DFG Großgeräteinitiative

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1 Berichte der geförderten Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler zur DFG Großgeräteinitiative Hochleistungs-Massenspektrometer in den Biowissenschaften

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3 2 Im Jahr 1999 hatte der Apparateausschuss der DFG in einer Großgeräteinitiative biowissenschaftliche Arbeitsgruppen in Deutschland aufgerufen, moderne Hochleistungs-Massenspektrometer - darunter insbesondere die Fourier-Transform- und Time-of-Flight-Hybrid-Geräte mit Ionenquellen (ICP, ESI, MALDI) - zu beantragen. In diesem Rahmen wurden in den Jahren 1999 und 2000 mehr als 30 erfolgreichen Antragstellerinnen und Antragstellern aus verschiedenen Bereichen der Biowissenschaften und Analytischen Chemie entsprechende Geräte bereitgestellt. Die Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler wurden im Herbst 2003 zu einem Symposium eingeladen, um über ihre Projekte und insbesondere ihre Erfahrungen mit den entsprechenden Geräten und deren Einsatzmöglichkeiten in den speziellen Forschungsgebieten zu berichten. Diese Berichte finden sich nun in dem vorliegenden Tagungsband als Kurzfassungen der Vorträge wieder. Zu dem Symposium wurden auch Gutachter und Berichterstatter der Großgeräteinitiative eingeladen, die im Anschluss an die Kurzfassungen ihren Abschlussbericht vorlegen. Seiten 4 60: Berichte zu den geförderten Projekten: Be 482/1-1: De novo Sequenzierung von Peptiden mit einem Q-TOF Massenspektrometer, K. Beyreuther, C. Clayton, D. Görlich, R. Herrmann, G. Multhaup, M. Stitt, Biomolekulare Chemie, ZMBH, Heidelberg Bu 617/13-1: Nutzung des LC-MS/MS-Spektrometers QStar des SFB 388 an der Universität Freiburg, Fakler, B. et al., Physiologisches Institut II, Universität Freiburg Ei 272/9-1: Innovative Isotopenanalyse von geochemischen und klimatologischen Archiven mittels MC-ICPMS, Eisenhauer, A., GEOMAR, Forschungszentrum für Marine Geowissenschaften, Kiel Ei 304/1-1: Sequenzierung integraler Membranproteine aus 2D-Nativer/SDS-PAGE, Eichacker, L.A., Department für Biologie I, Universität München Fi 253/16-1: Massenspektrometrische Detektion der posttranslationalen C(alpha)-Formylglycin-Bildung in Sulfatasen, Thomas Dierks, Bernhard Schmidt, Jianhe Peng, Kurt von Figura, Abteilung Biochemie II, Universität Göttingen Ge 386/3-1: Strukturanalyse von Glykokonjugaten und anderen Biomolekülen durch ESI-MS, Rudolf Geyer, Biochemisches Institut, Justus-Liebig-Universität Gießen He 1383/9-1: Überblick über die MS-Analytik mit dem Q-STAR XL an der Heinrich-Heine Universität Düsseldorf, Sabine Metzger, Johannes H. Hegemann, Biologisch Medizinisches Forschungszentrum (BMFZ) Institut für Mikrobiologie, Heinrich-Heine Universität Düsseldorf He 1887/6-3: Kurzbericht über die mit dem Tandem-Hybrid-Massenspektrometer QSTAR erarbeiteten Ergebnisse, Michael Hecker, Dörte Becher, et al., Institut für Mikrobiologie, Universität Greifswald Ho 1311/3-1: N-dimensionale Proteomanalyse mit Parallelchromatographie und offline-identifikation und Quantifizierung mittels Mikroplattentechnik, Kreusch, S., Hoppe, H., Bublitz, R., Rhode, H., Moore, T., Cumme, G. A., Ditze, G., Schulze, M. und A. Horn, Klinikum der FSU Jena, Institut für Biochemie I, Cybio AG, Jena, Klinikum der FSU Jena, Werkstatt der MTI, Jena Ho 2222/2-1: Analyse des humanen Tau-Proteins, Ralf Hoffmann, Biotechnologisch-Biomedizinisches Zentrum, Fakultät für Chemie und Mineralogie, Universität Leipzig Ka 783/3-1: FTe or not FTe MS das ist hier die Frage, Karas, M., Bahr, U. et al., Institut für Pharmazeutische Chemie, JW Goethe-Universität Frankfurt Le 597/3-1: Proteinidentifizierung und Identifizierung von Phosphorylierungen mit MALDI-TOF MS, Pfannstiel, J. et

4 3 al., Biochemisches Zentrum, Universität Heidelberg Li 309/19-1: Erste Erfahrungen mit dem LTQ-FT MS: Die hochauflösende Ionenfalle, Sebastian Beck, Timo Hagemeister, Michael W. Linscheid, Institut für Chemie, Humboldt Universität zu Berlin Li 448/1-1: Analyse von Glycokonjugaten mittels FT-ICR MS: Beiträge zur Struktur Wirkungsbeziehung bakterieller Zellwandkomponenten, Buko Lindner, LG Biophysik, Forschungszentrum Borstel Me 765/8-1: Einsatz des FTICR am Medical Proteom-Center Bochum, Helmut E. Meyer, Moritz Bernd, André van Hall, et al., Medical Proteom-Center, Ruhr-Universität Bochum Mo 479/4-1: Proteomanalysen zur Charakterisierung zellulärer Funktionen pflanzlicher Trichome, Amme, Steffen; Schlesier, Bernhard; Rutten, Twan; Melzer, Michael; Mock, Hans-Peter, Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung, Gatersleben Ne 427/10-1: Hochleistungs-Massenspektrometrie in der Analytik von pharmazeutischen Wirkstoffen und Biomolekülen, Klaus Raith und Reinhard H.H. Neubert, Institut für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie, Martin Luther Universität Halle-Wittenberg No 113/11-1: Das QTOF II im Zentrum für Biochemie der Universität zu Köln, Stefan Müller, Angelika A. Noegel, Mats Paulsson, Zentrum für Biochemie, Medizinische Fakultät, Universität zu Köln No 120/11-1: Proteomanalyse für Mikrobiologie, Tumorbiologie und Molekulargenetik: Tübinger Perspektive, A. Nordheim, Interfakultäres Institut für Zellbiologie, Eberhard-Karls-Universität Tübingen Pe 415/14-1: Biomedizinische Analytik mit 9.4T FT-ICR Massenspektrometrie, Jasna Peter-Kataliniæ, Institut für Medizinische Physik und Biophysik, Universität Münster Pr 175/4-1/5-1: Hochauflösende FT-ICR-Massenspektrometrie in der Biopolymer-Strukturanalytik: Analytische Entwicklung, neue biochemische und medizinische Anwendungen, Michael Przybylski, Fachbereich Chemie, Laboratorium für Analytische Chemie, Universität Konstanz Re 837/7-1: Moos Proteomik, Eric Sarnighausen, Dimitri Heintz, Stefan A. Rensing, Ralf Reski, Pflanzenbiotechnologie, Universität Freiburg Ri 192/22-1: Untersuchung von Protein-Komplexen in Neuronen durch Affinitätsreinigung und massenspektrometrische Identifizierung, Friedrich Buck, Hans-Jürgen Kreienkamp, Stefan Schumacher und Dietmar Richter, Institut für Zellbiochemie und Klinische Neurobiologie, Universitäts-Klinikum Hamburg-Eppendorf Sa 257/20-1: Proteingebundene Lipide beim Aufbau der Wasserbarriere der Haut, Barbara Pierstorff, Ingo Damm, Heike Hupfer und Konrad Sandhoff, Kekulé-Institut für Organische Chemie und Biochemie, Universität Bonn Sche 235/11-1: MALDI-TOF-MS-gestützte Analyse von an der Ausprägung pflanzlicher Stressantworten und Sekundärstoffwechselprozesse beteiligten Peptiden und Proteinen, Dierk Scheel, Stephan Clemens, et al., Institut für Pflanzenbiochemie, Halle/Saale Schi 416/1-1: Der Einsatz eines Q-TOF II Massenspektrometers am Fachbereich Biochemie der Martin-Luther- Universität Halle-Wittenberg, Angelika Schierhorn, FB Biochemie/Biotechnologie, Martin-Luther-Universität Halle- Wittenberg Schn 254/11-1: FT/ICR-MS als Werkzeug zur Untersuchung der Bildungsmechanismen und der Bindungsverhältnisse von metalloiden Clustern, Katharina Weiß, Ralf Burgert und Hansgeorg Schnöckel, Institut für Anorganische Chemie, Universität Karlsruhe (TH) Schn 317/6-9: The Smaller the Better 25µ-Columns for Protein and Peptide Analysis, Andreas Schlosser, Jens Schneider-Mergener, Institut für Medizinische Immunologie, Charité, Universitätsmedizin Berlin Schr 305/2-1: Antimikrobielle Peptide und Proteine der menschlichen Haut, Jens-Michael Schröder, Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie, Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Kiel und SFB 617 Schw 221/15-1: Entwicklung eines SIFT/GIB-Massenspektrometers für die Grundlagenforschung, Detlef Schröder und Helmut Schwarz, Institut für Chemie Technische Universität Berlin Se 263/17-1: Massenspektrometrische Analytik der Eicosanoide und ihrer Pharmakomodulatoren in der Pädiatrie, Bernhard Watzer, Hannsjörg W. Seyberth, Horst Schweer, Rolf Nüsing, Andreas Leonhardt, Günter Klaus, Medizinisches Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin, Philipps-Universität Marburg Se 435/7-1: ESI FT-ICR Massenspektrometrie für die Analyse von molekularen Erkennungsmechanismen in regulatorischen Membranproteinen, Ernst Conzelmann, Walter Sebald, et al., Physiologische Chemie II, Würzburg Sp 314/3-1: FT-ICR-Massenspektrometrie in der bioanalytischen Methodenentwicklung, Bernhard Spengler, Dieter Kirsch, Werner Bouschen, Institut für Anorganische und Analytische Chemie, Justus-Liebig-Universität Gießen We 888/15-1: Vom Proteinkomplex zur Aminosäure: LC-MS/MS in den Pflanzenwissenschaften, Elmar W. Weiler, Markus Piotrowski, Fakultät für Biologie, Ruhr-Universität Bochum Seiten 61 63: Stellungnahme der eingeladenen Gutachter

5 4 Be 482/1-1 De novo Sequenzierung von Peptiden mit einem Q-TOF Massenspektrometer K. Beyreuther, C. Clayton, D. Görlich, R. Herrmann, G. Multhaup, M. Stitt Biomolekulare Chemie - ZMBH - Heidelberg Die DFG stellte den Antragstellern am Zentrum für Molekulare Biologie, Universität Heidelberg (ZMBH) ein Elektrospray-Quadrupol-Time of Flight Hybrid Massenspektrometer (ESI-QTOF-MS: QSTAR) zur Verfügung. Gleichzeitig wurde dem Biochemiezentrum der Universität Heidelberg ein Flugzeitmassenspektrometer (MALDI-TOF MS) zur Verfügung gestellt. Den Forschungsgruppen am ZMBH und am Biochemiezentrum standen somit zwei komplementäre Hochleistungs-Massenspektrometer zur Verfügung, die zur Beantwortung der wissenschaftlichen Fragestellungen alternativ verwendet werden konnten: Das MALDI- TOF MS ermöglicht die schnelle und sehr sensitive Proteinidentifizierung anhand des peptide mass fingerprints (PMF). Im Gegensatz dazu sind die Untersuchungen an einem ESI-QTOF MS relativ zeitaufwendig. Der Informationsgehalt solcher Messungen ist jedoch wesentlich höher, da exakte Informationen zur Aminosäuresequenz von Peptiden und deren Modifikationen erhalten werden. Das ESI-QTOF-MS wurde in der Zentraleinheit Biomolekulare Chemie am ZMBH im Herbst 2000 installiert. Da bereits Erfahrung in der Identifizierung von Proteinen und Peptiden vorhanden war, konnte dieses Massenspektrometer rasch für Routineuntersuchungen eingesetzt werden. In der Regel werden Proteine charakterisiert, die mittels 1-D oder 2-D Gelelektrophorese aufgetrennt wurden. In solchen Fällen wird zunächst ein proteolytischer Verdau mittels Trypsin im Gel durchgeführt und die generierten Peptide aus dem Gel extrahiert. Diese werden anschließend alternativ mittels Festphasenextraktion entsalzt und nach statischer nanoelektrospay Ionisation (nanoesi) massenspektrometrisch analysiert oder nach nanohplc-trennung und dynamischer nanoesi untersucht. Anhand eines Modellproteins (Glutamatdehydrogenase) wurde gezeigt, daß weniger als 10 fmol für die statische nanoesi-methode und 25 fmol für die dynamische nanoesi-methode ausreichend waren zur eindeutigen Identifizierung des Proteins. Der Zeitaufwand für die Interpretation der Daten ist in der Regel wesentlich höher als die Zeitdauer der Datenaufnahme. Das ESI QTOF MS ist trotzdem voll ausgelastet, da es von mittlerweilen ca. 10 Personen aus 4 verschiedenen Forschungsgruppen zur Lösung unterschiedlichster Fragestellungen eingesetzt wird (De novo Sequenzierung zur Identifizierung unbekannter Proteine, posttranslationale Proteinprozessierung, Proteinphosphorylierung, Proteinkonformation, Analyse der Lipidzusammensetzung von Zellmembranen). Exemplarisch soll hier auf ein Forschungsprojekt eingegangen werden, das die Leistungsfähigkeit dieses ESI-QTOF MS zeigen: Antonio Estevez aus der Forschungsgruppe C. Clayton untersuchte die Zusammensetzung des Exosome-Komplexes in Trypanosoma brucei. Nach Affinitätsreinigung und Auftrennung im SDS-Polyacrylamidgel konnten die meisten Untereinheiten mittels MALDI-TOF MS rasch identifiziert werden, wobei auffiel, daß die Sequenzhomologie zu homologen Untereinheiten aus z.b. Hefe sehr gering war. Eine weitere, nur schwach mittels kolloidalem Coomassie anfärbbare Bande kam als Kandidat für eine weitere Untereinheit in Frage. Die mittels MALDI-TOF MS erhaltenen PMF-Daten führten zu keinen Ergebnis bei der Datenbanksuche. Daher wurde diese Probe mit der nanoesi-qtof-ms Technik weiter analysiert. Obwohl diese Technik weniger sensitiv ist, wird sie zur Identifizierung von Proteinen in der Regel erfolgreicher eingesetzt aufgrund des hohen Informationsgehaltes der Fragmentierungsspektren, anhand derer die Peptide sequenziert werden können. Die hohe Massengenauigkeit des ESI-QTOF MS ermöglicht die Unterscheidung aller Aminosäuren bis auf die isobaren Aminosäuren Leucin und Isoleucin. So konnten drei längere Peptide dieses Proteins sequenziert werden (VVCAVHHPQQLLDEYR,..LALEGVVEQAVVLEK und TALDLVTAALK). Mit Hilfe degenerierter Oligonukleotide war es schließlich möglich, die c- DNA und damit die komplette Sequenz des entsprechenden Proteins von Trypanosoma

6 5 brucei zu erhalten. Voraussetzung für den Erfolg war, daß die über massenspektrometrische Sequenzierung ermittelten Aminosäuresequenzen fehlerlos waren. Wie diese Beispiele zeigen ist das QSTAR ein ausgezeichnetes Gerät bezüglich Empfindlichkeit und Auflösung. Insbesondere für die de novo Sequenzierung von Peptiden ist es sehr geeignet. Der Einsatz lohnt sich jedoch wegen des hohen Zeitaufwands nur für spezielle Projekte. Bedingt ist der hohe Zeitaufwand nur zum Teil durch die nanoesi-technik selbst. Datenauswertung und Interpretation mittels der zu wenig ausgereiften Software erfordern einen zusätzlichen Zeitaufwand. Weiterhin sind die Betriebskosten erheblich. Das QSTAR ist somit eher ein Gerät für die Forschung. Für die rasche Routineanalytik ist es meines Erachtens zu aufwendig zu betreiben. Gerade daher war es außerordentlich wichtig, auf das MALDI-TOF MS am BZH zurückgreifen zu können.

7 6 Fakler, B. et al. Physiologisches Institut II Universität Freiburg Bu 617/13-1 Nutzung des LC-MS/MS-Spektrometers QStar des SFB 388 an der Universität Freiburg Die grundsätzliche Thematik des SFB 388 ('Zelluläre Funktionen dynamischer Proteinwechselwirkungen') liegt in der Identifizierung und funktionellen Charakterisierung von Multiproteinkomplexen sowie den ihnen zugrundeliegenden Protein-Protein Wechselwirkungen. Die fundamentale Bedeutung des o.g. Massenspektrometers für diese proteomanalytischen Arbeiten soll nachfolgend kurz anhand der Untersuchungen 'Ionenkanalassoziierter Multiproteinkomplexe' (Projektleiter Prof. Dr. B. Fakler) skizziert werden. Nach neuesten Erkenntnissen sind diese integralen Membranproteine in größere Signalkomplexe integriert, die über Proteinwechselwirkungen die Funktion der Kanäle steuern und verantwortlich sind für deren perfekte Anpassung an die physiologischen Erfordernisse verschiedener Zellentypen. Nach Isolierung aus nativen Membranen zentraler Neuronen konnten wir mittels LCgekoppelter Nanospray-MS/MS-Spektroskopie die Zusammensetzung der Multiproteinkomplexe Ca 2+ -aktivierter Kaliumkanäle des SK-typs sowie spannungsgesteuerter Kv1.1 Kanäle ermitteln. Die Menge an Protein, die für diese MS-Analysen zur Verfügung steht, liegt dabei typischerweise im Bereich von ng. Die Ergebnisse zeigten, dass die porenbildenden SK -Untereinheiten über ihre zytoplasmatischen Domänen mit dem Ca 2+ -Bindungsprotein Calmodulin, der Proteinkinase CK2 (regulatorische und katalytische Untereinheit), der Proteinphosphatase PP2A (regulatorische und katalytische Untereinheit), zytoskelettalen Proteinen (Aktin, Internexin, Tubulin und ) sowie zwei Isoformen der Proteine verbunden sind. Calmodulin, CK2 und PP2A bilden dabei die 'Gating'- Maschinerie, die den Kanal auf einen Anstieg des intrazellulären Kalziumspiegels hin öffnet. Die Ca 2+ -Sensitivität dieser Gating-Maschinerie wird durch Phosphorylierung/Dephosphorylierung des Calmodulin am Threoninrest 80 via CK2 und PP2A reguliert, wodurch Amplitude und Zeitverlauf der SK-getragenen Nachhyperpolarisation zentraler Neuronen effektiv kontrolliert und an die zellspezifischen Erfordernisse angepasst werden können. Als Komponenten der molekularen Mikrodomäne von Kv1.1 Kanälen wurden neben weiteren a- Untereinheiten der Kv1 Familie, 3 verschiedene b-untereinheiten, synaptische Proteine, Adapterproteine (PSD95, Caspr), sowie neue Proteine mit bislang unbekannter Funktion identifiziert. Ähnlich den SK-Kanälen kontrollieren die genannten Proteine die subzelluläre Lokalisation, die Prozessierung sowie die Gating- Maschinerie der Kv1.1 Kanäle. Weitere Projekte des SFB, für die die Massenspektroskopie von fundamentaler Bedeutung ist, sind die Analyse und Charakterisierung: - der Protein-Importkomplexe in der mitochondrialen Aussen- und Innenmembrane (Projektleiter Prof. Dr. N. Pfanner, Drs. Meisinger, Rehling, Truscott) - der Rop GTPasen gekoppelten Signalkaskaden in Arabidopsis thaliana (Projektleiter Prof. Dr. K. Palme) - des ZWILLE Proteinkomplexes aus Arabidopsis (Projektleiter Prof. Dr. T. Laux) - des FtsZ-Protein-assoziierten Proteinkomplexes des Mooses Physcomitrella (Projektleiter Prof. Dr. R. Reski), sowie - der Multiprotein-Signalkaskade des B-Zell Antigenrezeptors (Prof. Dr. M. Reth).

8 7 Ei 272/9-1 Innovative Isotopenanalyse von geochemischen und klimatologischen Archiven mittels MC-ICP-MS Eisenhauer, A. GEOMAR Forschungszentrum für Marine Geowissenschaften, Kiel Das Ziel des Vorhabens Ei272/9-1 (MEIKE) war es, unter Anwendung eines neuartigen Massenspektrometers (MC-ICP-MS = Multi-Collector-Ionization-Coupled-Plasma-Massspectrometer) lange und exakt datierte Zeitreihen (U/Th, Th/Ra) simultan gemessener Proxie-Daten (Ba/Ca, Cd/Ca, Mg/Ca, Mn/Ca, Pb/Ca, Sr/Ca, U/Ca, 11 B, 44 Ca/ 40 Ca, 230 Th/ 234 U, 226 Ra/ 230 Th, 207 Pb/ 206 Pb, etc.) in marin-geochemischen Archiven zu erstellen, diese zu vergleichen und zu modellieren. Mit diesem neuen Multi-Proxie -Ansatz soll die marin-geochemische/klimatologische Variabilität mit Perioden im Bereich von Dekaden bzw. von Jahrhunderten untersucht werden. Das Projekt war in verschiedene Phasen unterteilt, wobei die 1. Phase mit dem Aufbau und erfolgreichen Inbetriebnahme des MC-ICPMS erfolgreich abgeschlossen werden konnte. In der 2. Phase soll die Maschine dazu verwendet Zeitreihen von klimarelevanten Proxies zu gewinnen. Während der 1. Phase ist es uns insbesondere gelungen, die Messung von 44 Ca/ 40 Ca Isotopenverhältnissen zu etablieren und die Bestimmung der U/Th-Isotope um einen Faktor 100 gegenüber den herkömmlichen TIMS (Thermal Ionisation Mass-Spectrometry) Messungen zu verbessern. Unsere Gruppe ist somit weltweit die erste, welche in der Lage ist, 44 Ca/ 40 Ca Verhältnisse an einer MC-ICPMS mittels der sogenannten cool plasma - Technik präzise zu bestimmen. Der Messung von 44 Ca/ 40 Ca Verhältnissen wird in naher Zukunft eine große Bedeutung zukommen, da es sich in verschiedenen Arbeiten gezeigt hat, dass es ein robustes Proxie für die Rekonstruktion von vergangenen Temperaturschwankungen der Meeresoberflächentemperatur ist. 1. Bestellung, Aufstellung und Inbetriebnahme der MC-ICPMS Die Chronologie des Projektes ist in der Tabelle zusammengefasst. Die Maschine wurde am vorbehaltlich abgenommen, da die wichtigsten der geforderten Spezifikationen erreicht wurden. Projekt Chronologie Datum Vorgang Bewilligung des Projektes (MEIKE) zur Anschaffung einer MC-ICPMS durch die DFG (Ei272/9). Beginn umfangreicher Umbaumaßnahmen in den Laboren. Installation eines Argon Tanks auf dem GEOMAR Gelände zur kontinuierlichen Argon Versorgung des anzuschaffenden Gerätes. Europaweite Ausschreibung für eine MC-ICPMS entsprechend unseren Anforderungen. Drei Firmen beteiligten sich an der Ausschreibung. Nach Erhalt des Leistungsheftes gaben jedoch nur zwei Firmen ein Angebot ab Erteilung des Auftrages zur Lieferung einer MC-ICPMS (AXIOM) bis Werksabnahme des Gerätes Lieferung der AXIOM MC-ICPMS bis Installations-, Kalibrations- und Optimierungsarbeiten an der AXIOM Vorbehaltliche Abnahme der AXIOM Spezifikationen

9 8 Abb. 1 Abb. 2 Die Abb. 1 und 2 zeigen das AXIOM MC-ICPMS Gerät von zwei Seiten. In Abb. 1 ist im Vordergrund der sogenannte Aridus Zerstäuber im Laminar Flow Gehäuse zu erkennen. Abb. 2 zeigt zeigt im Hintergrund den Laminar-Flow welcher einen kontaminationsfreies Einleiten der Lösungen in die Ionenquelle ermöglicht. 2. Die Messung von 44 Ca/ 40 Ca Isotopenverhältnissen an der MC-ICPMS (AXIOM) Die für die Messung der Ca-Isotope verwendete Methode beruht auf der sogenannten Cool- Plasma-Technik. Bei dieser Methode wird die Energie für die Erzeugung eines Plasmas von üblicherweise ca Watt auf ca. 400 Watt reduziert. Durch diese drastische Reduktion der eingesetzten Energie wird die Bildungsrate von 40 Ar + -Ionen um mehrere Größenordnungen reduziert, da die mittels Hochfrequenzgenerator eingestrahlte Energie für eine Stoßionisation der Ar-Atome zu gering ist. Dies bedeutet, dass der Isobareneffekt von 40 Ar + und 40 Ca +, der die simultane Messung der Intensitäten von 40 Ar + und 40 Ca + Ionen normalerweise behindert, fast vollständig ausgeblendet werden kann. Das unter hotplasma -Bedingungen vorliegende 40 Ar + / 40 Ca + -Verhältnis wird von ca. 0.1 auf ca unter cool-plasma Bedingungen reduziert. Die nun erstmalig mögliche Messung von 44 Ca/ 40 Ca- Isotopenverhältnissen an einer MC-ICPMS hat gegenüber der herkömmlichen TIMS-Technik deutliche Vorteile, da man auf die Verwendung eines 43 Ca/ 48 Ca-Doppelspikes verzichten kann. Für die Messung der 44 Ca/ 40 Ca Verhältnisse an der MC-ICPMS wird das sogenannte bracketing-standard -Verfahren verwendet, indem die gemessene Probe auf einen gewählten Standard normalisiert wird. Für Karbonatproben verwenden wir den allgemein üblichen SRM915a Standard. Neben dem Ar können jedoch noch weitere Isobareneffekte mit Molekül-Ionen wie MgO +, NaOH + (mit 40 Ca) und MgOH 2 + (mit 44 Ca) auftreten. Diese Isobareneffekte können umgangen werden, indem die Peak -Intensität nicht in der Mitte sondern um ca amu (atomic mass unit) zur Niederenergie-Seite versetzt gemessen wird (siehe Abb. 2b in Manuskript Nr. 2 der Anlagen). Weitere Isobareneffekte mit doppelt geladenen 88 Sr 2+ -Ionen können durch die Messung der Ionenintensität bei 43.5 amu, was die doppelt geladene 87 Sr 2+ -Ionen rerpräsentiert, korrigiert werden. Erste Messung von Standardmaterialien ergeben hinsichtlich der Richtigkeit der Werte und der Reproduzierbarkeit der Messungen mit TIMS vergleichbare Messwerte. Deutliche Abweichungen zwischen der herkömmlichen TIMS Technik und der neuen, für die MC- ICPMS entwickelten Technik ergaben sich bei einigen kalzitischen Proben. Die Ursache hier lag bei unterschiedlichen Säurenormalitäten der für die Normalisierung verwendeten Standards. Für die zukünftige Messung von Ca-Isotopenverhältnissen muss daher darauf geachtet werden, dass die Säurenormalität der Proben als auch der Standards einheitlich sind. 3. Zusammenfassung hinsichtlich der Arbeiten zur Verbesserung der Nachweisgrenzen für U-, Th und Ra-Isotope Die neue Messtechnik für die Bestimmung von U- und Th-Isotopen an einer MC-ICP-MS beinhaltet die Zugabe eines U- bzw. Th-Spikes bekannter Zusammensetzung. Das

10 9 230 Th/ 229 Th und 230 Th/ 229 Th wird dann unter der simultanen Benutzung der Faraday-Cups und der Multiplier gemessen, wobei das 234 U/ 235 U die Multiplier/Cup Eichung widerspiegelt und das 235 U/ 238 U Verhältnis, gemessen auf den Faraday Cups, dazu dient, die Massendiskriminierung des MC-ICP-MS festzustellen. Unsere ersten Messungen zeigen, dass mit der neuen MC-ICPMS eine um den Faktor 100 gesteigerte Präzision gegenüber den herkömmlichen TIMS-Massenspektrometern erreicht werden kann. Dies bedeutet, dass entweder die U/Th Alter sehr viel genauer statistisch erfasst werden können, oder dass die für die U/Th-Datierungen notwendige Probenmenge um einen Faktor 100, bei gleich bleibender Präzision, verringert werden kann. Diese neuen technischen Optionen eröffnen wiederum neue Möglichkeiten, die Dynamik klimatischer, geochemischer und geologischer Prozesse mit einer bisher unerreichten Hochauflösung zu erfassen. Erste Anwendungen dieser neuen Methode soll der zeitlich hochauflösenden Erfassung von klimatischen und geochemischen Proxies in corallinen Spongien aus der Karibik und schnellwachsenden Mn/Fe-Krusten aus der Ostsee gelten. Beide Archive eignen sich hervorragend für die Rekonstruktion des klimatischen Geschehens während der Kleinen Eiszeit. Letztere ist von besonderem Interesse, da sie die letzte klimatische Phase war, welche wahrscheinlich nicht anthropogen beeinflusst gewesen ist.

11 10 Ei 304/1-1 Sequenzierung integraler Membranproteine aus 2D-Nativer/SDS-PAGE Eichacker, L.A. Department für Biologie I, Universität München Die Identifikation von integralen Membranproteinen gelingt nur mit sehr geringen Ausbeuten nach 2D-IEF/SDS-PAGE. Es wurde deshalb die Methode der Blau-Nativen/SDS-PAGE (Schägger and Jagow (1991) Anal. Biochem. 199, ) als eine alternative 2D-PAGE Trenntechnik weiterentwickelt. Wir zeigen, dass Untereinheiten von Membranproteinen mit einem Gravy index > 0.5 in diesem System mit hoher Auflösung und Ausbeute getrennt werden können. Die Sequenzierung interner Peptid-Sequenzen mit einem Q-TOF ESI- Massenspektrometer zeigt, dass Membranproteine gegenwärtig mittels der Proteinbereiche identifiziert werden, die außerhalb der Transmembranregionen liegen. Die mittels 2D-PAGE aufgetrennten und identifizierten Protein-Untereinheiten erlauben es, den Assemblierungszustand von Membranprotein-Komplexen zu bestimmen. Vergleiche der Protein-Muster von solubilisierten Thylakoidmembranen aus Wildtyp und Mutante zeigen, dass mit der 2D-Native/SDS-PAGE eine herausragende Trenntechnik vorliegt, die in Verbindung mit Massenspektrometrie zur Kartierung von funktionellen Proteinkomplexen herangezogen werden kann. Die Technik wird entsprechend als Werkzeug für funktionelle Proteomics von Membranproteinen diskutiert.

12 11 Fi 253/16-1 Massenspektrometrische Detektion der posttranslationalen C(alpha)-Formylglycin-Bildung in Sulfatasen Thomas Dierks, Bernhard Schmidt, Jianhe Peng und Kurt von Figura Abteilung Biochemie II Universität Göttingen Sulfatasen tragen in ihrer aktiven Tasche eine einzigartige, für die enzymatische Funktion essentielle Aminosäure, C(alpha)-Formylglycin (FGly), die posttranslational aus einem Cystein (Eu- und Prokaryoten) oder einem Serin (Prokaryoten) generiert wird. FGly als Aldehyd-haltige Aminosäure wurde mittels Massenspektrometrie tryptischer Sulfatase- Peptide identifiziert, wobei die Verwendung Glycerol- oder p-nitroanilin-haltiger Matrices zu Aldol-Kondensation bzw. zur Bildung Schiff'scher Basen führte (1). Kürzlich haben wir eine MALDI-TOFMS Methode ausgearbeitet, bei der die Verwendung von Dinitrophenylhydrazin als Matrix zu einer effizienten FGly-Dinitrophenylhydrazon-Bildung führt. Die Hydrazon- Derivate desorbieren und ionisieren mit hoher Effizienz und lassen sich in einem tryptischen Verdau im sub-femtomol-bereich nachweisen. Die Anwesenheit von FGly lässt sich durch ein Masseninkrement von u sowie durch ein charakteristisches zyklisches Fragment- Ion in MALDI-PSD-Spektren erkennen, das indikativ für Sulfatasen ist, auch wenn die Sequenz der Sulfatase noch unbekannt ist (2, 3). Diese Methode wurde außerdem genutzt, um einen qualitativen in vitro Assay für die FGly-Bildung durch zelluläre Extrakte zu entwickeln, wobei als Substrate GST-Fusionsproteine mit einem C-terminalen, die FGly- Bildung determinierenden Sequenzmotiv verwendet wurden (4). Für die Quantifizierung der FGly-Bildung nach in vitro Modifizierung synthetischer Peptide wurde alpha-cyano-4-hydroxyzimtsäure als Matrix verwendet, was zu vergleichbarer Desorption/Ionisation von Substrat- und Produktpeptid führte. Dies ermöglichte es uns, die Kinetik und Enzymologie des FGly-bildenden Enzyms (FGE) zu untersuchen und schließlich FGE aus Rinderhoden zu reinigen. Seine molekulare Identifizierung gelang durch fingerprint- Analyse der tryptischen Peptide, wobei die Sequenz zweier zwischen Rind und Mensch konservierter Peptide durch MALDI-PSD und durch MS/MS Analyse mittels nano-esi Ionenfallen-Massenspektrometrie bestätigt wurde (5). Der verwendete in vitro Assay wird gegenwärtig zu einer Routine-Methode weiterentwickelt, die unter Verwendung von Hautfibroblasten eine schnelle und zuverlässige Diagnose der Multiplen Sulfatasedefizienz ermöglicht, einer seltenen, aber fatalen Erbkrankheit, die durch die genetische Defizienz des FGE verursacht wird. Literatur 1. Schmidt, B., Selmer, T., Ingendoh, A. & von Figura, K. (1995) Cell 82, Peng, J., Schmidt, B., von Figura, K. & Dierks, T. (2003) J. Mass Spec. 38, Marquordt, C., Fang, Q., Will, E., Peng, J., von Figura, K. & Dierks, T. (2003) J. Biol. Chem. 278, Fang, Q., Peng, J., von Figura, K. & Dierks, T. (2003), submitted. 5. Dierks, T., Schmidt, B., Borissenko, L. V., Peng, J., Preusser, A., Mariappan, M. & von Figura, K. (2003) Cell 113,

13 12 Ge 386/3-1 Strukturanalyse von Glykokonjugaten und anderen Biomolekülen durch ESI-MS Rudolf Geyer, R. Biochemisches Institut Justus-Liebig-Universität Gießen Die bewilligte nano-lc-esi-ion Trap (IT)-MS-Anlage wurde vor allem zur Strukturanalyse der Kohlenhydrateinheiten von Glykoproteinen [1] und Glykolipiden [2-4] genutzt, wobei letztere zum Teil auch als intakte Glykokonjugate [4,5] eingesetzt wurden. Daneben diente das Gerät der Zuordnung einzelner Kohlenhydratketten zu distinkten N-Glykosylierungsstellen [6], der Lokalisierung von O-Glykanen sowie der Identifizierung anderweitig post-translational modifizierter Proteine (Manuskripte in Vorbereitung). Das Gerät wurde sowohl im "off-line nanospray-mode" als auch im "on-line mode" in Kombination mit der nano-lc-anlage betrieben. Im folgenden sollen drei Anwendungen beispielhaft vorgestellt werden: I. Strukturanalyse von Glykolipiden aus Parasiten Parasitische und freilebende Nematoden zeichnen sich dadurch aus, dass sie Glykolipide und Glykoproteine exprimieren, die Phosphorylcholin(PC)-Substituenten tragen. Derartige Moleküle sind insofern interessant, als gezeigt werden konnte, dass sie in der Lage sind, die Immunantwort des Wirtes zu modulieren. Sie scheinen damit eine wichtige Rolle für das Überleben des Parasiten im Wirt zu spielen. Um biologische Aktivitäten mit strukturellen Parametern korrelieren zu können, haben wir die in ihren Kohlenhydratanteilen PCsubstituierten Glykolipide des Schweinespulwurms Ascaris suum genauer untersucht. Nach enzymatischer Freisetzung der Kohlenhydratketten und Trennung durch zweidimensionale HPLC wurden die Glykane vor allem durch "off-line" nano-esi-it-ms n charakterisiert [2]. Dabei erwies sich insbesondere die Möglichkeit, multiple MS/MS-Experimente durchführen zu können, als unabdingbar, da nur so relevante Informationen über die Monosaccharid- Sequenz, das Verzweigungsmuster und die Substitutionsposition des PC-Restes zu ermitteln waren. Im Fall des Trematoden-Erregers Schistosoma mansoni konnten analoge Untersuchungen [3] zeigen, dass dieser Parasit im Ei-Stadium bevorzugt mehrfach fucosylierte Glykolipid- Spezies exprimiert, die sich in ihrer Struktur von den Glykolipid-Hauptkomponenten des Cercarien-Stadiums unterscheiden, was auf eine stadienspezifische Synthese dieser Glykokonjugate schließen läßt. Auch hier erwies sich die Möglichkeit, im "nanospray-mode" multiple MS/MS-Experimente durchführen zu können, als besonders wertvoll. Ausgehend von Glykolipiden des Leberegels Fasciola hepatica, der ebenfalls zu den Trematoden zählt, führten entsprechende Untersuchungen zur Identifizierung eines neuartigen Kohlenhydrat-Epitops, das im Endwirt zu einer gegen dieses Epitop gerichteten, spezifischen Immunantwort führt und daher für diagnostische Zwecke einsetzbar sein sollte [4]. In diesem Fall wurden die intakten Lipide bzw. Glykolipide im "off-line mode" durch nano- ESI-IT-MS n analysiert, was eine gleichzeitige Charakterisierung der jeweiligen Lipidanteile gestattete. Insgesamt konnte durch diese Studien der Kenntnisstand hinsichtlich des Glykoms dieser Parasiten maßgeblich erweitert werden. II. Lokalisierung O-glykosidisch gebundener Kohlenhydrate im M-Protein des humanen Hepatitis B Virus (HBV) In dieser Untersuchung sollte geprüft werden, inwieweit O-Glykosylierung ein generelles Charakteristikum des HBV M-Proteins darstellt. Dazu wurden drei verschiedene HBV- Genotypen, die sich in der Aminosäuresequenz ihrer M-Proteine partiell unterscheiden, vergleichend untersucht. Lag eine derartige Modifikation vor, so wurden die jeweiligen O- Glykane mittels Massenspektrometrie lokalisiert. Hierzu wurden zunächst die entsprechenden Glykopeptide isoliert und danach durch "on-line" nano-lc-esi-it-ms/ms untersucht. Das erhaltene Fragmentionenspektrum erlaubte dann eine eindeutige Identifizierung der O-Glykosylierungsposition. Darüber hinaus war eine nahezu vollständige

14 13 Abdeckung der Aminosäuresequenz durch die anfallenden Fragmentionen feststellbar. (Schmitt et al., Manuskript in Vorbereitung). III. Identifizierung post-translational modifizierter Proteine bei Caenorhabditis elegans Die Proteine des Modellnematoden C. elegans tragen zum Teil PC-Substituenten als posttranslationale Modifikationen. Frühere Untersuchungen hatten bereits gezeigt, dass Antigene mit solchen PC-Epitopen während der Embryogenese des Wurms offensichtlich nur von spezifischen Zellen exprimiert werden. Im Rahmen unserer Untersuchungen zur Identifizierung und Charakterisierung derartig modifizierter Proteine wurde ein solches im Überstand von C. elegans-kulturen nachgewiesen. Nach zweidimensionaler SDS-PAGE und in situ-verdau mit Trypsin konnte dieses Protein durch "on-line" nano-lc-esi-it-ms der tryptischen Peptide sowie durch MS/MS-Analyse eines ausgewählten Peptids als Aspartylprotease Asp-6 von C. elegans identifiziert werden (J. Grabitzki, Diplomarbeit, Universität Gießen, 2003; entsprechendes Manuskript in Vorbereitung). Auch in diesem Fall konnte anhand der detektierten Fragmentionen eine hohe Sequenzabdeckung erzielt werden. Die angeführten Beispiele belegen, dass die bewilligte nano-lc-esi-it-ms-anlage bereits erfolgreich für Fragestellungen auf dem Gebiet der Analytik von Glykokonjugaten und anderweitig post-translational modifizierten Proteinen eingesetzt werden konnte. Publikationen mit Daten, die mit dem bewilligten Gerät erhalten wurden: 1. Kurokawa, T., Wuhrer, M., Lochnit, G., Geyer, H., Markl, J. and Geyer, R. (2002). Hemocyanin from the keyhole limpet Megathura crenulata (KLH) carries a novel type of N-glycans with Gal(ß1-6)Manmotifs. Eur J Biochem. 269, Friedl, C.H., Lochnit, G., Zähringer, U., Bahr, U. and Geyer, R. (2003). Structural elucidation of zwitterionic carbohydrates derived from glycosphingolipids of the porcine parasitic nematode Ascaris suum., Biochem J. 369, Wuhrer, M., Kantelhardt, S.R., Dennis, R.D., Doenhoff, M.J., Lochnit, G. and Geyer, R. (2002). Characterization of glycosphingolipids from Schistosoma mansoni eggs carrying Fuc( 1-3)GalNAc-, GalNAc(ß1-4)[Fuc( 1-3)]GlcNAc- and Gal(ß1-4)[Fuc( 1-3)]GlcNAc- (Lewis X) terminal structures. Eur J Biochem. 269, Wuhrer, M., Grimm, C., Zähringer, U., Dennis, R.D., Berkefeld, C.M., Idris, M.A. and Geyer, R. (2003). A novel GlcNAc 1-HPO 3-6Gal(1-1)ceramide antigen and alkylated inositol-phosphoglycerolipids expressed by the liver fluke Fasciola hepatica. Glycobiology. 13, Houston, K.M., Lochnit, G., Geyer, R. and Harnett, W. (2002). Investigation of the nature of potential phosphorylcholine donors for filarial nematode glycoconjugates. Mol Biochem Parasitol. 123, Wuhrer, M., Geyer, H., von der Ohe, M., Gerardy-Schahn, R., Schachner, M. and Geyer, R. (2003). Localization of defined carbohydrate epitopes in bovine polysialylated NCAM. Biochimie. 85,

15 14 He 1383/9-1 Überblick über die MS-Analytik mit dem Q-STAR XL an der Heinrich-Heine Universität Düsseldorf Sabine Metzger, Johannes H. Hegemann Biologisch Medizinisches Forschungszentrum (BMFZ) Institut fuer Mikrobiologie Heinrich-Heine Universität Düsseldorf Das ESI-QqTOF steht seit April 2003 als Nachfolgegerät des 1999 bewilligten Gerätes im Analytischen Zentrallabor des Biologisch-Medizinischen Forschungszentrum (BMFZ) der Heinrich-Heine Universität Düsseldorf. Das QSTAR XL wird sowohl in der Forschung als auch in der Routineanalytik eingesetzt. Im Verlauf der vergangenen drei Jahren war es ein wesentlicher Bestandteil von Kooperationsprojekten innerhalb und außerhalb der Universität Düsseldorf. Im nachfolgenden wird ein kurzer Überblick über drei dieser Kooperationsprojekte gegeben. Analyse des myokardialen Proteom von Myoglobin Knockout-Mäusen (Kooperation mit Prof. Schrader und Dr. Laussman, Heinrich-Heine Universität) Myoglobin gehört zu den sauerstoffbindenden Häm-Proteinen. In Vertebraten ist es in den langsamen Muskelfasern wie z.b. dem Herzmuskel lokalisiert. Die Hauptaufgabe des Myoglobins ist das Speichern und Puffern von Sauerstoff, der Transport des Sauerstoffs innerhalb der Muskelzelle und das Einfangen von NO und anderen Radikalen. Berücksichtigt man diese zentrale Funktion des Myoglobins für den Muskel, so erstaunt es, dass Myoglobin Knockout-Mäuse keine nennenswerte Beeinträchtigung ihres Phänotyps zeigen. Histologische Untersuchungen des Herzmuskels zeigen allerdings, dass das Fehlen von Myoglobin durch eine Erhöhung der Kapillargefässdichte um 20-46% und einen verringerten Durchmesser der Herzmuskelzellen kompensiert wird. Durch eine vergleichende Untersuchung des myokardialen Proteoms von Myoglobin Knockout-Mäusen (myo-/-) und Wildtyp-Mäusen (WT) wurden Mechanismen aufgeklärt, die die Myoglobin Defizienz auf der Proteinebene kompensieren. Myokardiales Gewebe von Myoglobin defizienten (Mb-KO) Mäusen wurde einer differentiellen Proteomanalyse durch zweidimensionale Gelektrophorese unterzogen (n = 12 Mb-KO Mäuse versus n = 12 Wildtyp (WT)-Mäuse). Es wurden 450 +/- 25 Proteinspezies durch die 2D-PAGE erfaßt, hiervon zeigten insgesamt 21 Proteine signifikant unterschiedliche Expression (t-test: p<0.005). Diese Proteine wurden durch ESI-MS/MS Analysen identifiziert. 10 der 21 differentiell exprimierten Proteine sind im Fettsäurestoffwechsel involviert. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass bei Myoglobin- Mangel eine Umstellung der Substratutilisation von Fettsäuren zu Glucose stattfindet. Dies würde die Sauerstoffbilanz der Mb-KO Herzen günstig beeinflussen, da die Oxidation von Glucose weniger Sauerstoff pro Mol produziertes ATP benötigt als die Oxidation von Fettsäuren. Es gibt also auch auf der Proteinebene eine Reaktion der Myoglobin-Knockout- Maus auf die Myoglobin Defizienz. De novo Sequenzierung der IP 7 -Kinase aus Dictyostelium discoideum (Kooperation mit Prof. Vogel und Ch. Trautwein, Universität Wuppertal) Inositolphosphate spielen eine zentrale Rolle bei der intrazellulären Signalvermittlung. Vom myo-inositol abgeleitete Verbindungen sind beteiligt an fundamentalen zellulären Prozessen wie Zellmotilität, Endocytose, Chemotaxis sowie Zelldifferenzierung. Dictyostelium besitzt einen komplexen Inositolphosphatstoffwechsel, der in vielen Gesichtspunkten dem von Säugerzellen ähnelt, ist aber experimentell besser zugänglich. Neben Inositolphosphaten wurde von der Arbeitsgruppe Vogel in Dictyostelium zusätztlich die neue in Eukaryonten ubiquitäre Klasse von Diphosphoinositolphosphaten gefunden.

16 15 Dictyostelium discoideum bildet aus 6-Diphosphoinositol Pentakisphosphat (6-PP-InsP 5 ) unter Anwesenheit von ATP 5,6-Bisdiphosphoinositol Tetrakisphosphat (5,6-Bis-PP-InsP 4 ). Das dafür verantwortliche Enzym ist die Diphosphoinositol Pentakisphosphat Kinase (InsP 7 Kinase). Um neue Einsichten in mögliche physiologische Funktionen von höher phosphorylierten Inositolphosphaten zu erlangen, welche einmalig für Dictyostelium discoideum sind, ist es notwendig das codierende Gen zu identifizieren. Dafür wurde die IP7-Kinase aus Dictyostelium discoideum isoliert und mittels ESI-MS/MS sequenziert. Bei Beginn des Projektes lagen keine Proteinsequenzdaten von Dictyostelium discoideum vor, auch das Genom war nur zu ca. 30% sequenziert. Somit war eine de novo Sequenzierung erforderlich. Nach Isolierung des Enzyms und tryptischen In-Gel Verdau wurden 16 Peptide vollständig sequenziert. Davon konnten acht Peptide dem cdna-klon VFM264 zugeordnet werden mit einer Sequenzabdeckung von 32%. Sechs Peptide konnten dem hypothetischen Protein AAO50847 codiert von einem Gen, das auf Chromosom 2 lokalisiert ist, zugeordnet werden. Hier wird eine Sequenzabdeckung von 21% erreicht. Dieses Protein zeigt eine % ige Sequenzhomologie zu bekannten Polyphosphat Kinasen anderer Organismen. Allerdings codiert diese DNA ein wesentlich kleineres Protein mit einem niedrigerem isoelektrischen Punkt. Die Sequenz des anderen Proteins hingegen stimmt in Grösse und isoelektrieschem Punkt mit dem isolierten Protein gut überein, zeigt aber keine Sequenzhomologie zu bekannten in dem Inositolphosphatstoffwechsel involvierten Enzymen. Das Genomprojekt von Dictyostelium ist noch nicht beendet, so dass nicht ausgeschlossen werden kann, dass am Ende alle gefundenen Aminosäuresequenzen einem einzigen Protein zugeordnet werden können. Identifizierung des Proteoms von Hydrogenosomen aus Trichomonas vaginalis (Dr. Katrin Henze, Heinrich-Heine Universität) Viele eukaryotische Pathogene bestreiten ihre ATP-Synthese entweder während des gesamten Lebenszyklus oder während bestimmter Entwicklungsphasen gänzlich ohne Sauerstoff. Solche anaerobe Parasiten umfassen sowohl Protisten wie Trypanosoma brucei oder Trichomonas vaginalis (ein Infektionserreger im Urogenitaltrakt), aber auch vielzellige Parasiten wie Ascaris suum, Fasciola hepatica oder Schistosoma mansonii. Essentiell für die anaerobe ATP-Synthese bei den o.g. Parasiten sind die biochemischen Stoffwechselleistungen ihrer anaeroben Mitochondrien bzw. ihrer Hydrogenosomen - H 2 - produzierende Organellen der anaeroben ATP-Synthese bei amitochondrialen Eukaryoten. Die zurzeit verfügbaren Indizien sprechen eindeutig dafür, dass Mitochondrien und Hydrogenosomen aus ein und demselben, fakultativ anaeroben eubakteriellen Endosymbionten hervorgegangen sind. Demnach sollten die biochemischen Spuren dieser fakultativ anaeroben Lebensweise jeweils in den Mitochondrien bzw. Hydrogenosomen erhalten geblieben sein. Ziel des Projektes ist die Identifizierung des vollständigen Proteom isolierter Hydrogenosomen von Trichomonas vaginalis um die Stammesgeschichte und Biochemie dieser anaerob funktionierenden Organellen besser zu verstehen. Ein erstes interessantes Ergebnis ist die Identifizierung von Rubrerythrin, dass zum ersten Mal in aneroben Eukaryoten gefunden wurde. Die Funktion von Rubrerythrin ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Vermutet wird, dass es vor reaktivem Sauerstoff schütz. Es hätte somit eine ähnliche Funktion wie Katalasen. Die wiederum bis dato nicht in Amitochondriaten nachgewiesen wurden. Amitochondriaten bilden aber nachweislich reaktiven Sauerstoff.

17 16 He 1887/6-3 Kurzbericht über die mit dem Tandem-Hybrid-Massenspektrometer QSTAR erarbeiteten Ergebnisse Michael Hecker, Dörte Becher, et al. Institut für Mikrobiologie Universität Greifswald Das QSTAR wurde hauptsächlich in zwei Arbeitsfeldern eingesetzt: - der Identifizierung von Proteinen aus 2D-Gelen, die mit einem MALDI-TOF- Massenspektrometer gar nicht oder nur unsicher identifiziert werden können - der detaillierten Charakterisierung posttranslationaler Modifikationen. Beide Arbeitsfelder sind essentieller Bestandteil unseres Forschungsschwerpunktes der funktionellen oder physiologischen Proteomics, mit deren Hilfe wir zu neuen Erkenntnissen über die Bakterienphysiologie ganz allgemein gelangen möchten. Die Identifizierung von Proteinen mit einem MALDI-TOF stößt bei bestimmten Proteinen an objektive Grenzen, die durch die physikochemischen Eigenschaften ebendieser Proteine bedingt sind. Die wichtigste Gruppe stellen dabei die kleinen Proteine dar, die nach einem enzymatischen Verdau keine oder nur eine sehr geringe Anzahl von analysierbaren Peptiden ergeben, so dass eine sichere Identifizierung mittels eines einfachen Peptide Mass Fingerprints schwierig oder unmöglich ist. Mit dem QSTAR kann man in dieser Situation einzelne Peptide durch MS/MS-Experimente sequenzieren und damit eine sichere Identifizierung gewährleisten. Weiterhin ermöglichen die Kopplung mit einer Nano-HPLC und die vom MALDI verschiedene Art der Ionisierung die Vermessung von zusätzlichen Peptiden, die man mit dem MALDI-TOF nicht finden kann. Diese Arbeiten laufen sehr stabil und sind bereits als Routine zu bezeichnen. Die detaillierte Charakterisierung posttranslationaler Modifikationen ist wesentlich schwieriger. In jedem Falle ist die modifizierte Aminosäure mittels Sequenzierung exakt zu ermitteln. Da der experimentelle Ansatz der Nutzung von 2D-Gelen aber die Beobachtung von bisher völlig unbekannten posttranslationalen Modifikationen ermöglicht, sind auch Modifikationen zu ermitteln, bei denen die modifizierende funktionale Gruppe vorher nicht bekannt ist und demzufolge auch ihr chemischer Charakter erst zu ermitteln ist. Aufgrund der immensen physiologischen Bedeutung und der auf diesem Sektor technisch nahezu einzigartigen Stellung von Proteomics interessiert uns dies in besonderem Maße und ist uns bisher in folgenden Fällen gelungen: - bei der Sulfonylierung des Proteins Gap in Staphylococcus aureus - bei dern-terminalen Formylierung einer Anzahl von Proteinen in Bacillus subtilis - bei der Succinylierung des Proteins MetA in Escherichia coli Damit sind wir in der Lage komplexe Regulationsvorgänge der Zelle wesentlich besser zu verstehen bei: - der oxidativen Schädigung von Proteinen (Sulfonylierung) - der Neusynthese von Proteinen und ihrer Funktionalisierung (Formylierung und Deformylierung) - der direkten Analyse eines Enzym-Substrat-Komplexes (Succinylierung) Die Nutzung eines Tandem-Hybrid-Massenspektrometers ist bei derartigen Untersuchungen unverzichtbar. Andere Techniken sind nicht oder nur sehr beschränkt dafür geeignet.

18 17 Ho 1311/3-1 N-dimensionale Proteomanalyse mit Parallelchromatographie und offline-identifikation und Quantifizierung mittels Mikroplattentechnik Kreusch, S. *), Hoppe, H. *), Bublitz, R. *), Rhode, H. *), Moore, T. +), Cumme, G. A. *), Ditze, G. #), Schulze, M. *) und A. Horn *) *) Klinikum der FSU Jena, Institut für Biochemie I, Jena +) Cybio AG, Jena #) Klinikum der FSU Jena, Werkstatt der MTI, Jena Die zentrale Technik für die Proteomanalyse, die 2D-Elektrophorese, hat eine Reihe bekannter Nachteile, wie begrenzte Trennkapazität (Menge, isoelektrischer Punkte und Größe), Produktion von Modifikationsartefakten, Denaturierung der Proteine und Schwierigkeiten bei der Automatisierung. Um diese Nachteile zu überwinden haben wir ein mehrdimensionales Trenn-und Analyseverfahren für die Proteine des Proteoms entwickelt, welches die gut etablierte Mikroplattentechnologie mit ihren Umfeldtechniken nutzt und zu einem digitalisierten Abbild des Proteoms in flüssigen, leicht zugänglichen Proben in Mikroplatten führt (Abb.1). Die Großgeräteinitiative der DFG ermöglichte die Beschaffung eines API QSTAR Pulsar i für das Vorhaben. Der Nachweis der prinzipiellen Funktionsfähigkeit des Verfahrens wurde anhand einer zweidimensionalen Analyse eines normalen Serumproteoms geführt. Die erste Trennung erfolgte nach der Größe unter nicht denaturierenden Bedingungen mittels Gelchromatographie, gefolgt von Anionenaustauschchromatographie mit Hilfe eines Polychromatographiemoduls, der eine Parallelchromatographie mit im 8x12-Raster angeordneten Mikrosäulen erlaubt. Spezielle Module die in Kombination mit der Cybio-Liquid-Handling-Technik das effektive Trennen und Analysieren einer grosser Probenzahl erlaubt, sowie Software zum Hantieren großer Datenmengen aus der Massenspektrometrie wurden entwickelt und erprobt. Durch den Einsatz der Software wurde als bester diskriminierender Parameter für die Identifikation von Proteinen mit MALDI-MS nach tryptischem Verdau die Summe der Peakhöhen der Peptide für das relevante Protein (nach Filterung von Isopeptiden aus dem Proteinsuchraum) erhalten. Die Proteinbestimmung erfolgt mit großem dynamischen Bereich durch Absorbanzmessung bei 205, 215 und 280 Nanometern in Mikroplatten. Beispielproteine in niedrigen Konzentrationen wurden über Enzymaktivität und ELISA charakterisiert. Zur Charakterisierung von Lipoprotein-Interaktomen wurden niedermolekulare Marker (Triglyceride und Cholesterol) in Verbindung mit den zugehörigen Apolipoproteinen bestimmt. Mit Hilfe des von der DFG erhaltenen Gerätes wurden durch LC-ESI-MS-MS nach tryptischen Verdau Peptide gefunden mit denen 617 Proteinen nach stringenten Filterkriterien identifiziert wurden. Das Verfahren wird hinsichtlich Anzahl der Trennschritte, Trennschärfe und Erhöhung des Automatisierungsgrades weiter entwickelt. Erwähnt werden müssen neben den vorhandenen guten Eigenschaften (z.t. besser als in den Spezifikationen genannt), folgende Schwachpunkte des erhaltenen Gerätes. Es wurde mit einer vorläufigen Softwareversion geliefert, die unzuverlässig war. Updates und Einweisung ermöglichten ab September 02 die vorgesehene automatische LC-MS-MS- Analytik. Unzureichend war auch das mitgelieferte Manual und die zunächst abwesende Onlinehilfe. Die Fehlercodes sind oft auch für die Applikationschemikern der Firma kryptisch. Auffällig häufig musste innerhalb von zweieinhalb Jahren die sehr teuren Turbopumpen gewechselt werden. Wenn diese Schwachpunkte noch durch die Firma beseitigt werden, kann das Gerät im vollem Umfang den Erwartungen entsprechen.

19 18 THIRD DIMENSION DIMENSION: N Abb. 1: Schema mit dem Prinzip der Trennung in dem Verfahren. Die Proteine des Proteoms werden n verschiedenen Trennschritten unter standardisierten Bedingungen unterworfen, wobei jede der m 1 nach der Trennung anfallenden Fraktionen im nächsten Trennschritt m 2 Fraktionen liefert, so dass am Ende der Trennung m 1 *m 2 *...* m n Fraktionen vorliegen, die offline mit bekannten Quantifizierungsmethoden (Proteinbestimmung, ELISA, RIA, Aktivitätstests) und Identifikationsmethoden (MALDI, ESI) charakterisiert werden.

20 19 Ralf Hoffmann Biotechnologisch-Biomedizinisches Zentrum Fakultät für Chemie und Mineralogie Universität Leipzig Ho 2222/2-1 Analyse des humanen Tau-Proteins Der eigenständige und meist progressive Verlauf neurodegenerativer Erkrankungen ist in vielen Fällen durch pathologische, hochmolekulare Ablagerungen in den betroffenen Hirnarealen gekennzeichnet. Zentrale Fragestellung unserer Forschung ist die Aufklärung der chemischen und strukturellen Eigenschaften von Protein-Ablagerungen in den neurofibrillären Tangles (NFT) bei der Alzheimer-Krankheit. Die Hauptkomponente dieser NFT ist das Tau-Protein ( ), das entsprechend seinem Vorkommen in den paired helical filaments (PHF) als PHF- bezeichnet wird. Ziel der Arbeiten ist die Analyse der posttranslationalen Modifikationen des -Proteins und deren relative Quantifizierung. Neben PHF- untersuchen wir auch aus Kalbshirn als Modellsystem. Modifiziertes wurde nach unterschiedlichen Methoden (Gesamt-, twice-cycled ) aus Kalbshirn präpariert. Dabei wurden mittels SDS-PAGE und zweidimensionaler Gelelektrophorese (IEF/ SDS-PAGE) die einzelnen Fällungs- und Reinigungsschritte der Aufarbeitung bezüglich der enthaltenen -Varianten charakterisiert. Während Gesamt- sehr stark mit Fremdproteinen verunreinigt war, enthielt das mit Tubulin zweimal selektiv gefällte und danach wieder gelöste ( twice-cycled ) nur wenige weitere Proteine im 2D-Gel. Die - Muster beider Präparationen waren sehr ähnlich, so dass im Vergleich beider Präparationsmethoden offensichtlich keine -Varianten diskriminiert wurden. Zudem ähnelt das bovine Muster dem PHF- sehr stark, auch bezüglich der stark modifizierten Varianten. Interessant und wichtig für unsere Arbeiten ist die Tatsache, dass alle -Präparationen in der 2D- Gelelektrophorese in einzelne diskrete Spots getrennt wurden. Dies legt den Schluss nahe, dass den Varianten des PHF- mit unterschiedlichem Phosphorylierungsgrad in vivo eine Bedeutung zukommt und kein unspezifisches Phosphorylierungsmuster in den abgelagerten Filamenten vorliegt. Nach elektrophoretischer Charakterisierung wurde das von Prof. Dr. P. Davies (Einstein College, Bronx, U.S.A.) zur Verfügung gestellte PHF- enzymatisch (Trypsin, Arg-C Protease) gespalten und massenspektrometrisch analysiert. Dabei wurde sowohl eine statische nano ESI- als auch eine nano LC-ESI-Kopplung verwendet. Insgesamt wurden über 140 Peptide im tryptischen Verdau nachgewiesen (Tabelle 1), von denen wiederum 85 Peptide durch MS/MS-Spektren identifiziert wurden. Tabelle 1: Massenspektrometrische Analyse von PHF- nach enzymatischer Spaltung Protease Anzahl Peptide Identifizierte Sequenzen Trypsin Arg-C Protease Während beim Rind fünf verschiedene -Isoformen durch unterschiedliches Splicing entstehen können, liegen beim Menschen sechs Isoformen vor. Die als Isoform A bis F bezeichneten Varianten werden in der SDS-PAGE in sechs Banden im Bereich von 45 bis 65 kda getrennt. Die erwarteten spezifischen Peptide der einzelnen Isoformen wurden mittels Massenspektrometrie ebenfalls in der tryptischen Spaltung identifiziert (Tabelle 2). Tabelle 2: Identifizierte tryptische Spaltpeptide der PHF- Präparation, die