-hairpin-peptide zur Erkennung von. Antikörpern gegen rheumatoide Arthritis

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1 -hairpin-peptide zur Erkennung von Antikörpern gegen rheumatoide Arthritis Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) dem Fachbereich Chemie der Philipps Universität Marburg vorgelegt von SABRINA FISCHER, M. SC. aus Kassel Marburg/Lahn 2015

2 Vom Fachbereich Chemie der Philipps-Universität als Dissertation angenommen am: Erstgutachter: Zweitgutachter: Prof. Dr. Armin Geyer Prof. Dr. Eric Meggers Tag der mündlichen Prüfung: Hochschulkennziffer: 1180

3 Der experimentelle Teil dieser Arbeit entstand in der Zeit von Februar 2011 bis Mai 2014 am Fachbereich Chemie der Philipps Universität Marburg. Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. Armin Geyer für die große wissenschaftliche Freiheit und die hervorragende Unterstützung und Hilfestellung bei der Bearbeitung dieser vielseitigen und faszinierenden Thematik.

4 Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht: Fischer, S., Geyer, A. Filaggrin-Peptide mit β-haarnadel-struktur binden Rheuma- Antikörper. Angewandte Chemie 2014, 126, doi: /ange Fischer, S., Geyer, A. Filaggrin peptides with β-hairpin structure bind rheumatoid arthritis antibodies. Angewandte Chemie International Edition 2014, 53, doi: /anie

5 Zwei Dinge sind zu unserer Arbeit nötig: Unermüdliche Ausdauer und die Bereitschaft, etwas, in das man viel Zeit und Arbeit gesteckt hat, wieder wegzuwerfen. Albert Einstein

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7 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Proteine und Peptide Definierte Peptid-Hairpinstrukturen NMR-Spektroskopische Strukturaufklärung von Peptiden Oxidative Faltung von Cystein enthaltenden Peptiden Geometrie von Disulfidbrücken Faltungsmotive natürlich vorkommender Cystein-reicher Peptide Filaggrin Filaggrin - Filament aggregierendes Protein Die Rolle von Filaggrin-Peptiden in der Diagnose von rheumatoider Arthritis Aufgabenstellung Ergebnisse und Diskussion Konzept der chimären Filaggrin-Peptide Synthese von Filaggrin-Peptiden Festphasensynthese Bildung des Disulfids Strukturaufklärung der chimären Filaggrin-Peptide mit -hairpin-struktur Oxidative Faltung zum -hairpin Voraussetzungen für die Strukturanalyse der Filaggrin-Peptide Charakterisierung der Wasserstoffbrückenbindungen im Peptidrückgrat I

8 Inhaltsverzeichnis Charakterisierung der strukturrelevanten NOE-Kontakte Bestimmung der Seitenkettenrotamere und prochirale Zuordnung der -Protonen Biologische Aktivität der chimären Filaggrin-Peptide Einfluss der einzelnen Aminosäuren auf die -hairpin-struktur der Filaggrin- Peptide Mutationen in i+2 Position des -turns in chimären Filaggrin-Peptiden Einfluss der Mutationen in i+2 Position auf die Faltung Bestimmung des -turn Typs Starrer -turn oder turn-flip und dessen Einfluss auf die biologische Aktivität Chimäre Filaggrin-Peptide mit zweifacher Disulfid-Verknüpfung Synthese und oxidative Faltung der zweifach disulfidverbrückten Filaggrin-Peptide Einfluss des zweiten Disulfids auf die -hairpin-struktur Bestimmung der Disulfid-Konformation Biologische Aktivität der zweifach disulfidverknüpften Filaggrin- Peptide Mutationen in i+1 Position des -turns - Citrullinmimetika Thiocitrullin (Tci) in i+1 Position Amino-4-carbamidobutansäure (Acb) in i+1 Position Bestimmung der konformativen Stabilität des Disulfids durch Mutation mit -Methylcystein Synthese von -Methylcystein (Tth) II

9 Inhaltsverzeichnis Modell-Hexapeptide zur Untersuchung des Einflusses eines -Methylcystein-Cystein-Disulfids auf die Struktur Einfluss eines -Methylcystein-Cystein-Disulfids auf ein chimäres Filaggrin-Peptid Bestimmung der konformativen Stabilität des hydrophoben Clusters durch Mutation mit -Methylhistidin Synthese von N -Methylhistidin (Tmh) Einfluss von -Methylhistidin auf die Konformation eines chimären Filaggrin-Peptids Einfluss der Peptidlänge auf die Faltung zum -hairpin Veränderung der Citrullin-Position innerhalb der chimären Filaggrin- Peptide Bestimmung der Antikörperaffinität chimärer Filaggrin-Peptide über Immunassays Bestimmung der Antikörperaffinität über Dot Blot Assays Bestimmung der Antikörperaffinität über ELISA Vergleich der Ergebnisse von Dot Blot und ELISA Design einer Studie zur Antikörperbestimmung im Blutserum zur diagnostischen Eignung neuer konformativ fixierter Filaggrin-Peptide Zusammenfassung Summary Ausblick Experimenteller Teil Allgemeine Anmerkungen III

10 Inhaltsverzeichnis 7.2 Allgemeine Vorschrift zur Durchführung der Dot Blots Allgemeine Vorschrift zur Durchführung der ELISAs Allgemeine Arbeitsvorschriften für die Festphasensynthese von Peptiden Beladung des 2-Chlortritylchlorid-Harz Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe Kupplung der Aminosäure Abspaltung des Peptids vom Harz und Entfernung der Seitenkettenschutzgruppen Automatisierte Festphasensynthese von Peptiden Oxidation von L-Cystein-haltigen Peptiden Synthese der Aminosäure-Bausteine Fluorenylmethoxycarbonyl-Isothiocyanat (FmocNCS, S02) N -Boc-L-Ornithin (H-Orn(Boc)-OH, S04) N -Fmoc-N -Boc-L-Ornithin (Fmoc-Orn(Boc)-OH, S05) N -Fmoc-N -Dde-L-Ornithin (Fmoc-Orn(Dde)-OH, S06) N -Fmoc- 2,4-Diaminobutansäure (Fmoc-Dab-OH, S08) N -Fmoc- 2-Amino-4-carbamidobutansäure (Fmoc-Acb-OH, S09) Boc-L-Threonin (Boc-Thr-OH, S11) N -Boc-L-Threoninyl-β-lacton (S12) N -Boc-S-Acetyl-L-allo-Thiothreonin (Boc-Tth(Ac)-OH, S13) N -Boc-L-allo-Thiothreonin (Boc-Tth-OH, S14) L-allo-Thiothreonin (Boc-Tth-OH, S15) S-Trityl-L-allo-Thiothreonin (H-Tth(Trt)-OH, S16) N -Fmoc-S-Trityl-L-allo-Thiothreonin (Fmoc-Tth(Trt)-OH, S17) IV

11 Inhaltsverzeichnis N -Boc-S-Trityl-L-allo-Thiothreonin (Boc-Tth(Trt)-OH, S18) L-Histidinmethylester-Dihydrochlorid (H-His-OMe, S20) (7S)-7-Methoxycarbonyl-5,6,7,8-tetrahydro-5-oxoimidazo- [1,5-c]pyrimidin (S21) (7S)-7-Methoxycarbonyl-2-Methyl-5,6,7,8-tetrahydro-5-oxoimidazo- [1,5-c]pyrimidiniumiodid (S22) N -Methyl-L-Histidin-Dihydrochlorid (H-Tmh-OH, S23) N -Fmoc-N -Methyl-L-Histidin-Dihydrochlorid (Fmoc-Tmh-OH, S24) Synthese der Peptide Literatur Anhang V

12 Abkürzungen Abkürzungsverzeichnis Å Abs. abs. Ac Acm ACPA AFA AFP AK AKA ber. bs Boc Boc₂O BPTI CCP CDI COSY d dd ddd DCM DEE DIPEA DMF DMSO ELISA ESI Et et al. FMN Fmoc Ångström Absorption absolut Acetyl Acetamidomethyl anti citrullinated peptide/protein antibody, engl. Anti-Citrulliniertes- Peptid/Protein-Antikörper Anti-Filaggrin-Antikörper antiperinuklärer Faktor Antikörper Anti-Keratin-Antikörper berechnet breites Singulett tert-butyl-dicarbonat Di-tert-butyl-dicarbonat bovine pancreatic trypsin inhibitor, engl. Pankreatischer Trypsin-Inhibitor cyclische citrullinierte Peptide 1,1'-Carbonyldiimidazol correlated spectroscopy, engl. Korrelations-Spektroskopie day, engl. Tag / Dublett / Durchmesser Doppeldublett Dublett eines Doppeldubletts Dichlormethan Diethylether Di-iso-propyl-ethylamin N,N-Dimethylformamid Dimethylsulfoxid enzyme-linked immunosorbent assay, engl. enzymgekoppelter Immunadsorptionstest Elektrospray-Ionisation Ethyl et alii, et aliae lat. und Andere Flavinmononukleotid Fluorenylmethoxycarbonyl VI

13 gef. HBTU HMBC HOBt HPLC HRMS HSQC IEP IgG IgM IL n J LH M m MCV Me MS NMP NMR NOE NOESY PAD Pbf PBS PIFA ppm q RA rc RE RF Abkürzungsverzeichnis gefunden 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat heteronuclear multiple bond correlation, engl. Heterokern Mehrbindungs- Korrelation 1-Hydroxybenzotrizol Hochleistungsflüssigkeitschromatographie high resolution mass spectroscopy, engl. hochaufgelöste Massenspektrometrie heteronuclear single quantum correlation, engl. Heterokern Einquanten- Korrelation Isoelektrischer Punkt Immunglobulin G Immunglobulin M Interleukine skalare Kopplung über n Bindungen / Joule left-handed, engl. linksgängig molar Multiplett mutiertes citrulliniertes Vimentin Methyl Massenspektrometrie N-Methyl-2-pyrrolidon nuclear magnetic resonance, engl. Kernspinresonanz nuclear overhauser effect, engl. Kern-Overhauser-Effekt nuclear overhauser enhancement spectroscopy, engl. Kern-Overhauser-Effekt verstärkende Spektroskopie Peptidylarginindeiminase 2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl phosphate buffered saline, engl. phosphatgepufferte Salzlösung Phenyliod(III)bis(trifluoracetat) parts per million, engl. Teile pro Million Quartett Rheumatoide Arthritis random coil relative Einheiten Rheumafaktor VII

14 RH ROE ROESY rpm RT s SFTI-1 SPPS Su t tbu TFA TGM THF TIPS TNF- TOCSY TOF Trt TSP WBB Xaa Abkürzungsverzeichnis right-handed, engl. rechtsgängig rotating frame nuclear overhauser effect, engl. im rotierenden Koordinatensystem auftretender Kern-Overhauser-Effekt rotating frame nuclear overhauser enhancement spectroscopy, engl. Kern- Overhauser-Effekt verstärkende Spektroskopie im rotierenden Koordinatensystem rounds per minute, engl. Umdrehungen pro Minute Raumtemperatur (ca. 20 C) Singulett sunflower trypsin inhibitor-i, engl. Sonnenblumen Trypsin-Inhibitor-I solid phase peptide synthesis, engl. Festphasenpeptidsynthese Succinimid Triplett / Zeit tert.-butyl Trifluoressigsäure Transglutaminase Tetrahydrofuran Triisopropylsilan Tumornekrosefaktor total correlation spectroscopy, engl. totale Korrelations-Spektroskopie time of flight, engl. Flugzeitanaylsator Triphenylmethyl, Trityl Natrium-(Trimethylsilyl)-propionat-d4 Wasserstoffbrückenbindung beliebige Aminosäure VIII

15 Abkürzungsverzeichnis Ein- und/oder Dreibuchstabenkode der kanonischen, sowie weiteren für diese Arbeit relevanten Aminosäuren (wenn nicht anders gekennzeichnet handelt es sich bei allen Aminosäuren immer um die S- bzw. L-Isomere): Acb 2-Amino-4-carbamidobutansäure Ala A Alanin Arg R Arginin Asn N Asparagin Asp D Asparaginsäure Cit Citrullin Cys C Cystein Gln Q Glutamin Glu E Glutaminsäure Gly G Glycin His H Histidin Ile I Isoleucin Leu L Leucin Lys K Lysin Met M Methion Phe F Phenylalanin Pmh -Methylhistidin Pro P Prolin Sar Sarkosin Ser S Serin Tci Thiocitrullin Thr T Threonin Tmh -Methylhistidin Trp W Tryptophan Tth Thiothreonin Tyr Y Tyrosin Val V Valin IX

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19 Abstract Abstract Im Rahmen dieser Arbeit wurden Filaggrin-Peptide mit einer definierten Konformation in Lösung synthetisiert und analysiert. Bei Filaggrin-Peptiden handelt es sich um eine biologisch aktive Peptidsequenz, welche in der Lage ist Autoantikörper zu erkennen, die bei einer Erkrankung mit rheumatoider Arthritis gebildet werden. Die Struktur der rigiden Filaggrin-Peptide wurde NMR-spektroskopisch aufgeklärt und deren Einfluss auf die biologische Aktivität durch Immunassays untersucht. Ferner wurden über Aminosäuren-Mimetika Informationen über Position und Eigenschaften des Bindungsepitops sowie den Einfluss verschiedener Aminosäuren und Funktionalitäten auf die Faltung des Peptids erhalten. So kann ein entscheidender Beitrag zur Aufklärung der Geometrie der Epitop-Antikörper-Bindung sowie der Entwicklung einer personenspezifischen, frühzeitigen Rheumadiagnose auf Grundlage von Immunassays geleistet werden. Abbildung 9-1: Durch die Integration des Strukturmotivs eines rigiden -hairpin-peptids auf eine flexible Filaggrin-Sequenz, welche ein Epitop für die Bindung von Antikörpern beinhaltet, konnte eine Klasse von chimären Filaggrin-Peptiden entwickelt werden, die das Bindungsmotiv in einer definierten dreidimensionalen Form präsentiert. Durch verschiedene Mutationen innerhalb und außerhalb des Epitops sowie der Strukturaufklärung dieser Peptide konnten Informationen über den Zusammenhang zwischen funktionellen Gruppen, Struktur und biologischer Aktivität der chimären Filaggrin-Peptide erhalten werden. 1

20 1 Einleitung Einleitung 1.1 Proteine und Peptide Proteine und Peptide erfüllen in lebenden Systemen eine Vielzahl von unterschiedlichen Funktionen. Sie katalysieren Reaktionen, dienen als Transportund Speichersysteme, koordinieren Bewegungen, wirken als Stütze für Haut und Knochen und sind als Antikörper für den Immunschutz verantwortlich. An der Biosynthese von Proteinen sind 20 verschiedene Aminosäuren beteiligt, welche auch kanonische Aminosäuren genannt werden. Durch posttranslationale Modifizierung der Polypeptidkette werden jedoch fast 200 verschiedene Aminosäurereste gebildet. [1] Die Abfolge der kanonischen Aminosäuren wird durch Codons in den Genen codiert. Die Struktur von Proteinen kann in vier Hierarchien eingeteilt werden: Die Primärstruktur ist die Reihenfolge der Aminosäuren in der linearen Polypeptidkette und die Grundlage für die dreidimensionale Struktur des Proteins. Die Sekundärstruktur entsteht durch Wechselwirkungen der Aminosäuren untereinander, wobei sich die Polypeptidketten zu regelmäßigen Strukturen, wie Helices oder Faltblättern, falten. Solche Abschnitte sind lokal begrenzt und werden durch Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen stabilisiert. Die Tertiärstruktur beschreibt die räumliche Anordnung der Polypeptidkette und entsteht aus der spontanen Faltung des Proteins. So sind zum Beispiel bei wasserlöslichen Proteinen Aminosäuren mit hydrophilen Resten an der Oberfläche und solche mit hydrophoben Resten im Inneren des Proteins lokalisiert. Stabilisiert wird die Tertiärstruktur neben Wasserstoffbrückenbindungen von VAN-DER-WAALS-Wechselwirkungen, ionischen und hydrophoben Wechselwirkungen sowie Disulfidbrücken. Die Anordnung mehrerer Polypeptidketten untereinander wird schließlich als Quartärstruktur bezeichnet. Eine einfache Form der Quartärstruktur ist beispielsweise ein Dimer aus zwei identischen Proteinen. [2] Innerhalb des Rückgrats der Polypeptidkette ist nur eine begrenzte Bindungsrotation möglich. Die Amidbindung ist aufgrund des 2

21 Peptidfaltung partiellen Doppelbindungscharakters planar und nimmt daher nur Diederwinkel von etwa 180 (trans-amidbindung) oder etwa 0 (cis-amidbindung) ein, wobei die trans-konformation aufgrund sterischer Hinderung gegenüber der cis-konformation stark bevorzugt ist (Abbildung 1-1). Durch die sterische Einschränkung der partiellen Doppelbindung sind nur bestimmte Kombinationen der - und -Winkel innerhalb des Peptidrückgrats möglich. Der -Winkel wird zwischen NH und C von den benachbarten Carbonylkohlenstoffen aufgespannt, der -Winkel zwischen C und Carbonlykohlenstoff von den benachbarten NHs. Die Kombination der möglichen - und -Winkel ergeben ein - -Diagramm, auch RAMACHANDRAN Diagramm genannt, welches die Häufigkeit der auftretenden Winkel in Proteinstrukturen zeigt. [3 5] Abbildung 1-1: Darstellung der cis- und trans- Konformation von Amidbindungen innerhalb eines Proteins und des RAMACHANDRAN Diagramms. [3] Die trans-konformation des Amids ist (mit Ausnahme der Aminosäure Prolin) stark bevorzugt. Im RAMACHANDRAN Diagramm sind die häufig auftretenden Kombinationen von - und -Winkel gezeigt. Die einzelnen Bereiche lassen sich verschiedenen Sekundärstrukturelementen zuordnen. Der Übergang vom Peptid zum Protein ist fließend und liegt etwa bei Aminosäuren. Neben der Strukturanalyse natürlicher Peptide gibt es inzwischen eine ganze Reihe "designter" Peptide, welche wichtige Informationen über Faltungsmechanismen von Proteinen und den Zusammenhang zwischen Sequenz und Konformation liefern. [6] 3

22 Einleitung Obwohl die Struktur von Proteinen sehr komplex ist, lässt sie sich durch die Kombination einer limitierten Anzahl von Sekundärstrukturelementen (Helix, Faltblatt und turn) beschreiben. Die Untersuchung von Struktur und Faltung isolierter Sekundär- oder Supersekundärstrukturen (Abbildung 1-2) in Form von Peptiden ermöglicht ein besseres Verständnis der komplexen Proteinstrukturen. [7] In der Literatur sind die Strukturanalysen vieler -helicaler Peptide beschrieben, [8 10] während -Faltblatt- Peptide aufgrund ihrer Aggregationsfreudigkeit häufig synthetische Probleme mit sich Abbildung 1-2: Darstellung der Struktur-Hierarchien in Proteinen. Bei Peptiden sind aufgrund ihrer Größe meist nur Sekundär- oder Supersekundärstrukturen existent. (Abbildung entnommen aus: J. VENKATRAMAN et al., Design of folded peptides, Chem. Rev. 2001, 101, ) bringen und schlecht wasserlöslich sind. [6] Erst in den letzten Jahren wurden vermehrt monomere, nicht aggregierende Faltblatt-Peptide beschrieben, wobei die meisten davon -hairpins darstellen. [11 15] Ein selbstständig faltender -hairpin ist das einfachste Modell zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen den Aminosäuren während der Faltung von -Faltblättern in Proteinen. [6,15] 4

23 Peptidfaltung Viele der "designten" Peptide stellen Modifikationen natürlicher oder bereits bekannter Peptide oder Proteinabschnitte dar. Diese in Abbildung 1-3 dargestellten Modifikationen können einerseits eine Deletion, Addition oder Mutation einzelner Aminosäuren sein, zum anderen aber auch chemische Modifizierungen beispielsweise durch Verwendung unnatürlicher Aminosäurederivate oder Zyklisierungsmethoden. [16] Abbildung 1-3: Schematische Darstellung verschiedener Modifizierungen eines (natürlichen) Peptids. Durch Deletion oder Substitution einzelner Reste oder Bereiche kann deren Einfluss auf die Konformation oder die biologische Aktivität des Peptids untersucht werden. [17] Zentrale Deletion, nicht isostere Substitution (beispielsweise durch -Aminosäuren) und Insertion zerstört hierbei das Raster des Peptids. Eine Addition erhält alle Funktionalitäten und ermöglicht es, Chimäre aus verschiedenen Sequenzen aufzubauen und so die biologischen Eigenschaften zweier Peptide zu kombinieren. [18] Durch Zyklisierung des Peptids kann die Stabilität einer gebildeten Vorzugskonformation erhöht oder überhaupt erst eine definierte Struktur gebildet werden. [19,20] Ebenfalls möglich ist dies durch Substitution bestimmter Aminosäuren oder deren Mimetika, wenn diese attraktive Wechselwirkungen ausbilden oder aufgrund einer rigiden Struktur das Peptid in eine Vorzugskonformation dirigieren. [21 23] 5

24 Einleitung Eine solche Veränderung der Peptidsequenz kann zur Erhöhung oder Verringerung der biologischen Aktivität oder Selektivität führen oder, vor allem im Falle einer chemischen Modifikation, zu geringerer Proteolyseanfälligkeit, da Peptidasen natürliche Substrate besser erkennen. [16,17,24] Zusätzlich können durch selektive Mutationen Informationen über die an der Faltung beteiligten Aminosäuren erhalten oder durch Makrozyklisierung die Stabilität der gefalteten Struktur durch Verringerung der thermodynamischen Freiheitsgrade erhöht werden. [19,25] Die Faltung eines Peptids oder Proteins ist ein thermodynamischer Vorgang, bei dem der Zustand mit der geringsten freien Energie eingenommen wird. Die treibende Kraft beruht hierbei auf der Zusammenlagerung hydrophober Abschnitte der Polypeptidkette, welche versuchen, sich dem polaren Wasser zu entziehen. [26] Schematisch lässt sich die Proteinfaltung in einem Faltungstrichter darstellen, wobei die vertikale Achse die freie Energie aller möglichen Peptidstrukturen darstellt und die horizontale Achse die Anzahl der konformationellen Freiheitsgrade. [27] Alle nicht nativen Strukturen weisen eine höhere freie Energie auf als die native Struktur, sodass die Faltung den Trichter hinab zum thermodynamisch günstigsten Zustand abläuft. Der Faltungsweg weist hierbei lokale Minima auf (Abbildung 1-4), wovon einige Faltungsintermediate darstellen, während andere das Protein in einer missgefalteten Konformation halten. [26] Bei diesem Konzept muss jedoch beachtet werden, dass die Verringerung der möglichen Konformationen während der Faltung automatisch zu einer energetisch ungünstigen Entropieerniedrigung führt. Die Faltung eines Proteins stellt demnach ein empfindliches Gleichgewicht zwischen der günstigen Erniedrigung der freien Energie und der ungünstigen Erniedrigung der Entropie dar und ist durch äußere Einflüsse sehr störungsanfällig. [28] 6

25 Peptidfaltung Abbildung 1-4: Darstellung des Faltungstrichters der Proteinfaltung. Der Faltungstrichter zeigt die freie Energie der verschiedenen Strukturen als Funktion der Entropie. Ein realer Faltungstrichter hat viele lokale Minima, in welche ein Protein während der Faltung zum nativen, energieärmsten Zustand fallen kann. Diese stellen entweder Zwischenstufen oder falsch gefaltete Strukturen dar. [26,27] Definierte Peptid-Hairpinstrukturen Autonom faltende -hairpins stellen das einfachste Modell zur Untersuchung lokaler Wechselwirkungen während der -Faltblatt-Faltung oder Aggregation dar. [6,15] Die Faltung eines -hairpins beruht auf den Wechselwirkungen zwischen den Aminosäure-Seitenketten, wobei vor allem elektrostatischen und hydrophoben Wechselwirkungen große Bedeutung bei der autonomen Peptidfaltung zugemessen wird. [29] Den Einfluss einer Glutaminsäure-Lysin-Salzbrücke auf die Stabilität eines Modell- -hairpins wurde von SEARLE et al. gezeigt. [30] In einem 16er Modellpeptid wurden zwei Serin-Lysin-Paare zu Glutaminsäure-Lysin-Paaren mutiert (Abbildung 1-5) und dadurch der Einfluss auf die Stabilität der Struktur untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass jede der beiden Salzbrücken in wässriger Pufferlösung zu einer größeren Signaldispersion im 1 H-NMR-Spektrum führte. Der Beitrag einer der Salzbrücken zur Stabilität wurde mit 1.2 kj/mol angegeben, während das Peptid mit zwei Salzbrücken eine Stabilisierung von 3.6 kj/mol erfährt. Die Einführung von 7

26 Einleitung elektrostatischen Wechselwirkungen durch geladene Seitenketten in einen -hairpin führt zu einer Stabilitätserhöhung der gefalteten Struktur. Abbildung 1-5: Darstellung der -hairpin-peptide A-D. X steht hierbei für die Position der Mutation. Es wurde der Einfluss von einer (Peptid B und C) bzw. zwei Salzbrücken (Peptid D) auf die Stabilität der Struktur im Gegensatz zu Modellpeptid A untersucht. [30] Neben elektrostatischen Wechselwirkungen spielen vor allem hydrophobe Wechselwirkungen eine entscheidende Rolle bei der Ausbildung stabiler Peptidstrukturen. Insbesondere Tryptophan fällt hier eine besondere Bedeutung zu, da ein gegenüberliegendes Trp-Trp-Paar einen größeren Beitrag zur Stabilisierung einer -hairpin-struktur liefert als jede andere hydrophobe Wechselwirkung. [31] Abbildung 1-6: Verschiedene Orientierungen der Indolringe in -sheet-strukturen. A: edge-to-face Anordnung eines Trp-Trp-Paares in einem -hairpin-peptid. B: -stacking eines Trp-Trp-Paares in einem parallelen -sheet. C: Diagonales Trp-Trp-Paar in einem trpzip-peptid. D: -Kation-Wechselwirkung in einem diagonalen Trp-Arg-Paar. (Abbildung entnommen aus: C. SANTIVERI et al., Tryptophan Residues: Scarce in Proteins but Strong Stabilizers of -Hairpin Peptides, Biopolymers 2010, 94, ) 8

27 Peptidfaltung Die planare und aromatische Indolseitenkette erlaubt hierbei sowohl eine -stacking (face-to-face) als auch eine edge-to-face-anordnung der Aromaten (Abbildung 1-6). Der Stabilisierungsbeitrag durch eine solche Aromat-Aromat-Wechselwirkung liegt in Proteinen zwischen 2.5 kj/mol und 5.4 kj/mol. [32] Neben den Wechselwirkungen zwischen gegenüberliegenden Aminosäuren sind auch diagonale Wechselwirkungen zwischen hydrophoben Seitenketten möglich, wenn sich beide auf der gleichen Seite des Rückgrats befinden, also die übernächste Position der gegenüberliegenden Aminosäure einnehmen (Abbildung 1-7). [33] Abbildung 1-7: Schematische Darstellung eines -hairpin-peptids. Charakteristisch ist eine alternierende Abfolge von Wasserstoffbrücken (WWB) bildenden (bonded) und nicht bildenden (non-bonded) Aminosäurepaaren, wodurch sich immer das übernächste Paar auf der gleichen Seite des Peptidrückgrats befindet. Neben den hydrophoben Wechselwirkungen zwischen gegenüberliegenden Aminosäure-Paaren (roter Kasten) können auch diagonale Interaktionen zur Strukturstabilisierung beitragen (blauer Kasten). Eines der bekanntesten Beispiele zur Anwendung hydrophober Wechselwirkungen beim Design kleiner Peptide stellen die trpzip-peptide von COCHRAN et al. dar. [34] Diese 12er Peptide beinhalten vier Tryptophane, wobei zwei Trp-Trp-Paare gebildet werden, die jeweils durch ein Threonin getrennt sind und sich auf der gleichen Seite des Peptid-Rückgrats befinden. Hierdurch entsteht zusätzlich ein diagonaler Kontakt zwischen den beiden Paaren, welche in einer -stacking Anordnung miteinander wechselwirken. [34,35] Es wurden mehrere trpzip-peptide entwickelt, die sich in den turn-aminosäuren voneinander unterscheiden (Abbildung 1-8). Diese bilden entweder einen I - (E und G) oder einen II -turn (F) aus (vgl. Kapitel 1.1), zeigen aber 9

28 Einleitung sonst eine fast identische Struktur. [34] Im Gegensatz zu vielen anderen -hairpin-peptiden sind die trpzip-peptide gut wasserlöslich und bilden keine Aggregate. Sie stellen damit die kleinste Untereinheit eines antiparallelen -Faltblatts dar und zeigen die thermodynamischen Eigenschaften von gefalteten Proteinen. [29] Darüber hinaus können sie aufgrund ihrer stabilen, monomeren Struktur zum Verständnis des Faltungsmechanismus von -hairpin-peptiden beitragen. [36] Abbildung 1-8: Sequenzen der trpzip-peptide E-F. [34] Durch die hydrophoben Wechselwirkungen von vier Tryptophanen bilden sie stabile -hairpins aus, welche trotz des hohen Anteils hydrophober Seitenketten zu monomeren Strukturen falten. Inspiriert durch die trpzip-peptide wurde von BUTTERFIELD et al. das WKWK-Peptid (H) entwickelt, das einen Rezeptor für Nukleotide darstellt. [37] Dieses Peptid enthält zwei Trp-Lys-Paare, welche durch -Kation-Wechselwirkung die -hairpin-struktur stabilisieren. Da beide Aminosäurepaare auf der gleichen Seite des Peptidrückgrats lokalisiert sind, findet außerdem eine diagonale Wechselwirkung zwischen den beiden Tryptophanen statt (Abbildung 1-9). Abbildung 1-9: Sequenz des WKWK-Peptids. [37] Die Stabilisierung der Struktur beruht auf -Kation- Wechselwirkungen zwischen Tryptophan und Lysin sowie hydrophoben Wechselwirkungen zwischen dem diagonalen Trp-Trp-Paar. 10

29 Peptidfaltung Die Fähigkeit zur Bindung von Nukleotiden wie ATP an WKWK wird durch eine Spalte zwischen den beiden Tryptophanen begründet, welche die Bindungsstelle darstellt. NMR-Titrationsversuche zeigten, dass die Zugabe von ATP zu einer Hochfeldverschiebung der Indolprotonensignale führt, was die Beteiligung beider Tryptophane an der Bindung vermuten lässt. [38] Zusätzlich konnte eine Bindung des Peptids an FMN (Flavin-Mononukleotid) gezeigt werden, wobei die Bindung hier vermutlich auf elektrostatische Wechselwirkungen mit den Lysin-Seitenketten zurückzuführen ist. [39] Das angewandte Konzept, Struktur und biologische Aktivität in einem Peptid zu vereinigen, konnte bereits von KESSLER et al. mit Integrinbindenden RGD-Pentapeptiden gezeigt werden. [40,41] In Arbeiten von LÖSCHE et al. wurde das Epitop dieser Peptidklasse erfolgreich in dem Peptidgerüst von Cystin- Knoten Mikroproteinen fixiert. [42] Eine dritte Möglichkeit zur Stabilisierung einer -hairpin-struktur ist die kovalente Verknüpfung beider Stränge. In der Natur kommen hierzu Disulfidbrücken zum Einsatz, welche auch häufig beim Design kleiner monomerer Peptide verwendet werden. Der Beitrag einer Disulfidbrücke zur Stabilisierung des -hairpins beträgt etwa 4.2 kj/mol, wobei die größte Stabilisierung an einer non-bonded Position erfolgt (vgl. Abbildung 1-7), während eine Disulfidbrücke an einer bonded Position sogar zur Destabilisierung der Struktur führen kann. [43,44] Der Grund hierfür ist die für diese Position ungünstige Geometrie des Disulfids, welche die stabilisierenden Eigenschaften fast wieder aufhebt. Da die Bildung einer -hairpin- Struktur entropiegetrieben ist, führt außerdem eine weiter vom -turn entfernte Disulfidbrücke zu einer größeren Stabilisierung der Struktur. [43] Beim Design disulfidverbrückter Peptide ist also die Position der Cysteine von elementarer Bedeutung für die Stabilität der Struktur. Eines der bekanntesten designten Peptide mit Disulfidverknüpfung ist das Oktapeptid Octreotid, welches als synthetisches Analogon des Peptidhormons Somatostation als Medikament zur Tumorbehandlung zugelassen ist. Das Konzept eines stark verkleinerten Somatostatin Analogons mit vergleichbarer Aktivität wurde bereits 1981 von VEBER et al. realisiert. [45] Basierend 11

30 Einleitung auf diesem bizyklischen Peptid (I) wurde das Octreotid (J) entwickelt (Abbildung 1-10). Im Gegensatz zum Somatostatin, welches eine Vielzahl von Konformationen in Lösung annimmt, bilden die Analoga definierte Strukturen aus, in welchen die - turn-region verantwortlich für die biologische Aktivität ist. [29,45,46] Das Octreotid (J) stellt eine der kleinsten möglichen -Faltblatt-Strukturen dar, wobei die Stabilisierung der Konformation neben der Zyklisierung vor allem vom D-Tryptophan im -turn her rührt. [12] Die Struktur von Octreotid konnte zuerst über Kristallstrukturanalyse und kurze Zeit später auch durch NMR-spektroskopische Methoden bestimmt werden. [12,47 49] Abbildung 1-10: Sequenz des ersten Somatostatin Analogons (I) von VEBER et al. [45] und des Peptid- Medikaments Octreotid (J). Zur Stabilisierung der Struktur enthalten die Peptide eine Disulfidbrücke an Position 2 und 7 sowie eine D-Aminosäure im -turn. Es wurden eine Vielzahl weitere Somatostatin Derivate untersucht, unter anderem wurde von KESSLER et al. ein über das Peptidrückgrat zyklisiertes Somatostatinanaloges Hexapeptid beschrieben und dessen Struktur NMR-spektroskopisch aufgeklärt. [50] Eine weitere Klasse designter -hairpin-peptide stellen die von COCHRAN et al. beschriebenen disulfidverbrückten Hexapeptide dar (Abbildung 1-11). Durch systematisches Mutieren einzelner Aminosäurepositionen wurde zunächst das Peptid bhpw (K) entwickelt, welches durch die hydrophoben Wechselwirkungen eines Trp-Leu-Paars stabilisiert wird. [51,52] In ihrer Arbeit konnten sie zeigen, dass Tryptophan an dieser Position zu einer deutlich stabileren Peptidstruktur führt als jede andere Aminosäure und dass die Positionen von Tryptophan 3 und Leucin 8 12

31 Peptidfaltung vertauschbar sind. Eine Weiterentwicklung stellt das Peptid bhphv (L) dar, in welchem die Positionen 2 und 9 ebenfalls systematisch optimiert wurden. [53] Es zeigte sich, dass ein His 2 -Val 9 -Paar zu einer effektiven Stabilisierung führt. Im Gegensatz zum Trp-Leu-Paar sind diese beiden Positionen nicht ohne Stabilitätsverlust miteinander tauschbar, was die Autoren auf eine Wechselwirkung zwischen der Valin-Seitenkette und dem Disulfid zurückführen. [53] Abbildung 1-11: Sequenzen der zyklischen Hexapeptide bhpw (K) und bhphv (L), welche durch systematische Mutation der einzelnen Positionen erhalten wurden und stabile -hairpin-strukturen ausbilden. [51,53] Vollständig ausgelassen wurde in diesem Kapitel das große Feld der -hairpin-peptide, welche nicht natürliche Bausteine enthalten. Hier gibt es etwa eine Reihe von Dipeptid-Mimetika, die einen -turn induzieren und damit zur Stabilisierung der Peptidstruktur beitragen, [20,22,54] oder kovalente Verknüpfungsmethoden der einzelnen Peptidstränge, beispielsweise über Click-Chemie. [55] Für einen Überblick sei hier auf die Reviews von SCHNEIDER et al. und ROSS et al. verwiesen. [56,57] NMR-Spektroskopische Strukturaufklärung von Peptiden Eine genaue Kenntnis der Struktur, Dynamik und Reaktionsweise von Molekülen ist der Schlüssel zum Verständnis ihrer Funktionen und Eigenschaften (KESSLER et al., 1988). [58] Besonders für Biomakromoleküle ist das Erlangen dieser Kenntnis gleichermaßen wichtig wie auch komplex. Die NMR-Spektroskopie als eine Methode mit atomarer Auflösung und der Möglichkeit, Moleküle in Lösung bei verschiedenen Temperaturen, ph-werten und Salzgehalt zu untersuchen, nimmt bei der Aufklärung der Struktur von Peptiden und Proteinen eine besondere Stellung ein. Neben 13

32 Einleitung der Struktur können auch Gleichgewichtsprozesse sowie Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Molekülen analysiert werden. Eine wichtige Erkenntnis zur Aufklärung von Peptid- und Proteinstrukturen ist, dass die Spektren eines gefalteten Proteins weitaus komplexer sind, als die Summe der NMR-Signale der einzelnen Aminosäuren. [59 61] Abbildung 1-12: Oben: 1 H-NMR-Spektrum von gefaltetem BPTI (bovine pancreatic trypsin inhibitor) in Wasser, unten: simuliertes Spektrum der ungefalteten random coil (rc) Form von BPTI. (Spektren entnommen aus: K. WÜTHRICH, NMR-Untersuchungen von Struktur und Funktion biologischer Makromoleküle, Angew. Chem. 2003, 115, ) Während bei der random coil Form alle Aminosäuren lösungsmittelexponiert sind, werden einige bei gefalteten Proteinen im hydrophoben Inneren eingeschlossen und zeigen daher eine andere chemische Verschiebung. Da durch die Faltung ein Teil der Aminosäurereste vom Lösungsmittel abgeschirmt wird, während andere exponiert an der Oberfläche liegen, ergeben sich für diese 14

33 Peptidfaltung Unterschiede in der chemischen Verschiebung. Aus diesem Grund ist es auch möglich, gefaltete von nicht gefalteten Strukturen zu unterscheiden, da bei unstrukturierten Proteinen im Mittel alle Protonen lösungsmittelexponiert sind (Abbildung 1-12). [61] Für die Zuordnung von Peptid-NMR-Spektren wird die Tatsache ausgenutzt, dass es sich bei jeder Aminosäure in der Peptidkette um ein eigenes Spinsystem handelt. [62] Durch die Messung eines TOCSY-Spektrums (Total Correlation Spectroscopy) können alle zu einem Spinsystem gehörenden Protonen detektiert werden. Im Gegensatz dazu werden in einem NOESY-Spektrum (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) dipolare Kopplungen durch den Raum erfasst, unabhängig von den Spinsystemen (Abbildung 1-13). NOE-Kontakte werden dabei in sequenzielle NOEs und middle oder long range NOEs eingeteilt, je nachdem ob eine dipolare Kopplung zur nächsten Aminosäure besteht oder zu solchen, die in der Peptidkette weiter entfernt liegen und aufgrund der dreidimensionalen Struktur in räumlicher Nähe sind. Abbildung 1-13: Methoden zur Zuordnung von Peptid-NMR-Spektren. COSY- und TOCSY- Spektren liefern Kreuzsignale, welche durch skalare Kopplungen entstehen. Während im COSY-Spektrum nur geminale Kopplungen sichtbar sind, zeigen im TOCSY-Spektrum alle einem Spinsystem zugehörigen Protonen Kreuzsignale. NOE-Signale liefern durch dipolare Kopplungen Informationen über die räumliche Nähe von Protonen. Ein NOE-Kontakt zur benachbarten Aminosäure wird als sequenzieller NOE bezeichnet, Kontakte zu weiter entfernten Aminosäuren als middle oder long range NOE und dienen zur Strukturaufklärung. 15

34 Einleitung Unter Zuhilfenahme eines NOESY-Spektrums kann die Sequenz eines Peptids ermittelt werden. Die Spinsysteme zweier benachbarter Aminosäuren können durch den sequenziellen Hi NHi+1 Kontakt verknüpft werden. Durch den intraresidualen NHi+1 Hi+1 Kontakt erhält man eine Verbindung zum nächsten sequenziellen Hi+1 NHi+2 NOE-Kontakt und kann so das gesamte Peptidrückgrat entlangwandern (sequencial walk, siehe Abbildung 1-14). [61] Die einzige Ausnahme bildet die Aminosäure Prolin, welche im Peptid ein tertiäres Amid bildet und daher kein Amidproton besitzt. Die vollständige Zuordnung ist Grundlage für eine NMRbasierte Analyse der dreidimensionalen Struktur. Abbildung 1-14: Darstellung des sequencial walk. Die Sequenz eines Peptids kann durch die sequenziellen Hi NHi+1 Kontakte (blau) im NOESY-Spektrum ermittelt werden. Durch die intrarresidualen NHi+1 Hi+1 Kontakte (rot), welche auch im COSY- und TOCSY-Spektrum sichtbar sind, besteht eine Verknüpfung zum nächsten sequenziellen NOE-Kontakt. 16 Neben der vollständigen Zuordnung aller Signale ist konformative Homogenität essentiell für die Analyse der dreidimensionalen Struktur. Da ein konformatives Gleichgewicht zu einer Mittelung der Signale führt (vgl. Abbildung 1-12), können nur bei einer einheitlichen Konformation aus den NMR-spektroskopischen Daten Rückschlüsse auf die Struktur des Peptids gezogen werden. Diese Homogenität kann vor allem durch große Differenzen der chemischen Verschiebung gleicher Aminosäurereste sowie stark unterschiedlichen Kopplungskonstanten diastereotoper Protonenpaare ermittelt werden. [63,64] Ist diese Voraussetzung erfüllt, können zum einen durch 3 J-Kopplungskonstanten und selektive NOE-Kontakte zwischen H, NH und den diastereotopen s die am häufigsten populierten Rotamere der Aminosäure-Seitenketten ermittelt werden, (Beschreibung der Methode in Kapitel 3.3.5) um durch die Orientierung mögliche Wechselwirkung zwischen den Seitenketten zu detektieren. [65 68] Zum anderen kann durch die Temperaturabhängigkeit der chemischen Verschiebung von Amidprotonen ermittelt werden, welche eine

35 Peptidfaltung Wasserstoffbrückenbindung ausbilden (vgl. Kapitel 3.3.3). Dies ist möglich, da die Spaltung einer zum Solvent ausgebildeten Wasserstoffbrücke im Gegensatz zu einer intramolekularen entropisch begünstigt ist. [63] Der vor allem für längere Polypeptidketten aussagekräftigste Parameter sind long range NOE-Kontakte, welche die einzelnen Abschnitte der Kette miteinander in Verbindung bringen (Abbildung 1-15). Abbildung 1-15: Darstellung eines Peptid-NOESY-Spektrums. Durch die NOE-Kreuzsignale zwischen verschiedenen Aminosäuren können Strukturinformationen abgeleitet werden, da diese die jeweiligen Protonen in räumliche Nähe bringt. Durch die Kombination vieler NOE-Kontakte entsteht eine dreidimensionale Struktur des Peptids. 17

36 Einleitung Über NOEs können nur Abstände bis etwa 5 Å detektiert werden. Dadurch entsteht durch die Summe vieler dieser NOE-Abstandsinformationen ein dreidimensionales Bild des Peptids. [61] Vor allem die NOE-Kreuzsignale liefern bei einem Gleichgewicht mehrerer Konformationen gemittelte Werte, welche schnell zu einer falschen Interpretation oder nicht auflösbaren Informationen führen. Aus diesem Grund sollte vor der Interpretation der NOE-Abstandsinformationen die Homogenität der Konformation eindeutig gezeigt werden. Zusätzlich können durch Spindiffusion und chemischen oder konformationellen Austausch die Intensitäten der Kreuzsignale verfälscht sein, sodass kein NOE-Kontakt allein, sondern nur die Summe aller Signale verlässliche Strukturinformationen liefert. [61,69] Oxidative Faltung von Cystein enthaltenden Peptiden Bei der natürlichen Faltung von Proteinen und Peptiden ist die Bildung von Disulfiden ein Schlüsselschritt, da Disulfidbrücken die native Form der meisten extrazellulären Proteine stabilisieren. [70] Aus diesem Grund ist deren Ausbildung direkt an die Faltung gekoppelt. Die oxidative Faltung von Protein oder Peptiden ist ein komplexes Zusammenspiel von nichtkovalenten Wechselwirkungen sowie der Bildung kovalenter Verknüpfungen, bei der das reduzierte, ungefaltete Protein seine nativen Disulfidbrücken und seine native Struktur erhält. [71 73] Der Verlauf der oxidativen Faltung hängt primär von der Reaktivität und Zugänglichkeit der Thiolgruppen und Disulfide ab, da eine Thiol-Disulfid-Austauschreaktion nur stattfinden kann, wenn sich ein Thiolat und ein Disulfid in räumlicher Nähe befinden. [72,74] Die Thiol-Disulfid-Austauschreaktion ist wie in Abbildung 1-16 gezeigt einstufig und bei neutralem ph-wert reversibel. Da das Thiolat das Nukleophil dieser SN2-Reaktion darstellt, läuft sie basenkatalysiert ab und kann durch Zugabe von Säure abgebrochen werden. [75] 18

37 Peptidfaltung Abbildung 1-16: Reaktion zur Bildung von Disulfiden bei der oxidativen Faltung. Durch den nukleophilen Angriff eines Thiolats an das Oxidationsmittel (z.b. Cystin, Glutathion oder ein anderes Peptiddisulfid) wird ein gemischtes Disulfid und ein freies Thiol des Oxidationsmittels gebildet. Das gemischte Disulfid wird vom zweiten Thiolat der Peptidkette ebenfalls nukleophil angegriffen um ein intramolekulares Disulfid zu bilden. Beim reshuffling bilden sich intramolekular neue Disulfidbrücken aus, indem ein Cystein-Thiolat der Peptidkette ein bereits bestehendes intramolekulares Disulfid angreift. Durch die Analyse von Faltungsintermediaten unterschiedlicher Polypeptide wurde eine Vielzahl von Mechanismen für die oxidative Faltung beschrieben. Drei verschiedene Faltungs-Modelle für die in vitro Faltung von Peptiden wurden hieraus abgeleitet. [74] Das framework-modell verläuft über eine limitierte Anzahl selektiv gebildeter Disulfid-Intermediate mit nativer Substruktur, welche den konformationellen Raum einschränken und die Konformation des Peptids zur nativen Struktur hin dirigieren. Im Gegensatz dazu entstehen beim collapse-modell durch unspezifische Disulfidbrücken-Bildung eine Vielzahl unterschiedlicher Faltungsspezies. In einem langsameren Folgeschritt findet ein reshuffling der Disulfidbrücken statt, sodass sich aus den vielen heterogenen Intermediaten die native Struktur bilden kann. Beide Modelle sind in Abbildung 1-17 schematisch gezeigt. Das dritte Modell ist das sogenannte mixed-modell, welches eine Kombination der beiden vorher beschriebenen Modelle darstellt. 19

38 Einleitung Abbildung 1-17: Darstellung der zwei verschiedenen Modelle des Konformationsraums der oxidativen Faltung von Peptiden in vitro. [74] Beim framework-modell verläuft die Faltung über eine limitierte Anzahl nativ-ähnlicher Intermediate mit selektiv gebildeten Disulfidbrücken, während beim collapse-modell durch unspezifische Disulfidbildung eine Vielzahl von Intermediaten entsteht, welche anschließend durch Disulfid reshuffling die native Struktur ausbilden. Das Problem der oxidativen Faltung besteht jedoch nicht nur bei Proteinen und Polypeptiden sondern auch bei kleinen, synthetischen Peptiden. Erschwerend kommt hinzu, dass nicht einmal die Faltung von natürlichen Peptiden in vivo und in vitro vergleichbar sind. Schlüsselschritt bei all diesen Oxidationsreaktionen ist die Bildung des Thiolat-Anions. Die Acidität des Cystein-Thiols und damit auch die Thiol-Disulfid-Austauschreaktion werden stark beeinflusst von den benachbarten Aminosäuren. Positiv geladene Aminosäurereste wie Lysin oder Arginin führen durch Absenken des Thiol-pKs-Werts zu einer Erhöhung der Thiol-Reaktivität, während negativ geladene Seitenketten wie Glutamin- oder Asparaginsäure durch Destabilisierung des Thiolats den gegenteiligen Effekt bewirken. [76] Elektrostatische Wechselwirkungen spielen eine wichtige Rolle beim Thiol-Disulfid-Gleichgewicht. Dies konnte beispielsweise für das drei Disulfide enthaltende Polypeptid BPTI gezeigt werden, bei dem lokale elektrostatische Effekte in einem während der Faltung früh gebildeten Intermediat zur Erhöhung der Thiol-Reaktivität führen. In dieser 20

39 Peptidfaltung Arbeit wurde ebenfalls gezeigt, dass BPTI nach dem framework-modell oxidativ zur nativen Struktur faltet. [77] Abgesehen von den geladenen Aminosäureseitenketten spielt die Primärstruktur von disulfidreichen Peptiden für die Bildung der Disulfidbrücken eine eher untergeordnete Rolle. Viel entscheidender ist hier die Anordnung der einzelnen Cysteine innerhalb der Aminosäuresequenz, das sogenannte Cystein- Muster. Selbst Peptide mit völlig unterschiedlicher Primärstruktur können bei gleichem Cystein-Muster das gleiche dreidimensionale Disulfidbrücken-Gerüst ausbilden. Für die Geschwindigkeit der Disulfidbildung ist vor allem die Größe des sich durch die Oxidation bildenden Rings entscheidend. Kleinere Ringe führen zu schnelleren Reaktionsraten, wobei auch eine gerade oder ungerade Anzahl von Aminosäuren im Ring einen Einfluss auf die Reaktionsgeschwindigkeit haben kann. [78] Während die Bildung des ersten intramolekularen Disulfids in einem Peptid hauptsächlich von der Position der Cysteine und der Ringgröße abhängt, wird die Bildung der folgenden Disulfide vor allem durch die vorgegebene Struktur des ersten Disulfids beeinflusst. [79] Die optimalen Reaktionsbedingungen für eine oxidative Faltung von disulfidreichen Peptiden in vitro können nur empirisch ermittelt werden und sind für jede Peptidsequenz unterschiedlich. [80] Prinzipiell wird die Reaktion in wässrigen Pufferlösungen durchgeführt und wird u.a. durch Temperatur, ph-wert, Pufferzusammensetzung oder Zugabe von organischen Lösungsmitteln beeinflusst. [70,81] Geometrie von Disulfidbrücken Zur Beschreibung verschiedener Faltungsmotive und Strukturen von Peptiden ist eine Analyse der Seitenkettenkonformation unerlässlich. Besonders von Bedeutung ist hierbei die Konformation der Disulfidbrücken, da diese durch die kovalente Verknüpfung verschiedener Abschnitte des Peptidrückgrats maßgeblich zur 21

40 Einleitung dreidimensionalen Struktur des Peptids beitragen. Eine erste Klassifizierung verschiedener Disulfidkonformationen wurde 1989 von RICHARDSON vorgeschlagen, nach welcher die verschiedenen Konformationen über die Vorzeichen der Diederwinkel 2, 3 und 2 (Abbildung 1-18) definiert werden. [82] Abbildung 1-18: Definition der Diederwinkel innerhalb einer Disulfidbrücke, welche in einem Protein oder Peptid von zwei Cysteinen gebildet wird. In dieser Klassifizierung werden Disulfide, welche für alle drei Diederwinkel das gleiche Vorzeichen zeigen als spiralförmig (spiral) beschrieben, solche, bei der das Vorzeichen des Diederwinkels abwechselnd positiv und negativ ist als klammerförmig (staple) und solche mit unregelmäßigem Wechsel des Vorzeichens als hakenförmig (hook). Alle möglichen Kombinationen der Diederwinkel für 2, 3 und 2 sowie die dazugehörige Einteilung in die Disulfidklassen sind in Tabelle 1-1 zusammengefasst. Tabelle 1-1: Klassifizierung der Disulfidkonformation nach den Vorzeichen der Diederwinkel innerhalb der Disulfidbrücke. Diese Art der Einteilung wurde zuerst von RICHARDSON beschrieben. [82] Faltungs-Motiv Spirale (spiral) Klammer (staple) Haken (hook)

41 Peptidfaltung Zusätzlich erfolgt eine Einteilung in rechts- und linksgängige Disulfid-Strukturen, je nachdem ob der 3-Winkel positiv (rechtsgängig, RH) oder negativ (linksgängig, LH) ist. [82] Die Angabe der Konformation wird um diese Information ergänzt, also beispielsweise RHstaple. In einer erweiterten Kategorisierung von HOGG et al. wurden 1 und 1 ebenfalls mit einbezogen und je nach Vorzeichen mit +, oder +/ bezeichnet und der Klassifizierung vorangestellt, beispielsweise +/ LHspiral. [83,84] Eine Analyse von 6874 verschiedenen Disulfidkonformationen aus der Proteindatenbank ergab, dass fast 25% der Disulfide in LHspiral-Konformation vorliegen. [83] Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Disulfide mit bestimmter Funktion häufig die selbe Konformation einnehmen. So zeigen strukturelle Disulfide meist eine spiralförmige Konformation, katalytische Disulfide eine +/ RHhook-Konformation und allosterische eine RHstaple-Konformation. [83,85] Allosterische Disulfide sind solche, die die Funktion eines Proteins durch konformationelle Änderung, hervorgerufen durch Oxidation oder Reduktion, kontrollieren können. [86] So kann umgekehrt aus der Form eines Disulfids auch dessen Funktion abgeleitet werden Faltungsmotive natürlich vorkommender Cystein-reicher Peptide Die Klassifizierung von Cystein-reichen Peptiden erfolgt durch die Einteilung in unterschiedliche Disulfidbrücken-Peptidgerüste, abhängig von Anzahl, Abstand und Verknüpfung der Cysteine und den daraus resultierenden dreidimensionalen Strukturen. [85] Eine grobe Einteilung kann aufgrund der enthaltenen Disulfide erfolgen. Eine Auswahl an Peptiden geordnet nach der Anzahl ihrer Disulfide ist in Abbildung 1-19 gezeigt. Die Vielfalt der möglichen Strukturen aufgrund unterschiedlicher Disulfidverknüpfungen wird hier nur teilweise deutlich. 23

42 Einleitung Abbildung 1-19: Darstellung einer Auswahl verschiedener Disulfidverknüpfungen in natürlich vorkommenden Cystein-reichen Peptiden. Die Anzahl der Cystine oder die Art der Verknüpfung lässt aufgrund der vielfältigen Möglichkeiten nicht auf die Struktur des Peptids schließen. [85] Peptide mit Ein-Disulfid-Motiven weisen nur eine limitierte strukturelle Komplexität auf und bilden in der Regel turn- oder faltblattartige Strukturen aus. [85] Eine große Klasse bilden die Vasopressin-artigen Peptide, welche als Peptidhormone eine Reihe von biologischen Funktionen erfüllen. [87] Diese 9er Peptide weisen eine Disulfidverknüpfung zwischen Position 1 und 6 auf, wobei die dazwischenliegenden Aminosäuren einen -turn ausbilden. [88] Bekanntester Vertreter dieser Klasse ist Oxytocin, welches als Hormon und Neurotransmitter eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Mutter-Kind-Bindung spielt. [89] Ein weiteres natürlich vorkommendes Peptid mit Ein-Disulfid-Motiv ist der sunflower trypsin inhibitor (SFTI-1), welcher ein 14er hairpin-peptid mit zyklischem Rückgrat darstellt. [90] Interessanterweise führt bei diesem Peptid die Entfernung der Disulfidbrücke, welche die beiden hairpin-stränge miteinander verbindet, nicht zum Verlust der Konformation. Die Faltung zum hairpin wird hier nicht durch das Disulfid induziert, sondern nur die bestehende Konforma- 24

43 Peptidfaltung tion stabilisiert. [91] Im Gegensatz dazu steht das 21er Peptid Arenicin-1, welches ebenfalls einen disulfidverbrückten hairpin ausbildet und bei dem die Entfernung des Disulfids zum vollständigen Verlust der Struktur führt. [92] Die Unterschiede von Peptiden mit Zwei-Disulfid-Motiv werden vor allem bei den Conotoxinen deutlich, die eine Gruppe aus Meeresschnecken isolierter neurotoxischer Peptide sind. Die Peptidklasse der Conotoxine umfasst zur Zeit etwa 1700 identifizierte Sequenzen, welche aufgrund ihres Disulfid-Musters in verschiedene Unterfamilien eingeteilt werden. [93] Diese 10-30er Peptide enthalten bis zu zehn Cysteine und nehmen die verschiedensten dreidimensionalen Strukturen ein. Zwei bekannte Familien sind die - und die -Conotoxine, welche je zwei Disulfide enthalten (Abbildung 1-20). Die -Conotoxine bilden eine Cys I -Cys III und Cys II -Cys IV Verknüpfung aus, was zu einer cystinstabilisierten -Helix führt, während die -Conotoxine Cys I -Cys IV und Cys II -Cys III verknüpft sind und eine hairpin-struktur einnehmen. [67,94] Abbildung 1-20: Darstellung der dreidimensionalen Struktur verschiedener Conotoxine. Helicale und Faltblatt-Abschnitte sind als Cartoon, Disulfide im Kugel-Stab-Format dargestellt. MrIA: -Conotoxin, PDB-Code 3ew4; MVIIA: -Conotoxin, PDB-Code 1mvj; PnIA: -Conotoxin, PDB-Code 1pen; RXIA: - Conotoxin, PDB-Code 1p41. (Abbildung entnommen aus: N. DALY, D. CRAIK, Structural Studies of Conotoxines, IUBMB Life 2009, 61, ) 25