielgestaltig. In verstärktem Maße treten Alveolen mit sekretgefülltem Lumen auf. Die Myoepithelzellen dehnen sich durch Vergrößerung ihrer Zellfortsätze aus und erhalten somit die für die sezernierende Alveole typische Form. Die interalveolären Räume verkleinern sich parallel zur Vergrößerung der Alveolen und die Anzahl der Makrophagen und Lymphozyten in den interalveolären Räumen reduziert sich. Im Vergleich zu anderen Spezies sind Milchkühe normalerweise tragend, wenn diese trockengestellt werden. Deshalb steht der Stillstand der Laktation der beginnenden Mammogenese und Laktogenese gegenüber (CAPUCO et al. 1997). Es herrscht Einigkeit darüber, dass die Milchdrüse eine nicht-laktierende Phase vor einer bevorstehenden Geburt benötigt, um in der folgenden Laktation eine optimale Milchleistung zu erbringen (OLIVER u. SORDILLO 1988; CAPUCO et al. 1997). CAPUCO und AKERS (1999) wiesen im Euter trockenstehender Kühe kurz vor der

31 5 Schrifttum Abkalbung einen um rund 10 % höheren Anteil sekretorischer Zellen im Vergleich zu durchgehend gemolkenen Kühen nach Abwehrmechanismen der bovinen Milchdrüse Die Abwehr der bovinen Milchdrüse wird von einer Vielzahl nichtspezifischer und spezifischer Mechanismen gebildet (CRAVEN u. WILLIAMS 1985). Sie umfassen den nach außen gerichteten Sekretstrom, die Zitzenbarriere, die zelluläre (Blut- und Gewebezellen) und humorale Abwehr und, auf humoraler Ebene, Hemmstoffe und Immunglobuline, die dem Blut, dem Eutergewebe und den Euterlymphknoten entstammen (SCHULZ et al. 1974). Die sogenannte Zitzenbarriere schützt dabei das Hohlraumsystem des Euters im nichtlaktierenden Zustand und während der Zwischenmelkzeit vor dem Eindringen von Keimen. Während des Melkens tritt die reinigende Wirkung des Milchstromes ein. Nach MATTILA und SANDHOLM (1986) ist der Auswascheffekt durch den Milchfluss der wichtigste antimikrobielle Mechanismus. Morphologische Grundlage der Zitzenbarriere bildet die besondere strukturelle Ausbildung der Zitzenspitze. Durch das Muskelsystem des Zitzensphinkters wird der Strichkanal verschlossen. Gleichzeitig stellt die Innenauskleidung des Strichkanals eine Invagination der äußeren Haut dar und besitzt ein schuppenartiges Epithel. Die schützende Funktion dieses Epithels basiert auf einer starken Keratinisierung (physiologische Hyperkeratose) und einer ständigen, nach außen gerichteten Zellerneuerung der Hornschicht (Stratum corneum, PAULRUD 2005). Das verhornte Epithel weist in seiner oberflächlichen Schicht einen hohen Gehalt an bakterizid wirkenden Fettsäuren und Proteinen und an Laktoferrin und Phagozyten auf. Auch das antimikrobiell wirksame Laktoperoxidase-Thiocyanat-Wasserstoffperoxidase- System befindet sich in dieser Schicht (OPDEBEECK 1982; SORDILLO et al. 1997; PAULRUD 2005). Am Übergang des Strichkanals zur Zitzenzisterne findet sich eine als Fürstenberg sche Rosette bezeichnete Faltenbildung der inneren Wandabschnitte. Durch die rosettenartigen Falten wird die Oberfläche der Zitzenwandung erheblich vergrößert, was zu einer längeren Verweildauer der eindringenden Erreger in diesem Bereich führt (NICKERSON 1983).

32 Schrifttum 6 Neben der mechanischen Zitzenbarriere gehört die zelluläre Immunantwort durch Leukozyten zur unspezifischen Abwehr der Milchdrüse. Metabolische Abbauprodukte, Endotoxine oder Zellwandkomponenten der Bakterien aktivieren die zelluläre Abwehr durch Leukozyten. Weiterhin gehören antimikrobiell wirksame Proteine wie Lysozyme, Laktoperoxidase, Zytokine und Laktoferrin als lösliche, humorale Abwehr zu den unspezifischen Abwehrsystemen der Milchdrüse (CRAVEN u. WILLIAMS 1985) Blut-Euter-Schranke Die Blut-Euter-Schranke ist ein weiterer Bestandteil der lokalen Abwehr des Rindereuters. Sie besteht aus dem Endothel der Gefäße, dem Bindegewebe und dem Epithel der Milchzisterne, der Milchgänge und der Alveolen. Dabei ist die Barrierefunktion des Epithels der Milchgänge und Milchzisterne aufgrund ihrer unmittelbaren Beziehungen zu der in den Anteilen des Hohlraumsystems gespeicherten Milch von besonderer Bedeutung. Das Epithel wird zu einem Schutzmechanismus, ermöglicht aber gleichzeitig den transzellulären oder parazellulären Durchtritt von gelösten Stoffen, Zellen und Partikeln. Elektronenmikroskopisch sind die Zellen der apikalen Schicht durch mikrovilliartige Zytoplasmafortsätze an der Oberfläche gekennzeichnet. Seitlich sind die Zellen fest über eine Schlussleiste (Zonula occludens) und die Desmosomen verbunden. Diese Verbindungen benachbarter Epithelzellen sind besonders während der Laktogenese verstärkt, um einen parazellulären Ionenfluß bei einsetzender Milchproduktion zu verhindern (KNIGHT et al. 1998). Es befinden sich zahlreiche Vakuolen unterschiedlicher Größe in allen Zellbereichen, die das Zytoplasma im Extremfall nahezu vollständig ausfüllen und hauptsächlich Proteingranula enthalten (LUDEWIG 1996). Die Kapillaren gehören zum kontinuierlichen Kapillartyp, da sie von einer geschlossenen Schicht Endothelzellen ausgekleidet werden. Die Endothelzellen enthalten in ihrem Zytoplasma zahlreiche Pinozytosevesikel und weisen tight junctions und gap junctions zur Verbindung der Endothelzellen untereinander auf. Auffällig sind Endotheleinstülpungen in das Lumen der Kapillare, die eine

33 7 Schrifttum Vergrößerung der inneren Oberfläche bewirken. Als durchschnittliche Dicke der Blut- Euter-Schranke wurden 2,33 µm ermittelt (LUDEWIG 1996). Über die in der Wand der Milchzisterne und Milchgänge und im Euterparenchym enthaltenen Abwehrzellen erfolgt die Verbindung mit dem Gesamtabwehrsystem des Körpers. Dies geht unter anderem aus der unterschiedlichen Anzahl von T- und B- Lymphozyten und Makrophagen hervor. Erst nach Durchbrechen dieser Barriere kommt es zum Eindringen der Bakterien in das Eutergewebe und damit zur Infektion (MICHEL u. SCHULZ 1987). Ionen können aus dem Interstitium nur über die tight junctions in die Milch gelangen. Die tight junctions sind semipermeabel und ermöglichen so einen isoosmotischen Druckausgleich zwischen Milch und Blut. Laktose ist dabei für die Hälfte des osmotischen Druckes in der Milch verantwortlich. Der übrige osmotische Druck wird von den Ionen Kalium, Natrium und Chlorid erzeugt. Bei Eutererkrankungen allerdings treten in der Milch starke Konzentrationsänderungen der osmotisch aktiven Substanzen auf. Die Ionen Chlorid und Natrium diffundieren entlang des Konzentrationsgefälles in die Milch und Kalium und Laktose diffundieren entgegengestzt ins Blut (HAMANN u. ZECCONI 1998). 2.2 Physiologische Eigenschaften von reifer Milch und Kolostrum Physikalische Eigenschaften Elektrische Leitfähigkeit Die elektrische Leitfähigkeit (elf) der Milch wird definiert als der reziproke Wert des elektrischen Widerstandes und wird hauptsächlich durch die enthaltenen löslichen Salze aus Natrium, Kalium und Chlorid bestimmt. Weitere Einflussfaktoren sind Inhaltsstoffe wie Laktose, die elektrischen Strom ebenso wenig leitet wie Fett (MUCCHETTI et al. 1994). Die elf wird durch ihre schnelle und einfache Messung besonders zur Einschätzung der Eutergesundheit in automatischen Melksystemen eingesetzt (MAATJE et al. 1992; HAMANN u. ZECCONI 1998). In reifer Milch gesunder Euterviertel schwankt die elf signifikant in Abhängigkeit vom Laktationsstand zwischen 5,3 ms/cm und 6,5 ms/cm am Ende der Laktation

34 Schrifttum 8 (SHELDRAKE et al. 1983; NORBERG et al. 2004). Sie wird im Viertelvorgemelk gemessen, welches auch die höchsten Messwerte im Vergleich zu den anderen Gemelksfraktionen enthält (WOOLFORD et al. 1998; ONTSOUKA et al. 2003). In dieser Gemelksfraktion ist der Milchfettgehalt signifikant niedriger und behindert die elf deshalb deutlich weniger (FERNANDO et al. 1985). Da sich durch Mastitiden die Natrium- und Chloridionenkonzentration erhöht und somit die elf ansteigt, wird dieser Parameter auch zur unterstützenden Mastitisdiagnostik eingesetzt (ASHWORTH et al. 1967; LINZELL u. PEAKER 1975). Euterkranke Viertel weisen erhöhte Werte von 7,2 ms/cm ± 1,0 auf (MAATJE et al. 1992). Aufgrund des starken Einflusses des Milchfettgehaltes auf die elf und der damit einhergehenden unbefriedigenden diagnostischen Sicherheit wurde zusätzlich zu einem Grenzwert von 6,5 ms/cm auch folgender Ansatz publiziert: Ein Euterviertel gilt als erkrankt, wenn der Wert der elf um mehr als 15 % über den Werten der Referenzviertel liegt (Inter-Quarter-Ratio, IQR). Von allen Mastitiserregern hat eine Infektion mit Staphylococcus aureus (S. aureus) den höchsten Anstieg der elf zur Folge (SHELDRAKE et al. 1983). Korrelationen mit anderen Mastitisindikatoren wie der Anzahl somatischer Zellen (SCC) und der N-Acetyl-ß-D-glucosaminidase (NAGase) liegen bei r = 75 bzw. r = 77 (KITCHEN et al. 1980). Nach SCHULTZE (1985) ist die Messung der elf in reifer Milch der SCC-Messung in Sensitivität und Spezifität überlegen. Kolostrum enthält signifikant höhere Natrium- und Chloridkonzentrationen, die eine physiologisch höhere elf in der Kolostralphase bedingen (ONTSOUKA et al. 2003). GRABOWSKI (2000) ermittelte in der Kolostralmilchphase einen Wert von 5,51 ± 0,62 ms/cm in gesunden Eutervierteln ph-wert Der ph-wert ist ein weiterer Parameter, um den Eutergesundheitsstaus einer Kuh einzuschätzen. GRABOWSKI (2000) ermittelte einen durchschnittlichen ph-wert von 6,66 ± 0,11 in Viertelanfangsgemelken (VAG) gesunder Euterviertel. Durch eine klinische Mastitis wird die Permeabilität des Eutergewebes verändert und der

35 9 Schrifttum ph-wert der Milch nähert sich durch den Übertritt von Proteinen und Salzen dem ph- Wert des Blutes an. Der ph-wert der Milch ist somit ein Indikator für Mastitis (ASHWORTH et al. 1967). Nach MAUNSELL (1998) eignet sich der ph-wert aufgrund der hohen Standardabweichung nur bedingt zur Unterscheidung von gesunden und infizierten Eutervierteln. Die Proteine der Milch agieren als Puffersystem und halten den ph-wert innerhalb physiologischer Grenzen, auch wenn die Zellzahl bereits im pathologischen Bereich ist. Beeinflusst wird der ph-wert unter anderem von der Gemelksfraktion. Im Verlauf eines Melkvorgangs nimmt der ph-wert ebenso wie im Laufe einer Laktation signifikant zu. Unterschiede zwischen zwei unterschiedlichen Herden waren hingegen nicht signifikant (HOLDAWAY et al. 1996). Während der ersten zwei Wochen der Involution kommt es zu einem stetigen Anstieg des ph-wertes von 6,7 auf 7,4, der sich um den Geburtszeitpunkt auf 6,3 reduziert und sich p.p. wieder bei 6,7 einpendelt (HURLEY 1987). Der ph-wert kann somit ebenso als Indikator für den Fortschritt der Involution angesehen werden. Für die ersten Gemelke p.p. konnten FOLEY und OTTERBY (1978) folgende ph- Werte feststellen (Tabelle 1): Tabelle 1: ph-wert der Kolostralmilch in den ersten beiden Tagen p.p. (FOLEY u. OTTERBY 1978) Tag p.p. 1 2 Gemelk (n = 20) ph-wert (X a ) (Min Max) 6,32 (6,00 6,61) 6,32 (6,11 6,59) 6,33 (6,09 6,62) 6,34 (6,08 6,67) Ebenso wurden jahreszeitliche Schwankungen des ph-wertes von KLIMES et al. (1986) untersucht (Tabelle 2):

36 Schrifttum 10 Tabelle 2: Jahreszeitliche Schwankungen des ph-wertes in den ersten fünf Tagen p.p. (KLIMES et al. 1986) Erstgemelk [X a ± sd] 3. Tag p.p. [X a ± sd] 5. Tag p.p. [X a ± sd] Sommer (n = 13) 6,31 ± 0,07 6,31 ± 0,10 6,43 ± 0,10 Winter (n = 24) 6,24 ± 0,08 6,35 ± 0,06 6,39 ± 0,07 X a = Arithmetischer Mittelwert, sd = Standardabweichung Signifikante Unterschiede zwischen den ph-werten von gesunden und infizierten Eutervierteln konnten MAUNSELL et al. (1998) in ihrer Untersuchung von Kolostralmilchproben darstellen. In infizierten Eutervierteln 14 Tage bzw. 7 Tage vor Abkalbung und 3 Tage nach Abkalbung lagen die ph-wert signifikant über den Werten gesunder Viertel (Tabelle 3). Tabelle 3: ph-wert in Präkolostrum und Kolostrum zu unterschiedlichen Probennahmezeitpunkten (MAUNSELL et al. 1998) Zeitpunkt der Probennahme Infizierte Milchdrüse [X a ± sd] Nicht infizierte Milchdrüse [X a ± sd] 14 d a.p. 7,39* ± 0,52 6,99 ± 0,52 7 d a.p. 7,21* ± 0,60 6,99 ± 0,61 3 d p.p. 6,49* ± 0,16 6,43 ± 0,16 X a = Arithmetischer Mittelwert, sd = Standardabweichung, * = p < 0, Fettfreie Trockenmasse Die fettfreie Trockenmasse (SNF) setzt sich aus drei Komponenten zusammen: Eiweiß, Laktose und anorganischen Salzen. Bis 1999 musste die Konsummilch laut EG-Verordnung 2597/97 mindestens einen Gehalt von 8,5 % fettfreier Trockenmasse aufweisen. Dies sollte vor allem einer Manipulation bei der Milcherzeugung vorbeugen (SCHNEIDER 2003). Da aber der Eiweißgehalt, unter anderem abhängig von der Energieversorgung der Kuh, stark schwankt, wurde dieser Grenzwert wieder aufgehoben (Tabelle 4).

37 11 Schrifttum Tabelle 4: Darstellung der Schwankungsbreiten von Komponenten der fettfreien Trockenmasse in reifer Milch (SCHNEIDER 2003) Inhaltsstoff Gehalt [%] Schwankungsbreite [%] absolut Schwankungsbreite [%] relativ Eiweiß 3,4 2,5-6,0 ± 80 Laktose 4,8 3,5-5,5 ± 30 Mineralstoffe 0,7 0,5-1,0 ± 30 Summe 8,9 6,5-12,5 -/- MIELKE (1994) und HILLERS (1969) ermittelten einen Gehalt fettfreier Trockenmasse von durchschnittlich 8,8 %, wobei Faktoren wie die Energieversorgung der Kuh, das Laktationsstadium und die Jahreszeit eine Rolle spielen (WILCOX et al. 1959; MEYER et al. 1984) Für die ersten Gemelke p.p. konnten von MIELKE (1994) folgende Trockensubstanzgehalte gemessen werden (Tabelle 5): Tabelle 5: Gehalt fettfreier Trockenmasse in Kolostralmilch (MIELKE 1994) 1. Gemelk 2. Gemelk 10. Gemelk Trockensubstanz 21,6 % 16,9 % 14,2 % Fettgehalt 3,3 % 4,9 % 4,7 % Fettfreie Trockenmasse 18,3 % 12,0 % 9,5 % FOLEY und OTTERBY (1978) veröffentlichten folgende Werte (Tabelle 6): Tabelle 6: Gehalt fettfreier Trockenmasse (SNF) in Kolostralmilch in den ersten vier Tagen p.p. (FOLEY u. OTTERBY 1978) 1. Gemelk 2. Gemelk 3. Gemelk 4. Gemelk SNF 16,7 % 12,2 % 9,8 % 9,4 %

38 Schrifttum Chemische Eigenschaften Protein Der Proteingehalt setzt sich aus den Hauptproteinfraktionen Kasein (Synthese in den Alveolen) und Molkenprotein (aus dem Serum) zusammen (GÜRTLER u. SCHWEIGERT 2006). Reife Milch enthält einen Proteingehalt um 3,25 % (BOBE et al. 2007). TSIOULPAS et al. (2007) kamen in ihren Untersuchungen auf ähnliche Werte (90. Tag p.p.). BOBE et al. (2007) untersuchten den Proteingehalt bei Kühen mit genetisch bedingter hoher und durchschnittlicher Milchleistung und konnten feststellen, dass Kühe mit hoher Milchleistung einen geringeren Proteingehalt aufweisen als Kühe mit durchschnittlicher Milchleistung. Im Kolostrum wird der Proteingehalt als ausschlaggebendes Kriterium für die Kolostrumqualität bewertet (KLIMES et al. 1986). KEHOE (2007) untersuchte Kolostrum von 55 Kühen aus 55 Milchkuhherden und ermittelte einen durchschnittlichen Proteingehalt von 14,9 ± 3,3 % im Erstgemelk. Minimale und maximale Schwankungen lagen bei 7,1 % und 22,6 %, wobei das Kolostrum von Mehrkalbinnen höhere Proteingehalte als das Kolostrum von Färsen aufwies (STREKOZOV et al. 2008). Die Konzentration von Milchprotein nimmt im Übergang von Kolostrum zu reifer Milch ab, was hauptsächlich auf die Verdünnung infolge der steigenden Milchleistung zurückzuführen ist (ONTSOUKA et al. 2003). In dieser Phase ist der Proteingehalt der größte variable Faktor zwischen Kühen am gleichen Zeitpunkt p.p. (OYENIYI u. HUNTER 1978). Innerhalb der ersten drei Tage p.p. konnte die höchste signifikante Reduktion des Proteingehaltes hin zur reifen Milch beobachtet werden (KEHOE 2007). Schon 12 bzw. 24 Stunden p.p. reduziert sich der Proteingehalt um 84 % bzw. 64 % (OYENIYI u. HUNTER 1978). In der folgenden Tabelle werden Proteingehalte in den ersten 5 Tagen p.p. dargestellt (Tabelle 7):

39 13 Schrifttum Tabelle 7: Proteingehalt in den ersten 5 Tagen p.p. (TSIOULPAS et al. 2007) Zeit p.p. [Tage] Protein [%] 1 16,12 ± 1,64 2 5,43 ± 0,24 3 4,54 ± 0,4 4 4,41 ± 0,31 5 4,23 ± 0,24 In einer Studie untersuchte ONTSOUKA (2003) die Proteinkonzentrationen unterschiedlicher Gemelksfraktionen im Kolostrum. Er fand heraus, dass der Proteingehalt im Vorgemelk am höchsten ist und dann im Laufe des Melkvorgangs stetig abnimmt. Generell besteht Kolostrum zu 15,41-15,68 % aus Serumproteinen (davon gehören 74,9 bis 75,2 % zu den Immunglobulinen, 5,2-7,1 % zu den -Laktoglobulinen, 15,2-17,5 % zu den -Globulinen) und zu 2,1-2,8 % aus Serumalbuminen (STREKOZOV et al. 2008) Fett Die genetische Selektion auf eine hohe Milchleistung in den letzten Jahren ließ den Fettgehalt in reifer Milch sinken (BOBE et al. 2007). Die Milchfettzusammensetzung hat sich durch diese Entwicklung allerdings nicht verändert. Kühe mit hoher Milchleistung wiesen im Durchschnitt einen Fettgehalt von 3,29 % auf, Kühe mit durchschnittlicher Milchleistung hingegen einen höheren Fettgehalt von 3,49 %. In den verschiedenen Laktationsperioden schwankt der Fettgehalt in der Milch nicht signifikant, wohingegen der Fettgehalt während des Melkvorgangs kontinuierlich zunimmt. Letzteres Phänomen ist auf die geringere Dichte des Fettes im Vergleich zu Wasser zurückzuführen: Die Fetttröpfchen werden während des Melkvorgangs weniger schnell abgegeben als die wässrige Phase. Unvollständige Milchejektion und unvollständiges Ausmelken führen daher zu einem geringeren Fettgehalt in der Milch (ONTSOUKA et al. 2003).