Tiergesundheit und Diagnostik von Tierkrankheiten im 21. Jahrhundert

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1 Tiergesundheit und Diagnostik von Tierkrankheiten im 21. Jahrhundert Wissenschaftliches Symposium 20 Jahre TLLV, 31. Mai 2012, Bad Langensalza Horst Schirrmeier, Institut für f r Virusdiagnostik

2 Veterinärwesen rwesen und Tiergesundheit im umfassenden Sinne Aufgaben und Ziele Verhütung und Bekämpfung von Krankheiten, insbesondere von übertragbaren Krankheiten der Tiere, (Tierseuchenbekämpfung) Schutz des Menschen vor Gefahren und Schädigungen durch Tierkrankheiten, (Zoonoseabwehr) Schutz des Menschen vor Gesundheitsgefährdung hrdung und -schädigung durch Lebensmittel und Erzeugnisse tierischer Herkunft, (Verbraucherschutz) Schutz des Lebens und Wohlbefindens der Tiere sowie Verhütung von Leiden. (Tierschutz) Schutz der Umwelt vor den von Tieren sowie tierischen Erzeugnissen en und Abfällen ausgehenden schädlichen Einflüssen, (Umweltschutz) Diagnostik als Basis von Entscheidungen

3 Handel/Transport Politik Landwirtschaft Wissenschaft Verbraucher TS-Bek Bekämpfung Zoonoseabwehr Verbraucherschutz Tierschutz Umweltschutz

4 Veterinärdiagnostik rdiagnostik in Deutschland Legislative Grundlagen Tierseuchengesetz regelt Zuständigkeiten für Diagnostik, epidemiologische Erhebungen und Forschung Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen Verordnung über meldepflichtige Tierkrankheiten Zoonoserichtlinie Tierimpfstoffverordnung amtlich zugelassene Diagnostika (FLI ist Zulassungsstelle) Bundesmaßnahmekatalog Task Force der Länder für MKS, SP und a.i (Diagnosehandbuch)

5 Veterinärdiagnostik rdiagnostik in Deutschland Amtliche Methodensammlung (Friedrich-Loeffler- Institut)/Methodensammlung AVID Tierseuchennachrichtensystem TSN (FLI) Tierseuchenjahresbericht (FLI) Falldefinitionen (wann ist ein Fall ein Fall) Diagnostik Grundlage der Bekämpfung anzeigepflichtiger Tierseuchen

6 Kindly provided: IAH, Pirbright, UK (2001)

7 Tierbestände in Deutschland (in Tausend)

8 Aktuelle Herausforderungen an die Tierseuchendiagnostik(er) Auftreten neuer Tierseuchen (Globalisierung, Klimaeinflüsse) Notwendigkeit einer raschen Diagnostik Sensitivere Methoden ( Spurensuche( Spurensuche ) (je sensitiver eine Methode, desto geringer u.u. die diagnostische Aussagekraft) Erfassung mehrere Pathogene Massentaugliche, aber dennoch robuste Methoden Automatisierbar /reduzierter Personaleinsatz Bekämpfungskonzeptkonform Plausibilitätsprüfung und Einordnung von Befunden in pathogenetische Zusammenhänge nge Fachkompetenz in der Diagnostik

9 Moderne Diagnosesysteme ELISA (Antikörper und Antigen) Durchflusszytometrie (Antigen) Polymerase-Kettenreaktion (PCR) > DNA (Genom) reverse Transkriptase PCR (RT-PCR) > RNA (Genom) real-time PCR (quantitative PCR) Sequenzierung (klassisch und 454 Technologie = NGS) DNA- Fingerprinting Fingerprinting (RFLP) Southern Blot (Genom) microarray Systeme DNA-Chip Protein-Chip pen-side Teste (Schnelltests im Stall)

10 Erste PCR-Protokoll, Protokoll, 9. August 1983 ( Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol 1987;155:335-50)

11 Vorteile der real time PCR hohe Sensitivität, t, da kleinere Fragmente Hochspezifisch durch Sondendetektion Schnelle, da Amplifikation und Detektion parallel ablaufen Vermeidung von Kreuzkontaminationen, da im geschlossenen System Quantifizierung möglichm Interne Kontrollen erhöhen hen Validität t der Ergebnisse Well Name Dye Well Type Ct (drn) Final Call (drn) Quantity (copies) #_00 FAM Unknown 20,21 + 7,94E+05 #_03 FAM Unknown 27,03 + 6,73E+03 DI9 FAM Standard 16,46 + 1,00E+07 DI9 FAM Standard 23,12 + 1,00E+05 DI9 FAM Standard 30,24 + 1,00E+03 DI9 FAM Standard 36,02 + 1,00E+01 NTC FAM NTC No Ct - No Ct Unbekannte Probe Standards

12 Massen Tests ca Gnitzenpools mittels qpcr geprüft 585 waren BTV positive (2,4%)(

13 Automatisierte Nukleinsäure-Extraktion Robotic pipette Robotic arm heating Buffer- reservoirs Barcode reader Rack Lysed samples Magnet. separator Vakuumstation Tip disposal and washing Seit 12/2005 > RNA/DNA Extraktionen Test run BTV: > 800 Proben in 24 h ( + PCR)

14 Folie: M. Beer Entwicklung eines Microarrays für AIV am FLI Pan Haemagglutinin RT-PCR NanoChip 400 System (Nanogen) Selektion von Sonden Validierungsstudie 104 Influenza A-spezifische Sonden in Triplikaten 91 x H x HPAIV H5 3 x HPAIV H5N1/Asia 2 x HPAIV H7 1 x M 1 (nicht genutzt) 5 x Consensus-HA + 6 Biotin-Marker ArrayTube System (Clondiag) Routinediagnostik

15 Hochdurchsatz-Sequenzierung High-throughput-Sequenzing Deep-Sequenzing 454/Roche Genome Sequencer GSflex Folie: M. Beer

16 LAMP (Loop-mediated isothermal amplification, Eiken chemicals) BART (Bioluminescent assay in real-time) Optigene Folie M. Beer

17 pen site - SNAP-Test (snap = spontan, kinderleicht) Ohrstanzproben Korr. OD: 0,041 Korr. OD: 0,054 Korr. OD: 2,259 Korr. OD: 2,231 Korr. OD: 2,216 Seren Korr. OD: 0 Korr. OD: 0,006 Korr. OD: 2,391 Korr. OD: 2,351 Korr. OD: 1,848

18 Pen-site MolekulardiagnostiK - batteriebetriebene tragbare Systeme Probnen /Lauf -NS-Extraktion integriert - leicht zu reinigen und zu desinfizieren Bio-Seeq-Vet TM (Smiths Detection) Enigma-FL TM (EnigmaDiagnostics)

19 Diagnostik = Methode und Konzept (kompatibel zum Bekämpfungsverfahren) Bsp,: Ohrstanzdiagnostik für f r die Erkennung von PI-Tieren bei BVD -Frühzeitige Erkennung und Entfernung - Keine diagnostische LückeL Antigen- ELISA oder real-time RT-PCR (einzeln oder Pool)

20 Methode BVD-Untersuchungmethoden nach Amtlicher Methodensammlung unter Berücksichtigung der diagnostischen LückeL Material Diagnostische LückeL E RNS Ag-capture ELISA NS3 Ag- capture ELISA Serum, Plasma, EDTA-Blut Organe, Hautbioptate Blutleukozyten Hautbioptate < 60. Tag Keine diagnostische LückeL Tag Durchflußzytometrie Blutleukozyten Tag Virusisolierung Blutleukozyten Tag < 90 d: zusätzlich AK-Test RT-PCR Serum, Plasma, EDTA- Blut, Leukozyten, Organe, Milch Hautbioptate Poolproben: Tag Einzelproben: keine diagn. Lücke Poolproben Keine diagnostische LückeL

21 PI-Jahresverlauf in Deutschland bis Januar Februar März April Mai Juni Juli?? Anzahl PI-Tiere: August Anteil PI-Tiere an 2011 geborenen Kälbern: 0,36 % Anzahl Betriebe mit PI-Tier: 6016 Anteil Betriebe mit PI-Tier: 4,11 % September Oktober November Dezember

22 November Dezember PI-Jahresverlauf Thüringen Thüringen 507 April Mai Juni Juli August September Oktober März Januar 2012 : 26 Februar 2012: 21 Februar Januar

23 Was ich bisher sagen wollte Molekulare Diagnostik: zunehmend wichtiges Werkzeug in der Sicherung der Tiergesundheit state-of-the-art: real time PCR (was der ELISA für die Serologie ist, ist die qpcr für den Erreger-/Genomnachweis) Neue Technologien: Typisierung und detaillierte Charakterisierung von Proben, enorme Zahl von Daten werden generiert (Biomathematische Herausforderung!!) (DNA-chip, NGS) pen-side Teste könnten zukünftig eine Rolle spielen (Problem: amtlicher Charakter der Untersuchung)

24 Brauchen wir denn überhaupt noch die klassische Virologie?? (Zellkultur, Serumneutralisation, Hämamagglutination, Komplementbindungsreaktion, Immundiffisionstest usw.) Antwort: Eindeutiges Ja Referenzmethode Goldstandard (Bsp: SNT bei BVD) Infektiositätsnachweistsnachweis Differenzierung von Biotypen/Phänotypen notypen Zu Beginn einer neuen Erkrankung hat man häufig h nichts anderes!! Modernes vorantreiben und Bewährtes bewahren! Beispiel: Schmallenbergvirus

25 Historie Sommer 2011: kurzzeitig fieberhafte Erkrankungen, Milchverlust, evtl. Durchfall bei Rindern (NRW und NL) - ( MHD ) Ausschluss verschiedener Erkrankungen u.a. BEFV (Dreitagekrankheit) Nachweis von Orthomyxovirusgenom mittels ungerichteter Metagenomanalyse (AG Höper), Simbuvirus, prel. Shamonda-like Etablierung einer Falldiagnostik am FLI mittels real time RT-PCR (B. Hoffmann) Isolierung eines Virus (M. Eschbaumer) in BHK-21 nach KC-Blindpassage erster TV zur Reproduktion des Krankheitsbildes (IS) Arbeiten zur phylogenetischen Einordnung des Erregers (K. Goller) Aufbau serologischer Tests (SNT, Ind. Fluoreszenztest, ELISA) Zellkuturelle Arbeiten mit anderen Simbuviren und Feldisolaten

26 Prognose Früherbst 2011 Orthobunyaviren der Simbuvirusgruppe verursachen milde klinische Erkrankungen und sind m.o.w. teratogen Akanbane-like Geschehen zu erwarten?? Viruseintrag im Spätsommer kongenitale Schäden bei Lämmern ab Dezember und bei Kälber ab März (fetale Infektion: Schaf: (56.) d, beim Rind: (150.) d)

27 Wingst Jade Großefehn Wardenburg GroßenknetenBassum Rees Haminkeln, Hünxe,?? Dinslaken, Schmallenberg, Borken Hünxe Wesél KempenBalve- Garbeck SBV positive Rinder, Nov SBV positive Schaflämmer, Stand

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32 Sind wir bereits über den Berg? Diagramm: Franz Conraths

33 57 Fälle bis

34 Serologie der Schmallenberginfektion - warum? 1. PCR bei Tieren (vor allem Kälbern) K mit AHS negativ - Frage: kann ein präkolostraler AK-Nachweis die Diagnosemöglichkeiten glichkeiten erweitern? 2. Rückverfolgung der Einschleppungsursache und zeit (tracing back) 3. Feststellung der tatsächlichen Verbreitung (Monitoring, tracing forward) 4. Feststellung Einzeltierstatus bei Exporttieren und Statuserhebungen in Betrieben mit besonderer Spezifikation (Bullenaufzucht-,, Besamungsstationen)

35 Serologie der Schmallenberginfektion - wie? 1. Serumneutralisationstest (SNT) unter Verwendung der Zelllinien BHK- 21-CT (L164 CCLV, FLI Insel Riems) und des Zellkulturisolates Schmallenberg BH80

36 2. Indirekter Immunfluoreszenztest im 96well Format mit SBV infizierten BHK BRS5 als Antigenmatrix (L194, CCLV FLI Insel Riems)

37 Ind. Fluoreszenztest an L194-Matrix Elmi-Aufnahmen: H. Granzow

38 3. Indirekter ELISA als Versuch einer Eigenentwicklung sowie Eignungsprüfungen und Erhebung von Validierungsdaten für einen ersten Prototyp eines kommerziellen ELISA (ID Screen Schmallenberg-Virus, ID Vet) Vergleich IDscreen Schmallenberg und SNT ID screen SBV netto OD S/P SNT(1/ND50) D157/12-1 0,293 18,90 tox <40 D157/12-2 0,081 5,23 <5 D157/12-3 1,478 95,35 40 D157/12-4 1, ,61 60 D157/12-5 1, ,97 40 D157/12-6 1,468 94, D157/12-7 1, ,94 15 D157/12-8 2, , D157/12-9 0,318 20,52 <5 D157/ , ,58 40 D157/ , ,45 60 D157/ , ,29 20 D157/ , ,42 tox <80 D157/ ,227 14,65 <5 D157/ ,215 13,87 <5 D157/ ,043 67,29 30 D157/ ,066 4,26 <5 D157/ , ,71 40 D157/ ,882 56,90 <5 D157/ ,07 4,52 <5 D157/ ,175 11,29 <5 D157/ ,517 33,35 <5 D157/ , , D157/ , , D157/ ,13 137,42 10 D157/ ,15 9,68 <5 D157/ ,069 68,97 15 D157/ , ,13 80 D157/ , ,77 15 D157/ , , D157/ , ,68 60 D157/ ,158 10,19 <5 D157/ ,455 29,35 <5 D157/ ,41 90,97 10 D210/ ,195 11,46 <5 D149/ ,2 11,42 <5 D149/ ,604 34,47 <5

39 Prävalenzstudie Vorgabe: je Bundesland 60 Rinder und 60 Schafe/Ziegen aus soviel Beständen wie möglich Rinder Schafe Ziegen sonstige n Positiv fraglich n Positiv fraglich n Positiv fraglich n positiv (61.0%) 7 (0,7 %) (24,7 %) 6 (1,3 %) (26,4 %)2 (1,6 %) 4 2 (50 %) Wildwiederkäuer: 12/15 positiv Bullenstationen: NS 7/94 NRW 12/58 MV 2/34 BY 8/86 Gesamt: 29/272 Bisons: 64/103

40 ,3 63,70 27, ,7 42,9 65 SBV-Prävalenzstudie SBV Monitoring ,7 83,3 52,5 30,6 32,5 18,5 30,2 14,7 11,3 2,3 0 23,3 57, ,9 83,3 69,7 NRW Thüringen Sachsen-Anhalt Rinder Schafe Saarland Baden-Würtemberg Bayern Meck-Pomm Brandenburg Sachsen Niedersachsen Hessen Rheinland-Pfalz Schleswig-Hollstein Hamburg

41 SBV- Antikörpermonitoring Thüringen 2012 positiv negativ

42 Credo der Diagnostik 1. Diagnostik = Analyse eines komplexen biologischen Prozesses 2. Verhältnis/Unterschied Diagnose Befund ; Methoden als Werkzeuge 3. Weg zur Diagnose kann von Erkrankung zu Erkrankung variieren (komplexes Denken) 4. Cutt off- und Bandengläubigkeit auf unbedingt notwendiges Mindestmaß reduzieren 5. Epidemiologische Rückkopplung und Plausibilitätsprüfung (Wert des Vorberichtes wieder auf vernünftiges Maß bringen) 6. Standardisierung ist Arbeiten nach anerkannten Standards aber nicht ein 100% einheitliches Vorgehen (erlaubt ist, was nachweislich zum richtigen Ergebnis führt) 7. Arbeiten mit Substandards interne Validierungen Checklisten 8. Automaten ersetzten nicht den veterinärmedizinischen und diagnostischen Sachverstand

43 Diagnostik ist auch immer Wahrscheinlichkeitsrechnung und Plausibilitätspr tsprüfung

44 Animal disease control consists of 20 % science and 80 % politics Sorgen wir alle gemeinsam dafür, dass die politischen Entscheidungen in der Tierseuchendiagnostik und - bekämpfung mit veterinärmedizinischem rmedizinischem Sachverstand getroffen werden

45 Alles Gute für f r die nächsten n 20 und Grüß üße e von der Insel Wünschen die Mitarbeiter des IVD am FLI Vielen Dank