I nterleukin-10 und I nterleukin-12 produzierende Monozyten - Subpopulationen bei Normalpersonen und Probanden mit atopischer Diathese

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1 Aus der Medizinischen Universitätsklinik und Poliklinik Abteilung Pneumologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. I nterleukin-10 und I nterleukin-12 produzierende Monozyten - Subpopulationen bei Normalpersonen und Probanden mit atopischer Diathese I N A U G U R A L - D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. vorgelegt 2000 von Martin Germann geboren in Illertissen

2 Dekan: Prof. Dr. rer. nat. M. Schumacher Erster Gutachter: Prof. Dr. med. J. C. Virchow jun. Zweiter Gutachter: PD Dr. rer. nat. J. Thompson Jahr der Promotion: 2002

3 Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG Monozyten Subpopulationen der Monozyten Atopie Das TH1-TH2-Modell Interferon-γ Interleukin Interleukin Transforming-Growth-Factor-β Typ-1 und Typ-2 Subpopulationen bei anderen Zellarten Fragestellung MATERIAL UND METHODEN Material Geräte Verbrauchsmaterialien Reagenzien Medien und Lösungen Zytokine Antikörper Probanden Methoden Isolierung mononukleärer Zellen mittels Dichtegradientenzentrifugation Kimura-Färbung Zellkultur Durchflußzytometrie Statistische Auswertung ERGEBNISSE Versuche zur Optimierung der Kulturbedingungen Einfluß von Brefeldin A auf die Viabilität der Monozyten Einfluß der Kulturbedingungen auf die Viabilität der Monozyten Einfluß von Brefeldin A auf die Zytokinmessung im Durchflußzytometer Optimale Kulturbedingungen IL-10 und IL-12 (p40/p70) produzierende Subpopulationen der Monozyten Getrennte Populationen produzieren IL-10 und IL Regulation der Produktion von IL-12 durch IFN-γ, TGF-β 1 und IL Regulation der Produktion von IL-10 durch IFN-γ, TGF-β 1 und IL Expression von Oberflächenmolekülen auf IL-10 und IL-12 produzierenden Monozyten Koexpression von IL-6, IL-10 und IL

4 3.3 Vergleich der Monozytensubpopulationen von Atopikern und Normalpersonen IL-10 und IL-12 produzierende Subpopulationen nach Stimulation mit LPS IL-10 und IL-12 produzierende Subpopulationen nach Stimulation mit IFN-γ und LPS IL-10 und IL-12 produzierende Subpopulationen nach Stimulation mit TGF-β 1 oder TGF-β 1 und LPS Korrelation des Serum IgE Spiegels mit der IL-10 und IL-12 (p40/p70) Produktion Zusammenfassung der Ergebnisse als Tabelle DISKUSSION Produktion von IL-10 und IL-12 durch unterschiedliche Monozytenpopulationen Molekulare Mechanismen der LPS induzierten IL-10 und IL-12 Produktion Regulation der Bildung von IL-10 und IL Regulation der Bildung von IL-10 und IL-12 durch IFN-γ Regulation der Bildung von IL-10 und IL-12 durch IL Regulation der Bildung von IL-10 und IL-12 durch TGF-β Die Rolle von camp in der Regulation der Zytokinproduktion von Monozyten Expression von Oberflächenmolekülen auf den IL-10 und IL-12 produzierenden Monozyten Die Bedeutung von IL-10 und IL-12 bei atopischen Erkrankungen Unterschiede in der Expression von IL-10 und IL-12 zwischen Atopikern und Normalpersonen nach LPS Stimulation Expression von IL-10 und IL-12 nach Inkubation mit Zytokinen Ausblick ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS ABBILDUNGSVERZEICHNIS LEBENSLAUF DANKSAGUNG...76

5 Abkürzungsverzeichnis camp CD Cy5 FCS FITC FSC GM-CSF IFN-γ Ig IL LPS MHC n n.s. p PBMC PBS PE Zyklisches Adenosinmonophosphat Cluster of Differentiation Phycoerythrin-Cyanin-5 Fetal Calf Serum (Serum von Kälberföten) Fluoresceinisothiocyanat Forward Scatter (Vorwärtsstreuung) Granulocyte-Macrophage-Colony-Stimulating-Factor Interferon-γ Immunglobulin Interleukin Lipopolysacharid Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) Anzahl der Experimente nicht signifikant Irrtumswahrscheinlichkeit Peripheral Blood Mononuclear Cells (mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut) Phosphate Buffered Saline (Kochsalzlösung mit Phophatpuffer) Phycoerythrin PGE 2 Prostaglandin E 2 RSMF relative spezifische mittlere Fluoreszenz SEM Standard Excess of the Mean (Standardfehler des Mittelwerts) SSC Side Scatter (Seitwärtsstreuung) TGF-β 1 Transforming-Growth-Factor-β 1 TH-Zelle T-Helfer-Zelle TNF-α Tumor-Nekrose-Faktor-α Selten verwendete Abkürzungen werden im Text erläutert.

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7 1 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Monozyten Monozyten sind weiße Blutzellen von µm Durchmesser mit einem großen, unsegmentierten und meist gelappten Kern. Sie entstehen über mehrere Zwischenstufen aus myeloischen Vorläuferzellen im Knochenmark. 78 Im Blut zirkulieren die Monozyten durchschnittlich 3 Tage, 201 bevor sie in verschiedene Organe wandern und dort zu Makrophagen und anderen spezialisierten Phagozyten differenzieren. Es gibt eindeutige Hinweise dafür, daß sich zumindest ein Teil der dendritischen Zellen von Monozyten ableitet. 28,29,210,215 Anhand spezifischer Oberflächenrezeptoren kann man Monozyten von anderen Blutzellen abgrenzen und verschiedene Reifungsstadien unterscheiden. Gemeinsam ist allen Monozyten der LPS-Rezeptor CD14, nur eine Subpopulation reiferer Zellen besitzt dagegen das CD16 Molekül. 135,216 Monozyten und Makrophagen können Zellen, Bakterien und Pilze phagozytieren und die aufgenommenen Fremdantigene anderen Abwehrzellen präsentieren. Oberflächenrezeptoren für Immunglobuline und Komplementfaktoren erleichtern dabei die Erkennung potentiell schädlicher Substanzen. Außerdem bilden sie zytotoxische Enzyme sowie Zytokine, die andere Immunzellen beeinflussen und so eine spezifische Immunreaktion auslösen, aufrechterhalten und beenden können Subpopulationen der Monozyten Die vielfältigen Funktionen der Monozyten, die sich teilweise gegenseitig ausschließen, bedingen die Heterogenität der Monozytenpopulation. Nach Dichte, Sedimentationsgeschwindigkeit oder Adhärenz fraktionierte Monozyten unterscheiden sich zum Teil erheblich in der Expression von Oberflächenrezeptoren, 127,164,197 ihrer Phagozytosefähigkeit 85,197 und dem Vermögen, die Immunglobulinproduktion von B-Zellen zu verstärken. 85 Von besonderem Interesse ist in diesem Zusammenhang die Produktion immunregulatorischer Zytokine. Signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Populationen zeigen sich bei der Produktion von IL-1, 181 TNF-α 197 und PGE 2. 59

8 Einleitung 2 Khansari et al. trennten Monozyten nach ihrer Dichte in mehrere Fraktionen und konnten zeigen, daß eine dieser Fraktionen hauptsächlich das proinflammatorisch und pyrogen wirkende Zytokin IL-1 bildet, während eine andere nur wenig IL-1, aber viel PGE 2 produziert, welches auf Immunzellen hemmend wirkt. 84 Wang et al. untersuchten die Zytokinproduktion von Monozyten nach deren Trennung in zwei Populationen mit großen und kleinen Zellen. Sie beschrieben, daß die größeren Zellen im Vergleich zu den kleineren sowohl mehr IL-1 als auch mehr PGE 2 bilden. 197 Mit CD16 konnte die Arbeitsgruppe um Ziegler-Heitbrock erstmals einen Oberflächenrezeptor auf Monozyten identifizieren, der nur von einem Teil der Zellen exprimiert wird 217 und eine funktionell und phänotypisch abweichende Subpopulation charakterisiert. 135 In Hinblick auf ihre Zytokinproduktion unterscheiden sich die CD16 exprimierenden Monozyten von der Hauptpopulation nicht in der Produktion von IL-1, IL-6 oder TNF-α, die IL-10 Bildung ist allerdings stark vermindert. 53 Wenn auch die bisherigen Untersuchungen zum Teil widersprüchliche Ergebnisse erbracht haben, so lassen sich dennoch nicht alle beschriebenen Unterschiede auf zellschädigende Isolationsvorgänge oder die unterschiedliche Reife der Zellen zurückführen, sondern deuten die Existenz von funktionell verschiedenen monozytären Subpopulationen an. 44, Atopie Unter Atopie versteht man eine erhöhte Reaktionsbereitschaft des Immunsystems gegenüber apathogenen Substanzen der natürlichen Umwelt, wie beispielsweise Pollen, Milbenkot, Tierhaaren oder bestimmten Nahrungsmitteln. Diese Überempfindlichkeit kann sich als Ekzem, Rhinitis, Konjunktivitis oder allergisches Asthma bronchiale manifestieren. In Ländern mit hohem Lebensstandard leidet bis zu einem Viertel der Bevölkerung an allergischen Erkrankungen, in wenig entwickelten Regionen haben sie dagegen praktisch keine Bedeutung. Die IgE-vermittelte allergische Reaktion, die auch als Soforttyp-Reaktion bezeichnet wird, ist nach der Einteilung von Gell und Coombs eine Überempfindlichkeitsreaktion des Typs 1. Nach dem ersten Allergenkontakt kommt es zur Aktivierung allergenspezifischer T-Helfer Lymphozyten und zur Bildung von spezifischen IgE-Antikörpern, die an Rezeptoren auf der Oberfläche von Mastzellen und Basophilen binden. Diese Sensibilisierung ist Voraussetzung einer allergischen Reaktion.

9 3 Einleitung Bei erneuter Zufuhr des Allergens werden die IgE-Moleküle auf der Zellmembran vernetzt. Dadurch wird die Entleerung von Granula mit bereits präformierten Entzündungsmediatoren ausgelöst und die Neusynthese weiterer Faktoren induziert. In der Frühphase der allergischen Reaktion bewirken diese Entzündungsmediatoren eine Veränderung von Permeabilität und Tonus der Blutgefäße und eine Bronchokonstriktion. Lokale Symptome sind Urtika, Ekzem, Schleimhautschwellung oder Asthmaanfall; eine schwere systemische Manifestation stellt der anaphylaktische Schock dar. Durch chemotaktisch wirkende Zytokine angelockt, infiltrieren bald zusätzliche Immunzellen das Gebiet der allergischen Entzündung, vor allem Lymphozyten, neutrophile und eosinophile Granulozyten. Sie verursachen in der Spätphase der allergischen Entzündung weitere Gewebeschäden. Da bei atopischen Krankheiten zuviel IgE produziert wird, ist der Serum IgE Spiegel ein guter Laborparameter zum Nachweis einer atopischen Diathese. 204 So korreliert beispielsweise die Prävalenz von allergischem Asthma bronchiale mit der Höhe des IgE Spiegels. 17 Eine IgE Konzentration im Serum von mehr als 100 U/ml gilt als erhöht Das TH1-TH2-Modell Die T-Helfer Lymphozyten, deren gemeinsames Merkmal die Expression des CD4 Oberflächenmoleküls ist, können sich im Verlauf ihrer Reifung zu zwei verschiedenen Phänotypen entwickeln, die sich durch die Bildung charakteristischer Zytokine unterscheiden. Beide Subtypen der T-Helfer-Zellen hemmen durch Freisetzung bestimmter Zytokine die Entwicklung von undifferenzierten TH0-Zellen zum jeweils anderen Phänotyp. Diese Dichotomie wurde erstmals 1986 von Mosmann et al. bei Mäusezellen beobachtet 119 und konnte in Folge auch für den Menschen beschrieben werden. 39 TH1-Zellen produzieren Zytokine wie IL-2 und IFN-γ, die die Abwehr gegen infektiöse Krankheitserreger regeln. Sie aktivieren Makrophagen und zytotoxische T-Zellen und erhöhen die IgG Bildung. Zu dieser Gruppe von Zytokinen mit ähnlichen Wirkungen gehört auch IL-12. TH2-typische Zytokine sind IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13. Diese Botenstoffe dienen der Abwehr von Parasiten, indem sie die Bildung von IgE fördern und Eosinophile, Mastzellen und Basophile aktivieren.

10 Einleitung 4 Neben Zytokinen können auch bestimmte Membranmoleküle antigenpräsentierender Zellen die Entwicklung der T-Lymphozyten beeinflussen. Monozyten und dendritische Zellen exprimieren das kostimulatorische Molekül CD86, das die Bildung von TH2-Zellen fördert, während CD80 die Bildung von TH1-Zellen initiieren kann. 92,149 Andererseits können aber auch TH1- und TH2-Zellen die Produktion pro- und antiinflammatorischer Zytokine durch direkten Zellkontakt mit Monozyten auslösen. 24 Die Entstehung allergischer Erkrankungen führt man auf eine verstärkte TH2-Immunantwort zurück. Durch die erhöhte Ausschüttung von Typ-2 Zytokinen wird einerseits die Ausdifferenzierung von naiven T-Lymphozyten zu TH2-Zellen gefördert und so die schädliche Immunreaktion weiter unterhalten, andererseits auch die Aktivierung und Proliferation von TH1-Zellen unterdrückt. Im folgenden werden die Zytokine IFN-γ, IL-12, IL-10 und TGF-β 1 genauer besprochen, da sie Gegenstand dieser Arbeit sind Interferon-γ IFN-γ wird von T-Lymphozyten und natürlichen Killerzellen gebildet und hat neben seinen antiviralen Wirkungen eine besondere Bedeutung bei der Regulation von Immunantworten. Dabei fördert IFN-γ zellvermittelte Immunantworten und hemmt als typisches TH1 Zytokin die Typ-2 Immunantwort. Auf Monozyten beziehungsweise Makrophagen steigert IFN-γ die Expression der Fcε-Rezeptoren, 123 antigenpräsentierender MHC Moleküle 83 und der kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 66 und fördert so die Phagozytose von Zellen und die Aktivierung von T-Lymphozyten. Daneben führt IFN-γ zur Bildung zahlreicher proinflammatorischer und zytotoxischer Mediatoren. Bei B-Zellen supprimiert IFN-γ die IgG 1 und IgE Synthese, erhöht aber die IgG 2 Synthese. 49 Die Wirkungen von IFN-γ werden über den Jak/STAT Mechanismus 175 und Erhöhung des camp Spiegels 37,162 vermittelt. Die unterschiedlichen Wirkungen auf TH1- und TH2-Zellen könnten mit einem Defekt der β-kette des IFN-γ Rezeptors auf TH1 Lymphozyten zusammenhängen. 140,140 Patienten mit allergischem Asthma weisen eine verminderte Ausschüttung von IFN-γ auf, die mit dem Schweregrad der Krankheit korreliert. 90,95,212

11 5 Einleitung Interleukin wurde erstmals eine neue Substanz beschrieben, die natürliche Killerzellen stimuliert. 88 Dieses später Interleukin-12 genannte Zytokin ist ein Heterodimer, das aus zwei über Disulfidbrücken verknüpften Untereinheiten mit 40 kd (p40, β-kette) und 35 kd (p35, α-kette) Molekulargewicht besteht. Diese Untereinheiten werden von zwei verschiedenen 65,143 und unabhängig voneinander regulierten 67 Genen kodiert. Dabei wird das p35 Molekül von vielen Zellen konstitutiv exprimiert, aber nicht sezerniert. 32 Die p40 Untereinheit wird hingegen im Überschuß und fast immer zusammen mit dem bioaktiven Heterodimer sezerniert. 32,54 Sie zeigt wie die isolierte p35 Untereinheit keine biologische Aktivität. Im menschlichen Organismus wird IL-12 hauptsächlich von Monozyten, Makrophagen, dendritischen Zellen und B-Lymphozyten gebildet. 32,182 Die Produktion von IL-12 in Monozyten und Makrophagen wird entweder durch Antigene verschiedener Mikroorganismen 32 oder durch Interaktion mit T-Lymphozyten über CD40 / CD40-Ligand 166 induziert. IL und PGE hemmen die Bildung von IL-12, die Zytokine TGF-β 1, IL-4 und IL-13 können je nach Zeitpunkt ihrer Zugabe hemmenden oder fördernden Einfluß auf die IL-12 Produktion nehmen. 31 Verglichen mit IL-10 ist die Hemmwirkung von IL-4 und IL-6 aber geringer und abhängig davon, wie die IL-12 Produktion ausgelöst wurde. 173 Die wohl wichtigste Wirkung von IL-12 ist die Regulation des Gleichgewichts zwischen TH1 und TH2-Zellen. Dabei fördert es einerseits die Entwicklung von TH0- und ruhenden T-Gedächtniszellen zu TH1-Zellen, 73 andererseits dient es als Kostimulus für die IFN-γ Freisetzung durch TH1 und natürliche Killerzellen. 22,88 Da IFN-γ selbst die Bildung von IL-12 erhöht, entsteht so durch positive Rückkopplung ein Mechanismus gegenseitiger Verstärkung. 67,91 Daneben verstärkt IL-12 die Bildung von IgG 117 und hemmt die Bildung von IgE durch B-Lymphozyten. 86 Mäuse, die kein IL-12 bilden können, zeigen eine verminderte IFN-γ Produktion und Typ-1 Immunantwort. 105 Ob gleichzeitig auch vermehrt TH2 Zytokine produziert werden 70,105 oder nicht, hängt von den experimentellen Bedingungen und dem verwendeten Mäusestamm ab. 55,150 Bei Patienten mit Krankheiten des atopischen Formenkreises wie allergischem Asthma 185 oder atopischer Dermatitis 89 wurde eine verringerte Produktion von IL-12 und IFN-γ im peripheren Blut beobachtet.

12 Einleitung Interleukin-10 Ursprünglich wurde IL-10 als ein Produkt von TH2-Lymphozyten entdeckt, das die Zytokinsekretion von TH1-Zellen hemmt. 50 Das 35 kd schwere Molekül besteht aus zwei identischen Untereinheiten, die auch einzeln ihre volle biologische Wirksamkeit entfalten. 50,116 Neben TH2-Zellen produzieren auch TH1 Lymphozyten, 38 Monozyten, 35 Makrophagen, Keratinozyten 45 und mit dem Epstein-Barr- Virus infizierte B-Lymphozyten 9,16 IL-10. Dabei erfolgt die IL-10-Ausschüttung im Vergleich zu anderen Zytokinen verzögert, das Maximum wird erst nach h erreicht. 35 Monozyten bilden IL-10 nach Stimulation mit LPS, 35 PGE 8 2 und TNF-α. 198 Dabei bewirkt die intrazelluläre Signalübertragung über camp eine Steigerung der Transkription des IL-10 Gens. 8,142 In der Einzelzellmessung zeigt sich, daß von allen Monozyten nur ein kleiner Teil IL-10 bildet. 25,58 Die Zytokine IFN-γ, 25 IL-4, IL und auch IL-10 selbst 35 unterdrücken die IL-10 Produktion. Bei Lymphozyten führt IL-10 zur Hemmung der TH1 Immunantwort und begünstigt TH2 Reaktionen, indem es die Proliferation, Aktivierung und Zytokinsynthese von TH1 und natürlichen Killerzellen unterdrückt. 118 Allerdings kann IL-10 auch die Zytokinproduktion von TH2-Lymphozyten hemmen. 38 Da sowohl proinflammatorische Zytokine des TH1 und wie auch des TH2 Typs die IL-10 Freisetzung erhöhen, 33,76 stellt die Ausschüttung von IL-10 ein Mittel dar, das eine anhaltende und überschießende Entzündung verhindern kann. Auch für IL-12 wurde auf einen solchen Mechanismus negativer Rückkoppelung geschlossen, da IL-12 die IL-10 Produktion von T-Lymphozyten steigert. 113 Wie andere TH2 Zytokine fördert auch IL-10 die Proliferation und Aktivierung von B-Zellen. 155 In Monozyten und Makrophagen hemmt IL-10 die Produktion von Zytokinen, die normalerweise bei Kontakt mit Bakterien freigesetzt werden, unter anderem IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-α und GM-CSF. 35,51 Daß es sich hierbei nicht um eine unspezifische Wirkung handelt, beweist die gleichzeitig vermehrte Bildung des antiinflammatorisch wirkenden IL-1-Rezeptor-Antagonisten. 2 Daneben vermindert IL-10 die Freisetzung von zytotoxischen NO-Radikalen 57 und die Antigenpräsentation über MHC-Komplexe der Klasse II. 35 Die Expression der kostimulatorischen B7- Moleküle, die der T-Zell Aktivierung dienen, wird ebenfalls durch IL-10 gehemmt. 40 In einem Mausmodell einer asthmaähnlichen Immunreaktion bilden IL-10 Knockout-Mäuse mehr IFN-γ und IL-12, aber weniger IL-5 als die Wildtyp-Mäuse und entwickeln eine geringere Entzündung in den Atemwegen. 211 In einem anderen Modellversuch wurde dagegen eine erhöhte Produktion von IL-4, IL-5 und IFN-γ und eine erhöhte Sterblichkeit bei den IL-10 Knockout-Mäusen beobachtet. 64

13 7 Einleitung Die Bedeutung von IL-10 bei atopischen Erkrankungen des Menschen ist bislang nicht ausreichend geklärt. Verschiedene Arbeitsgruppen beobachteten bei atopischer Dermatitis eine normale 168 oder gesteigerte 130 IL-10 Produktion, und bei Asthma bronchiale wurden erhöhte, 154 unveränderte 185 und erniedrigte 15 IL-10 Werte beschrieben Transforming-Growth-Factor-β 1 Man kann drei Isoformen von TGF-β unterscheiden, die sich in ihrer Regulation und ihrem zellulären Ursprung unterscheiden, aber alle an denselben Rezeptor binden. 4 Wie alle anderen aus dem Knochenmark stammenden Zellen produzieren auch Monozyten TGF-β, wobei sie nach Stimulation mit LPS vor allem die Isoform 1 ausschütten. 63 Neben seiner Rolle als Wachstumsfaktor wirkt TGF-β 1 auch als regulatorisches Zytokin auf das Immunsystem. In diesem Zusammenhang interessiert besonders die Beeinflussung des TH1-TH2- Gleichgewichts. Dabei hemmt TGF-β 1 sowohl die durch IL-12 induzierte IFN-γ Bildung wie auch die durch diese Zytokine hervorgerufene TH1 Entwicklung. 161 Auf ruhende Monozyten wirkt TGF-β 1 chemotaktisch, 194 erhöht ihre Phagozytoseaktivität, 199 induziert die Bildung von IL-1, 194 TNF-α 203 und verschiedener Wachstumsfaktoren 109 und steigert die Expression bestimmter Adhäsionsmoleküle. 6 Im Gegensatz zu diesen aktivierenden Einflüssen steht die antiinflammatorische Wirkung von TGF-β 1 auf bereits durch LPS aktiverte Monozyten und reife Makrophagen. Mit ihrer veränderten Reaktion ist eine verringerte Expression der TGF-β 1 Rezeptoren verbunden. 110 TGF-β 1 vermindert jetzt die Freisetzung von NO Radikalen 13 und erhöht die Bildung des IL-1-Rezeptor-Antagonisten Typ-1 und Typ-2 Subpopulationen bei anderen Zellarten Wie die T-Helfer Lymphozyten können sich auch die zytotoxischen T-Zellen (TC-Zellen) unter dem Einfluß bestimmter Zytokine in zwei verschiedene Untergruppen entwickeln, die in einer analogen Terminologie TC1 und TC2 genannt werden. 156 TC1 Zellen sezernieren vorwiegend IL-2 und IFN-γ, TC2 Zellen dagegen IL-4, IL-5 und GM-CSF. 158 IL-12 und IFN-γ fördern wie bei den T-Helfer Zellen die Bildung von Typ-1 Zellen, während IL-4 die Bildung von Typ-2 Zellen induziert. 125 Dendritische Zellen (DC) können ebenso wie Monozyten die Entwicklung von T-Lymphozyten zu TH1 und TH2-Zellen beeinflussen. Dabei fördern die aus Monozyten entstandenen DC1 Zellen durch Sekretion von IFN-γ und IL-12 die Entwicklung von TH1-Zellen, während die von lymphoiden Vorläuferzellen abstammenden DC2 Zellen IL-4, IL-5 und IL-10 sezernieren und so die TH2 Entwicklung initiieren. 79,106,153,167

14 Einleitung 8 Auch für natürliche Killerzellen (NK-Zellen) wurde eine Einteilung in NK1 und NK2 Subtypen vorgeschlagen. NK1-Zellen, die vor allem IFN-γ und IL-10 produzieren, werden durch IL-12 induziert, während IL-4 die Entwicklung IL-5 und IL-13 bildender NK2-Zellen fördert. 139 Bei Alveolarmakrophagen wurden ebenfalls Untergruppen charakterisiert, denen verschiedene immunologische Funktionen zugeordnet werden konnten. Anhand der Expression von Oberflächenantigenen lassen sich antigenpräsentierende, phagozytierende und immunsuppressive Populationen unterscheiden. 169 Letzteren soll in der Pathogenese allergischer Lungenerkrankungen wie dem Asthma bronchiale eine besondere Rolle zukommen. 145,146 Die Arbeitsgruppe um Modolell beobachtete, daß Makrophagen abhängig vom umgebenden Zytokinmilieu zwei konkurrierende Wege im Metabolismus von Arginin einschlagen können: TH1 Zytokine induzieren die Expression der NO- Synthase und erhöhen so die Bildung des zytotoxisch und antimikrobiell wirkenden Stickstoffmonoxids, während TH2 Zytokine mittels Induktion der Arginase die Metabolisierung von Arginin zu Ornithin und Harnstoff fördern. 115, Fragestellung Da die Expression des Typ-1 Zytokins IL-12 und des Typ-2 Zytokins IL-10 bei Monozyten bisher nicht auf Einzelzellniveau untersucht wurde, ergaben sich für diese Arbeit folgende Fragestellungen: 1. Welches sind die optimalen Versuchsbedingungen, um in Monozyten die Produktion von IL-10 und IL-12 zu induzieren und diese Zytokine simultan im Durchflußzytometer zu messen? 2. Bilden einzelne Monozyten gleichzeitig IL-10 und IL-12, oder werden diese Zytokine von getrennten Subpopulationen gebildet? 3. Bestehen Zusammenhänge zwischen der Expression bestimmter Oberflächenmoleküle und der IL-10 und IL-12 Produktion der Monozyten? 4. Unterscheiden sich Atopiker und Normalpersonen im Anteil IL-10 und IL-12 produzierender Monozyten?

15 9 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Material Geräte Analysenwaage Handy H 51-D Computer Power Macintosh G3 Dispenser Durchflußzytometer FACScan Heizplatte mit Magnetrührer Inverses Mikroskop CK-2 Mikrobiologische Sicherheitswerkbank Mikroskop Axiolab Monovetten (EDTA-Röhrchen) Neubauer-Zählkammer, verbessert ph-meter ph 535 MultiCal Pipetten Pipetta 2 (10; 50; 200 und 1000 µl) Pipette Proline Electronic 100 µl Präzisionswaage Scaltec SBC52 Software CellQuest Software SigmaStat Version 2.03 Vacuum module atom 304 Whirler REAX 2000 Begasungsbrutschrank Zentrifuge Centrifuge 5415 C Zentrifuge LaboFuge 400R Zentrifuge Rotixa/RP Sartorius, Göttingen, D Apple, Cork, IRL Eppendorf, Hamburg, D Becton Dickinson, San Jose, CA, USA Franke & Kunkel IKA-Labortechnik, Staufen, D Olympus, Hamburg, D Heraeus, Stuttgart, D Carl Zeiss, Oberkochem, D Sarstedt, Nümbrecht, D Brand, Wertheim/Main, D WTW, Weilheim, D Ratiolab, Dreieich, D Biohit, Helsinki, Finnland Scaltec, Heiligenstadt, D Becton Dickinson, San Jose, CA, USA SPSS, Erkrath, D Biotron, E Heidolph, Kelheim, D Heraeus, Stuttgart, D Eppendorf, Hamburg, D Heraeus, Stuttgart, D Hettich, Tuttlingen, D Verbrauchsmaterialien Dispenser-Tips (0,5; 5 und 12,5 ml) FACS-Röhrchen (0,6 ml) Kulturplatten Costar 48 Well Culture Cluster Eppendorf, Hamburg, D Greiner Labortechnik, Frickenhausen, D Corning Inc., Corning, NY, USA

16 Material und Methoden Millex HV Sterilfilter Pipettenspitzen Reagenzröhrchen (15 und 50 ml) Reagenzröhrchen Falcon 2052 Reaktionsgefäße (1,5 und 2 ml) 10 Millipore, Bedford, MA, USA Ratiolab, Dreieich, D Greiner Labortechnik, Frickenhausen, D Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ, USA Eppendorf, Hamburg, D Reagenzien Brefeldin A Bovines Serumalbumin Ethanol 99,9 % Fetal Calf Serum (FCS) Ficoll Separating Solution Light Green SF Yellowish Lipopolysaccharid (LPS) von E. coli Natriumazid Paraformaldehyd PBS Dulbecco s Penicillin/Streptomycin Seromed Poly(2-Hydroxyethylmethacrylat) Propidiumjodid RPMI 1640 Medium mit L-Glutamin Saponin Toluidinblau Sigma, Deisenhofen, D USB, Cleveland, USA Baker, Deventer, NL Sigma, Deisenhofen, D Biochrom, Berlin, D Sigma, Deisenhofen, D Sigma, Deisenhofen, D Merck, Darmstadt, D Merck, Darmstadt, D Gibco Life Technologies, Paisley, GB Biochrom, Berlin, D Sigma, Steinheim, D Sigma, Deisenhofen, D Gibco Life Technologies, Paisley, GB Sigma, Deisenhofen, D Merck, Darmstadt, D Medien und Lösungen Kulturmedium Zur Herstellung des Zellkulturmediums wurde RPMI 1640 Medium (mit 2 mm Glutamin) mit 20 % FCS, 100 µg/ml Streptomycin und 100 U/ml Penicillin versetzt.

17 11 Material und Methoden Kimura-Färbelösung Die Kimura-Lösung enthielt als Farbstoffe Toluidinblau und Light Green. Sie bestand aus 62 % Toluidinblau-Lösung (500 µg/ml Toluidinblau, 0,9 % NaCl und 20 % Ethanol gelöst in Aqua bidest), 5 % Light Green-Lösung, 3 % in PBS gesättigter Saponinlösung und 30 % Phosphatpuffer ph 6,4. Nach Mischen wurde die Lösung durch einen 0,45 µm Filter filtriert Zytokine rh Interferon-γ PBH, Hannover, D rh Interleukin-10 ICC, Ismaning, D rh TGF-β 1 Bioconcept, Umkirch, D Die Zytokine wurden mit RPMI Medium aliquotiert und bei -70 C gelagert. Da die Wirksamkeit von TGF-β 1 durch Adhäsion an den Gefäßwänden vermindert werden kann, wurden für seine Verdünnung Reaktionsgefäße verwendet, die über Nacht mit 10 % bovinem Serumalbumin geblockt worden waren Antikörper Bei allen Antikörpern handelt es sich um monoklonale Antikörper vom Isotyp IgG 1. Sie wurden mit einer Lösung aus PBS, 2 % FCS und 0,1 % Natriumazid verdünnt. Spezifität Fluorochrom Klon Hersteller keine (Negativkontrolle) FITC DAK-GO1 Dako, Glostrup, DK keine (Negativkontrolle) PE DAK-GO1 Dako, Glostrup, DK keine (Negativkontrolle) Cy Mc7 Immunotech, Marseille, F Anti-CD11b PE 2LPM19c Dako, Glostrup, DK Anti-CD14 FITC TÜK4 Dako, Glostrup, DK Anti-CD14 Cy5 Immunotech, Marseille, F Anti-CD16 Cy5 3G8 Pharmingen, San Diego, CA, USA Anti-CD23 PE B-G6 Diaclone, Besançon, F Anti-CD80 PE BB1 Becton Dickinson, San Jose, CA, USA Anti-CD86 PE 2331 (FUN-1) Pharmingen, San Diego, CA, USA Anti-IL-6 PE MQ2-13A5 Pharmingen, San Diego, CA, USA Anti-IL-10 PE JES3-9D7 Pharmingen, San Diego, CA, USA Anti-IL-12 (p40/p70) FITC C11.5 Pharmingen, San Diego, CA, USA Tabelle 1: Verwendete fluoreszenzmarkierte Antikörper

18 Material und Methoden Probanden Die Probanden wurden anhand ihres Gesamt-Serum-IgE-Spiegels in zwei Gruppen eingeteilt: Personen mit Werten von mehr als 100 ku/l wurden der Gruppe der Atopiker, solche mit weniger als 100 ku/l der Kontrollgruppe zugeordnet. Abgesehen von Symptomen der in Tabelle 2 genannten atopischen Erkrankungen waren die Probanden gesund. Keiner der Probanden hat zum Versuchszeitpunkt und im vorangegangenen Monat systemische Kortikosteroide oder andere immunmodulatorische Medikamente eingenommen. Die Bestimmung des Gesamt-IgE erfolgte im Allergielabor der Abteilung Pneumologie der medizinischen Uniklinik Freiburg. Kontrollgruppe Atopiker Anzahl der Probanden (weiblich : männlich) 13 (9 : 4) 14 (8 : 6) Alter ± SEM 30 ± 4 J. 36 ± 4 J. Gesamt-IgE ± SEM 39 ± 10 ku/l 738 ± 333 ku/l Probanden mit anamnestischen Hinweisen auf atopische Diathese (weiblich : männlich) Tabelle 2: Eigenschaften der Probanden 1 (0 : 1) 12 (7 : 5) 2.2 Methoden Isolierung mononukleärer Zellen mittels Dichtegradientenzentrifugation Peripher venöses Blut aus einer 9 ml EDTA- Monovette wurde mit etwa der gleichen Menge PBS verdünnt und über Ficoll (Dichte 1,077 g/ml) geschichtet. Nach Zentrifugation bei 1000 x g und 4 C für 20 Minuten wurden aus der Interphase die mononukleären Zellen entnommen. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen (600 x g, 10 min, 4 C) und das Zellsediment mit 1 ml Kulturmedium resuspendiert. Plasma Ficoll mononukleäre Zellen sedimentierte Zellen Abbildung 1: Zellseparation nach Dichtegradientenzentrifugation.

19 13 Material und Methoden Kimura-Färbung Die Zellfärbung diente zur Bestimmung der Zelldichte in der Suspension, um daraus die Gesamtzahl der isolierten Zellen zu errechnen. Zur Färbung der Zellen wurden 10 µl Zellsuspension mit 90 µl Kimuralösung vermischt und mindestens eine Minute stehengelassen. Anschließend wurde die Zellzahl mit einer Zählkammer im Lichtmikroskop bestimmt, wobei 4 Großquadrate mit je 0,01 µl Volumen ausgezählt wurden. Die durchschnittliche Anzahl der Zellen je Großquadrat mit 10 5 multipliziert ergab die Anzahl der Zellen in einem Milliliter Zellkultur Beschichtung der Kulturplatten Um zu verhindern, daß sich Zellen auf der Plastikoberfläche der Kulturplatten anheften, wurden diese mit Poly(2-Hydroxyethylmethacrylat) (Poly-HEMA) beschichtet. 52 Adhäsion ist unerwünscht, da die anheftenden Zellen nur schwer aus dem Kulturgefäß gelöst und daher nicht vollständig im Durchflußzytometer gemessen werden können. Daneben verändert die Adhäsion auf Plastikoberflächen auch die Stimulierbarkeit der adhärenten Zellen und deren Zytokinproduktion, wie Berton et al. 10 und Standiford et al. 170 an Makrophagen zeigten. 1,2 g Poly-HEMA und 50 ml 99,9% Ethanol wurden in ein Reagenzröhrchen gegeben und auf einem Magnetrührer bei 40 C im Wasserbad aufgelöst. Von dieser Lösung wurden 80 µl pro Well auf eine 48 Well Kulturplatte gegeben. Während des Trocknens in keimarmer Umgebung bei 37 C wurden durch Schwenken der Platte auch deren Wände mit der Poly-HEMA Lösung benetzt Zellkultur und -stimulation In die Kulturschalen wurden jeweils 2 x 10 6 Zellen in 1 ml Kulturmedium gegeben. Die Zellen wurden soweit nicht anders angegeben 14 h in einem Brutschrank bei 37 C und einer halbfeuchten Atmosphäre mit 5 % CO 2 kultiviert. Als stimulierendes Antigen wurde LPS von Escherichia coli in einer Konzentration von 100 ng/ml verwendet, die bei Monozyten eine maximale IL-10 Produktion induziert. 100

20 Material und Methoden 14 In einigen Versuchen erfolgte zusätzlich eine Vorstimulation mit IFN-γ, IL-10 (je 10 ng/ml) oder TGF-β 1 (1 ng/ml). Nach 2 h wurde den vorstimulierten Ansätzen ebenfalls LPS (100 ng/ml) hinzugefügt. Um die Zytokine im Zellinneren anzureichern, wurde nach der Vorstimulation Brefeldin A in einer Konzentration von 10 µg/ml zugesetzt. Brefeldin A ist ein Stoffwechselprodukt des Pilzes Penicillium brefeldianum und blockiert den Transport sekretorischer Proteine vom Endoplasmatischen Retikulum durch den Golgi-Apparat. 114 Nach Ende des Kulturzeitraums wurde die entnommene Zellsuspension auf Eis weiterverarbeitet Durchflußzytometrie Durchflußzytometrie ermöglicht die gleichzeitige Analyse von Größe, Granularität und Fluoreszenz in Suspension befindlicher Zellen. Dabei werden die Zellen zur näheren Charakterisierung meist mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gekennzeichnet. Photodetektor Fluoreszenz 1 (FITC) Kurzpaßfilter Detektor Seitwärtsstreuung (SSC) Langpaßfilter Detektor Vorwärtsstreuung (FSC) Bandpaßfilter Linse Photodetektor Fluoreszenz 2 (PE) Photodetektor Fluoreszenz 3 (Cy5) Meßkammer Laser Abbildung 2: Schematischer Aufbau eines Durchflußzytometers

21 15 Material und Methoden Als Durchflußzytometer wurde ein FACScan mit einem Argon-Laser der Wellenlänge 488 nm verwendet. Als Fluorochrome kamen Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE) und Phycoerythrin-Cyanin-5 (Cy5) mit Emissionsmaxima von 503, 585 und 670 nm zum Einsatz. Bei der Messung wurden die Zellen im Einzelzellstrom durch eine Meßkammer geleitet, wo sie das monochromatische Licht eines Lasers bestrahlte. Mit Photodetektoren wurde neben drei verschiedenen Fluoreszenzen auch die Vorwärts- und Seitwärtsstreuung erfaßt, die Aussagen über Größe und Granularität der Zellen erlauben. Die erhobenen Daten wurden auf Einzelzellniveau gespeichert, um so bestimmte Meßparameter verschiedenen zellulären Subpopulationen zuordnen zu können. Überlappungen der Emissionsspektren der Fluorochrome wurden mit Hilfe der Meßsoftware ausgeglichen. Dazu wurde die Verstärkung der Photodetektoren und die Kompensation zwischen den einzelnen Kanälen vor jeder Messung überprüft und gegebenenfalls neu eingestellt Auswertung der Fluoreszenzdaten Die Fluoreszenz einer Zelle im Durchflußzytometer entspricht der Summe aus ihrer Eigenfluoreszenz und der Fluoreszenz der an ihr gebundenen Antikörper-Fluorochrom-Konjugate. Dabei setzt sich letztere aus spezifisch an das nachzuweisende Molekül und unspezifisch gebundenen Antikörpern zusammen. Um die Summe aus Eigen- und unspezifischer Fluoreszenz zu messen, wurde jede Probe in einem zusätzlichen Ansatz mit Antikörpern ohne Affinität zu menschlichen Zellen markiert (IgG 1 - Negativkontrolle). Somit ergibt sich für die Berechnung der spezifischen Fluoreszenzintensität folgende Formel: spezifische Fluoreszenz = Fluoreszenz der markierten Probe Fluoreszenz der IgG 1 -Negativkontrolle Da die Intensität der spezifischen Fluoreszenz in willkürlichen Einheiten gemessen wurde, die von der Verstärkung in den Photodetektoren und der Kompensation abhängig waren, wurde zum Vergleich der Messungen untereinander die relative spezifische Fluoreszenz errechnet. Sie ist ein Maß für die Intensität der spezifischen Fluoreszenz im Verhältnis zur Fluoreszenz der IgG 1 -Negativkontrolle und errechnet sich wie folgt: relative spezifische Fluoreszenz = spezifische Fluoreszenz Fluoreszenz der IgG1-Negativkontrolle

22 Material und Methoden Viabilitätsmessung Bei einigen Versuchen wurde der Anteil avitaler Zellen durch Anfärbung mit Propidiumiodid bestimmt. Propidiumiodid reichert sich in apoptotischen und toten Zellen an und interkaliert mit deren DNA. Da Propidiumiodid nach Anregung Licht einer Wellenlänge von 610 nm emittiert, kann im Durchflußzytometer der Anteil toter Zellen bestimmt werden. Aus dem Zellkulturansatz wurde nach zweimaligem Waschen mit PBS / 2% FCS (500 x g, 5 min, 4 C) ein Aliquot mit ca Zellen entnommen, 100 µl Propidiumiodidlösung (500 ng in 1 ml PBS) zugefügt und kurz darauf mit der Messung begonnen Nachweis von Oberflächenrezeptoren und intrazellulären Zytokinen Der intrazelluläre Nachweis von Zytokinen erfolgte in Anlehnung an die von de Caestecker et al. 34 beschriebene Methodik und beruht auf der Anfärbung intrazellulär angereicherter Zytokine mit monoklonalen fluoreszenzmarkierten Antikörpern in fixierten und permeabilisierten Zellen. Außerdem wurden auch bestimmte Oberflächenmoleküle mit monoklonalen Antikörpern angefärbt. Die Suspension aus PBMC wurde aus der Kulturschale entnommen und der Überstand abzentrifugiert (500 x g, 5 min). Danach wurden die Zellen mit 1 ml PBS gewaschen und zur Fixation mit 200 µl 4 % Paraformaldehyd 10 min auf Eis inkubiert. Nach zwei weiteren Waschschritten mit 1 ml PBS wurde der Zellniederschlag in 100 µl PBS resuspendiert und davon je µl in ein FACS-Röhrchen gegeben. Die Zellen wurden mit je 10 µl Antikörperlösung und 20 µl 0,1 % Saponinlösung vermischt und bei Raumtemperatur 15 min im Dunkeln inkubiert. Saponin bewirkt eine Permeabilisierung der Zellmembran und ermöglicht so den fluoreszenzmarkierten Antikörpern in die Zellen einzudringen. Nach zweimaligem Waschen mit 0,1 % Saponinlösung wurden die Zellen in 100 µl PBS aufgenommen und im Durchflußzytometer gemessen.

23 17 Material und Methoden Identifizierung der Monozyten Da die durchflußzytometrisch gemessene Zellsuspension aus mononukleären Zellen bestand und somit Lymphozyten, Monozyten und auch einige wenige natürliche Killerzellen enthielt, durften bei der Auswertung der Meßergebnisse nur Monozyten berücksichtigt werden. Die Monozyten konnten nach der Messung klar von den Lymphozyten abgegrenzt werden, da sie größer waren (entsprechend einem höheren FSC-Wert) und eine höhere Granularität (SSC) aufwiesen (Abbildung 3A). Um die korrekte Lage der Monozytenregion im FSC/SSC-Schaubild (Monozytengate) zu bestätigen, wurde bei allen Versuchen ein Ansatz mit Antikörpern gegen CD14 gefärbt. CD14 wird nur von Monozyten exprimiert (Abbildung 3B), nicht aber von Lymphozyten (Abbildung 3C). Einige wenige Zellen im Monozytengate wahrscheinlich dendritische Zellen besaßen weder das CD14 noch das CD16 Molekül (Abbildung 3B). Da diese Zellen unter den beschriebenen Kulturbedingungen keine meßbaren Mengen an Zytokinen bildeten, beeinflußten sie die Versuchsergebnisse nicht wesentlich. A B Monozyten CD14 + / CD16 + C Lymphozyten Monozyten Lymphozyten CD14 ++ Abbildung 3: Monozyten und Lymphozyten im Durchflußzytometer. Unterscheidung zwischen Monozyten und Lymphozyten im FSC / SSC Schaubild (A), Expression von CD14 und CD16 auf Zellen im Monozytengate (B) und Lymphozytengate (C) Statistische Auswertung Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± Standardfehler der Mittelwerte (SEM) dargestellt. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe des T-Tests für verbundene oder unverbundene Stichproben bei normalverteiltem Merkmal, des U-Tests von Mann, Whitney und Wilcoxon für unverbundene Stichproben oder des Wilcoxon Tests für Paardifferenzen. Das Signifikanzniveau betrug 0,05.

24 Ergebnisse 18 3 Ergebnisse 3.1 Versuche zur Optimierung der Kulturbedingungen Einfluß von Brefeldin A auf die Viabilität der Monozyten Um im Zellinneren der Monozyten eine im Durchflußzytometer meßbare Menge an Zytokinen anzureichern, wurde während der Stimulation der Proteintransportinhibitor Brefeldin A in einer Konzentration von 10 µg/ml zugesetzt. Verglichen mit Stimulation ohne Brefeldin A erhöhte sich dadurch der Anteil toter Zellen signifikant (n = 8; p < 0,01), und zwar durchschnittlich um den Faktor 2,3 nach 18 h Inkubation. In einem weiteren Versuch wurde untersucht, ob die Dauer der Inkubation mit Brefeldin A einen Einfluß auf die Viabilität der kultivierten Monozyten hatte. Dazu wurde bei einer konstanten Inkubationsdauer von 18 h der Zeitpunkt der Zugabe von Brefeldin A variiert. Bei zum Teil erheblichen Unterschieden zwischen den einzelnen Versuchen ergaben sich jedoch keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf den Anteil avitaler Monozyten (Abbildung 4). Bei 14, 10, 8 und 6 h Inkubationsdauer fiel der Anteil toter Zellen mit sinkender Einwirkdauer von Brefeldin A. Auffällig war jedoch, daß bei Zugabe von Brefeldin A 4 und 2 h vor Ende des Kulturzeitraums wieder höhere Werte gemessen wurden. 10 Anteil avitaler Monozyten [%] Dauer der Inkubation mit Brefeldin [h] Abbildung 4: Anteil avitaler Monozyten bei verschieden langer Inkubationsdauer mit Brefeldin A. 10 µg/ml Brefeldin A wurden 4, 8, 10, 12, 14 und 16 h nach Beginn einer 18-stündigen Stimulation von PBMC mit Medium, LPS, IFN-γ & LPS oder IL-10 & LPS zugesetzt (n=4).

25 19 Ergebnisse Einfluß der Kulturbedingungen auf die Viabilität der Monozyten Abbildung 5 zeigt den Anteil avitaler Monozyten nach 14-stündiger Zellkultur in Anwesenheit von Brefeldin A. Bei Inkubation in Kulturmedium betrug der Anteil avitaler Monozyten 2,95 ± 0,47 % (n = 15). Im Vergleich dazu erhöhte der Zusatz von LPS (100 ng/ml) allein oder in Kombination mit IFN-γ (10 ng/ml) oder TGF-β 1 (1 ng/ml) den Anteil avitaler Zellen signifikant. Die zweistündige Vorstimulation mit IL-10 (10 ng/ml) konnte das Überleben der Monozyten im Vergleich zur alleinigen Stimulation mit LPS signifikant erhöhen, der viabilitätsfördernde Einfluß von TGF-β 1 erreichte hingegen keine Signifikanz. Die Vorstimulation mit IFN-γ veränderte die Viabilität der Monozyten nicht. Ohne Zusatz von LPS bewirkte die Inkubation mit TGF-β 1 keine Veränderung der Viabilität gegenüber dem Kontrollexperiment. Bei Stimulation mit Staphylokokken-Kapsid-Antigen (Sigma, Steinheim, D) und Brefeldin A waren nach h Kultur 32 ± 7 % der Monozyten avital (n = 6). Da dieser Wert deutlich höher als in den übrigen Ansätzen war, wurde in allen folgenden Versuchen auf die Verwendung von Staphylokokken- Kapsid-Antigen verzichtet. p < 0,01 8 p < 0,01 p < 0,01 Anteil avitaler Monozyten [%] ** ** n.s. * n.s. 0 Kontrolle LPS IFN-γ & LPS IL-10 & LPS TGF-β & LPS TGF-β Abbildung 5: Anteil avitaler Monozyten bei verschiedenen Kulturbedingungen. 2*10 6 PBMC wurden für 14 h mit LPS, IFN-γ & LPS, IL-10 & LPS, TGF-β 1 & LPS oder TGF-β 1 inkubiert. 10 µg/ml Brefeldin A wurde allen Ansätzen zugesetzt. *: p < 0,05; **: p < 0,01; n.s.: nicht signifikant; jeweils im Vergleich zur Kontrolle.

26 Ergebnisse Einfluß von Brefeldin A auf die Zytokinmessung im Durchflußzytometer Um im Zellinneren eine für die durchflußzytometrische Messung ausreichende Menge der Zytokine anzureichern, wurde während der Stimulation der Monozyten Brefeldin A zugesetzt. Dieser Stoff blockiert den Proteintransport vom Endoplasmatischen Retikulum zum Golgiapparat und verhindert so die Proteinsekretion, nicht aber die Proteinproduktion. 114 Um den optimalen Zeitpunkt für die Zugabe von Brefeldin A zur Zellkultur zu bestimmen, wurde es zu unterschiedlichen Zeitpunkten einer 18-stündigen Stimulation mononukleärer Zellen zugesetzt. Die höchsten Werte wurden bei Zugabe von Brefeldin A 10 h vor Ende des Kulturzeitraums erreicht. Wurde die Ausschüttung der Zytokine erst später blockiert, war der Anteil zytokinproduzierender Monozyten um so geringer, je kürzer die Einwirkungszeit von Brefeldin A war (Abbildung 6). A Anteil IL-10 produzierender Monozyten [%] B Anteil IL-12 produzierender Monozyten [%] Dauer der Zugabe von Brefeldin [h] Dauer der Zugabe von Brefeldin [h] Abbildung 6: Messung von IL-10 und IL-12 (p40/p70) bei verschieden langer Inkubation mit Brefeldin A. Zu PBMC wurden 4, 8, 10, 12, 14 oder 16 h nach Beginn der Inkubation mit LPS (A) oder IFN-γ & LPS (B) jeweils 10 µg/ml Brefeldin A gegeben und nach Ende des Kulturzeitraums von jeweils 18 h der Anteil IL-10 (A) und IL-12 (p40/p70) (B) anreichernder Monozyten bestimmt Optimale Kulturbedingungen Um sowohl eine möglichst vollständige intrazelluläre Anreicherung der produzierten Zytokine als auch eine hohe Viabilität der Monozyten zu erreichen, wurde in allen weiteren Versuchen die Inkubationszeit auf 14 h verkürzt. Da die Viabilität der Monozyten durch eine frühe Zugabe von Brefeldin A nur unwesentlich verringert wurde (Abschnitt 3.1.1), wurde Brefeldin A allen Ansätzen zwei Stunden nach Kulturbeginn oder nach Ende der zweistündigen Vorstimulation zugesetzt, so daß die gesamte Einwirkdauer des Proteintransportinhibitors 12 h betrug.

27 3.2 IL-10 und IL-12 (p40/p70) produzierende Subpopulationen der Monozyten 21 Ergebnisse Getrennte Populationen produzieren IL-10 und IL-12 Nach Stimulation mit LPS veränderte sich die Zytokinproduktion der meisten Monozyten nicht. Diese Hauptpopulation umfaßte 80,4 ± 1,2 % aller Monozyten und steigerte ihre Zytokinproduktion im Vergleich zur Inkubation in Medium nicht statistisch signifikant: Die RSMF erhöhte sich für IL-10 lediglich von 0,49 ± 0,09 auf 0,51 ± 0,06 und für IL-12 (p40/p70) von 0,26 ± 0,06 auf 0,30 ± 0, % 0.2 % 0.0 % 0.0 % 0.0 % 0.0 % 0.3 % 0.2 % 1.1 % 6.4 % 0.8 % 6.3 % 0.7 % 11.3 % 0.6 % 5.4 % 7.7 % 3.9 % Abbildung 7: Produktion von IL-12 (p40/p70) und IL-10 durch getrennte Monozytenpopulationen. PBMC wurden für 14 h mit LPS inkubiert, fixiert und anschließend mit unspezifischen Antikörpern (obere Reihe) oder mit Antikörpern gegen IL-12 (p40/p70) und IL-10 (untere Reihe) gefärbt. Dargestellt sind repräsentative Ergebnisse aus drei unabhängigen Experimenten.

28 Ergebnisse 22 Daneben gab es Monozyten, die größere Mengen der Zytokine IL-10 oder IL-12 (p40/p70) bildeten. Die Population der IL-10 bildenden Monozyten umfaßte 10,6 ± 1,3 %, die der IL-12 (p40/p70) bildenden Zellen 7,5 ± 1,2 % aller Monozyten. In beiden Populationen war demzufolge die RSMF für das jeweilige Zytokin höher als in der Hauptpopulation (n = 24, p < 0,0001). Bei der gleichzeitigen Färbung der Monozyten mit Antikörpern gegen IL-10 und IL-12 (p40/p70) fiel auf, daß es nur wenige Zellen gab, die doppelt markiert wurden (Abbildung 7). Ihr Anteil betrug durchschnittlich 1,5 ± 0,2 %. Das bedeutet, daß die IL-10 produzierenden Monozyten fast kein IL-12 (p40/p70) bilden und die überwiegende Mehrzahl der IL-12 (p40/p70) produzierenden Zellen kein IL-10 exprimiert. Somit handelt es sich um zwei verschiedene, abgrenzbare Subpopulationen der Monozyten Größe und Granularität der IL-10 und IL-12 produzierenden Zellen Da zu beobachten war, daß Monozyten nach Stimulation an Größe und Granularität zugenommen hatten, stellte sich die Frage, ob sich die IL-10 und IL-12 produzierenden Zellen untereinander und von der Gesamtpopulation der Monozyten in diesen Parametern unterschieden. Dazu wurden, wie in Abbildung 8 gezeigt, bei mehreren Probanden nach Stimulation mit LPS Größe und Granularität aller Monozyten sowie der IL-10 und der IL-12 (p40/p70) produzierenden Subpopulation dargestellt. Es ergaben sich keine auffälligen Unterschiede in der Verteilung der Zellen. Außerdem konnte auf diesem Wege nochmals bestätigt werden, daß annähernd alle als zytokinproduzierend gewerteten Meßereignisse in der Monozytenregion lagen. Alle Zellen IL-12 bildende Zellen A B C IL-10 bildende Zellen Monozytenregion Monozytenregion Monozytenregion Abbildung 8: IL-10 und IL-12 produzierende Zellen unterscheiden sich nicht in Größe oder Granularität. PBMC eines repräsentativen Probanden wurden für 14 h mit LPS inkubiert, fixiert und anschließend mit Antikörpern gegen IL-12 (p40/p70) und IL-10 gefärbt.. Dargestellt sind Grafiken für Größe (FSC) und Granularität (SSC) aller mononukleären Zellen (A) (nur 10 % der Zellen sind dargestellt), der IL-12 (B) und der IL-10 (C) bildenden Zellen. Die Ellipse markiert die Monozytenregion, wobei nur Zellen in dieser Region in die Auswertung einbezogen wurden.

29 23 Ergebnisse Um zu untersuchen, ob die Produktion von IL-10 und IL-12 (p40/p70) durch getrennte Subpopulationen nur nach Stimulation mit LPS auftritt, wurden die Zellen mit den Zytokinen IFN-γ oder TGF-β 1 allein oder mit IFN-γ, IL-10 oder TGF-β 1 in Kombination mit LPS stimuliert. In keinem dieser Fälle konnte eine Koexpression von IL-10 und IL-12 (p40/p70) beobachtet werden. Die Regulation der IL-10 und IL-12 (p40/p70) Bildung durch die genannten Zytokine wird im folgenden dargestellt Regulation der Produktion von IL-12 durch IFN-γ, TGF-β 1 und IL Einfluß der Vorstimulation mit Interferon-γ auf die IL-12 Produktion Da IFN-γ ein potenter Stimulus für die monozytäre IL-12 (p40/p70) Bildung ist, wurde sein Einfluß auf die Größe der IL-12 (p40/p70) produzierenden Monozytenpopulation und die RMSF aller Monozyten untersucht. Die alleinige Inkubation von Monozyten mit IFN-γ führte dabei zu keiner meßbaren IL-12 (p40/p70) Bildung (n = 5), daher wurde IFN-γ in Kombination mit LPS eingesetzt. A B Anteil IL-12 produzierender Zellen [%] Vorstimulation mit IFN-γ [h] RSMF IL-12 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, Vorstimulation mit IFN-γ [h] Brefeldin ab Beginn 10 h Brefeldin 8 h Brefeldin Abbildung 9: Einfluß der Dauer der Vorstimulation mit IFN-γ auf die Bildung von IL-12 (p40/p70). Nach 0, 2, 4 und 6 h Vorstimulation mit 10 ng/ml IFN-γ wurde zu frisch isolierten PBMC 100 ng/ml LPS gegeben und die Zellen ab diesem Zeitpunkt für 10 h stimuliert. Brefeldin A wurde entweder zu Beginn der Vorstimulation, zusammen mit LPS (10 h Brefeldin A) oder zwei Stunden später (8 h Brefeldin A) hinzugefügt. Dargestellt ist der Anteil IL-12 (p40/p70) produzierender Monozyten (A) und die RSMF aller Monozyten (B).

30 Ergebnisse 24 Mit den Monozyten eines gesunden Probanden wurde untersucht, welchen Einfluß die Dauer der Vorstimulation mit IFN-γ auf die Produktion von IL-12 (p40/p70) durch die Monozyten hat. In allen Ansätzen zeigte sich, daß die Inkubation mit IFN-γ zwei Stunden vor der Zugabe von LPS zu einem höheren Anteil IL-12 (p40/p70) produzierender Monozyten und zu einer höheren RSMF führt als die gleichzeitige Applikation beider Substanzen. Durch eine Verlängerung der Vorstimulationszeit mit IFN-γ auf 4 oder 6 h ließ sich keine weitere Steigerung der IL-12 (p40/p70)-produktion erzielen (Abbildung 9). Daher wurde die Dauer der Vorstimulation mit IFN-γ für die weiteren Experimente auf zwei Stunden festgelegt. Wie die Abbildung 10 zeigt, erhöhte die zweistündige Vorinkubation mit IFN-γ den Anteil IL-12 (p40/p70) produzierender Monozyten im Durchschnitt auf 36,1 ± 3,5 %, während nach einer Stimulation mit LPS alleine nur 5,3 ± 1,2 % der Zellen IL-12 (p40/p70) produzierten (n = 14; p < 0,001). Gleichzeitig erhöhte sich auch die RSMF der Monozyten von 0,95 ± 0,24 auf 3,23 ± 0,65 (n = 12; p < 0,01) Einfluß der Vorstimulation mit Interleukin-10 auf die IL-12 Produktion Bei den gleichen Probanden wurde auch der Einfluß von IL-10 auf die Größe der IL-12 (p40/p70) produzierenden Subpopulation untersucht. Diese umfaßte durchschnittlich 5,8 ± 1,4 % der Monozyten. Die Vorinkubation mit IL-10 führte somit zu keiner signifikanten Änderung der Populationsgröße. Die Fluoreszenzwerte unterschieden sich ebenfalls nicht signifikant, es konnte jedoch ein leichter Abfall der RSMF von 0,95 ± 0,24 ohne IL-10 auf 0,77 ± 0,13 nach Vorinkubation mit IL-10 beobachtet werden.

31 25 Ergebnisse Anteil IL-12 produzierender Monozyten [%] K ** LPS p < 0,01 IFN-γ & LPS p < 0,01 ** ** IL-10 & LPS RSMF IL-12 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 K LPS p < 0,01 n.s. IFN-γ & LPS p < 0,01 ** n.s. IL-10 & LPS Abbildung 10: Regulation der IL-12 (p40/p70) Bildung durch IFN-γ und IL-10. PBMC wurden für 14 h in Medium, LPS, IFN-γ & LPS oder IL-10 & LPS (2 h Vorinkubation mit IFN-γ oder IL-10, anschließend Zugabe von LPS) stimuliert. Dargestellt sind der Anteil der IL-12 (p40/p70) produzierenden Monozyten und die RSMF für IL-12 (p40/p70) (n = 14; * p < 0,05; ** p < 0,01; n.s. nicht signifikant; jeweils im Vergleich mit K) Einfluß der Vorstimulation mit TGF-β 1 auf die IL-12 Produktion In einer weiteren Versuchsreihe wurde der Einfluß von TGF-β 1 auf die Zytokinproduktion der Monozyten untersucht (Abbildung 12). Dabei zeigte sich, daß TGF-β 1 im Gegensatz zu IFN-γ auch ohne zusätzliche Zugabe von LPS die Monozyten zur Produktion von IL-12 (p40/p70) und IL-10 (siehe Abschnitt ) stimulieren kann. Der Anteil IL-12 (p40/p70) produzierender Monozyten betrug nach 14-stündiger Inkubation mit TGF-β 1 2,4 ± 0,5 % und war damit signifikant höher als nach Inkubation in Medium. Verglichen mit der Populationsgröße von 6,4 ± 0,8 % nach Stimulation mit LPS lag dieser Wert deutlich niedriger (p < 0,05). Wurden die Zellen vor der LPS Zugabe mit TGF-β 1 inkubiert, so sank der Anteil IL-12 (p40/p70) bildender Monozyten zwar auf 4,9 ± 0,6 %, er lag aber immer noch deutlich über dem Anteil, der bei alleiniger TGF-β 1 Verwendung erreicht wurde (p < 0,05). Dieser hemmende Effekt der Vorstimulation mit TGF-β 1 auf die IL-12 (p40/p70) Produktion war um so stärker ausgeprägt, je länger die Vorstimulation dauerte (Abbildung 11). Die signifikante Steigerung der TGF-β 1 induzierten IL-12 (p40/p70) Produktion durch alleinige oder zusätzliche Stimulation mit LPS ließ sich auch anhand der relativen Fluoreszenzwerte nachweisen.

32 Ergebnisse 26 Proband 1 Proband 2 Anteil Il-12 (p40/p70) produzierender Monozyten [%] Dauer der Vorstimulation mit TGF-β [h] RSMF IL-12 (p40/p70) 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0, Dauer der Vorstimulation mit TGF-β [h] Abbildung 11: Zeitabhängigkeit der Wirkung von TGF-β 1 auf die IL-12 (p40/p70) Produktion. PBMC zweier gesunder, nichtatopischer Probanden wurden für 2, 4 oder 6 h mit 1 ng/ml TGF-β 1 vorstimuliert und anschließend für 12 h mit 100 ng/ml LPS inkubiert. Dargestellt ist der Anteil IL-12 (p40/p70) produzierender Monozyten und die RSMF für IL-12 aller Monozyten. Anteil IL-12 produzierender Monozyten [%] K LPS ** p < 0,01 ** TGF-β & LPS p < 0,01 RSMF IL-12 1,0 0,8 0,6 n.s. ** n.s. 0,4 TGF-β 0,2 0,0 K LPS * p < 0,05 TGF-β & LPS p < 0,05 TGF-β Abbildung 12: Regulation der IL-12 (p40/p70) Produktion durch TGF-β 1. PBMC wurden für 14 h mit Medium, LPS, TGF-β 1 & LPS oder TGF-β 1 inkubiert. Dargestellt ist der Anteil der IL-12 (p40/p70) produzierenden Monozyten und die RSMF für IL-12 (p40/p70) (n = 8; * p < 0,05; ** p < 0,01; n.s. nicht signifikant; jeweils im Vergleich mit K).

33 27 Ergebnisse Regulation der Produktion von IL-10 durch IFN-γ, TGF-β 1 und IL Einfluß von IFN-γ auf die IL-10 Produktion Bei alleiniger Inkubation mit IFN-γ produzierten die Monozyten kein IL-10 (n = 5). Wurden die Monozyten für 2 h mit IFN-γ vorstimuliert und dann LPS hinzugegeben, so sank der Anteil IL-10 produzierender Monozyten im Vergleich zur Stimulation mit LPS (10,4 ± 2,5 %) signifikant auf 5,9 ± 1,3 % (n = 14; p < 0,05). Dieser Wert lag aber immer noch höher als bei den in Medium kultivierten Monozyten (n = 14; p < 0,05) (Abbildung 13) Einfluß der Vorstimulation mit Interleukin-10 auf die IL-10 Produktion Wie IFN-γ verkleinerte auch IL-10 bei zweistündiger Vorstimulation die IL-10 bildende Monozytenpopulation. Mit 5,9 ± 1,3 % war ihr Anteil etwas größer als nach IFN-γ Vorstimulation, aber deutlich niedriger als nach LPS Stimulation (n = 14; p < 0,05). Die Auswertung der RSMF Daten erbrachte tendenziell ähnliche Ergebnisse, bei erheblichen interindividuellen Abweichungen ergaben sich jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Ansätzen (Abbildung 13). p < 0,05 14 p < 0,05 1,2 Anteil IL-10 produzierender Monozyten [%] K LPS ** * IFN-γ & LPS ** IL-10 & LPS RSMF IL-10 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 K LPS n.s. n.s. IFN-γ & LPS n.s. IL-10 & LPS Abbildung 13: Regulation der IL-10 Bildung durch IFN-γ und IL-10. PBMC wurden für 14 h in Medium, LPS (100 ng/ml) IFN-γ & LPS oder IL-10 & LPS (2 h Vorinkubation mit IFN-γ oder IL-10, anschließend Zugabe von 100 ng/ml LPS) stimuliert. Dargestellt sind der Anteil der IL-10 produzierenden Monozyten und die RSMF für IL-10 (n = 12; * p < 0,05; ** p < 0,01; n.s. nicht signifikant; jeweils im Vergleich mit K).

34 Ergebnisse Einfluß der Vorstimulation mit TGF-β 1 auf die IL-10 Produktion Wie schon in Abschnitt beschrieben, stimulierte die Inkubation mit TGF-β 1 Monozyten zur Produktion von IL-12 (p40/p70), verminderte aber die durch LPS induzierte IL-12 (p40/p70) Bildung. Abbildung 14 zeigt den Einfluß von TGF-β 1 auf die IL-10 Bildung. Der Anteil IL-10 produzierender Monozyten betrug nach Stimulation mit TGF-β 1 5,6 ± 0,6 % und unterschied sich damit praktisch nicht von dem Wert von 5,7 ± 1,0 % bei alleiniger Verwendung von LPS. Durch zweistündige Vorstimulation mit TGF-β 1 und anschließender Zugabe von LPS konnte dieser Anteil zwar auf 6,8 ± 1,1 % gesteigert werden, der Unterschied erreichte aber ebenfalls keine statistische Signifikanz. Die Differenzen zwischen den RSMF Werten der drei verschiedenen Ansätze waren ebenfalls minimal (Abbildung 14). Dagegen ergaben sich bei der Untersuchung der Zeitabhängigkeit der IL-10 Produktion in Abhängigkeit von der Dauer der Vorstimulation mit TGF-β 1 bei anschließender Stimulation mit LPS bei zwei Probanden abweichende Ergebnisse: TGF-β 1 bewirkte eine von der Dauer der Vorstimulation mit TGF-β 1 abhängige Steigerung der IL-10 Bildung in Monozyten (Abbildung 15). Anteil IL-10 produzierender Monozyten [%] K ** ** ** LPS TGF-β & LPS TGF-β RSMF IL-10 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 K * LPS n.s. TGF-β & LPS n.s. TGF-β Abbildung 14: Regulation der IL-10 Produktion durch TGF-β 1. PBMC wurden für 14 h mit Medium, LPS, TGF-β 1 & LPS oder TGF-β 1 allein inkubiert. Dargestellt sind der Anteil der IL-10 produzierenden Monozyten und die RSMF für IL-10 (n = 8;*: p < 0,05; **: p < 0,01; n.s.: nicht signifikant, jeweils im Vergleich mit K).

35 29 Ergebnisse Anteil IL-10 produzierender Monozyten [%} Dauer der Vorstimulation mit TGF-β [h] Proband 1 Proband 2 RSMF IL-10 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, Dauer der Vorstimulation mit TGF-β [h] Abbildung 15: Zeitabhängigkeit der Wirkung von TGF-β 1 auf die IL-10 Produktion. PBMC zweier gesunder, nichtatopischer Probanden wurden für 2, 4 oder 6 h mit 1 ng/ml TGF-β 1 vorstimuliert und anschließend für 12 h mit 100 ng/ml LPS inkubiert. Dargestellt ist der Anteil IL-10 produzierender Monozyten und die RSMF für IL-10 aller Monozyten Expression von Oberflächenmolekülen auf IL-10 und IL-12 produzierenden Monozyten CD14 Der LPS-Rezeptor CD14 wird von allen Monozyten exprimiert. Daher wurde in jedem Ansatz durch Darstellung der CD14 positiven Zellen die korrekte Lage des Monozytengate im FSC/SSC-Schaubild überprüft. Zwischen 7 und 30 % der Zellen im Monozytengate trug kein CD14, der Mittelwert lag bei 14,1 ± 0,9 %. Diese Zellen produzierten weder IL-12 (p40/p70) noch IL-10 (Abbildung 16). 0.0 % 10.4 % 9.7 % 79.9 % 0.3 % 16.1 % 9.7 % 73.9 % Abbildung 16: Nur CD14 positive Zellen im Monozytengate bilden IL-10 und IL-12 (p40/p70). PBMC wurden für 14 h mit LPS inkubiert, mit Antikörpern gegen IL-10, IL-12 (p40/p70) und CD14 gefärbt und anschließend im Durchflußzytometer gemessen. Dargestellt ist eines von acht Experimenten mit vergleichbaren Ergebnissen.

36 Ergebnisse CD16 In allen Ansätzen trug ein Teil der Monozyten das Oberflächenmolekül CD16. Direkt nach der Isolation der Zellen waren dies 8,9 ± 2,6 % (n = 4) und nach 14-stündiger Inkubation mit Medium 9,2 ± 0,9 % (n = 15). Wie in Abbildung 17 dargestellt, verminderte die Inkubation mit LPS allein oder in Kombination mit IFN-γ, TGF-β 1 oder IL-10 den Anteil CD16 exprimierender Zellen auf 4 6 %. Auch eine 14-stündige Inkubation mit TGF-β 1 senkte die CD16 Expression gegenüber der Kontrolle. Signifikante Unterschiede wurden dabei nur für die RSMF erreicht (p < 0,05), nicht aber für den Anteil der CD16 positiven Zellen (p = 0,56).Nach Stimulation bildeten die CD16 exprimierenden Zellen weder IL-12 (p40/p70) noch IL-10 (Abbildung 18). Da jedoch der Anteil CD16 positiver Zellen nach Stimulation vermindert war, kann keine Aussage über die Zytokinproduktion der Monozyten gemacht werden, die nur vor der Stimulation CD16 exprimierten. Anteil CD16 exprimierender Monozyten [%] A K ** ** ** LPS IFN-γ & LPS IL-10 & LPS TGF-β & LPS TGF-β n = 15 n = 15 n = 15 n = 5 n = 12 n = 8 B RSMF CD16 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 K ** ** ** LPS IFN-γ & LPS IL-10 & LPS TGF-β & LPS TGF-β n = 15 n = 15 n = 15 n = 5 n = 12 n = 8 * Abbildung 17: Modulation der CD16 Expression auf Monozyten durch verschiedene Zytokine. PBMC wurden für 14 h in Medium, mit LPS und / oder verschiedenen Zytokinen inkubiert, fixiert, mit Antikörpern gegen CD16 gefärbt und im Durchflußzytometer gemessen. Dargestellt ist der Anteil CD16 exprimierender Monozyten (A) und die RSMF der Monozyten für CD16 (B). Vergleich mit K im gepaarten T-Test, *: p < 0,05, **: p < 0, % 1.5 % 72.0 % 5.2 % 10.4 % 1.7 % 82.9 % 5.0 % Abbildung 18: CD16 positive Zellen im Monozytengate bilden kein IL-10 und kein IL-12 (p40/p70). PBMC wurden für 14 h mit LPS inkubiert, mit Antikörpern gegen IL-10, IL-12 (p40/p70) und CD16 gefärbt und anschließend im Durchflußzytometer gemessen. Dargestellt ist eines von sechs Experimenten mit vergleichbaren Ergebnissen.

37 31 Ergebnisse CD11b CD11b, eine Untereinheit des Integrins Mac-1, wurde sowohl vor als auch nach Stimulation von allen CD14 positiven Monozyten exprimiert (Abbildung 19). Daher war CD11b auch auf den IL-12 (p40/p70) produzierenden Monozyten nachweisbar (Abbildung 20). A Vor Inkubation B Nach Inkubation ohne LPS C Nach Inkubation mit LPS 0.0 % 99.7 % 13.6 % 86.0 % 12.9 % 80.4 % 0.2 % 0.0 % 0.3 % 0.1 % 6.0 % 0.7 % Abbildung 19: Alle CD14 tragenden Monozyten exprimieren CD11b. PBMC wurden vor (A) und nach 14-stündiger Inkubation in Medium (B) oder mit LPS (C) mit Antikörpern gegen CD11b und CD14 gefärbt. Dargestellt ist eines von fünf unabhängigen Experimenten mit ähnlichen Ergebnissen. A 1.7 % 0.2 % B 94.0 % 1.3 % C 39.6 % 53.7 % 96.5 % 1.5 % 4.6 % 0.1 % 6.3 % 0.5 % Abbildung 20: IL-12 (p40/p70) produzierende Monozyten exprimieren CD11b. PBMC wurden für 14 h mit Medium (B) oder IFN-γ & LPS (A, C) inkubiert, mit unspezifischen (A) oder IL-12 (p40/p70) & CD11b Antikörpern (B, C) gefärbt und anschließend im Durchflußzytometer gemessen. Dargestellt ist eines von drei unabhängigen Experimenten mit ähnlichen Ergebnissen.

38 Ergebnisse CD80 und CD86 Außerdem wurde die Expression der kostimulatorischen Moleküle CD80 (B7.1) und CD86 (B7.2) auf IL-12 (p40/p70) produzierenden Monozyten untersucht. Alle CD14 exprimierenden Monozyten trugen vor und nach 14-stündiger Inkubation mit Medium, LPS oder IFN-γ & LPS das Oberflächenmolekül CD86 (Abbildung 21). Somit besaßen auch die IL-12 (p40/p70) produzierenden Monozyten CD86 (Abbildung 22). Eine Expression von CD80 auf Monozyten war unter den gegebenen Versuchsbedingungen nicht nachweisbar. Daher war auch keine Aussage über einen eventuellen Zusammenhang mit der Produktion von Zytokinen möglich. A Vor Inkubation B Inkubation ohne LPS C Inkubation mit LPS 0.6 % 91.1 % 10.4 % 81.2 % 13.6 % 77.4 % 1.7 % 6.6 % 5.2 % 3.2 % 8.1 % 0.8 % Abbildung 21: Alle CD14 tragenden Monozyten exprimieren CD86. PBMC wurden vor (A) und nach 14-stündiger Inkubation in Medium (B) oder mit LPS (C) mit Antikörpern gegen CD86 und CD14 gefärbt. Dargestellt ist eines von fünf unabhängigen Experimenten mit ähnlichen Ergebnissen. A B C 0.3 % 0.5 % 89.7 % 0.4 % 45.3 % 46.8 % 99.1 % 0.2 % 9.9 % 0.0 % 7.9 % 0.0 % Abbildung 22: IL-12 (p40/p70) produzierende Monozyten exprimieren CD86. PBMC wurden für 14 h mit Medium (B) oder IFN-γ & LPS (A, C) inkubiert, mit unspezifischen (A) oder IL-12 (p40/p70) & CD86 Antikörpern (B, C) gefärbt und anschließend im Durchflußzytometer gemessen. Dargestellt ist eines von fünf unabhängigen Experimenten mit ähnlichen Ergebnissen.

39 33 Ergebnisse CD23 Der niedrig affine IgE-Rezeptor CD23 (FcεRII) wurde nur von einem kleinen Teil der unstimulierten Monozyten exprimiert. Nach Stimulation mit LPS ließ sich CD23 jedoch nicht mehr auf den Zellen nachweisen. Somit konnte nicht festgestellt werden, ob sich die IL-10 und IL-12 (p40/p70) produzierenden Monozyten in Bezug auf die Expression von CD23 unterscheiden Koexpression von IL-6, IL-10 und IL-12 Bei einigen Probanden wurde die Bildung des Zytokins IL-6 untersucht. Nach 14-stündiger Zellkultur in Medium bildeten 10,9 ± 6,2 % der Monozyten IL-6. Nach Stimulation mit LPS erhöhte sich der Anteil IL-6 produzierender Monozyten auf 51,8 ± 5,0 % (n = 6; p < 0,01). Zusätzliche Vorstimulation mit IFN-γ oder TGF-β 1 veränderte diesen Anteil nicht, er betrug dann 50,1 ± 4,4 % bzw. 51,7 ± 3,6 % (n = 6). Die Vorstimulation mit IL-10 konnte den Anteil IL-6 bildender Monozyten auf 35,5 ± 4,4 % senken, dieser Unterschied erreichte jedoch keine Signifikanz (n = 4; p = 0,054). Unter allen Versuchsbedingungen produzierten sowohl die IL-12 (p40/p70) wie auch die IL-10 bildenden Monozyten IL-6 (Abbildung 23). A B 0.2 % 14.9 % 0.3 % 4.7 % 29.7 % 55.2 % 27.2 % 67.8 % Abbildung 23: IL-10 und IL-12 (p40/p70) produzierende Monozyten bilden gleichzeitig auch IL-6. PBMC wurden für 14 h mit LPS & IFN-γ (A) oder LPS (B) inkubiert, mit Antikörpern gegen IL-6 & IL-12 (p40/p70) (A) oder IL-6 & IL-10 (B) gefärbt und anschließend im Durchflußzytometer gemessen. Dargestellt ist eines von mehreren unabhängigen Experimenten mit ähnlichen Ergebnissen.