Entwicklung und Charakterisierung. bispezifischer Antikörper-Derivate zur Immuntherapie. CD19-positiver Leukämien und Lymphome

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1 Entwicklung und Charakterisierung bispezifischer Antikörper-Derivate zur Immuntherapie CD19-positiver Leukämien und Lymphome Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Christian Kellner aus Nürnberg

2 Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 24. Juni 2008 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. E. Bänsch Erstberichterstatter: Zweitberichterstatter: Prof. Dr. G. H. Fey PD Dr. B. Stockmeyer

3 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Seite 1 ZUSAMMENFASSUNG Abstract Zusammenfassung 2 2 EINLEITUNG Lymphome und Leukämien Lymphome und Leukämien der B-Zellreihe Hodgkin-Lymphome Non-Hodgkin-Lymphome Chronische lymphozytische Leukämie der B-Zellreihe (B-CLL) Akute lymphoblastische Leukämie der B-Zellreihe (B-ALL) Nebenwirkungen konventioneller Therapieansätze Antikörper-basierte Strategien in der Krebstherapie Wirkmechanismen therapeutischer Antikörper Antikörper als Vehikel Antikörper in der Therapie hämatologischer Neoplasien Limitierungen monoklonaler Antikörper Bispezifische Antikörper als Immuntherapeutika Bispezifische Antikörper zur Rekrutierung von Effektorzellen Klassische Formate bispezifischer Antikörper Rekombinante bispezifische Antikörper-Derivate Limitierungen rekombinanter bispezifischer Antikörper-Derivate Zielstrukturen auf Effektorzellen Auswahl der Effektorzellpopulation durch Wahl der Zielstruktur Der Fcγ-Rezeptor III (CD16) auf NK-Zellen und Makrophagen Zielstrukturen auf Tumorzellen für eine Antikörper-basierte Therapie Allgemeine Anforderungen für Zielantigene auf Tumorzellen Zielstrukturen auf B-lymphoiden Neoplasien CD19 als Zielstruktur zur Immuntherapie B-lymphoider Neoplasien 36 I

4 Inhaltsverzeichnis 3 PROBLEMSTELLUNG 38 4 ERGEBNISSE Herstellung und Charakterisierung rekombinanter bispezifischer Fab-scFv Fusionsproteine gegen CD19 und CD Konstruktion der Expressionsvektoren für den bstb [Fab19xds19xds16] und den bsbb [Fab19xds16] Expression und Aufreinigung des bstb [Fab19xds19xds16] und des bsbb [Fab19xds16] Analyse der Bindungseigenschaften des bstb [Fab19xds19xds16] und des bsbb [Fab19xds16] Analyse der Bindungsstärken des bstb [Fab19xds19xds16] und des bsbb [Fab19xds16] Bestimmung der Gleichgewichtskonstante (K D ) Bestimmung der Retentionszeit auf Antigen-positiven Zellen in vitro Bestimmung der Stabilität des bstb [Fab19xds19xds16] und des bsbb [Fab19xds16] in humanem Serum in vitro Untersuchungen zur Vermittlung der zellulären Zytotoxizität durch den bstb [Fab19xds19xds16] und den bsbb [Fab19xds16] in vitro Analyse der Antigen-spezifischen zellulären-zytotoxizität des bstb [Fab19xds19xds16] und des bsbb [Fab19xds16] Vergleichende Analyse des ADCC-Potentials der Antikörper-Derivate bstb [Fab19xds19xds16], bsbb Fab[19xds16] und bsscfv [19x16] Zytotoxische Aktivität des bstb [Fab19xds19xds16] und des bsbb [Fab19xds16] gegenüber primären Tumorzellen Herstellung und funktionelle Charakterisierung des bispezifischen single-chain Fv triple-bodys ds[19x16x19] Herstellung eines Expressionsvektors für den sctb ds[19x16x19] Bindungsstudien mit dem trispezifischen sctb [33xds16xds19] zur Analyse der Funktionalität des single-chain Fv triple-body Formats Eukaryotische Expression und Aufreinigung des sctb ds[19x16x19] Analyse der Bindungseigenschaften des sctb ds[19x1619] Vergleich der Bindungsstärken des sctb ds[19x16x19] und des bsscfv ds[19x16] 63 II

5 Inhaltsverzeichnis Bestimmung der Gleichgewichtskonstante (K D ) Kompetitive Inhibition des parentalen CD19 Antikörpers Bestimmung der Zelloberflächenretention in vitro Bestimmung der Stabilität des sctb ds[19x16x19] und des bsscfv ds[19x16] in humanem Serum in vitro Bestimmung der Plasmaretention des sctb ds[19x16x19] und des bsscfv ds[19x16] in Mäusen Untersuchungen zur Vermittlung der zellulären Zytotoxizität durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscfv ds[19x16] Nachweis der Antigen-spezifischen Induktion der zellulären Zytotoxizität durch den sctb ds[19x16x19] Vergleichende Untersuchungen zur Vermittlung der zellulären Zytotoxizität durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscfv ds[19x16] Zytotoxische Aktivität des sctb ds[19x16x19] und des bsscfv ds[19x16] gegen primäre Leukämie- und Lymphomzellen 74 5 DISKUSSION 78 6 MATERIAL UND METHODEN Materialien Chemikalien und Enzyme Allgemeine Puffer und Lösungen Vektoren Oligonukleotide Bakterienstämme Zellkulturmedien Zelllinien Mäuse Antikörper Methoden Allgemeine Methoden Klonierungen Herstellung der Expressionsvektoren für die bispezifischen Fab-scFv Fusionsproteine 95 III

6 Inhaltsverzeichnis Herstellung der Expressionsvektoren für die scfv triple-bodies Expression der rekombinanten Antikörper-Derivate und der GFP- und RFP- Fusionsproteine in 293T Zellen Aufreinigung monoklonaler Antikörper aus Hybridomen SDS-PAGE und Western-Transfer Experimente Durchflusszytometrische Methoden Nachweis der spezifischen und simultanen Bindung Bestimmung der Gleichgewichtskonstante (K D ) Bestimmung der Serumstabilität in vitro Bestimmung der Zelloberflächenretention in vitro Kompetitive Inhibition der Bindung des parentalen Antikörpers 4G Bestimmung der Plasmaretention in Mäusen Isolierung mononukleärer Zellen (MNCs) Zytotoxizitätsexperimente Graphische Auswertung und statistische Analysen LITERATUR WEITERE INFORMATIONSQUELLEN UND INTERNETSEITEN ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS EIGENE VERÖFFENTLICHUNGEN 124 IV

7 Inhaltsverzeichnis Verzeichnis der Abbildungen Seite Abbildung 1: Prozentualer Anteil der häufigsten Krebsformen an allen Krebsneuerkrankungen in Deutschland Abbildung 2: Wirkmechanismen therapeutischer Antikörper 16 Abbildung 3: Antikörper als Vehikel 18 Abbildung 4: Struktur eines monoklonalen IgG Antikörpers und klassische Formate bispezifischer Antikörper 25 Abbildung 5: Formate rekombinanter bispezifischer scfv Antikörper-Derivate 27 Abbildung 6: Rekombinante bispezifische Antikörper-Derivate mit Dimerisierungsdomänen 29 Abbildung 7: Stadienspezifische Expression von Differenzierungsantigenen in der B-Zell-Entwicklung 35 Abbildung 8: Konstruktion der bispezifischen Fab-scFv Fusionsproteine bsbb [Fab19xds16] und bstb [Fab19xds19xds16] 40 Abbildung 9: Spezifischer Nachweis der Fusionsproteine bsbb [Fab19xds16] und bstb [Fab19xds19xds16] nach Aufreinigung 43 Abbildung 10: Spezifische Bindung der Fab-scFv Fusionsproteine 44 Abbildung 11: Simultane Antigenbindung der bispezifischen Fab-scFv Fusionen 46 Abbildung 12: Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten für den bstb [Fab19xds19xds16] und den [bsbb [Fab19xds16] 47 Abbildung 13: Zelloberflächenretention der Fab-scFv Fusionsproteine 48 Abbildung 14: Stabilität der Fab-scFv Fusionsproteine in humanem Serum 50 Abbildung 15: Antigen-spezifische Induktion der Zielzelllyse durch den bstb [Fab19xds19xds16] und den bsbb [Fab19xds16] 52 Abbildung 16: Einfluss des E:T Verhältnisses auf die durch den bstb [Fab19xds19xds16] oder den bsbb [Fab19xds16] vermittelte Lyse 53 Abbildung 17: Dosis-abhängige ADCC durch den bstb [Fab19xds19xds16], den bsbb [Fab19xds16] und den bsscfv ds[19x16] 54 V

8 Inhaltsverzeichnis Abbildung 18: ADCC gegenüber primäre Tumorzellen durch den bstb [Fab19xds19xds16] und den bsbb [Fab19xds16] 56 Abbildung 19: Schema des Expressionsvektors für den sctb ds[19x16x19] 58 Abbildung 20: Nachweis der spezifischen Bindung des sctb [33xds16xds19] an Antigen-positive Zellen 59 Abbildung 21: Analyse der simultanen Bindefähigkeit des sctb [33xds16xds19] 60 Abbildung 22: Aufreinigung und Nachweis des sctb ds[19x16x19] 61 Abbildung 23: Spezifische und simultane Bindung des sctb ds[19x16x19] 62 Abbildung 24: Bestimmung der Gleichgewichtskonstanten K D für den sctb ds[19x16x19] und den bsscfvs ds[19x16] 64 Abbildung 25: Kompetitive Inhibition der Bindung des parentalen Antikörpers 4G7 durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscfv ds[19x16] 65 Abbildung 26: Bestimmung der in vitro Zelloberflächenretention des sctb ds[19x16x19] und des bsscfv ds[19x16] 66 Abbildung 27: Stabilität des sctb ds[19x16x19] und des bsscfv ds[19x16] in humanem Serum bei 37 C 69 Abbildung 28: Vergleich der Plasmaverweildauer des sctb ds[19x16x19] und des bsscfv ds[19x16] in Mäusen 69 Abbildung 29: Antigen-spezifische Induktion der ADCC durch den sctb ds[19x16x19] 71 Abbildung 30: Zytotoxizität durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscfv ds[19x16] in Abhängigkeit des E:T Verhältnisses 72 Abbildung 31: Dosis-abhängige Vermittlung der Lyse humaner Tumorzelllinien durch den sctb ds[19x16x19] und der bsscfv ds[19x16] 73 Abbildung 32: Vermittlung der ADCC gegen primäre Leukämie- und Lymphomzellen durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscfv ds[19x16] 75 Abbildung 33: Dosis-abhängige ADCC durch den sctb ds[19x16x19] und den bsscfv ds[19x16] gegen primäre Tumorzellen 76 VI

9 Inhaltsverzeichnis Verzeichnis der Tabellen Seite Tabelle 1: Einteilung, Ursprung und relative Häufigkeiten B-lymphatischer Neoplasien 5 Tabelle 2: Stadieneinteilung der B-CLL nach Rai und Binet 9 Tabelle 3: Chromosomale Aberrationen und assoziierte Prognosen bei der B-CLL 10 Tabelle 4: Klassifizierung akuter lymphoblastischer Leukämien der B-Zellreihe 11 Tabelle 5: Zugelassene Antikörper in der Krebstherapie (Stand: 2007) 21 Tabelle 6: Effektorzellen des Immunsystems, trigger-moleküle und aktivierende Zytokine 32 Tabelle 7: Bindungseigenschaften und Zytotoxizität der bispezifischen Antikörper-Derivate 55 Tabelle 8: EC 50 -Werte des sctb ds[19x16x19] und des bsscfv ds[19x16] in ADCC Experimenten mit CD19-positiven Zelllinien 74 Tabelle 9: EC 50 Werte des sctb ds[19x16x19] und des bsscfv ds[19x16] in ADCC Experimenten mit primären B-CLL Zellen 77 Tabelle 10: Übersicht über verwendete Oligonukleotide 92 Tabelle 11: Übersicht über die verwendeten Zelllinien 93 Tabelle 12: Übersicht über die verwendeten Antikörper 94 VII

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11 Zusammenfassung 1 Zusammenfassung 1.1 Abstract Bispecific antibodies are attractive agents for therapy of cancer and have been generated against different combinations of tumor antigens and trigger molecules on effector cells. Redirecting Natural Killer (NK) cells against leukemias and lymphomas is promising, as demonstrated by a bispecific single-chain fragment variable (bsscfv) against the tumor antigen CD19 and the trigger molecule CD16 (FcγRIII). However, monovalent targeting and almost equal equilibrium constants (K D ) for binding to CD19 (K D = 42 nm) and to CD16 (K D = 56 nm) were considered unfavorable for tumor-site specific retention and cytotoxicity. Therefore, novel bispecific proteins with increased functional affinity for CD19 were designed. A bispecific bibody was generated by genetically fusing a CD19-directed fragment antigen binding (Fab) with a single-chain fragment variable (scfv) specific for CD16. By extension of this molecule with a CD19-directed scfv, a bispecific tribody was obtained, now being bivalent for CD19 and monovalent for CD16. The tribody displayed 3-fold greater avidity for CD19 (K D = 8 nm) than the bibody (K D = 23 nm) and equal affinity for CD16 (K D = 57 nm). Both the tribody and the bibody induced ADCC against human leukemia-derived cell lines and primary cells from tumor patients with human mononuclear cells (MNCs) as effectors. The tribody displayed halfmaximum effective concentrations (EC 50 ) of 55 pm, and promoted equal antibodydependent cellular cytotoxicity (ADCC) at 6- and 12-fold lower concentrations than the bibody and the bsscfv, respectively. Based on these findings a novel format was designed, a scfv triple-body (sctb), consisting of one polypeptide chain with three scfvs connected in tandem. The two distal scfvs were specific for CD19, and the central scfv was directed against CD16. The sctb demonstrated 3-fold greater avidity for CD19 than the bsscfv (K D = 13 nm) and had equal affinity for CD16 (K D = 58 nm). The sctb induced ADCC against tumor cell lines and primary malignant cells at 10- to 40-fold lower EC 50 than the bsscfv and therefore constituted a major improvement. In summary, converting CD19 and CD16 directed bispecific antibody-derivatives into bivalent targeting formats resulted in enhanced cytotoxicity. With EC 50 in the low picomolar range, both the sctb and the tribody represent attractive candidates for further evaluation towards clinical studies. 1

12 Zusammenfassung 1 Zusammenfassung Bispezifische Antikörper sind attraktive Wirkstoffe für die Krebstherapie und wurden gegen verschiedene Kombinationen von Tumorantigenen und trigger Molekülen auf Effektorzellen hergestellt. Die Rekrutierung von Natürlichen Killer (NK) Zellen gegen Leukämien und Lymphome ist viel versprechend, wie ein bispezifisches single-chain fragment variable (bsscfv) gegen das Tumorantigen CD19 und das trigger Molekül CD16 (FcγRIII) zeigte. Jedoch wurden das monovalente Anvisieren der Tumorzellen und die fast identischen Gleichgewichtskonstanten (K D ) für CD19 (K D = 42 nm) und CD16 (56 nm) als ungünstig für eine Tumor-spezifische Anreicherung und für die Zytotoxizität erachtet. Daher wurden neue bispezifische Proteine mit höherer funktionaler Affinität für CD19 entwickelt. Ein bispezifischer bibody wurde durch Fusion eines fragment antigen binding (Fab) gegen CD19 mit einem single-chain fragment variable (scfv) gegen CD16 hergestellt. Durch Erweiterung dieses Moleküls um einen CD19-gerichteten scfv wurde ein bispezifischer tribody erhalten, der nun bivalent für CD19 und monovalent für CD16 war. Der tribody besaß eine 3-fach höhere Avidität für CD19 (K D = 8 nm) als der bibody (K D = 23 nm) und eine gleich hohe Affinität für CD16 (K D = 57 nm). Sowohl der tribody als auch der bibody induzierten Antikörper-vermittelte zelluläre Zytotoxizität (ADCC) gegen Leukämie-abgeleitete Zelllinien und primäre Zellen von Tumorpatienten mit mononukleären Zellen (MNCs) als Effektoren. Der tribody wies eine halbmaximale effektive Konzentration(EC 50 ) von 55 pm auf und vermittelte gleich starke ADCC in 6- bzw. 12-fach niedrigeren Konzentrationen als der bibody und der bsscfv. Darauf aufbauend wurde mit dem scfv triple-body (sctb) ein neues Format entwickelt, welches drei scfvs innerhalb einer Polypeptidkette in tandem verknüpfte. Die distalen scfvs waren spezifisch für CD19, der zentrale für CD16. Gegenüber dem bsscfv zeigte der sctb eine 3-fach höhere Avidität für CD19 (K D = 13 nm) und eine vergleichbare Affinität für CD16 (K D = 58 nm). Der sctb vermittelte ADCC gegen humane Tumorzelllinien und primäre maligne Zellen in 10- bis 40-fach niedrigeren Konzentrationen als der bsscfv und repräsentiert somit eine wichtige Verbesserung. Zusammenfassend führte die Konvertierung CD19- und CD16-gerichteter bispezifischer Antikörper-Derivate in bivalent-anvisierende Formate zu einer gesteigerten Zytotoxizität. Mit EC 50 -Werten in niedrig-picomolaren Bereichen stellen der sctb als auch der tribody attraktive Kandidaten für eine Weiterentwicklung in Richtung klinischer Studien dar. 2

13 Einleitung 2 Einleitung 2.1 Lymphome und Leukämien Krebs ist mit etwa Todesfällen pro Jahr die zweithäufigste Todesursache nach Herz- und Kreislauferkrankungen in Deutschland. Insgesamt erkranken jährlich Männer und Frauen an Krebs. Mit einem Anteil von jeweils über 25% stellen der Prostatakrebs bei Männern und der Brustkrebs bei Frauen die häufigsten Krebsformen dar (Abbildung 1). Hämatologische Neoplasien, die grob in Leukämien und Lymphome untergliedert werden, liegen bei Männern und Frauen mit jeweils ca. 5% an fünfter Stelle der Krebsneuerkrankungen. Im Jahr 2004 erkrankten Erwachsene erstmals an einem Lymphom oder einer Leukämie. Abbildung 1: Prozentualer Anteil der häufigsten Krebsformen an allen Krebsneuerkrankungen in Deutschland Leukämien und Lymphome liegen bei Männern und Frauen mit jeweils 5,5% an fünfter Stelle der Häufigkeitsverteilung. Abgewandelt nach: Krebs in Deutschland, Robert Koch Institut, Der Anteil an Kindern unter allen Krebserkrankten beträgt weniger als 1%. Mit etwa Neuerkrankungen pro Jahr in Deutschland tritt Krebs mit einer Inzidenz von 14 pro Kinder unter 15 Jahren auf und ist die zweithäufigste Todesursache. Das Diagnosespektrum bei Kindern unterscheidet sich generell von dem bei Erwachsenen. So ist die relative Häufigkeit der hämatologischen Neoplasien bei Kindern deutlich höher, wobei Leukämien mit 34,1% die häufigste und Lymphome mit 11,8% 3

14 Einleitung die dritthäufigste Krebserkrankung darstellen (Krebs in Deutschland, Robert Koch Institut, 2008). Leukämien und Lymphome entstehen durch eine unkontrollierte Proliferation maligne entarteter Zellen des blutbildenden Systems. Die Einteilung nach Linienzugehörigkeit und Differenzierungsstadium der entarteten Zellen folgt der Klassifikation der World Health Organization (WHO) und bezieht klinische, morphologische und immunophänotypische, aber auch molekulargenetische Merkmale der Tumorzellen ein (Harris et al, 1999; Jaffe et al, 2001). Lymphome entwickeln sich aus maligne entarteten, in der Regel bereits differenzierten Lymphozyten in den sekundären lymphatischen Organen wie den Lymphknoten oder der Milz. Lymphome werden nach histologischen Gesichtspunkten in Hodgkin-Lymphome und Non-Hodgkin-Lymphome (NHL) unterteilt. Die malignen Zellen können sowohl der B-Zell-, oder deutlich seltener, der T- Zellreihe entstammen. Je nach Verlauf der Erkrankung werden chronische oder aggressive Formen unterschieden. Im Gegensatz dazu entstehen Leukämien typischerweise im Knochenmark, meist aus nicht, oder nur schwach ausdifferenzierten Vorläuferzellen der myeloischen oder der lymphatischen Linie. Nach Linienzugehörigkeit und weiterem Verlauf erfolgt eine Einteilung in akute myeloische Leukämie (AML), chronische myeloische Leukämie (CML), akute lymphoblastische Leukämie (ALL), oder chronische lymphozytische Leukämie (CLL). Wie Lymphome können auch die lymphatischen Leukämien immunophänotypisch der B- oder der T-Zellreihe zugeordnet werden Lymphome und Leukämien der B-Zellreihe Die Neoplasien der B-Zellreihe leiten sich von B-lymphoiden Zellen unterschiedlicher Differenzierungsgrade ab, wodurch die hohe Heterogenität unter diesen Erkrankungen erklärt wird. Insbesondere die Lymphome können in eine Vielzahl verschiedener Subtypen eingeteilt werden (Tabelle 1). Die genaue Abgrenzung zwischen Leukämien und Lymphomen verläuft dabei zum Teil fließend. So wird zum Beispiel die CLL aufgrund ihres Ursprungs als indolentes NHL eingestuft, verläuft aber durch eine sehr frühzeitige Ausschwemmung der entarteten Zellen ins Blut primär leukämisch. Eine Unterscheidung aggressiver Non-Hodgkin-Lymphome von akuten lymphoblastischen Leukämien erfolgt nach dem Ausmaß einer Infiltration des Knochenmarks mit 4

15 Einleitung malignen Zellen. Überschreiten diese einen Wert von 25%, so handelt es sich um eine akute lymphoblastische Leukämie. Tabelle 1: Einteilung, Ursprung und relative Häufigkeit B-lymphatischer Neoplasien Lymphom/Leukämie I. Indolente Non-Hodgkin-Lymphome/Leukämien zellulärer Ursprung Häufigkeit* [%] Chronische lymphozytische Leukämie naive od. Gedächtnis B-Zelle 7 Lymphoplasmozytisches Lymphom (post) GC B-Zelle 1 Haarzellleukämie Gedächtnis B-Zelle <1 Marginalzonenlymphom Marginalzonen B-Zelle 9 Follikuläres Lymphom Grad 1 und 2 GC B-Zelle 16 II. Aggressive Non-Hodgkin-Lymphome/Leukämien Prolymphozytenleukämie Gedächtnis B-Zelle <1 Plasmozytom (Multiples Myelom) Plasmazelle 10 Mantelzell-Lymphom CD5 + Mantelzonen B-Zelle 5 Follikuläres Lymphom Grad 3 wie Grad 1 und 2 6 Diffus großzelliges B-Zell Lymphom GC oder post-gc B-Zelle Burkitt-Lymphom, Burkitt-ähnliches Lymphom GC B-Zelle 2 Akute lymphoblastische Leukämie/Lymphom B-Vorläuferzellen 2-3 III. Hodgkin-Lymphome Klassisches Hodgkin-Lymphom GC B-Zelle 8-10 Lymphozyten-prädominantes Hodgkin-Lymphom GC B-Zelle <1 *relative Häufigkeit unter B-Zell Lymphomen bei Erwachsenen in Europa und den USA. GC, Keimzentrum (germinal center). Abgewandelt nach: Küppers et al., Hodgkin-Lymphome Hodgkin-Lymphome stammen in 95% der Fälle von einer entarteten reifen B-Zelle des Keimzentrums der Lymphknoten ab und sind charakterisiert durch die Bildung der Hodgkin- oder Reed Sternberg Zellen. Mit einer Inzidenz von 2-3 pro Einwohner ist das Hodgkin-Lymphom eine relativ seltene Krankheit bei Erwachsenen (0,5% aller jährlichen Krebsneuerkrankungen). Bei Kindern beläuft sich die relative Häufigkeit unter allen Krebsarten auf 4,8% bei einer Inzidenz von 0,7 pro (Krebs in Deutschland, Robert Koch Institut, 2008). Hodgkin-Lymphome werden nach histologischen Merkmalen weiter in das klassische Hodgkin-Lymphom (95% der Fälle) und das seltenere noduläre Lymphozyten-prädominante Hodgkin-Lymphom eingeteilt. 5

16 Einleitung Die Ursachen für die Entstehung eines Hodgkin-Lymphoms sind noch unklar. Klinische und biologische Merkmale wie z.b. die Ausschüttung von Entzündungsmediatoren wie Interleukinen, Tumor Nekrose Faktor α oder granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) durch die Reed Sternberg Zellen, sprechen für eine infektiöse Entstehung. Als Risikofaktor für eine Erkrankung gilt eine Infektion mit dem Epstein-Barr Virus (EBV), die bei etwa 40% der Patienten mit dem klassischen Hodgkin-Lymphom vorliegt (Khan, 2006). Die Therapie des Hodgkin-Lymphoms erfolgt mit Strahlentherapie oder, gegebenenfalls, mit ergänzender Poly-Chemotherapie aus Doxorubicin, Bleomycin, Vinblastin und Dacarbazin (ABVD-Schema). Im Vergleich zu anderen Neoplasien ist das Hodgkin-Lymphom gut therapierbar, mit relativen 5-Jahres-Überlebensraten von 87-97% bei Erwachsenen und 97% bei Kindern (Connors, 2005) Non-Hodgkin-Lymphome Der Überbegriff Non-Hodgkin-Lymphom (NHL) umfasst eine Vielzahl verschiedener Lymphomerkrankungen und repräsentiert eine sehr heterogene Gruppe von unterschiedlichen Krankheitsbildern (Tabelle 1; Küppers, 2005; The Non-Hodgkin-Lymphoma classification Project, 1997). Im Gegensatz zu Hodgkin-Lymphomen können NHL einen leukämischen Verlauf annehmen. Mit etwa 85-90% stammt die überwiegende Mehrheit der NHL von B-Lymphozyten ab (B-NHL), wohingegen sich nur 10-15% von T- oder Natürlichen Killer (NK) Zellen ableiten (Küppers, 2005). Bei Erwachsenen tritt das NHL mit einer jährlichen Inzidenz von 5-10 pro Einwohner auf und stellt etwa 3% der insgesamt diagnostizierten Krebsarten dar. In den letzten 30 Jahren wurde eine stetige jährliche Zunahme von 5-8% an Fällen beobachtet. Bei Kindern ist die relative Häufigkeit von 5-6% unter allen Krebsformen höher, wobei die jährliche Inzidenz 0,8 pro beträgt. Die beiden häufigsten Arten des NHL sind das diffus großzellige B-Zell Lymphom (30-40%) und das follikuläre Lymphom (22%). Die verschiedenen Subtypen des B-Zell NHL entsprechen annäherungsweise unterschiedlichen Reifungsstadien, woraus Rückschlüsse über die zelluläre Herkunft gezogen werden können. Ein B-Zell NHL kann aus B-1-Zellen (B-CLL), aus ruhenden CD5-positiven naiven B-Zellen der Mantellzone (Mantelzelllymphom), reifen Ge- 6

17 Einleitung dächtniszellen (Prolymphozyten Leukämie) oder B-Zellen des Keimzentrums (Burkitt- Lymphom), IgM sezernierenden B-Zellen (lymphoplasmozytisches Lymphom), aber auch aus ausdifferenzierten Plasmazellen (Plasmozytom) entstehen (Küppers, 2005). Je nach klinischem Verlauf kann eine Einteilung in indolente und aggressive NHL erfolgen (Tabelle 1). Jedoch ist diese Untergliederung nach der Kiel-Klassifikation nicht mehr Bestandteil der WHO-Richtlinien, da der weitere Verlauf nach Erstdiagnose von verschiedenen Faktoren, wie dem Grad des Fortschreitens der Krankheit, abhängig sein kann (Lennert und Feller, 1990). Die Ursachen, die zur Entstehung eines NHL führen, sind in der Regel genetisch bedingt und umfassen strukturelle und numerische Aberrationen wie Translokationen, Deletionen und Trisomien (Küppers, 2005). Häufig betroffen ist der Locus der Immunglobulin schweren Kette (IgH) auf Chromosom 14q32. Durch Translokationen geraten Proto-Onkogene wie myc, Bcl-1 (Mantelzelllymphom), Bcl-2 (Burkitt-Lymphom, follikuläres Lymphom) oder Bcl-6 (diffus großzelliges B-Zell-Lymphom) unter Kontrolle des IgH Promotors. Die Fehlregulation der Expression dieser Proteine führt zur Inhibition der Apoptose oder zu einer erhöhten Proliferationsrate. Neben genetischen Ursachen können auch virale Infektionen als Auslöser oder Kofaktoren eine Rolle spielen. Das Auftreten des Burkitt-Lymphoms ist stark mit EBV-Infektionen assoziiert. Etwa 95% des endemischen und ca. 30% des sporadischen Burkitt-Lymphoms sind EBV positiv (Brady et al, 2007). Auch eine Infektion mit dem human immunodeficiency virus (HIV) führt zu einem erhöhten Risiko an einem NHL zu erkranken (Knowles, 2003). Die Behandlung der NHL erfolgt mit Strahlen-, Chemo-, oder ergänzender Immuntherapie. Das Behandlungsschema wird an den Lymphomtyp angepasst, wobei auch das Stadium (Ann Arbor-Klassifikation), welches den Grad der Ausbreitung der Erkrankung im Körper widerspiegelt, das Alter des Patienten und dessen Allgemeinzustand berücksichtigt werden. Bei indolenten NHL mit einer sehr langsamen Progression der Krankheit kann, falls keine Beschwerden vorliegen, mit einer Behandlung in einzelnen Fällen noch abgewartet werden (watch and wait). Unter den unterschiedlichen Subtypen des NHL variieren die Aussichten auf Heilung stark. Gut therapierbar sind follikuläre Lymphome (Grad I und II) in frühen Stadien. Diese sind in der Regel strahlungssensitiv und können mit Radiotherapie und in manchen Fällen mit zusätzlicher Chemotherapie geheilt werden. In fortgeschrittenen 7

18 Einleitung Stadien hingegen ist eine vollständige Heilung selten möglich. Auch gelten das Plasmozytom, die B-CLL und das Mantelzelllymphom als nahezu unheilbar. Häufig ist der klinische Verlauf über Jahre durch wiederkehrende Rezidive geprägt, die durch die minimale Resterkrankung (minimal residual disease, MRD) entstehen und selbst nach Komplett-Remissionen auftreten können. Die Therapie ist meist palliativ. Bei follikulären, und anderen indolent verlaufenden Lymphomen in fortgeschrittenen Stadien sowie bei aggressiven Lymphomen (z.b. diffus großzelliges B-Zell- Lymphom) erwies sich Kombinationsbehandlungen mit verschiedenen Zytostatika als wirkungsvoll. Eingesetzt werden u.a. die Chemotherapeutika Cyclophosphamid, Hydroxidaunorubicin, Vincristin (Oncovin ) und Prednisolon (CHOP-Schema). Bei Rezidiv-Patienten wird inzwischen routinemäßig eine ergänzende Immuntherapie mit dem CD20 Antikörper Rituximab (Rituxan, MabThera ) durchgeführt (R-CHOP; Coiffier, 2007). Zur nachfolgenden Erhaltungstherapie werden Zytokine wie Interferon α eingesetzt. Bei NHL Patienten mit schlechter Prognose bietet eine Hochdosis-Chemotherapie mit anschließender Stammzelltransplantation eine weitere Therapiemöglichkeit. Die transplantierten Stammzellen können aus dem Patienten (autolog) oder von Fremdspendern (allogen) aus dem Knochenmark oder dem peripheren Blut nach Stimulation mit G-CSF gewonnen werden. Als Kandidaten gelten Patienten, die jünger als 60 Jahre sind und die in der Primärtherapie ein unbefriedigendes Ansprechen zeigten oder einen Rückfall erlitten (Weisdorf et al, 1992). Bei rezidivierten Patienten mit hochmaligen Lymphomen konnten deutliche Verbesserungen hinsichtlich der Progression und des ereignisfreien Überlebens erzielt werden (Shipp et al, 1999) Chronische lymphozytische Leukämie der B-Zellreihe (B-CLL) Die CLL ist eine indolente Form des NHL mit stark leukämischem Verlauf. Sie ist mit einer Inzidenz von 3-6 Neuerkrankungen pro Einwohner die häufigste Leukämie und betrifft bei einem durchschnittlichen Erkrankungsalter von 65 Jahren hauptsächlich ältere Menschen. Bei Kindern tritt die CLL gewöhnlich nicht auf. In 97% der Fälle sind die entarteten Zellen B-lymphatischen Ursprungs und stammen von Gedächtniszellen oder unreifen, naiven B-Zellen ab (B-CLL). Charakteristisch ist eine Expression von CD5 und B-Zell Differenzierungsantigenen wie CD19, CD20 und 8

19 Einleitung CD79a (Oduncu et al, 2004). Der Krankheitsverlauf der B-CLL variiert sehr stark. Zur Erstellung einer Prognose wird das individuelle Krankheitsstadium eines Patienten nach den Kriterien der unabhängig entwickelten Klassifikationen nach Rai oder Binet festgestellt (Tabelle 2; Binet et al, 1981; Tabelle 2; Rai et al, 1975). Beide Systeme beruhen auf dem Ergebnis, dass in frühen Stadien die Tumormasse, und in späten Stadien der Grad der Knochenmarkinsuffizienz den weiteren Verlauf der Krankheit bestimmen. Berücksichtigt werden die Lymphozytenzahl im Blut, die Anzahl betroffener Lymphknotenregionen, mögliche Vergrößerungen der Milz oder der Leber, etwaige vorliegende Blutarmut (Anämie) oder Verringerung der Thrombozytenzahl (Thrombopenie). Nach diesen Kriterien werden drei Risikogruppen unterschieden. Die Niedrigrisikogruppe (Rai 0 und Binet A) weist eine mediane Überlebenszeit von über zehn, die intermediäre Risikogruppe (Rai I und II, Binet B) von fünf bis sieben und die Hochrisikogruppe (Rai III und IV) von zwei bis dreieinhalb Jahren auf. Nach wie vor gilt die B-CLL als unheilbare Krankheit. Tabelle 2: Stadieneinteilung der B-CLL nach Rai und Binet Rai Definition Binet Definition 0 Lymphozytose > /mm 3, Knochenmarksinfiltration > 40% I Lymphozytose und Lymphadenopathie II Lymphozytose und Hepatomegalie und/oder Splenomegalie III Lymphozytose und Anämie (Hb < 11,0 g/dl) A B Hb > 10,0 g/dl, Thrombozytenzahl normal und < 3 vergrößerte Lymphknotenregionen* Hb >10,0 g/dl, Thrombozytenzahl normal und 3 vergrößerte Lymphknotenregionen IV Lymphozytose und Thrombozytopenie < /mm 3 mit oder ohne Anämie, Lymphadenopathie und Organomegalie C Hb > 10,0 g/dl und/oder Thrombozytenzahl x 10 9 /L unabhängig von der Zahl vergrößerter Lymphknotenregionen *Zervikale und axilläre, inguinale Lymphknoten uni- oder bilateral sowie Leber- und Milzvergrößerungen gelten als je eine Region. Hb, Hämoglobin. Nach: Rai et al, 1975 und Binet et al,1981. Weitere prognostische Faktoren liefern zytogenetische Analysen (Tabelle 3; Dohner et al, 2000). Häufigste zytogenetische Anomalie ist die Deletion 13q14, die in ca. 55% der Fälle nachzuweisen ist und mit einer günstigen Prognose assoziiert ist. Das in diesem Genomabschnitt vermutete tumor suppressor Gen ist bis heute nicht eindeutig identifiziert (Kalachikov et al, 1997; Liu et al, 1997). Die Deletion 17p13 führt zum Verlust des tumor suppressor Gens p53 und ist dagegen mit einer schlechten 9

20 Einleitung Prognose assoziiert. Weitere ungünstige prognostische Faktoren sind u.a. eine Expression von CD38, das Fehlen von Hypermutationen in Genen der variablen Immunglobulinregionen (IgV) und eine kurze Lymphozytenverdopplungszeit von unter zwölf Monaten. Tabelle 3: Chromosomale Aberrationen und assoziierte Prognosen bei der B-CLL* Aberration Betroffene Gene Häufigkeit [%] Prognose Deletion 13q14 D13S25 55 Günstig Deletion 11q ? 18 Schlecht Trisomie 12? 16 - Deletion 16q21-23? 6 Günstig Deletion 17p13 p53 7 Schlecht *Untersuchung beruht auf der Analyse von 343 Patienten. Abgewandelt nach: Dohner et al, Patienten im Binet Stadium A sind in der Regel symptomlos und müssen nicht behandelt werden (Oduncu et al, 2004). Bei Krankheitsprogression oder einer entsprechenden Prognose werden mit Purinanaloga (Fludarabin) verabreicht. Mit dieser Behandlung konnten zwar in vielen Fällen Komplettremissionen erzielt werden, ob jedoch die Überlebensrate erhöht wird ist derzeit noch unklar. In fortgeschrittenen Stadien (Binet B und C) werden standardmäßig die Alkylantien Chlorambucil oder Cyclophosphamid eingesetzt, wobei die Ansprechrate 40 70% beträgt. Komplette Remissionen werden allerdings, wie auch mit Polychemotherapie nach verschiedenen Standardprotokollen, selten erreicht (CLL Trialists Collaborative Group, 1999). Durch eine Kombinationsbehandlung mit Fludarabin, Cyclophosphamid und Mitoxantron konnte eine gute Gesamtansprechrate von 67% bei Patienten im Rezidiv und eine hohe Quote an kompletten Remissionen (50%) erzielt werden, die auch molekulare Remissionen umfasste (Bosch et al, 2002). Aufgrund des hohen Risikos wird eine Hochdosis-Chemotherapie mit anschließender Stammzelltransplantation nur bei Patienten mit hohem Progressionsrisiko, die jünger als 60 Jahre sind und einen guten Allgemeinzustand haben, durchgeführt (Dreger et al, 2003; Schetelig et al, 2003). In solchen Fällen konnten verringerte Rückfallquoten erzielt werden. Ob dies zu einer höheren Überlebensrate beitragen kann wird derzeit untersucht. Als alternativer Ansatz werden auch therapeutische Antikörper wie der gegen CD52-gerichtete Antikörper Alemtuzumab (Campath ) mit in die Therapieprotokolle integriert und in Kombination mit Chemotherapeutika verabreicht (Alinari et al, 2007). 10

21 Einleitung Akute lymphoblastische Leukämie der B-Zellreihe (B-ALL) Akute lymphatische Leukämien (ALL) treten bei Erwachsenen mit einer Inzidenz von 1 pro Einwohner eher selten auf, wobei das mittlere Erkrankungsalter zwischen 30 und 40 Jahren liegt. Im Kindesalter ist die ALL dagegen mit einer jährlichen Inzidenz von etwa 4 Fällen pro ungleich häufiger und stellt mit einem Anteil von 27% an allen Krebsarten die häufigste Krebsform in dieser Bevölkerungsgruppe dar. Insbesondere sind Kinder im Alter von unter vier Jahren betroffen, bei denen die ALL mehr als doppelt so häufig auftritt wie in anderen Altersgruppen. Unter den pädiatrischen Leukämien ist die ALL mit einem Anteil von 80% die häufigste Form (Felix und Lange, 1999). Die Einteilung der ALL erfolgt durch Immunphänotypisierung nach den Richtlinien der European Group for the Immunological Classification of Leukemia (EGIL; Bene et al, 1995). Bei Erwachsenen sind etwa 75% der diagnostizierten ALL B-lymphatischen Ursprungs (B-ALL). Im Kindes- und Jugendalter sind ca. 85% der B-Zellreihe zuzuordnen (Lipp et al, 2003). Innerhalb der B-lymphoiden ALL werden weitere Subtypen je nach Differenzierungsgrad der malignen Zellen unterschieden (Tabelle 4). Der häufigste Subtyp bei Erwachsenen und Kindern ist mit etwa 60% die common B-ALL, wohingegen eine reifzellige B-ALL sehr selten ist (6% der B-ALL). Tabelle 4: Klassifizierung akuter lymphoblastischer Leukämien der B-Zellreihe Antigen pro-b common B prä-b B TdT HLA-DR CD /- +/- CD cycd cycd79a cyµ IgM positiv bei > 20% der Blasten; +/- positiv bei 10% der Blasten; - positiv bei < 10% der Blasten; cy, zytoplasmatisch; TdT, terminale Desoxyadenylattransferase; HLA, human leukocyte antigen; CD cluster of differentiation. Abgewandelt nach: Lipp et al, Bei etwa 60 bis 80% der Patienten ist die B-ALL mit strukturellen oder numerischen Chromosomenaberrationen assoziiert, die auch von prognostischer Bedeutung sein können. So ist die reziproke Translokation t(9,22), die zur Bildung des Philadelphia- Chromosoms und des Fusionsproteins bcr-abl führt und die bei 10-30% der erwachsenen B-ALL Patienten gefunden wird, mit einer sehr ungünstigen Prognose 11

22 Einleitung assoziiert (Lipp et al, 2003). Auch Translokationen, die das mixed-lineage leukemia (MLL) Gen (11q23) betreffen, stehen mit einer schlechten Prognose in Zusammenhang (Thirman et al, 1993). MLL Translokationen werden in 50-80% der pädiatrischen ALL gefunden (Felix und Lange, 1999). Unter diesen ist die Translokation t(4;11), die zum Fusionsonkogen MLL-AF4 führt, am häufigsten. Zur Behandlung der ALL erfolgt eine Induktionstherapie mit einer Poly-Chemotherapie. Eingesetzt werden u.a. Prednison (oder Dexamethason), Vincristin, Anthrazykline (Daunorubizin) und L-Asparaginase, die zur Intensivierung mit Cyclophosphamid, Cytarabin oder Mercaptopurin ergänzt werden können (Hoelzer et al, 2002). Zur Konsolidierung wird insbesondere zusätzlich Methotrexat eingesetzt. Bei Patienten, die nicht auf eine Chemotherapie ansprechen oder die eine sehr schlechte Prognose haben, besteht die Möglichkeit einer Stammzelltransplantation. Diese bietet für diese Patientengruppe oft die einzige Option auf eine Heilung. An die Konsolidierungstherapie setzt eine bis zu zweijährige Erhaltungstherapie an, die die Gefahr eines Rezidivs vermindern soll. Üblicherweise werden Methotrexat und Mercaptopurin verabreicht. Ein Problem bei der ALL stellt der Befall des zentralen Nervensystems (ZNS) dar. Deshalb wird zusätzlich eine ZNS-Prophylaxe mit intrathekal applizierten Chemotherapeutika wie z.b. Methotrexat oder eine Schädelbestrahlung durchgeführt, wodurch die Rückfallquote deutlich verringert werden konnte. Inzwischen werden bei Kindern relativ hohe Heilungsraten von 80% erzielt (Schrappe et al, 2000), wohingegen bei Erwachsenen nur etwa 40% der Patienten geheilt werden (Gokbuget und Hoelzer, 2002). In Hoch-Risiko Gruppen z.b. mit Translokation t(9;22) liegt die 5-Jahres-Überlebenswahrscheinlichkeit noch immer bei unter 20% (Lipp et al, 2003) Nebenwirkungen konventioneller Therapieansätze Chemotherapeutika sind meist Zytostatika, die durch eine Hemmung der DNA Replikation oder der Zellteilung wirken. Anthrazykline, wie Daunorubicin oder Doxorubicin verhindern durch Interkalation in die DNA die Replikation. Eine ähnliche Wirkungsweise besitzen Alkylantien wie Cyclophosphamid, die Alkylgruppen auf die DNA übertragen. Alkaloide wie Vincristin binden das Protein Tubulin und verhindern dadurch die Mitose (Mitosespindelgifte). Topoisomerase-II-Inhibitoren wie Etoposid 12

23 Einleitung hemmen dieses zur Replikation wichtige Enzym, wodurch DNA Doppelstrangbrüche entstehen. Antimetabolite wie der Folsäure Antagonist Methotrexat oder Pyrimidinoder Purinanaloga (z.b. Fludarabin) verdrängen die natürlichen Metabolite und hemmen so wichtige Stoffwechselfunktionen wie die Nukleinsäuresynthese. Da Zytostatika generell auf schnell proliferierende Zellen und nicht selektiv auf Tumorzellen wirken, sind immer auch gesunde Gewebe wie Knochenmark, Magen- und Darmepithelien oder auch Haarfollikel betroffen. Daher ist eine Chemotherapie mit zum Teil schwerwiegenden Nebenwirkungen verbunden. Diese umfassen u.a. Übelkeit, Entzündungen der Mund-, Speiseröhren- und Darmschleimhäute, Menstruationsstörungen, Keimzellstörungen und Haarausfall. Eine Gefahr ist ein erhöhtes Infektionsrisiko durch hervorgerufene Störungen der Hämatopoiese, die zu einem Mangel an Granulozyten (Granulozytopenie) oder Lymphozyten (Lymphozytopenie) führen können. Dies schädigt zusätzlich das körpereigene Immunsystem, welches bei Leukämie- oder Lymphompatienten ohnehin beeinträchtigt ist. Weiterhin kann auch die Bildung von Blutplättchen eingeschränkt sein (Trombozytopenie), was zu Störungen in der Blutgerinnung führen kann und als deren Folge spontane Blutungen auftreten können. Störungen der Erythrozyten-Bildung können zu einer Blutarmut (Anämie) führen, die mit Müdigkeit, Konzentrationsschwäche und Kopfschmerzen verbunden ist. Diese Folgen sind jedoch zeitlich begrenzt, und nach Abschluss der Chemotherapie regenerieren sich die geschädigten Gewebe. Schwerwiegender sind mögliche dauerhafte Schädigungen von Organen wie des Herzens, der Leber, der Niere oder des Nervensystems. Darüber hinaus können als Folge einer Chemo- oder einer Strahlentherapie Therapie-induzierte Neoplasien auftreten, die durch die mutagene Wirkung vieler Chemotherapeutika verursacht werden können. Zudem stellt häufig die MRD ein Problem bei der Therapie dar. Tumorzellen, die im Verlauf der Therapie nicht beseitigt wurden, können erneut expandieren und zu einem Rezidiv führen. Oft haben diese MRD Zellen unter dem Selektionsdruck im Verlauf der Behandlung Resistenzmechanismen entwickelt und sprechen auf eine erneute Chemotherapie nicht mehr an (Hoelzer et al, 2002). Bei Transplantationen stellen mögliche Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktionen (graft versus host disease; GvHD) ein schwerwiegendes Problem dar. Die Ursache sind immunologische Reaktionen der T-Zellen des Spenders gegen Körperzellen des Empfängers, wodurch Gewebeschädigungen entstehen können. Zwar führt ein graft 13

24 Einleitung versus malignancy (GvM) Effekt auch zu einer Abwehrreaktion des Transplantates gegen die Tumorzellen, dennoch bleibt die GvHD ein Hauptproblem und kann in schweren Fällen tödlich enden. Insgesamt werden durch Verbesserungen der Chemotherapieprotokolle und der Transplantationsmethoden immer mehr Patienten geheilt. Aufgrund der erläuterten Nachteile ist es jedoch erforderlich, neue Strategien zu entwerfen, die eine gezielte antitumorale Therapie erlauben. Ansatzpunkte sind kleine Wirkstoffmoleküle (small inhibitory molecules), die in den Stoffwechselweg der Tumorzellen eingreifen (Imatinib mesylat; Nadal und Olavarria, 2004), Tumorvakzinierungen und Antikörper-basierte Strategien. 2.2 Antikörper-basierte Strategien in der Krebstherapie Bestimmte therapeutische Antikörper vereinen eine gewisse Spezifität für Tumorzellen mit einer Fähigkeit, Effektorzellen des körpereigenen Immunsystems aktivieren oder anti-proliferative bzw. pro-apoptotische Signale in den Tumorzellen auslösen zu können (Carter, 2006). Auch können Antikörper als Vehikel genutzt werden, um Zellgifte, wie Zytostatika, proteinogene Toxine oder radioaktive Isotope, gezielt zu den erkrankten Geweben zu transportieren (Allen, 2002). Durch die Spezifität des Antikörpers können somit systemische Nebeneffekte der zytotoxischen Substanzen reduziert werden. Der klinische Erfolg hängt dabei sowohl von den Eigenschaften des gewählten Zielantigens als auch von Eigenschaften des Antikörpers und des gewählten Formats ab Wirkmechanismen therapeutischer Antikörper Monoklonale Antikörper können auf verschiedene Art therapeutisch wirksam sein (Abbildung 2). Dabei werden direkte und indirekte Wirkmechanismen unterschieden (Glennie und Johnson, 2000). Direkte Wirkmechanismen beruhen einzig auf der Bindung des Antikörpers an das entsprechende Zielantigen. So können durch Kreuzvernetzung des Zielantigens auf den Tumorzellen intrazelluläre Signale ausgelöst werden, die den Zellzyklus beeinflussen und anti-proliferativ wirken oder direkt zur Apoptose führen (Signalisieren). Dies ist unter anderem ein Wirkmechanismus des Anti- 14

25 Einleitung körpers Rituximab (Rituxan, MabThera ), der durch Kreuzvernetzung des Zielantigens CD20 Apoptose in den Zielzellen induziert (Shan et al, 1998). Gleichermaßen löst auch die Antikörper-vermittelte Kreuzvernetzung anderer Antigene, wie CD22, CD33 oder human leukocyte antigen class II (HLA II) anti-proliferative Signale in den Zielzellen aus (Dechant et al, 2003; Meng et al, 2004; Vitale et al, 1999). Des Weiteren können Antikörper die Bindung verschiedener Liganden, wie z.b. Wachstumsfaktoren oder Zytokine, an entsprechende Rezeptoren verhindern (Blockieren). So inhibiert der zur Therapie von Brustkrebs eingesetzte Antikörper Trastuzumab (Herceptin ) durch Bindung an den Rezeptor Her2/neu dessen Interaktion mit dem epithelialen Wachstumsfaktor (epithelial growth factor, EGF). Als Folge wird die Vermittlung proliferationsfördernder Signale blockiert und dadurch das Wachstum des Tumors verlangsamt (Harries und Smith, 2002). Die beiden Antikörper Infliximab (Remicade ) und Adalimumab (Humira ), die zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen oder zur Immunsuppression eingesetzt werden, wirken blockierend, indem sie das Zytokin TNFα binden. Dadurch verhindern sie dessen Interaktion mit seinem Rezeptor und hemmen Entzündungsreaktionen (Bondeson und Maini, 2001; Navarro-Sarabia et al, 2006). Indirekte Wirkmechanismen hingegen beruhen auf der Aktivierung bestimmter Effektorfunktionen, die schließlich den Tod der Zielzelle auslösen. Effektorfunktionen werden über das fragment crystalizable (Fc) eines Antikörpers vermittelt, daher kommt der Art des Isotyps eine besondere Bedeutung zu. Zu den indirekten Wirkmechanismen zählen die Fixierung von Komplement und das Auslösen der Komplementkaskade. Dies führt zur Lyse der Zielzelle durch Komplement-abhängige Zytotoxizität (complement-dependent cytotoxicity, CDC). Die Vermittlung der CDC trägt auch zur therapeutischen Wirksamkeit von Rituximab und des ebenso in der Therapie B-lymphoider Neoplasien eingesetzten CD52-gerichteten Antikörpers Alemtuzumab (Campath ) bei (Alinari et al, 2007; Cragg und Glennie, 2004; Reff et al, 1994). Insbesondere sind Antikörper in der Lage, einen antigenspezifischen Angriff zytotoxischer Effektorzellen, die selbst keine Antigenspezifität besitzen, zu steuern. Durch Wechselwirkung zwischen dem Fc Teil des Antikörpers und den Fc-Rezeptoren der Effektorzellen, wie z.b. NK-Zellen, werden diese zu den erkrankten Zellen rekrutiert und aktiviert. Die Effektorzellen lösen schließlich durch Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) den Tod der Zielzelle durch die Freisetzung lytischer Granula aus, die sich aus Granzymen und Perforinen zusam- 15

26 Einleitung mensetzen. Für IgG Antikörper existieren drei wichtige Fc-Rezeptoren (FcR), die ADCC vermitteln, der hoch affine FcγRI (CD64), sowie die beiden niedrig affinen FcγRII (CD32) und FcγRIII (CD16) (Burton und Woof, 1992; Ravetch und Bolland, 2001). Für die Aktivierung der Effektorzellen ist die γ-kette verantwortlich, die mit den Fc-Rezeptoren assoziiert ist und die bei der Signalübertragung ins Innere der Effektorzelle eine entscheidende Rolle spielt. Die ADCC ist ein wichtiger Wirkmechanismus vieler therapeutischer Antikörper, einschließlich Rituximab, Alemtuzumab, Trastuzumab oder Cetuximab (Carter, 2001b; Cooley et al, 1999; Crowe et al, 1992; Hale et al, 1985; Kimura et al, 2007a; Naramura et al, 1993; Reff et al, 1994). Über den Fc Teil können Antikörper auch phagozytierende Zellen wie Makrophagen rekrutieren und auf diese Weise Phagozytose auslösen (Brekke und Sandlie, 2003). Abbildung 2: Wirkmechanismen therapeutischer Antikörper. Therapeutische Antikörper können direkt wirken, indem sie eine Interaktion zwischen einem löslichen oder einem zellgebundenen Liganden mit dem Rezeptor auf der Tumorzelle blockieren oder nach Bindung auf Zelloberflächenrezeptoren der Tumorzelle anti-proliferative oder pro-apoptotische Signale auslösen. Indirekte Mechanismen werden über den Fc-Teil des Antikörpers vermittelt. Über diesen können die Komplement-abhängige Zytotoxizität (CDC) ausgelöst oder Immuneffektorzellen rekrutiert werden, welche die Tumorzelle über Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) oder Phagozytose beseitigen können. Abgewandelt nach: Glennie und Johnson, Rituximab bietet ein Beispiel für einen Antikörper, der in vitro sowohl direkt durch Auslösen der Apoptose, als auch indirekt über CDC oder ADCC wirken kann. Die Be16

27 Einleitung teiligung der einzelnen Mechanismen in vivo ist noch nicht vollständig geklärt, den indirekten Mechanismen werden allerdings eine größere Bedeutung zugeschrieben (Carter, 2006). Die klinische Bedeutung der CDC ist noch umstritten und wird kontrovers diskutiert (Manches et al, 2003; Weng und Levy, 2001). Dahingegen stellt die Rekrutierung von Immunzellen und die Induktion der ADCC unter Beteiligung von Fc- Rezeptoren einen klinisch relevanten Mechanismus, sowohl in vitro als auch in vivo, dar (Cartron et al, 2002; Weng und Levy, 2003). Dies wurde inzwischen auch für andere therapeutische Antikörper, wie Cetuximab (Erbitux ) oder Trastuzumab gezeigt (Carter, 2001b; Musolino et al, 2008; Zhang et al, 2007) Antikörper als Vehikel Antikörper können auch als Vehikel eingesetzt werden um toxische Substanzen zu den Tumorzellen zu transportieren (Abbildung 3). Am weitesten entwickelt sind Radioimmunkonjugate, die aus an Antikörper-gekoppelte Radionuklide wie 131 Iod (I) oder 90 Yttrium (Y) bestehen. Mit Ibritumomab Tiuxetan (Zevalin ) und Tositumomab (Bexxar ) sind zwei gegen CD20 gerichtete Radioimmunkonjugate zur Therapie des NHL von der U.S. Food and drug administration (FDA) zugelassen, die in der Behandlung Chemotherapie-refraktärer Patienten hohe Ansprechraten erzielten (Witzig et al, 1999). Durch chemische Kopplung wurden Antikörper an verschiedene Zytostatika wie Doxorubicin oder Calicheamycin gekoppelt (Allen, 2002). Bislang ist mit Gemtuzumab Ozogamicin (Mylotarg ) ein Zytostatika-Immunkonjugat zum klinischen Einsatz zugelassen. Antikörper können auch chemisch an Liposomen gekoppelt werden, die Zytostatika als Fracht tragen (Immunliposomen). Auf diese Weise können größere Mengen der Wirkstoffe gezielt zum Tumorgewebe transportiert und systemische Toxizitäten reduziert werden (Allen, 2002). Die Entwicklung von Immuntoxinen ermöglichte eine genetische Kopplung proteinogener Toxine wie Ricin A oder Pseudomonas Exotoxin A (ETA) an Antikörper (Allen, 2002). Diese Moleküle besitzen eine hohe Effizienz, die Tumorzellen zu beseitigen. Durch die Verwendung von Antikörperfragmenten, die nur aus den variablen Bereichen der schweren und der leichten Kette bestehen (fragment variable, Fv), konnte ein Großteil der immunogenen Epitope beseitigt werden, die hauptsächlich in den konstanten Regionen eines Antikörpers lokalisiert sind (Thorpe et al, 2003). Dadurch 17

28 Einleitung wurde die Immunogenität der Moleküle entscheidend verringert. Zwar sind derartige Moleküle derzeit noch nicht zugelassen, zeigten aber in präklinischen Studien viel versprechende Ergebnisse (Bruell et al, 2005; Peipp et al, 2002; Schwemmlein et al, 2007; Tur et al, 2003). In einer Phase I Studie erzielte ein gegen CD22 gerichtetes Immuntoxin (BL22) bei Chemotherapie-resistenten Haarzellleukämie-Patienten eine Ansprechrate von 80%. Die Nebenwirkungen wurden als leicht eingestuft und waren reversibel und nicht Dosis-limitierend (Kreitman et al, 2005; Kreitman et al, 2001). Abbildung 3: Antikörper als Vehikel. Antikörper können genutzt werden, toxische Substanzen gezielt zum Tumorgewebe zu dirigieren. Toxische Substanzen können Zytostatika, die direkt gekoppelt oder in Form von Immunliposomen transportiert werden können, Radionukleide oder proteinogene Toxine aus Pflanzen, Pilzen sowie aus Bakterien sein. Auf indirektem Weg wirken Immunzytokine. Zytokine können Immunreaktionen auslösen oder verstärken. Durch die Fusion eines Zytokins an einen Antikörper kann eine lokale Anreicherung des Moleküls im Tumorgewebe erzielt und eine zielgerichtete Immunreaktion gegen die malignen Zellen ausgelöst werden. Abgewandelt nach: Carter, Auch wurden durch die Fusion von Zytokinen an Antikörper Immunzytokine entwickelt. Zytokine, wie Interleukin-2, oder andere immunmodulatorische Moleküle können antitumorale Immunantworten auslösen oder verstärken. In Form von Immunzytokinen, die gegen Zelloberflächenantigene des Tumors gerichtet sind, kann durch die resultierende Anreicherung des Zytokins am Tumorgewebe dessen therapeutische Wirksamkeit unter Minimierung der Nebenwirkungen verstärkt werden (Schrama et al, 2006). Des Weiteren wurden als Todeseffektordomänen Enzyme (z.b. Rnasen) oder Todesliganden der tumor necrose factor/nerve growth factor 18