Überproduktion der Taq DNA Polymerase mit rekombinanten E. coli Zellen

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1 Überproduktion der Taq DNA Polymerase mit rekombinanten E. coli Zellen Versuchsleiter: Bernhard Eikmanns Protokollführung: Karl Varadi Gruppe: 11 Durchführung: Protokoll testiert: WS02 Universität Ulm

2 Inhaltsverzeichnis I. Theoretischer Hintergrund... 1 II. Material und Methoden... 3 III. Ergebnisse 3.1 Ergebnisse des Wachstumsversuches Expressionskontrolle durch SDS-PAGE und Silbernitrat-Färbung Aufreinigungskontrolle durch SDS-PAGE und Coomasie-Färbung Funktionsüberprüfung der Taq-DNA-Polymerase... 8 IV. Diskussion 4.1 Ergebnisse des Wachstumsversuches Expressionskontrolle durch SDS-PAGE und Silbernitrat-Färbung Aufreinigungskontrolle durch SDS-PAGE und Coomasie-Färbung Funktionsüberprüfung der Taq-DNA-Polymerase

3 I. Theoretischer Hintergrund Die Überexpression von Proteinen gehört mitunter zu den wichtigsten Aufgabenbereichen der modernen Gentechnologie. Mit ihr ist es beispielsweise erst möglich geworden pharmazeutische Mittel wie Insulin billig und mit wenig Aufwand in hohen Mengen zu synthetisieren. Doch auch in der Forschung spielt sie eine wichtige Rolle, wie z.b. bei Untersuchungen an Proteinen selbst. In diesem Protokoll soll auf die Überexpression der Taq-DNA-Polymerase (Taq-Pol) näher eingegangen werden. Die Taq-Pol wurde aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus isoliert und dient dort den Replikationsprozessen. Sie besteht aus einer Untereinheit mit 832 Aminosäuren (2499 bp im Gen) und hat ein Molekulargewicht von 95 kda. Wie alle DNA- Polymerasen besitzt sie eine 5 3 -Polymeraseaktivität und eine zusätzliche Exonukleaseaktivität, jedoch fehlt ihr die 3 5 -Exonukleaseaktivität. Dem Fehlen dieses sog. proof-readings ist es zu verdanken, dass die Fehlerrate beim Einbau von Desoxyribonukleotiden höher ist als beispielsweise die der DNA-Polymerase I aus E. coli. Aufgrund der extremen Bedingungen im Lebensraum des Bakteriums ist das Protein mit einer optimalen Betriebstemperatur von 74 C sehr hitzestabil. Bei diesen Bedingungen synthetisiert es DNA mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 75 nt/sec. Vor allem aus dem zuletzt genannten Grund wird die Taq-Pol für PCR s und bei der Sequenzierung GC-reicher DNA verwendet. Für die Überexpression des Proteins muss das Gen der Taq-Pol in einen geeigneten Expressionsplasmid kloniert werden. In diesem Fall wurde der 4,5 kbp große, modifizierte Vektor pttq18 aus Thermus thermophilus verwendet. Er beinhaltet das cole1-origin of replication, welches die Expression in E. coli ermöglicht, das Repressorgen laci und das Resistenzgen amp. Letzteres codiert für das Enzym β-lactamase, welches das Antibiotikum Ampicillin neutralisiert und so nur denjenigen Bakterien das Wachstum in mit Ampicillin versetzten Medien erlaubt, die im Besitz des Vektors sind. Das Gen laci codiert für ein Repressorprotein, das mit dem Operator wechselwirkt und die RNA-Polymerase an der Transkription hindert. Zusätzlich befindet sich auf dem Plasmid der Hybridpromotor Ptac und eine MCS, gefolgt von der Sequenz des starken Transkriptionsterminators aus dem E. coli rrnb-operon. Der Hybridpromotor ist ein modifizierter lacuv5-promotor dessen 35-Region aus dem trp-promotor entstammt. Diese Kombination ergibt die optimale Consensus-Sequenz für die RNA-Polymerase von E. coli, wodurch eine hohe Transkriptionsrate erreicht wird. Die Modifikation beeinflusst jedoch nicht die Funktion der Operatorregion im Ptac-Promotor, so dass die Transkriptionsregulation mittels laci- Repressorproteinen problemlos betrieben werden kann. Durch Zugabe von IPTG ins Nährmedium der Bakterien kann die Expression der Taq-Pol induziert werden. Die Chemikalie bindet am Repressorprotein und bewirkt eine Konformationsänderung, wodurch die Wechselwirkung des Proteins mit dem Operator aufgehoben wird und den Transkriptionprozess freigibt. Für die Insertion muss das taq-gen mit flankierenden Sequenzen ausgestattet werden die als Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme agieren. Nach dem Verdau durch Restriktionsenzyme müssen deren Schnittmuster komplementär zu den Schnittmuster der Schnittstellen in der MCS sein, damit eine Ligation stattfinden kann. Das Hinzufügen der Erkennungssequenzen erfolgt durch eine Insertions-PCR, bei der die Primer eben diese Sequenzen enthalten. Während den PCR- Zyklen werden diese stabil in das generierte PCR-Fragment eingebaut. Durch die Auswahl der Erkennungssequenzen kann das nun modifizierte taq-gen mit den Enzymen EcoRI und BglII, die MCS im Vektor mit EcoRI und mit BamHI geschnitten werden. Das Restriktionsenzym BamHI hat zwar nicht die selbe Erkennungssequenz wie BglII, jedoch sind die Schnittmuster identisch und die Ligation des Inserts mit dem Vektor wird daher möglich. Der Grund für die Auswahl von BamHI ist logisch, denn die MCS des Plasmids enthält keine Schnittstelle für BglII. 2

4 Zu erwähnen sei noch, dass bei der Insertion der Schnittstellen im taq-gen dessen codierende Basentripletts im Bereich der EcoRI-Schnittstelle so verändert werden, dass das Protein statt 832 Aminosäuren 833 besitzt. Das beeinträchtigt jedoch nicht dessen Funktion. Der rekombinierte Expressionsvektor ptaq (pttq18 + taq-gen) wird in den E. coli-stamm BL21 transformiert und in ihm vermehrt. Dieser künstlich mutierte Bakterienstamm hat einige Eigenschaften, von denen jedoch nur ompt hervorgehoben werden soll. Mit diesem Genotyp ist das Bakterium nicht in der Lage eine Protease, welche in der äußeren Membran situiert ist (outer membrane protease), zu synthetisieren, wodurch man eine höhere Ausbeute an intakten rekombinierten Taq-Pol-Proteinen erzielen kann. Im Folgenden soll die Überexpression der Taq-DNA-Polymerase durchgeführt werden und nach deren Isolation die Funktion der 5 3 -Polymeraseaktivität sowie der 5 3 -Exonukleaseaktivität untersucht werden. Die Ergebnisse der Überexpression können mittels denaturierenden Acrylamid- Gelelektrophoresen überprüft werden, während man für die Funktionsuntersuchungen auf eine Agarose-Gelelektrophorese zurückgreifen muss. II. Material und Methoden Prinzipiell sind die Reagenzien, deren Zusammensetzung und die einzelnen Schritte der Aufarbeitung dem Praktikumsskript zu entnehmen. Etwaige Änderungen des Versuchsprotokolle sind hier jedoch erwähnt. Für die Überexpression wurden bereits transformierte E.coli-Kulturen des Stammes BL21 zur Verfügung gestellt. Die Expressionskultur beinhaltete den Plasmiden ptaq, die Kontrollkultur den Plasmiden pttq18 (kein Insert). In erster Linie wurden 5 ml-proben mit LB-Flüssigmedium autoklaviert und mit je 5 µl Ampicillinlösung (100 mg/ml Stammlösung, 100 µg/ml Endkonzentration) versetzt. Einzelne Kolonien beider Kulturen wurden von LB-Agarplatten ausgesucht und mit ihnen die LB-Medien angeimpft. Diese Vorkulturen wurden über Nacht (ÜN) bei 37 C unter Schütteln inkubiert. Für die Expressionshauptkultur wurden 250 ml LB-Flüssigmedium mit 2,5 ml Ampicillin und für die Kontrollhauptkultur 50 ml LB-Medium mit 0,5 ml Ampicillin (beide 100 µg/ml Endkonzentration) versetzt. Es wurde die optische Dichte beider Vorkulturen bei 578 nm (Photometer LBK Pharmacia) gemessen und die entsprechenden Mengen (s. Ergebnisse) für die Animpfung der Hauptkulturen verwendet. Da der Messbereich der Photometer nur von einer OD 578 = 0,1 0,3 linear ist, wurden die 1 ml Aliquote für die Messung mit reinem LB-Medium verdünnt (s. Ergebnisse). Bei einer OD 578 = 4,5 der Expressionsvorkultur wurden 5 ml zum Animpfen der Expressionshauptkultur verwendet. Die Kontrollhauptkultur wurde direkt mit 0,8 ml angeimpft. Des weiteren sollten die Hauptkulturen bei 37 C unter Schütteln inkubiert und bis zur Induktion mit IPTG alle 30 Minuten durch OD 578 -Messung auf ihr Wachstumsverhalten überprüft (s. Ergebnisse) werden. Diese Zeiten konnten aufgrund technischer Probleme nicht eingehalten werden (tatsächliche Zeiten s. Ergebnisse). Bei einer OD 578 = 0,35 wurde je Kultur ein 1 ml-aliquot entnommen, abzentrifugiert (5 Minuten, U/Min., Raumtemperatur) und das Pellet nach Dekantieren des Überstandes zur Expressionskontrolle eingefroren. Bei einer OD 578 = 0,6 fügte man beiden Kulturen 2,5 ml IPTG (1 mm Endkonzentration) für die Induktion hinzu und beobachtete das Wachstumsverhalten ab hier nur noch stündlich. Eineinhalb Stunden nach der Induktion erfolgte erneut eine Probenentnahme von 1 ml aus der Expressionskultur mit anschließendem Einfrieren des Pellets, 2,5 Stunden nach der Induktion wurde das mit beiden Kulturen wiederholt. Die Expressionskultur wurde zur Anreicherung der Exprimats weiter ÜN bei 37 C unter Schütteln inkubiert und am nächsten Morgen erneut optisch gemessen. 3

5 Gleichzeitig sollte eine Kontrolle der Induktion (die Expressionskultur als positive, die Kontrollkultur als negative) mittels einer SDS-PAGE (10% SDS-Polyacrylamidgel) in Kombination mit der Silberfärbung des Gels ausgeführt werden. Dazu wurden die vorhin isolierten Pellets in 50 µl H 2 O demin. und 50 µl SDS-Probenauftragspuffer resuspendiert und für 5 Minuten im kochenden Wasserbad denaturiert. Das Pipettierschema für das Gel ist der Tabelle 1 zu entnehmen, die aufgetragenen Probenvolumina errechnen sich aus den optischen Dichten der Kulturen zum Zeitpunkt der Zellentnahme (s. auch Ergebnisse). Die Laufzeit der Elektrophorese betrug 1,5 Stunden. Danach wurde das Gel ÜN in Fixierlösung aufbewahrt. Die Weiterbehandlung des Gels ist dem Skript zu entnehmen. Tabelle 1: Pipettierschema für die SDS-PAGE Spur Probe (BL21) Marker pttq ptaq ptaq ptaq ptaq pttq ptaq ptaq Marker Entnahmezeit* - V V V 1,5 h 1,5 h 2,5 h 2,5 h 2,5 h - Gruppe 2 * Probevolumen 5 µl 6 µl 10 µl 10 µl 4 µl 4 µl 3 µl 3 µl 3 µl 5 µl * Die Probenentnahme fand vor der Induktion (V) und 1,5 Stunden bzw. 2,5 Stunden nach der Induktion statt. 2 * Aufgeführt sind auch die Proben der Expressionkulturen einer anderen Gruppe (Gruppe 12) Während der Isolation der Taq-Pol wurde aus der ÜN-Expressionskultur 1ml für die Reinigungskontrolle entnommen und pelletiert (Probe 1). Die Kultur wurde im Folgenden sedimentiert, gewaschen, zentrifugiert und mit Lysozym (4 mg/ml) unter Inkubation behandelt. Nach diesem Schritt wurden erneut 50 µl aus der Lösung (Probe 2) entnommen. Zur Proteinfällung wurde Ammoniumsulfat (7,5 g) verwendet. Nach einer erneuten Zentrifugation wurden 50 µl (Probe 3) entnommen, die restliche Lösung in einen Dialyseschlauch gefüllt und 6 h bei RT gegen Aufbewahrungspuffer dialysiert (Puffer ist nach 2 h und 4 h auszutauschen). Dem Dialysat wurden 50 µl entnommen (Probe 4), dann wurde es 1:1 mit Aufbewahrungspuffer (enthielt 1 mm Pefablock) verdünnt und eingefroren. Die genauen Aufreinigungsschritte sind im Skript vermerkt. Zur Reinigungskontrolle wurde eine erneute SDS-PAGE (10% Polyacrylamid) in Kombination mit einer Coomasie-Färbung (ÜN) angewendet, deren Entfärbung am nächsten Tag erfolgte. Das Pipetierschema der zweiten SDS-PAGE ist in Tabelle 2 aufgeführt. Spur Probe Marker Marker Gruppe Probevolumen 4 µl 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl 4 µl Tabelle 2: Pipettierschema der SDS-PAGE für die Aufreinigungskontrolle Um die Taq-Pol auf ihre Polymerase- und Exonukleaseaktivität zu testen, wurde eine PCR durchgeführt. Das Dialysat wurde unverdünnt und verdünnt (1 Aufbewahrungspuffer) mit den Verdünnungen 1:2, 1:5 und 1:10 eingesetzt. Zum Vergleich wurde die Invitrogen-Taq-Pol (1:5 verdünnt, 1U/µl Endkonzentration) verwendet. Für beide Taq-Polymerasen wurde chromosomale 4

6 DNA aus Streptococcus agalactiae (ca. 1,5 kb groß) als Arbeitsmaterial zur Verfügung gestellt. Die restlichen PCR-Zutaten sind im Skript vermerkt. In Tabelle 3 ist lediglich der Inhalt der einzelnen Ansätze zu entnehmen. Die ersten fünf Ansätze sollen dabei die Polymeraseaktivität der beiden eingesetzten Taq-Pols, Ansatz 6 ist ein Test auf unspezifische Produkte durch Kontaminationen mit Fremd-DNA (keine chromosomale DNA), Ansatz 7 stellt den Test auf Exonukleaseaktivität dar (keine Primer und dntps) und Ansatz 8 die Kontrollspur der DNA (keine PCR-typischen Zusätze). Ansatz DNA ja ja ja ja ja nein ja ja Primer ja ja ja ja ja ja nein nein Enzym Taq 1:2 1:5 1:10 Invitrogen Taq Taq - Tabelle 3: Ansätze der PCR (unvollständig) Das Ergebnis der PCR wurde mit einer Agarose-Gelelektrophorese (0,8%) überprüft. Es wurden je 8 µl der PCR-Ansätze mit 2 µl Stop-Lösung versetzt und zusammen mit 2 µl Größenstandard im Gel aufgetrennt. Nach Anfärbung (Ethidiumbromid) und Fotographieren des Gels erfolgte der Aktivitätsvegleich der überexprimierten Taq-Pol und der Invitrogen-Taq-Pol durch Vergleichen der Bandenintensitäten. III. Ergebnisse 3.1 Ergebnisse des Wachstumsversuches In Tabelle 4 sind die tatsächlichen optischen Dichten beider Hauptkulturen (ptac = Expressionskultur, pttq18 = Kontrollkultur) zu den jeweiligen Entnahmezeiten aufgeführt. Die gemessenen Werte ergeben sich durch die Division mit den jeweiligen Verdünnungsfaktoren. Bei den OD 578 -Werten sind in Klammern zusätzlich die Verdünnungen aufgelistet die bei der Messung notwendig waren. Entnahmezeiten [h] OD 578 für ptac Entnahmezeiten [Min.] OD 578 für pttq18 Impfung Hauptkultur - Impfung Hauptkultur - 0 h 35 0,109 0 h 55 0,217 1 h 25 0,35 2 h 05 0,79 (1:10) 2 h 25 0,6 (1:10) Ind. 2 h 20 Induktion 3 h 30 0,85 (1:50) 3 h 15 1,9 (1:10) 4 h 30 2 (1:50) 4 h 15 3,05 (1:10) 20 h 35 3,8 (1:20) 20 h 35 4,67 Tabelle 4: Entnahmezeiten und optische Dichten der beiden Kulturen Mit diesen Werten lässt sich die Wachstumskurve (Diagramm 1) erstellen. Die für bakterielles Wachstum typischen lag-phasen können nicht gezeigt werden da die OD 578 -Werte zum Zeitpunkt der Impfung nicht aufgenommen wurden. Der OD 578 -Wert nach 20 h 35 ist im Diagramm nicht einbezogen. 5

7 log OD 10 1 ptaq pttq18 0, Entnahmezeit [Min.] Diagramm 1: Wachstumskurve beider Hauptkulturen 3.2 Expressionskontrolle durch SDS-PAGE und Silbernitrat-Färbung Bild 1 stellt das Ergebnis der Anfärbung des ersten Gels mit Silbernitrat. Der genauere Inhalt der Banden ist dem Pipetierschema aus Tabelle 1 zu entnehmen. Die Ergebnisse sollen dabei Kontrollen der Expression zu verschiedenen Zeitpunkten (V = vor Induktion, 1,5 h danach und 2,5 h danach) darstellen. ptaq ptaq ptaq ptaq pttq ptaq ptaq Markergröße M pttq 12 V 11 V 12/1,5 11/1,5 2,5 12/2,5 11/2,5 M Bild 1: SDS-PAGE in Kombination mit Silbernitrat-Färbung. Die dick markierten Spuren stellen die eigenen Werte dar. Die Kontrollwerte (pttq-spuren) entspringen der Zusammenarbeit beider Gruppen. 6

8 3.3 Aufreinigungskontrolle durch SDS-PAGE und Coomasie-Färbung Bild 2 zeigt die Kontrollen vor (Probe 1), nach der Hitzefällung (Probe 2), nach der Fällung mit Ammoniumsulfat (Probe 3) und letztendlich nach der Dialyse (Probe 4). Das Gel wurde von beiden Gruppen beladen, wobei die eigenen Werte die der Gruppe 11 (G11) sind. Anzumerken sei, dass Gruppe 12 auf diesem Gel aufgrund Problemen, welche bei der Überexpression auftraten (Kolben mit Expressionskultur wurde zerstört) die weiter aufgearbeitete Kontrollkultur aufgetragen hat. G12 G12 G12 G12 G11 G11 G11 G11 Markergröße M P1 P2 P3 P4 P1 P2 P3 P4 M Bild 2: Aufreinigungskontrolle durch SDS-PAGE und Coomasie-Färbung 3.4 Funktionsüberprüfung der Taq-DNA-Polymerase Die Agarose-Gelelektrophorese (Bild 3) soll die 5 3 -Polymeraseaktivität, sowie die 5 3 Exonukleaseaktivität der überexprimierten Taq-Pol überprüfen. In den Spuren 1 bis 4 wird die Funktionsfähigkeit der Polymerase durch Anwesenheit von PCR-Amplifikate nachgewiesen. In der ersten Spur wurde sie unverdünnt verwendet, bei den anderen drei Spuren handelt es sich um Verdünnungen von 1:2, 1:5 und 1:10. Die überexprimierte Taq-Pol soll mit einer handelsüblichen verglichen werden, welche in Spur 5 eingesetzt wurde. Spur 6 stellt eine Kontrolle auf unspezifische PCR-Produkte durch Kontamination mit fremder DNA dar. Da im 7. und 8. Ansatz der PCR alle Komponenten bis auf Puffer, Wasser und chromosomaler DNA ausgelassen wurden, kann hier die Exonukleaseaktivität der Taq-Pol (Spur 7) und die Kontrollspur der DNA (Spur 8) verfolgt werden. 7

9 Markergröße M M Bild 3: Funktionsüberprüfung durch Agarose-Gelelektrophorese IV. Diskussion 4.1 Ergebnisse der Wachstumsversuches Wie man dem Diagramm 1 entnehmen kann, wächst die Kontrollkultur etwas besser als die Expressionskultur: nach 4 h 15 erreicht sie eine OD 578 = 3,05. Dagegen erreicht die Expressionskultur erst nach 4 h 30 nur eine OD 578 = 2. Zudem zeigt die Wachstumskurve der Expressionskultur ca. von der 100. bis zur 200. Minute ein Rückgang im Wachstum. Diese Phase tritt zum Zeitpunkt des Induktionsbeginns (t = 145 Minuten) auf und ist eventuell auf die Auswirkungen von IPTG zurückzuführen. Ein Abnehmen der Wachstumsgeschwindigkeit ist bei Zugabe von Induktoren wie IPTG oft beobachtet worden. Interessanterweise zeigt sich dieser Rückgang jedoch nicht bei der Kontrollkultur obwohl diese ebenfalls mit IPTG behandelt wurde. An Eigenschaften des Stammes und der Expressionsvektoren können diese Unterschiede im Wachstum kaum liegen, denn insgesamt unterscheiden sich die beiden Stämme nur durch das Fehlen bzw. dem Vorhandensein des zu exprimierenden Taq-Pol-Gens. An unterschiedliche Eigenschaften der Medien liegt es auch nicht, denn beide Kulturen wurden im gleichen Medium aufgezogen. Vermutlich taucht das Problem aufgrund der unsachgemäßen Behandlung der Expressionskultur oder einer Mutation der Kontrollkultur (s. 4.2) auf. Aufgrund technischer Probleme (Inkubationskammer defekt) musste die Kultur öfters bei Raumtemperatur verweilen, was vermutlich das optimale Wachstum der Bakterien verhindert hat. Das Problem betraf die Kontrollkultur nicht in den selben Dimensionen, wodurch diese Kultur optimal wachsen konnte (jedes mal eine Verdoppelung der OD 578 ). Das technische Problem konnte allerdings im Laufe des Wachstumsversuches behoben werden. Dies zeigt sich bei der Expressionskultur in der erneuten Zunahme der Wachstumsrate (Verdopplung der Messwerte bei den letzten beiden Entnahmen). Die optischen Dichten beider Kulturen nach 20 h sind nicht so hoch wie erwartet (OD ptac = 3,8 und OD pttq18 = 4,67). Das liegt wahrscheinlich an der Unfähigkeit der Bakterien eine solche Expression konstant über einen längeren Zeitraum hindurch auszuführen. 8

10 4.2 Expressionskontrolle durch SDS-PAGE und Silbernitrat-Färbung Bild 1 zeigt die Ergebnisse der Expressionskontrolle. Da die Taq-Pol ein Molekulargewicht von 95 kda besitzt, sollte sich das Protein direkt überhalb der 83 kda-bande befinden. Vergleicht man allgemein die Bandenmuster der beiden Kulturen, bemerkt man erstaunlicherweise Unterschiede in der Anzahl. In der Kontrollspur vor der Induktion (pttq) fehlt unterhalb der 48 kda-markierung eine Bande, die bei den Expressionskulturen vor der Induktion (ptaq 11V und 12V) vorhanden ist. Das sollte normalerweise nicht der Fall sein, da stets der Stamm BL21 verwendet wurde. Vermutlich fand bei einer der (veralteten) Kolonien auf der Agarplatte eine Mutation statt, die sich hier in einer verminderten Produktion dieses Proteins wiederspiegelt. Knapp überhalb der 83 kda- Markerbande sollte sich die Taq-Pol befinden. Diese Vermutung wird durch die Zunahme der Bandenintensität nach der Induktion (Spuren 5-9) bestätigt. Das Problem ist aber, dass sowohl bei der Kontrollkultur (pttq/2,5h-bande) als auch bei der Expressionskulturen beider Gruppen (ptaq12/1,5/2,5 und ptaq11/1,5/2,5) nach der Induktion an diesen Stellen eine erhöhte Bandenintensität sichtbar ist. Das sollte bei der Spur pttq 2,5 h nicht der Fall sein, denn diese Kultur besitzt das Gen für die Taq-Pol nicht. Zusätzlich sind an dieser Stelle auch Banden vor der Induktion sichtbar. Das lässt sich damit erklären, dass der Stamm BL21 ein bis mehrere alternative Proteine synthetisiert, die in etwa dieselbe Größe von 95 kda besitzen und sich diese Proteine im Bereich der 95 kda-banden ansammeln. Nicht sichtbar ist die logische Zunahme der Proteinkonzentration 2,5 h nach der Induktion im Vergleich mit der nach 1,5 h. Da jedoch die in 4.1 erwähnten technischen Probleme auftraten, kann letztere Tatsache darauf zurückgeführt werden (Proteinsyntheseapparat durch inkonstante Temperaturverhältnisse gestört). Denkbar wäre auch eine Einstellung der Produktion bei der Synthese aufgrund hohem Energieverbrauch nach einer gewissen. Zeit Prinzipiell scheint die Proteinüberexpression funktioniert zu haben. Letztendlich werden Aufreinigungskontrolle und Funktionstest genauere Aufschlüsse erlauben. 3.2 Aufreinigungskontrolle durch SDS-PAGE und Coomasie-Färbung Allgemein bemerkt man bei der Aufreinigungskontrolle, dass die Bandenanzahl sowohl bei der Kontrollkultur (G12/P1-4) als auch bei der Expressionskultur (G11/P1-4) abnimmt. Zwischen den Proben P1 und P2 fand die Hitzefällung statt, bei der einige Proteine (Banden) entfernt werden konnten. Der größte Erfolg ist jedoch bei der Hauptanreicherung (Fällung mit Ammoniumsulfat, vgl. Probe 2 und 3) zu verbuchen. Hier beobachtet man im Falle der Expressionskultur die Anwesenheit von nur noch einer intensiveren Bande, deren Intensität aufgrund dem Entzug des Wassers bei der Dialyse (G11/P4) sogar zunimmt. Es ist anzunehmen, dass sich hier die Bande der überexprimierten Taq-Pol befindet, auch wenn laut Proteinmarker das Molekulargewicht von 95 kda nicht zutrifft. Die SDS-PAGE ist keine 100%-ige Methode für die Bestimmung des genauen Molekulargewichtes von Proteinen. Um definitiv zu beweisen, dass sich das Protein in dieser Bande befindet, müssten immunologische Tests mit Antikörper gegen die Taq-Pol durchgeführt werden. In den Spuren G12/3 und 4 existieren zwei weitere Banden, die auf der selben Höhe liegen (in Bild 2 nur schwer erkennbar). Bei ihnen handelt es sich jedoch nicht um Banden der Taq-Pol, da sie bei genauerer Betrachtung knapp 1 mm höher liegen als die Banden der Spuren G11/3 und 4. Mit diesem Ergebnis lässt sich auch belegen, dass die Zunahme der Bandenintensitäten in den Spuren 5-9 der Expressionskontrolle tatsächlich mit der Produktion der Polymerase nach der Induktion verbunden ist. 9

11 3.4 Funktionsüberprüfung der Taq-DNA-Polymerase Die erste Spur auf der Agarose-Gelelektrophorese zeigt eindeutig, dass die Polymerase erstens synthetisiert wurde und zweitens ihre volle biologische Aktivität besitzt. Die einzige sichtbare Bande enthält tatsächlich die amplifizierte chromosomale DNA von Streptococcus agalactiae, da sie eine ungefähre Größe von 1,5 kb besitzt (vgl. Material und Methoden). Die Amplifikate der verdünnten Taq-Pol in den Banden 2, 3 und 4 sind dagegen nicht sichtbar. Das hat jedoch keine schwerwiegende Bedeutung, denn bei Verdünnungen dieser Art muss nicht immer eine Konstanz in der Abnahme der Bandenintensität vorliegen. Bande 5 sollte eigentlich die Amplifikate der kommerziellen Taq-Pol anzeigen. Das Gegenteil könnte man damit erklären, das diese Polymerase mit Wasser, das kein Pefa-Block als Schutz enthielt, zu 1:5 verdünnt wurde und die Lösung zusätzlich relativ lange Raumtemperatur ausgesetzt wurde. Dies kann sich schädlich auf die Polymerase ausgewirkt haben. Im Kontrollansatz 6 sollte die Amplifikation von unspezifischen PCR-Produkten durch unverdünnte (funktionsfähige!, s. Bande 1) Taq-Pol überprüft werden. Das Ergebnis zeigt, dass keine Kontamination stattgefunden hat. In den letzten beiden Spuren wurde der Test für die Exonukleaseaktivität (7) und die Kontrolle mit reiner DNA ausgeführt. Erwartet hätte man im Falle der 7. Spur ein Schmier über die ganze Bande, da die Exonukleaseaktivität die DNA in Bruchstücke relativ unspezifischer Größe schneidet. In der 8. Spur dagegen sollte eine einzige Bande auf der Höhe von ca. 1,5 kb, welche die chromosomale DNA enthält, vorhanden sein. Da diese fehlt, kann man davon ausgehen, dass die DNA-Probe defekt war und so auch keine Exonukleaseaktivität sichtbar werden kann. Man könnte aber davon ausgehen, das diese Funktion aktiv ist, denn der Test auf Polymeraseaktivität verlief positiv. 10

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