De novo synthetisierte Proteine mit Metalloporphyrinkofaktoren

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1 De novo synthetisierte Proteine mit Metalloporphyrinkofaktoren vorgelegt von Diplom-Chemikerin Monika Fahnenschmidt aus Sindelfingen Dem Fachbereich 5 Chemie der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Naturwissenschaften Dr. rer. nat. genehmigte Dissertation Promotionsausschuß: Vorsitzender: Prof. Dr. Schomäcker Berichter: Prof. Dr. Lubitz Berichter: Priv.-Doz. Dr. Schlodder Tag der mündlichen Prüfung: 14. Juli 2000 Berlin 2000 D83

2 Abstract Fahnenschmidt, Monika De novo synthetisierte Proteine mit Metalloporphyrinkofaktoren Die Protein-de-novo-Synthese eröffnet vielfältige Möglichkeiten zur Konstruktion künstlicher Proteinmodelle, die sowohl hinsichtlich theoretischer Fragestellungen zur Faltung und Funktion natürlicher Proteine als auch für technische Anwendungen von großem Interesse sind. In dieser Arbeit wurden verschiedene de novo synthetisierte Proteine mit Metalloporphyrinkofaktoren hergestellt und untersucht. Dem Design dieser Polypeptidmodule liegt ein Vier- Helix-Bündel als Faltungsmotiv zu Grunde, dessen einfache und kompakte Struktur gute Voraussetzungen zur Untersuchung der Protein-Kofaktor-Wechselwirkung bietet. Zur Konstruktion der Polypeptidmodule wurden einzelne lineare Peptide, die in wäßriger Lösung amphiphile Helices ausbilden, mittels chemischer Festphasen-Peptidsynthese hergestellt und auf einem Trägermolekül zu einem Vier-Helix-Bündel angeordnet. In den hydrophoben Innenraum dieser Vier-Helix-Bündel konnten über Histidinseitengruppen Metalloporphyrinkofaktoren eingebunden werden. Durch den Einsatz unterschiedlicher Zentralmetallionen (Fe 3+ (Hämin), Co 3+ und Zn 2+ ) konnten verschiedene funktionelle Eigenschaften in die Vier-Helix- Bündel eingeführt werden. Dabei zeigte sich, daß das Redoxpotential des Häminkofaktors durch die Peptidumgebung beeinflußt werden kann und die Stabilität der Vier-Helix-Bündel gegenüber dem denaturierenden Agenz Guanidinium-Hydrochlorid durch den Einbau des Kofaktors erhöht wird. Das Co(III)porphyrin unterscheidet sich vom Hämin durch eine sehr langsame Reduktion zu Co 2+, die mit der Freisetzung des Kofaktors in die wäßrige Lösung einhergeht. Durch den Einbau des Zink(II)porphyrins in ein Vier-Helix-Bündel wurde ein wichtiger Schritt zur Entwicklung künstlicher Proteinmodelle für die Photosynthese realisiert. An diesem System wurde der lichtinduzierte Elektronentransfer zu einem Chinon in Lösung gemessen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Charakterisierungsmethode auf der Basis der EPR- und ENDOR-Spektroskopie ausgearbeitet, die eine detaillierte Beschreibung der Kofaktoreinbindung in de novo synthetisierten Hämproteinen ermöglicht. Der Spin-Zustand, die g-tensorhauptwerte und die EPR-Linienbreite wurden herangezogen, um die axialen Liganden der Hämgruppe zu identifizieren und auf grundlegende Merkmale ihrer geometrischen Anordnung zu schließen. Die Puls-ENDOR-Spektren der de novo synthetisierten Hämproteine und der Vergleich mit isotopenmarkierten Modellverbindungen zeigten, daß die ENDOR-Signale der Protonen der axialen Histidinliganden hervorragend als spektroskopische Sonde zur Charakterisierung de novo synthetisierter Hämproteine eingesetzt werden können. Anhand orientierungsselektionierter ENDOR- Spektren in gefrorener Lösung wurde ihre Hyperfeinwechselwirkung mit einem eigens erstellten Simulationsprogramm analysiert. Dies ermöglichte es, die Position der Protonen der axialen Histidinliganden im Koordinatensystem des g-tensors zu bestimmen und damit detaillierte strukturelle Aussagen zur Bindungssituation des Kofaktors zu treffen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden mit Hilfe der EPR- und ENDOR-Spektroskopie verschiedene de novo synthetisierte Hämproteine, die nach der Cytochrom b Untereinheit des Cytochrom bc 1 Komplexes modelliert wurden, charakterisiert. Es wurde festgestellt, daß nicht nur die Aminosäurezusammensetzung der einzelnen helicalen Bausteine, sondern auch das Designkonzept der Vier-Helix-Bündel Einfluß auf die Einbausituation des Kofaktors nimmt. Dabei unterschied sich die Faltung der Kofaktorbindungstasche in Templat-assoziierten synthetischen Proteine hinsichtlich der Orientierung der axialen Liganden von Vier-Helix-Bündeln, die auf der Selbstassoziation einzelner helicaler Bausteine beruhen.

3 Teile der vorliegenden Arbeit wurden bereits veröffentlicht Wissenschaftliche Publikationen 1. M. Fahnenschmidt, R. Bittl, H. K. Rau, W. Haehnel, W. Lubitz; Electron Paramagnetic Resonance and Electron Nuclear Double Resonance Spectroscopy of a Heme Protein Maquette; Chem. Phys. Lett., 2000, 323, M. Fahnenschmidt, H. K. Rau, R. Bittl, W. Haehnel, W. Lubitz; Characterization of de novo designed heme proteins by EPR and ENDOR spectroscopy; Chem.Eur.J., 1999, 5, M. Fahnenschmidt, H. K. Rau, R. Bittl, W. Haehnel, W. Lubitz; EPR/ENDOR Spectroscopic Characterization of a de novo Synthesized Cytochrome b Model; in Magnetic Resonance and Related Phenomena, D. Ziessow, W. Lubitz, F. Lendzian (editors), TU Berlin 1998, Vol. II, p M. Fahnenschmidt, R. Bittl, W. Haehnel, W. Lubitz; De novo Synthesized Proteins with Metalloporphyrin Cofactors; in Vorbereitung. Präsentationen auf internationalen Tagungen 1. M. Fahnenschmidt, H. Rau, R. Bittl, W. Haehnel, W. Lubitz; EPR/ENDOR Characterization of De Novo Designed Heme Proteins;2 nd International Symposium of the Volkswagen Stiftung, April 16 18, 1998, Staffelstein. 2. M. Fahnenschmidt, H. Rau, R. Bittl, W. Haehnel, W. Lubitz; Models for Electron Transfer Proteins: EPR/ENDOR Spectroscopic Characterization of de novo Designed Heme Proteins; Twelfth International Conference on Photochemical Conversion and Storage of Solar Energy, August 9 14, 1998, Berlin. 3. M. Fahnenschmidt, H. Rau, R. Bittl, W. Haehnel, W. Lubitz; EPR/ENDOR Spectroscopic Characterization of a de novo Synthesized Cytochrome b Model; Joint 29 th AMPERE 13 th ISMAR International Conference, August 2 7, 1998, Berlin. 4. M. Fahnenschmidt, H. K. Rau, R. Bittl, W. Haehnel, W. Lubitz; Characterization of de novo Designed Redox Active Proteins by EPR and ENDOR Spectroscopy; 3 nd International Symposium of the Volkswagen Stiftung, April 7 10, 1999, Konstanz. 5. M. Fahnenschmidt, R. Bittl, W. Haehnel, W. Lubitz; Synthesis and Spectroscopy of de novo Designed Heme Proteins; 3 nd International Symposium of the Volkswagen Stiftung, April 7 10, 1999, Konstanz. 6. M. Fahnenschmidt, R. Bittl, W. Haehnel, W. Lubitz; Polypeptide Modules with Metalloporphyrin Cofactors for Electron Transfer Studies; 4 nd International Symposium of the Volkswagen Stiftung, Juni 4 6, 2000, Wildbad Kreuth. 7. M. Fahnenschmidt, R. Bittl, W. Haehnel, W. Lubitz; De novo Synthesized Proteins with Metalloporphyrin Cofactors; 26 th European Peptide Symposium, September 11 15, 2000, Montpellier, France.

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5 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Protein-de-novo-Synthese Syntheseprinzip Einbau von Kofaktoren Theoretische Grundlagen EPR-Spektroskopie ENDOR-Spektroskopie EPR- und ENDOR-Messungen in gefrorenen Lösungen Elektronische Struktur von Häminkomplexen Low-spin Häminkomplexe High-spin Häminkomplexe Materialien und Methoden Synthese der Polypeptidmodule A utomatische Festphasensynthese der Peptide Modifizierung der Peptide A bspaltung der Peptide von der festen Phase Zusammensetzen der einzelnen Peptid-Bausteine zum Vier-Helix-Bündel Einbau von Metalloporphyrinkofaktoren Cytochrom b Modelle Präparation von Modellverbindungen Methoden zur Charakterisierung iii

6 iv INHALTSVERZEICHNIS Hochauflösende Flüssigkeitschromatogaphie (HPLC) Massenspektrometrie A nalytische Gelfiltration Circulardichroismus (CD) und Tryptophan-Fluoreszenz UV/VIS-A bsorptionsspektroskopie Blitzlichtspektroskopie EPR-Spektroskopie ENDOR-Spektroskopie Programme zur A uswertung der EPR- und ENDOR-Spektren EPR-Simulationsprogramm ELSI ENDOR-Simulationsprogramm SIMES Charakterisierung von Polypeptidmodulen mit einer Metalloporphyrin- Bindungsstelle Designkonzept der Polypeptidmodule Charakterisierung der leeren Polypeptidmodule Aufbau der Vier-Helix-Bündel Stabilität der Polypeptidmodule Hämin als redoxaktiver Kofaktor Einbau des Hämins Redoxpotential des Kofaktors Stabilität der künstlichen Hämproteine EPR-spektroskopische Charakterisierung Einbau eines Kobaltporphyrins Zink(II)porphyrin als Kofaktor UV/VIS-A bsorptionsspektroskopie EPR-Spektroskopie am Triplettzustand Blitzlichtspektroskopie und Elektronentransfer Zusammenfassung und Schlußfolgerungen Magnetische Resonanz Untersuchungen an Cytochrom b Modellen Designkonzept der Cytochrom b Modelle

7 INHALTSVERZEICHNIS v 6.2 EPR-Spektroskopie Simulation der EPR-Spektren Ligandenfeldanalyse der g-tensorhauptwerte Untersuchungen zur HA LS-Spezies des MOP ENDOR-Spektroskopie N und 15 N ENDOR-Spektroskopie H ENDOR-Spektroskopie Identifizierung der ENDOR-Signale anhand von Modellkomplexen Analyse der 1 H ENDOR-Spektren des maquette Gegenüberstellung der Cytochrom b Modelle Diskussion Zusammenfassung und Ausblick 141 Anhang 147 A EPR-Simulationsprogramm ELSI 147 A.1 Programm-Code für Linienverbreiterung durch g-strain A.2 Eingabe-Datei für ELSI B ENDOR-Simulationsprogramm SIMES 155 B.1 Programm-Code B.2 Eingabe-Datei für SIMES Literaturverzeichnis 165

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9 Kapitel 1 Einleitung Proteine stellen eine der wichtigsten Klassen an Biomakromolekülen dar. Dies deutet bereits ihr Name an, der von dem Griechischen Wort proteuo ich nehme den ersten Platz ein abstammt [1]. Fast alle biochemischen Prozesse in Lebewesen werden durch Proteine reguliert [2]. Als Enzyme katalysieren sie die enorme Vielfalt an chemischen Stoffwechselreaktionen in Zellen, die unter physiologischen Bedingungen ansonsten nicht möglich wären. Proteine dienen als Speicher- und Transportsysteme von Elektronen oder Molekülen, wie beispielsweise Sauerstoff, Glucose, Metallionen oder Lipiden. Als Hormone erfüllen Proteine wichtige Signalübertragungsfunktionen. Bei der Immunabwehr übernehmen Antikörper und Immunoglobine essentielle Schutzfunktionen. Des weiteren spielen Proteine eine entscheidende Rolle in der Muskelkontraktion und beim Aufbau von Gewebe, Knochen oder Haaren. Alle Proteine sind aus 20 verschiedenen Aminosäuren aufgebaut, die über eine Amidbindung zu linearen Polypeptidketten verknüpft sind. In den meisten bekannten Proteinen liegt die Kettenlänge bei etwa 100 bis 300 Aminosäuren, wobei sich einige Proteine jedoch aus mehreren Polypeptidketten zusammensetzen oder deutliche längeren Ketten mit bis zu 1800 Einzelbausteinen (Myosin) enthalten können [2]. Durch die Faltung der linearen Polypeptidketten entstehen dreidimensionalen Proteinstrukturen, in welche weitere organische Moleküle oder Metallionen eingebunden sein können. Diese sogenannten Kofaktoren bilden häufig das eigentlich katalytisch aktive Zentrum von Enzymen. Ihre funktionellen Eigenschaften werden entscheidend von der Wechselwirkung mit der Proteinumgebung geprägt. Wie anhand von Hämproteinen zu sehen ist, kann auf diese Weise ein Kofaktor (Eisenprotoporphyrin IX) verschiedene Funktionen 1

10 2 1. Einleitung ausüben [3]. In Hämoglobin und Myoglobin ermöglicht die Hämgruppe den Transport und die Speicherung von Sauerstoff [4]. In Katalasen, Peroxidasen und Oxygenasen hingegen ist sie an der Umsetzung verschiedenster Stoffwechselprodukte beteiligt [5]. In Elektronentransferprozessen tritt die Hämgruppe als Kofaktor der Cytochrome mit einer außerordentlich weiten Spanne an Redoxpotentialwerten (+400 bis 500 mv) auf [6, 7]. Die Zusammenhänge zwischen Aminosäuresequenz, Struktur und Funktion von Proteinen zu erforschen, ist eine große Herausforderung. Neben einem tieferen Verständnis komplexer biochemischer Systeme eröffnet sich hier die Perspektive, die speziellen Eigenschaften von Proteinen technisch nutzbar zu machen. Die Erforschung der Wechselwirkung zwischen Kofaktoren und ihrer Proteinumgebung ist dabei von zentraler Bedeutung. Der gezielte Einsatz von spezifischen Protein-Kofaktor-Wechselwirkungen sollte es analog zu natürlichen Proteinen ermöglichen, künstliche Systeme mit maßgeschneiderten funktionellen Eigenschaften zu konstruieren. Neben der gentechnischen Modifizierung von natürlichen Proteinen (Protein-Engineering) gewinnt hierbei die chemische Synthese künstlicher Proteinmodelle (Protein-de-novo-Synthese) zunehmend an Bedeutung. Da hier künstliche Proteine von Neuem, d. h. frei nach den eigenen Modellvorstellungen entworfen werden können, verwendet man auch häufig den Begriff Proteinde-novo-Design. Die Fortschritte, die im Bereich der Protein-de-novo-Synthese erzielt wurden, zeigen, daß es mittlerweile möglich ist, Polypeptide herzustellen, die in kompakte dreidimensionale Strukturen falten [8 10] und Kofaktoren binden können [11 13]. Die Weiterentwicklung dieser Systeme wird durch interessante Anwendungsmöglichkeiten in der Medizin (Impfstoffe, Medikamente) [14 16], Mikro- und Nanotechnologie (biokompatible Oberflächen, artifizielle Ionenkanäle) [17 19] oder der Katalyse [20, 21] und Bioelektronik [22, 23] motiviert. Da viele Aspekte der Protein-Kofaktor-Wechselwirkung noch nicht geklärt sind, deren Verständnis aber Voraussetzung für ein erfolgreiches Design funktioneller künstlicher Proteine ist, beschäftigt sich die hier vorliegende Arbeit mit der Untersuchung de novo synthetisierter Proteine, die Kofaktoren aufnehmen können. Aufgrund der Vielseitigkeit der biologischen Funktion von Hämin, steht dieser Kofaktor dabei im Vordergrund. Voraussetzung zur Untersuchung der Protein-Kofaktor-Wechselwirkung ist eine möglichst genaue Kenntnis der Bindungssituation des Kofaktors in seiner Proteinumgebung. Da die Hämgruppe in ihrem oxidierten Zustand (Fe 3+ )

11 3 paramagnetisch ist, kann der Kofaktor selbst als spektroskopische Sonde in magnetischen Resonanzuntersuchungen eingesetzt werden. Zur Charakterisierung de novo synthetisierter Hämproteine werden hier die EPR- (Electron Paramagnetic Resonance) und ENDOR- (Electron Nuclear Double Resonance) Spektroskopie herangezogen. Im nächsten Kapitel wird zunächst ein Überblick über den Stand der Forschung auf dem Gebiet der Protein-de-novo-Synthese gegeben. Dabei werden die Entwicklungen und Prinzipien zum Design künstlicher Proteinmodelle vorgestellt, auf denen die vorliegende Arbeit aufbaut. In Kapitel 3 werden die theoretischen Grundlagen zu den hier verwendeten Methoden der magnetischen Resonanzspektroskopie erläutert. Im Vordergrund steht dabei, wie die Meßgrößen der EPR- und ENDOR-Spektroskopie hinsichtlich der elektronischen und geometrischen Struktur künstlicher Hämproteine interpretiert werden können. Kapitel 4 (Materialien und Methoden) faßt alle experimentellen Aspekte zur Durchführung der hier vorliegenden Arbeit zusammen. Die Ergebnisse werden in den Kapiteln 5 und 6 vorgestellt. In Kapitel 5 werden de novo synthetisierte Proteine untersucht, die aus dem kompakten dreidimensionalen Strukturmotiv eines Vier-Helix-Bündels aufgebaut sind und eine Bindungsstelle für Metalloporphyrine enthalten. Diese Systeme wurden im Rahmen dieser Arbeit hergestellt, um den Einfluß der Aminosäurezusammensetzung auf die Struktur, Stabilität und Kofaktoreinbindung in de novo synthetisierten Proteinen zu untersuchen. Durch den Einbau von Metalloporphyrinen mit unterschiedlichen Zentralmetallionen (Fe 3+ (Hämin), Co 3+ und Zn 2+ )können verschiedene funktionelle Eigenschaften in die de novo synthetisierten Proteine eingeführt werden. Um zu erforschen, inwieweit sich diese Polypeptidmodule als Modellsysteme natürlicher Proteine einsetzen und funktionalisieren lassen, werden die Bindungssituation und die Eigenschaften der Kofaktoren in der Polypeptidumgebung mit verschiedenen spektroskopischen Methoden untersucht. In Kapitel 6 liegt der Schwerpunkt dagegen auf der magnetischen Resonanzspektroskopie. Hier werden verschiedene de novo synthetisierte Hämproteine, die nach der Cytochrom b Untereinheit des Cytochrom bc 1 Komplexes entworfen wurden, mittels EPR- und ENDOR-Spektroskopie charakterisiert. Ziel der magnetischen Resonanzuntersuchungen ist eine detaillierte strukturelle Beschreibung der Bindungssituation der Kofaktoren. Dabei wird untersucht, wie sich das Designkonzept von de novo synthetisierten Proteinen auf den Einbau der Hämgruppen auswirken kann. Die Arbeit schließt in Kapitel 7 mit einer Zusammenfassung der Ergebnisse und einem Ausblick für weitere Perspektiven in der Protein-de-novo-Synthese.

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13 Kapitel 2 Protein-de-novo-Synthese Ziel der Protein-de-novo-Synthese ist die Konstruktion von künstlichen Proteinmodellen. Diese Modellsysteme sind sowohl hinsichtlich grundlegender theoretischer Fragestellungen zur Struktur und Funktion von Proteinen, als auch für praktische Anwendungsmöglichkeiten in der (bio)chemischen Katalyse, der Medizin oder Biotechnologie von großem Interesse. Entscheidend für die Entwicklung der Protein-de-novo-Synthese war die Einführung der Festphasenpeptidsynthese durch Merrifield, die eine Automatisierung der ansonsten aufwendigen chemischen Polypeptidsynthese ermöglichte [24]. Zur Konstruktion der Proteinmodelle lassen sich auch gentechnische Methoden (DNA-Rekombinationstechnik, Oligonucleotid-Synthese) einsetzen [25]. Der Vorteil der chemischen Synthese liegt in der freien Wahl beliebiger Aminosäuresequenzen, die auch nicht-natürliche Aminosäurederivate mit speziellen Eigenschaften (z. B. zur Metallionenbindung [26], als Fluoreszenzmarker oder Spinlabel [27,28]) enthalten können. Die Protein-de-novo-Synthese stellt eine zweifache Herausforderung dar. Die künstlich hergestellten Polypeptide sollen in eine definierte Struktur falten und spezifische funktionelle Eigenschaften aufweisen. Der erste Abschnitt dieses Kapitels befaßt sich mit dem Problem der Faltung der künstlichen Proteinmodelle. Hier werden verschiedene Strategien vorgestellt, die eingesetzt werden, um in de novo synthetisierten Proteinen definierte Strukturen zu erzeugen. Im zweiten Abschnitt geht es um die Einbindung von Kofaktoren, über die spezielle funktionelle Eigenschaften in die de novo Proteine eingeführt werden sollen. 5

14 6 2. Protein-de-novo-Synthese 2.1 Syntheseprinzip Bei 20 verschiedenen natürlichen Aminosäuren existieren für eine Polypeptidkette aus 100 Einzelbausteinen bereits Möglichkeiten verschiedener Aminosäuresequenzen [9]. Demgegenüber sind in einer eukaryontischen Zelle jedoch nur etwa 10 5 Sequenzen in Form natürlicher Proteine realisiert [1, 29]. Es könnte also noch eine große Anzahl an Peptidsequenzen verborgen sein, die zu Proteinen mit neuen Strukturen und damit neuen funktionellen Eigenschaften führen. Wie Peptidbibliotheken 1 mit willkürlich gewählten Aminosäuresequenzen zeigen [30], bilden jedoch nicht alle Polypeptidketten wohldefinierte dreidimensionale Strukturen aus. Eine zentrale Aufgabe des Protein-de-novo-Designs ist die Suche nach Aminosäuresequenzen, die in bestimmte Strukturen falten ( inverse folding problem [31]). Der Einsatz von computerunterstützten Modellrechnungen gewinnt bei dem Design künstlicher Proteinmodelle zunehmend an Bedeutung [32 34]. Durch die Synthese von Polypeptiden mit unterschiedlichen Aminosäuresequenzen können die physikalischen Modellvorstellungen, die den Berechnungen zur Proteinfaltung zugrunde liegen, wiederum überprüft werden. Auf diese Weise können grundlegende Prinzipien der Proteinfaltung in künstlichen Proteinmodellen herausgearbeitet werden. Als Leitfaden für das Protein-de-novo-Design dienen die verschiedenen Organisationsebenen von Proteinstrukturen, die in vier Ebenen gegliedert werden [1]. Die Primärstruktur gibt die Abfolge der Aminosäuren in einer Polypeptidkette an (Aminosäuresequenz). Die Sekundärstruktur beschreibt die lokale Gerüstkonformation der Polypeptidketten. Man unterscheidet dabei z. B. helicale Bereiche von planaren Faltblattstrukturen, die untereinander durch Faltstellen (Turns), Schlaufen (Loops) oder weniger geordnete Kettensegemente verbunden sein können. In Abbildung 2.1 ist der Aufbau einer α-helix und eines β-faltblattes dargestellt. Diese Sekundärstrukturelemente ordnen sich in einer speziellen dreidimensionalen Struktur, der Tertiärstruktur, an. Die Anordnung verschiedener Polypeptidketten in Proteinen, die aus mehreren Polypeptid-Untereinheiten bestehen, wird als Quartärstruktur bezeichnet. Bei dem Design von de novo Proteinen werden im ersten Schritt Peptidblöcke mit hoher Tendenz zur Bildung definierter Konformationen (α-helices, β-faltblattstrukturen oder Loops) entworfen und im zweiten Schritt zu kleinen Tertiärstrukturen (Faltungseinheiten) zusammen- 1 Mit Peptidbibliothek bezeichnet man die Zusammenstellung einer großen Anzahl verschiedener Polypeptide, die mittels gentechnischer Methoden oder über chemische Synthese erhalten wurden.

15 2.1 Syntheseprinzip 7 geführt. In Abbildung 2.2 wird dieses Aufbauprinzip schematisch erläutert. Das Design der Sekundärstrukturelemente stützt sich auf die bisherigen Erkenntnisse, die zur Proteinfaltung vorliegen. Im allgemeinen ist die Konstruktion von helicalen Strukturen, die durch interne Wasserstoffbrücken des Peptidgerüstes stabilisiert werden und damit unabhängige autonome Faltungseinheiten darstellen, einfacher als das Design von Faltblattstrukturen, die nur zu ihrem nächsten Nachbarstrang Wasserstoffbrücken ausbilden können (siehe Abbildung 2.1). Die Stabilisierung von Sekundärstrukturelementen hängt sowohl von kurzreichweitigen Wechselwirkungen (einzelne Aminosäuren scheinen bestimmte Konformationen zu bevorzugen) als auch von langreichweitigen Wechselwirkungen der Aminosäuren untereinander ab. Abbildung 2.1: Darstellung einer α-helix (links) und einer β-faltblattstruktur (rechts in Aufsicht und Seitenansicht) nach [35]. Die α-helix wird durch fast lineare Wasserstoffbrückenbindungen zwischen CO und NH-Gruppen der Hauptkette stabilisiert. Die gesamte Struktur besitzt ein stäbchenförmiges Aussehen, wobei die Aminosäureseitenketten nach außen ragen. Für eine Helix- Windung werden 3,6 Aminosäuren benötigt. In β-faltblattstrukturen werden Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den CO- und NH-Gruppen verschiedener Ketten (hier antiparallel verlaufend) gebildet. Die Seitenketten der Aminosäure stehen jeweils ober- und unterhalb der Ebene des Faltblattes.

16 8 2. Protein-de-novo-Synthese & } Abbildung 2.2: Das Design von de novo Proteinen basiert auf dem Organisationsprinzip zur Klassifizierung natürlicher Proteinstrukturen. Danach setzen sich dreidimensionale Proteinstrukturen aus Sekundärstrukturelementen (α-helices, β-faltblattstrukturen) zusammen, die über kurze Peptidketten (Loops oder Turns) miteinander verbunden sind. Hierzu ist exemplarisch das Strukturmotiv eines Zinkfingerproteins gezeigt, das zwei β-faltblätter und eine α-helix enthält. Anhand statistischer und experimenteller Untersuchungen an Proteinen und Polypeptiden wurdendie Aminosäuren nach ihrer Tendenz, bestimmte Sekundärstrukturelemente auszubilden, geordnet. Dazu wurde zum einen die relative Häufigkeit des Auftretens bestimmter Aminosäuren in Sekundärstrukturelementen als Kriterium herangezogen [36] oder der Einluß einzelner Aminosäuren auf die Sekundärstrukturausbildung durch ihren gezielten Austausch in Polypeptiden nach dem Wirt-Gast-Prinzip untersucht [37]. Zur Konstruktion α-helicaler Peptidbausteine verwendet man daher beispielsweise sehr häufig die Aminosäuren Alanin, Leucin und Lysin [9,38]. Die Wechselwirkungen zwischen den Seitenketten verschiedener Aminosäuren können die Faltung eines Polypeptides entscheidend beeinflußen. Neben Wasserstoffbrückenbindungen und elektrostatischen Wechselwirkungen der Aminosäureseitenketten [39] spielen dabei insbesondere die hydrophoben Wechselwirkungen eine große Rolle. So findet man in natürlichen Proteinen häufig eine definierte Reihenfolge von hydrophoben und hydrophilen Aminosäuren, die in etwa der Periodizität des jeweiligen Sekundärstrukturelementes entspricht (3,6 für α-helices, 2,0 2,3 für β-faltblätter) [40]. Anhand künstlicher Polypeptide, die ausschließlich Leucin und Lysin enthalten, konnte gezeigt werden, daß die Reihenfolge der Plazierung der hydrophoben Aminosäure Leucin gegenüber dem hydrophilen Lysin, die Ausbildung verschiedener Sekundärstrukturelemente dirigieren kann [41]. Zur Konstruktion von kompakten, helicalen Strukturen hat sich das Prinzip einer definierte Abfolge an hydrophoben und hydrophilen Aminosäuren bereits bestens bewährt (binary-code Strategie) [42]. Auf diesem Wege konnten verschiedene amphiphile

17 2.1 Syntheseprinzip 9 α-helices erhalten werden. Amphiphile Sekundärstrukturelemente besitzen eine starke Neigung zur Selbstassoziation. Dies kann zur Anordnung der einzelnen Peptidbausteine in eine übergeordnete dreidimensionale Struktur ausgenutzt werden. Beispielsweise bilden amphiphile α-helices in Wasser bevorzugt tetramere Strukturen [42, 43]. Die treibende Kraft der Zusammenlagerung der einzelnen Helices liegt in der Ausbildung eines hydrophoben Innenraums (siehe Abbildung 2.3 und 2.4). Zur Konstruktion eines Vier-Helix-Bündels können die einzelnen helicalen Peptidblöcke über Loops oder Disulfidbrücken miteinander verbunden werden. Neben de novo synthetisierten Proteinen, die sich auf diese Verknüpfungsmethoden natürlicher Proteine beschränken, können in der Protein-de-novo-Synthese auch weitere Methoden der organischen Chemie zur Quervernetzung von Polypeptidbausteinen herangezogen werden. Von Mutter et al. [29,44] wurde ein Designkonzept eingeführt, in dem die Anordnung der einzelnen Peptidblöcke durch ihre Fixierung auf einem Trägermolekül (Templat) dirigiert wird. Diese Templat-assoziierten synthetischen Proteine (TASP) haben eine nicht-natürliche Konnektivität der Polypeptidketten und sind somit nur durch chemische Synthese zugänglich. Als Templat können Polypeptide [29,44,45] oder beliebige andere Moleküle [46,47] mit geeigneter räumlicher Anordnungfunktioneller chemischer Gruppen zur Verankerung der Polypeptidblöcke dienen. Das Templat legt durch die kovalente Fixierung der Peptidblöcke die Topologie der gesamten Faltungseinheit fest. Demgegenüber wird in dem alternativen Designkonzept, das auf der Selbstassoziation und linearen Verknüpfung der einzelnen Peptidblöcke beruht, die Topologie des Vier-Helix-Bündels ausschließlich durch die Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Helices bestimmt. Dabei spielen insbesondere Packungseffekte, hydrophile und hydrophobe Bereiche amphiphiler Helices Abbildung 2.3: Aufsicht auf ein Vier-Helix-Bündel. Amphiphile Helices ordnen sich in Wasser bevorzugt in tetrameren Strukturen an, wobei sich die hydrophoben Bereiche zusammenlagern und sich die hydrophilen Seiten nach Außen kehren.

18 10 2. Protein-de-novo-Synthese S S Abbildung 2.4: Amphiphile Helices neigen zur Selbstassoziation und bilden in Wasser bevorzugt tetramere Strukturen aus, die sich hervorragend zur Konstruktion von künstlichen Vier-Helix-Bündeln eignen. Links gezeigt ist ein Designkonzept, in welchem die helicalen Peptidblöcke analog zu natürlichen Proteinen über Loops oder Disulfidbrücken miteinander verbunden werden. Rechts ist ein Templat-assoziiertes synthetisches Protein mit einer quervernetzten Struktur gezeigt, in welchem die einzelnen Helices auf einem Trägermolekül (Templat) fixiert werden. d. h. die geometrische Anordnung der Seitenketten von Aminosäuren im hydrophoben Innenraum der Vier-Helix-Bündel, eine große Rolle [48, 49]. Von Vier-Helix-Bündeln, in denen die Seitenketten der Aminosäuren eine definierte Konformation einnehmen, konnten die Strukturen mittels NMR-Spektroskopie aufgeklärt werden [10, 50]. Andere Vier-Helix-Bündel liegen dagegen als molten globules vor, deren Seitenketten im hydrophoben Kern schlecht gepackt sind und mehrere Konformationen annehmen können. In diesem Fall findet man im Unterschied zu einem nativen Faltungszustand von Proteinen in den NMR-Spektren sehr breite Linien und einen langsamen Austausch der Amidprotonen [51]. Die unterschiedliche NMR-Charakteristik von molten globules und definierten Strukturen, die nativen Faltungszuständen entsprechen, kann als Kriterium zur Bewertung des Design von de novo synthetisierten Proteinen herangezogen werden. Neben dem Strukturmotiv des Vier-Helix-Bündels [9, 29, 38, 43, 45 53] konnten inzwischen auch Strukturen, die β-faltblätter enthalten in de novo synthetisierten Proteinen realisiert werden [54]. Dazu gehört auch das Zinkfingermotiv [8, 55, 56], das aus einer α-helix, die sich über eine Ebene aus zwei β-faltblattstrukturen beugt, besteht (siehe auch Abbildung 2.2 für eine vereinfachte schematische Darstellung). Wie der Name bereits zeigt, können Metallionen (Zn 2+ ) eingelagert werden. Zur Einbindung von Kofaktoren wurde jedoch auch das Strukturmotiv des Vier-Helix-Bündels erfolgreich eingesetzt.

19 2.2 Einbau von Kofaktoren Einbau von Kofaktoren Der Einbau des Kofaktors Hämin in künstliche Vier-Helix-Bündel durch die Arbeitsgruppen von Dutton und DeGrado [11, 12] stellt einen bedeutenden Beitrag in der Protein-de-novo-Synthese dar. Diese Systeme eröffneten die Möglichkeit, künstliche Enzymmodelle für Elektronentransfer oder Katalyse herzustellen. Das Designkonzept der Vier-Helix-Bündel beruht auf der Selbstassoziation helicaler Polypeptidbausteine. Der Kofaktor Hämin wurde über die axiale Koordination mit zwei Histidinresten in den Innenraum des Vier-Helix-Bündels eingebunden. Diese Koordination findet man auch häufig in natürlichen Proteinen, wie beispielsweise Cytochrom b 5 (siehe Abbildung 2.5) [57, 58]. Entsprechend ihrer Zielsetzung werden diese Systeme als maquettes bezeichnet. Der Begriff maquette steht im Englischen für Miniaturmodelle in der Architektur oder Kunst (Skulpturen). Im Französischen ist dieser Begriff noch allgemeiner gefaßt und schließt den Modellbau (z. B. Flugzeuge) mit ein. In den maquettes sollen die Eigenschaften, die für die Funktion natürlicher Proteine essentiell sind, in einfachen und kompakten Strukturen erfaßt werden. Die spektroskopischen und elektrochemischen Eigenschaften der maquettes sind dem Verhalten natürlicher Hämproteine ähnlich [53]. So zeigt die Hämgruppe eine starke Affinität zur Bindung im de novo synthetisierten Protein. Außerdem wurden die de novo synthetisierten Hämproteine als Modellsysteme eingesetzt, um den Einfluß protonierbarer Aminosäuren auf das Redoxpotential des Kofaktors zu untersuchen [59]. Neben Hämin [11,12,59,62,63] wurden auch andere Kofaktoren, wie Flavine [64] und einzelne Metallionen [65, 66] in künstliche Vier-Helix-Bündel eingebaut. Anhand von de novo synthetisierten Proteinen, deren Design sich an der Struktur des Ferredoxins orientiert, wurden die Bedingungen, die zum Aufbau von Eisenschwefelclustern notwendig sind, untersucht [67 69]. In diesen Ferredoxin- maquettes bilden sich [4Fe-4S] 2+/+ -Cluster, deren spektroskopische und elektrochemischen Eigenschaften bakteriellen Ferredoxinen ähneln [70]. Der Kofaktor kann bei der Protein-de-novo-Synthese auch als strukturbildendes Element eingesetzt werden. Beispielsweise wurde ein Porphyrinsystem (Coproporphyrin I) kovalent an die helicalen Bausteinen eines Vier-Helix-Bündels gebunden. In Analogie zu photosynthetischen Reaktionszentren bilden sich Porphyrin-Dimere, welche die Struktur des Vier-Helix-Bündels zusätzlich stabilisieren [28, 71]. Des weiteren konnten durch die kovalente Anknüpfung von Por-

20 12 2. Protein-de-novo-Synthese N N Fe N N COOH HOOC Abbildung 2.5: Der Kofaktor Hämin besteht aus einem Tetrapyrrolring (Protoporphyrin IX) mit einem Fe 3+ -Ion als Zentralmetallion. Im reduzierten Zustand (Fe 2+ -Ion) bezeichnet man das Metalloporphyrin auch als Häm. Ober- und unterhalb der Ebene des Porphyrinringes können zwei Moleküle als axiale Liganden an das Zentralmetallion binden. In Proteinen dienen dazu häufig Histidin (wie rechts am Beispiel eines Strukturausschnittes von Cytochrom b 5 gezeigt [58]) oder Methionin. Das Fe 3+ -Ion im Zentrum ist hier symbolisch als kleine Kugel gezeichnet. Der effektive Ionenradius des Fe 3+ beträgt 0,55 Åbei 6-facher Koordination im low-spin Zustand [60]. Damit paßt es gut in die Ringebene des Porphyrins [61].

21 2.2 Einbau von Kofaktoren 13 phyrinringen auch Systeme erhalten werden, in welchen ein Metalloporphyrin (mit Fe 3+,Co 3+ oder Zn 2+ als Zentralmetallion) von einer oder zwei Helices bedeckt wird [72 76]. Diese relativ einfachen Sandwich -Verbindungen werden auch als Mimichrome bezeichnet. Die Komplexbildung von Metallionen mit Bipyridin, das kovalent an helicale Polypeptidketten fixiert werden kann, wurde ausgenutzt, um Strukturen zu erzeugen, die sich aus drei α-helices zusammensetzen [77 79]. Verwendet man als Metallion Ru 2+, so entsteht bei der Zusammenlagerung der Drei-Helix-Bündel ein photoaktiver Ruthenium(II)-tris-Bipyridin-Komplex, der sich hervorragend zur Untersuchung von lichtinduziertem Elektronentransfer eignet [80]. Der Aufbau dieser Systeme entspricht dem Designkonzept Templat-assoziierter synthetischer Proteine, wobei der Kofaktor selbst als Templat dient. Damit werden Strukturbildung und Funktion direkt miteinander verbunden. Der Nachteil dieser Methode ist, daß die Eigenschaften des Kofaktors nur noch bedingt durch die Polypeptidumgebung beeinflußbar sind, da sich dieser als Templat meist außerhalb der Proteinumgebung befindet. In der Arbeitsgruppe Haehnel wurde das Designkonzept Templat-assoziierter synthetischer Proteine dagegen mit dem Einbau von Kofaktoren in den Innenraum von Vier-Helix-Bündeln kombiniert [81]. Als Templat dient ein zyklisches Dekapeptid. Neben Hämin, das über zwei axiale Histidinliganden koordiniert wird [13, 82], wurden auch Chlorophyllderivate (Zink(II)- methylpheophorbide) über die kovalente Anknüpfung der Seitengruppen in den Innenraum von Vier-Helix-Bündeln eingeführt [81]. Eines der de novo synthetisierten Hämproteine wurde an eine Goldoberfläche gekoppelt, wodurch ein elektrischer Kontakt zwischen der Metalloberfläche und dem redoxaktiven de novo Protein entsteht [22]. Mit diesen Systemen werden bioelektronische Anwendungen ermöglicht [23]. Außerdem konnte durch die Fixierung eines Ruthenium(II)-trisbipyridin-komplexes an die Außenseite eines de novo synthetisierten Hämproteins ein Modellsystem zur Untersuchung von lichtinduziertem Elektronentransfer erhalten werden [83]. Aufgrund der modularen Synthesestrategie, nach der das System schrittweise aus einzelnen helicalen Bausteinen auf dem Templat zusammengesetzt wird, wurde in der Arbeitsgruppe Haehnel die Bezeichnung MOP für modulares Protein eingeführt. Während de novo synthetisierte Proteine bisher meist als Einzelstücke synthetisiert wurden, wurde mit Hilfe eines kombinatorischer Ansatzes eine neue Größenordnung in der Herstellung und Variation von modularen Proteinen erreicht [84]. Dieser Ansatz kombiniert die

22 14 2. Protein-de-novo-Synthese Spot-Synthese 2 mit dem Designkonzept Templat-assoziierter synthetischer Proteine unter Verwendung verschiedenster Peptidbausteine. Dabei ist die Festphasensynthese von 462 Vier-Helix- Bündel-Proteinen auf Zellulosemembranen gelungen, die hinsichtlich der Bindungsaffinität und des Redoxpotentials der Hämgruppe auf dem festen Zelluloseträger untersucht wurden. Dieser Ansatz ist somit hervorragend zur Optimierung von Kofaktorbindungsstellen und der Faltung der Polypeptidstrukturen, sowie zum Einstellen bestimmter funktioneller Eigenschaften in de novo synthetisierten Proteinen geeignet. In der hier vorliegenden Arbeit werden de novo synthetisierte Hämproteine, die in der Arbeitsgruppe Haehnel hergestellt wurden, mittels EPR- und ENDOR-Spektroskopie charakterisiert (Kapitel 6). Ziel dieser magnetischen Resonanzuntersuchungen ist eine möglichst detaillierte Beschreibung der Einbausituation der redoxaktiven Kofaktoren. Des weiteren werden anhand selbst synthetisierter Polypeptidmodule grundlegende Untersuchungen zur Einbindung von Metalloporphyrinen in Vier-Helix-Bündeln durchgeführt (Kapitel 5). Im Unterschied zu den de novo synthetisierten Hämproteinen aus Kapitel 6 beschränken sich diese Systeme auf eine Kofaktor- Bindungsstelle, was die gezielte Untersuchung spezifischer Kofaktor-Protein-Wechselwirkungen erleichtert. Zur Unterscheidung werden diese Polypeptidmodule daher mit mmop1 und mmop2 bezeichnet, wobei das kleine m für mono steht. Durch die Einführung verschiedener Metalloporphyrine (mit den Zentralmetallionen Fe 2+/3+,Co 2+/3+,Zn 2+ ) soll anhand dieser Polypeptidmodule die funktionelle Vielfalt de novo synthetisierter Proteine erweitert werden. 2 Bei der Spot-Synthese werden kleine definierte Flüssigkeitstropfen auf Zellulosemembranen verteilt. Die Flüssigkeitstropfen enthalten chemische Reagentien mit mehreren funktionellen Gruppen, die zum einen zur Verankerung auf der porösen Membran dienen, und zum anderen zur weiteren Durchführung der gewünschten Reaktionen geeignet sein müssen.

23 Kapitel 3 Theoretische Grundlagen Dieses Kapitel gibt eine kurze Einführung in die EPR- (Electron Paramagnetic Resonance) und die ENDOR- (Electron Nuclear Double Resonance) Spektroskopie. Die EPR-Spektroskopie wird auch häufig als ESR-Spektroskopie für Electron Spin Resonance bezeichnet. Da beide magnetischen Resonanztechniken voraussetzen, daß mindestens ein ungepaarter Elektronenspin vorliegt, werden sie zur Charakterisierung von freien Radikalen, intermediären radikalischen Reaktionsstufen oder paramagnetischen Metallionen und Komplexen solcher Metallionen eingesetzt. Die theoretischen Grundlagen der EPR- und ENDOR-Spektroskopie sind in zahlreichen Lehrbüchern und Monographien [85 91] ausführlich beschrieben. In den folgenden Abschnitten wird kurz auf die Meßprinzipien und die molekularen Wechselwirkungen, die der EPR- und ENDOR-Spektroskopie zugrunde liegen, eingegangen. Ein wichtiger Schwerpunkt der hier vorliegender Arbeit liegt in der Untersuchung von de novo synthetisierten Hämproteinen hinsichtlich der Koordination des Fe 3+ -Zentralmetallions. Daher wird in Abschnitt 3.4 die geometrische und elektronische Struktur von Häminkomplexen und deren Charakterisierung mittels magnetischer Resonanzspektroskopie dargestellt. 3.1 EPR-Spektroskopie Das Meßprinzip der EPR-Spektroskopie beruht auf der Ausrichtung von ungepaarten Elektronenspins in einem statischen Magnetfeld B 0. Die Energie eines magnetischen Momentes in einem 15

24 16 3. Theoretische Grundlagen statischen Magnetfeld B 0 ergibt sich in der klassischen Elektrodynamik zu [94] E = µ e B 0. (3.1) Mit einem ungepaarten Elektronenspin S ist ein magnetisches Moment verbunden ˆµ e = gβ e Ŝ, (3.2) wobei β e das Bohrsche Magneton und Ŝ der Vektoroperator des Elektronenspins ist. Der sogenannte g-wert gibt die Proportionalitätskonstante zwischen ˆµ e und β e Ŝ an. Für ein freies Elektron ist g = g e = 2,0023. Analog zu Gleichung (3.1) wird für die Elektron-Zeeman- Wechselwirkung des Elektronenspins in einem äußeren Magnetfeld der Hamilton-Operator H = ˆµ e B 0 = gβ e ŜB 0 (3.3) formuliert. Für einen freien ungepaarten Elektronenspin mit Spinquantenzahl S = 1/2 gibt es zwei mögliche Orientierungen in einem statischen Magnetfeld, die durch die magnetischen Quantenzahlen m s =+1/2 ( parallele Ausrichtung) und m s = 1/2 ( antiparallele Ausrichtung) Energie m s = +1/2 n + h ν = g β eb 0 n - m s = -1/2 n+ n- = exp(- g B /kt) β e 0 Magnetfeld Abbildung 3.1: Elektron-Zeeman-Aufspaltung eines ungepaarten Elektronenspins S=1/2 in einem statischen Magnetfeld B 0. Nach der Boltzmann-Verteilung besteht zwischen den beiden Energieniveaus m s = ±1/2 ein Besetzungsunterschied (n + <n ), so daß bei Einstrahlung elektromagnetischer Strahlung der Frequenz ν = gβ e B 0 /h eine Netto-Absorption erfolgt. Voraussetzung dafür ist, daß durch Relaxationsprozesse der Besetzungsunterschied auch während der Einstrahlung der elektromagnetischen Strahlung aufrecht erhalten werden kann, da sonst eine Sättigung des EPR-Signals eintritt [87].

25 3.1 EPR-Spektroskopie 17 charakterisiert werden. Die energetische Aufspaltung E = E + E, die auch als Elektron- Zeeman-Aufspaltung bezeichnet wird, beträgt für diese beiden Niveaus E = gβ e B 0. (3.4) In einem EPR-Experiment werden durch Einstrahlung von elektromagnetischen Wellen Übergänge zwischen den beiden Spinniveaus induziert, wenn die Resonanzbedingung hν = E = gβ e B 0 (3.5) erfüllt ist (siehe Abbildung 3.1). Bei einem statischen Magnetfeld von 350 mt und g = g e liegt die Resonanzfrequenz bei ν 9.5 GHz und damit im X-Band (Wellenlänge λ 3cm)des Mikrowellenbereiches. Die experimentellen Beobachtungen werden in der EPR-Spektroskopie häufig in dem Formalismus des Spin-Hamilton-Operators wiedergeben. Der Spin-Hamilton-Operator faßt alle molekularen Wechselwirkungen zusammen, die zu dem magnetischen Resonanzspektrum beitragen und wird so formuliert, daß er nur auf den Spinanteil der elektronischen Grundzustandswellenfunktionen wirkt. Die einzelnen Terme des Spin-Hamilton-Operators werden nun kurz vorgestellt. Elektron-Zeeman-Wechselwirkung Bei der EPR-spektroskopischen Charakterisierung von Übergangsmetallkomplexen findet man deutliche Abweichungen von dem g e -Wert des freien Elektrons. Zusätzlich beobachtet man, daß die Elektron-Zeeman-Aufspaltung von der Orientierung des molekularen Achsensystems im magnetischen Feld abhängt. Dies ist darin begründet, daß auch das Bahnmoment L eines Elektrons ein magnetisches Moment besitzt (ˆµ L = β e ˆL), dessen Beitrag zur effektiven Elektron-Zeeman- Aufspaltung in den Übergangsmetallkomplexen von der Spin-Bahn-Kopplung (λˆlŝ) und der energetischen Aufspaltung der d-orbitale abhängt [87, 88]. Im Spin-Hamilton-Operator lautet der Term für die Elektron-Zeeman-Wechselwirkung H EZ = β e B 0 gŝ. (3.6) Dabei ist Ŝ der Vektoroperator des effektiven Spins. In Analogie zu dem Zwei-Niveau-System aus Abbildung 3.1 wird dem effektiven Spin häufig der Wert S=1/2 zugewiesen. Dies muß jedoch nicht der Spinquantenzahl der eigentlichen Wellenfunktion des elektronischen Grundzustandes

26 18 3. Theoretische Grundlagen entsprechen (siehe z. B. Abschnitt 3.4.2). Die Einflüsse von Spin- und Bahnmoment auf die EPR-Spektren werden in der (3 3) Matrix g zusammengefaßt, welche traditionell als g-tensor bezeichnet wird [85,87]. Der g-tensor ist kennzeichnend für die Symmetrie und die elektronische Struktur eines Übergangsmetallkomplexes. In Abschnitt wird anhand von low-spin Fe 3+ - Komplexen der Zusammenhang zwischen den g-tensorhauptwerten und der Wellenfunktion des elektronischen Grundzustandes näher erläutert. Dabei wird insbesondere gezeigt, wie aus den g-tensorhauptwerten Informationen über die axiale Ligandierung des Hämins erhalten werden kann. Nullfeldaufspaltung Die Wechselwirkung mehrerer ungepaarter Elektronenspins führt auch in Abwesenheit eines äußeren Magnetfeldes bereits zu einer Aufspaltungen der Energieniveaus des elektronischen Grundzustandes. Daher spricht man auch von einer Nullfeldaufspaltung. Der entsprechende Term im Spin-Hamilton-Operator ist H ZFS = ŜDŜ (3.7) mit dem sogenannten Nullfeldtensor D. DerTermH ZFS wird auch häufig in Form der Nullfeldparameter D und E ausgedrückt H ZFS = D (Ŝ2 z 1/3 Ŝ2) + E (Ŝ2 y Ŝ2 x ). (3.8) In organischen Molekülen, beispielsweise in photochemisch angeregten Triplettzuständen, wird die Nullfeldaufspaltung in erster Linie durch die dipolare Wechselwirkung der ungepaarten Elektronenspins bestimmt. Damit können die Nullfeldparameter D und E zur Charakterisierung der Elektronenspinverteilung in der Triplettwellenfunktion herangezogen werden (siehe Abschnitt 5.5.2). In Übergangsmetallkomplexen führt die Elektron-Elektron-Wechselwirkung im Zusammenspiel mit der Spin-Bahn-Kopplung zu Aufspaltungen der Energieniveaus des elektronischen Grundzustandes. In Abschnitt wird der Einfluß der Nullfeldaufspaltung auf die EPR- Spektren von high-spin Fe 3+ -Komplexen diskutiert. Hyperfeinwechselwirkung Die Wechselwirkung von Elektronen- und Kernspins bezeichnet man als Hyperfeinwechselwirkung. Voraussetzung ist, daß ein Kernspin mit I 0 und damit ein magnetisches Moment für

27 3.1 EPR-Spektroskopie 19 den Kern vorliegt µ N = g N β N I, (3.9) mit dem Kern-Magneton β N und dem g-faktor g N des entsprechenden Kerns. Im Vergleich zum magnetischen Moment des Elektronenspins (siehe Gleichung (3.2)) ist das Vorzeichen positiv und der Betrag des magnetischen Momentes des Kernspins wesentlich kleiner. Für ein Proton beträgt das Verhältnis g N β N /g e β e beispielsweise 1 / 658. Für die Wechselwirkung der magnetischen Momente des Elektronen- und Kernspins gilt [92] H = 8π 3 ˆµ e ˆµ Nδ(ˆr)+ 1 [ ] (ˆµ r 3 ˆµ e ˆµ N 3 eˆr)(ˆµ Nˆr) r 2. (3.10) Dabei ist ˆr der Ortsoperator des Verbindungsvektors zwischen den beiden magnetischen Momenten. Im ersten Term von Gleichung (3.10) wird die Elektronenspindichte direkt am Kernort ausgewertet. Dies setzt voraus, daß der elektronische Grundzustand s-orbitalcharakter vorweist. Für den Eigenwert des ersten Terms aus Gleichung (3.10) folgt [92] E = 8π 3 ψ(0) 2 < ˆµ e ˆµ N > (3.11) mit der Aufenthaltswahrscheinlichkeit ψ(0) 2 des ungepaarten Elektronenspins am Kernort (r = 0). Diese sogenannte Fermi-Kontakt-Wechselwirkung ist isotrop und liefert Informationen über die Spindichteverteilung in einem paramagnetischen Molekül. Aus dem zweiten Term von Gleichung (3.10) können Informationen über die Abstände von Elektronen- und Kernspin gewonnen werden. In einem äußeren Magnetfeld orientieren sich die magnetischen Momente von Elektronen- und Kernspin parallel zur Feldrichtung unter der Voraussetzung eines isotropen g-tensors für die Elektron-Zeeman-Wechselwirkung [93]. Wenn der Kern weit genug vom paramagnetischen Zentrum entfernt ist, um als lokalisierter Punktdipol behandelt zu werden, folgt ein einfacher Ausdruck für die Energie der Hyperfeinwechselwirkung [94] E = µ ( ) eµ N r 3 3 cos 2 γ 1. (3.12) Dabei ist γ derwinkel zwischen demäußeren Magnetfeld unddemverbindungsvektor r zwischen Elektronen- und Kernspin (siehe Abbildung 3.2.) Term Im Formalismus des Spin-Hamilton-Operators wird die Hyperfeinwechselwirkung durch den H HFC = ŜAÎ (3.13)

28 20 3. Theoretische Grundlagen B 0 γ µ e r µ N Abbildung 3.2: Links: Ineinemäußeren Magnetfeld B 0 richten sich die magnetische Momente von Elektronenspin µ e und Kernspin µ N parallel zur Feldrichtung aus. Die Voraussetzung hierfür ist ein isotroper g-wert für die Elektron-Zeeman-Wechselwirkung. Das äußere Feld B 0 und der Verbindungsvektor r zwischen µ e und µ N schließen den Winkel γ ein. beschrieben. Dabei ist Î der Vektoroperator des Kernspins. Der Hyperfeintensor A kann formal in einen isotropen Anteil a iso und einen spurfreien anisotropen Anteil A zerlegt werden H HFC = a iso ŜÎ + ŜA Î. (3.14) Die isotrope Kopplungskonstante a iso beschreibt dabei entprechend Gleichung (3.10) die Fermi- Kontakt-Wechselwirkung und ist proportional zur ungepaarten Elektronenspindichte am Kernort. Der Tensor A faßt die Hyperfeinwechselwirkungen zusammen, bei denen der Elektronenspin nicht am Kernort lokalisiert ist. Für den einfachen Fall aus Gleichung (3.12) ist A axial. Die Hauptwerte dieses Tensors, der in Abbildung 3.3 zur Veranschaulichung graphisch dargestellt ist, sind in Frequenzeinheiten und a = β eg e β N g N hr 3 (3.15) a = 2a. (3.16) Für eine beliebige molekulare Orientierung zum äußeren Magnetfeld ergibt sich für den Wert der dipolaren Hyperfeinwechselwirkung a = a ( ) 3 cos 2 γ 1. (3.17)

29 3.1 EPR-Spektroskopie 21 B 0 a a N a r M n+ Abbildung 3.3: Lage der Hauptachsen a und a des axialen Hyperfeintensors A für eine beliebige molekulare Orientierung im äußeren Magnetfeld. In der Punktdipolnäherung ist der Elektronenspin am Zentralmetall M n+ und der Kernspin am Kern N lokalisiert. Die Hauptachse a verläuft parallel zum Verbindungsvektor zwischen dem Kern und dem Zentralmetall. Kern-Zeeman-Wechselwirkung Die Formulierung des Kern-Zeeman-Terms erfolgt analog zur Elektron-Zeeman-Wechselwirkung H NZ = β N g N B 0 Î. (3.18) Der g-faktor des Kernspins g N wird im folgenden jedoch immer als isotrope Konstante angesehen. Wenn Effekte höherer Ordnung berücksichtigt werden und damit auch für den Kernspin ein g-tensor formuliert wird, spricht man von einer Pseudo-Kern-Zeeman-Wechselwirkung. Diese wird dann eingeführt, wenn der Einfluß einer anisotropen Elektron-Zeeman-Wechselwirkung, die sich über die Hyperfeinwechselwirkung auf die Quantisierungsrichtung des Kernspins auswirken kann, berücksichtigt werden soll [90, 95]. Kern-Quadrupol-Wechselwirkung Die Kern-Quadrupol-Wechselwirkung tritt nur bei Kernen mit I 1 auf. Dabei handelt es sich nicht um eine magnetische Wechselwirkung, vielmehr führt hier der elektrische Feldgradient am Ort des Kernes zu einer Wechselwirkung mit dem elektrischen Quadrupolmoment des Kerns. Der entsprechende Term im Spin-Hamilton-Operator lautet H Q = ÎQÎ. (3.19)