Mycoplasma pneumoniae

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1 Spezifische und sensitive iagnostik IgG-, IgA-, IgM-ELISA Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh GE Theaterstrasse 6 Telefon 04103/ Fax 04103/ Wedel

2 efinition/systematik M ycoplasma pneumoniae zählt zur Familie der Mycoplasmataceae, die mit weiteren vier Familien die eigenständige Klasse der Mollicutes (Weichhäutige) bildet. Mykoplasmen besitzen keine Zellwand. Ihre äußere Begrenzung stellt die Zellmembran dar, die sehr flexibel ist und extreme Formveränderungen (Pleomorphie) zulässt. Einige Arten, wie z. B. Mycoplasma pneumoniae, besitzen zur Stabilisierung der Zellform eine Zytoskelett-ähnliche Struktur. Mykoplasmen repräsentieren mit einer durchschnittlichen Größe von nm die kleinsten zur selbständigen Vermehrung fähigen Bakterien. Vergleichbar mit Viren können sie Membranfilter passieren. Mykoplasmen verfügen über ein nur sehr kleines Genom ( kbp), wodurch ihre Synthesefähigkeit stark eingeschränkt ist. Bisher sind über 100 Arten der Familie Mycoplasmataceae bekannt. ie Mehrzahl davon kommt ausschließlich bei Tieren vor. Beim Menschen sind unterdessen 14 Arten isoliert worden, die die Schleimhaut des Respirations- und Urogenitaltrakts besiedeln. Nur wenige Vertreter davon sind pathogen. Zu den humanpathogenen Arten zählt M. pneumoniae. er Erreger kommt in zwei Varianten vor, die sich durch das P1- Adhäsin unterscheiden. M. pneumoniae ist ein obligater, extrazellulärer Schleimhautparasit, der sich durch seine hohe Wirtsspezifität auszeichnet. Infektion M. pneumoniae verfügt über eine nur geringe Infektiosität. ie Übertragung erfolgt durch Tröpfcheninfektion von Mensch zu Mensch. M. pneumoniae besiedelt zunächst die Schleimhaut des menschlichen Respirationstrakts. Folgende Virulenzfaktoren sind dafür entscheidend: Adhärenz an die Epithelzellen, Mobilität, Anpassung an den Wirt und Induktion pathologischer Immunreaktionen. ie Mykoplasmen heften sich an die Zilien des Flimmerepithels an. Bereits wenige Stunden später tritt eine Ziliostasis mit nachfolgender Zerstörung des Epithels auf. Adhärens und Kolonisierung sind die Voraussetzungen für die weitere Ausbreitung des Erregers im Respirationstrakt. Neben der überwiegend lokalen, im Respirationstrakt ablaufenden Infektion durch M. pneumoniae ist auch eine systemische Ausbreitung bekannt. er Pathomechanismus, der verantwortlich für das Überwinden der Epithelschranke und den Eintritt des Erregers in das Blut ist, scheint weitgehend ungeklärt. Offensichtlich verändern sich die adhäsiven Eigenschaften des Erregers. Klinische Manifestation M. pneumoniae ruft Erkrankungen sowohl im oberen als auch im unteren Respirationstrakt hervor. Neben Tracheobronchitiden und atypischen Pneumonien können Pharyngitis, Laryngitis, Otitis media und Myringitis verursacht werden. Als mögliche extrapulmonale Komplikationen bzw. Folgeerkrankungen sind Meningitis, Meningoenzephalitis, Polyneuritis (Guillain-Barré-Syndrom), Myound Perikarditis, Myalgien, Arthralgien, Arthritis, hämolytische Anämien, thrombopenische Purpura sowie Affektionen der Haut (u.a. Stevens-Johnson-Syndrom) bekannt. Epidemiologie M. pneumoniae findet weltweite Verbreitung. ieser Erreger kann sowohl endemisch als auch epidemisch zu jeder Jahreszeit auftreten. Epidemien, die durch M. pneumoniae hervorgerufen werden, sind alle drei bis sieben Jahre zu beobachten. 2

3 Infektionen Krankheitsverlauf/Therapie ie Inkubationszeit für eine M. pneumoniae-erkrankung beträgt 10 bis 21 Tage. M. pneumoniaeinfektionen verlaufen sowohl asymptomatisch als auch symptomatisch. Jedoch sind die Symptome, wie Fieber, trockener Husten und Kopfschmerz, sehr unspezifisch. Infektionen bei Kleinkindern unter 5 Jahren zeigen im Gegensatz zu Infektionen bei Jugendlichen und Erwachsenen einen milderen Verlauf. Bei Kleinkindern ist die Erkrankung häufig selbstlimitierend. Erstinfektionen scheinen im allgemeinen einen günstigeren Verlauf als Reinfektionen zu nehmen. Bei Reinfektionen durch M. pneumoniae kann es auf Grund autoimmuner Prozesse zu wesentlich stärkeren Entzündungsprozessen kommen. Nach einer abgelaufenen Infektion sind häufig noch persistierende Erreger über Wochen und Monate nachweisbar. as sogenannte Switching, d.h. das spontane An- und Abschalten der Synthese von Membranproteinen ermöglicht eine kurzfristige Veränderung der antigenen Eigenschaften der Membran. So entzieht sich der Erreger der vorhandenen Immunabwehr. Zur Therapie von M. pneumoniae-infektionen werden klassischerweise Tetrazykline eingesetzt. aneben kommen auch Makrolide und Chinolone zur Anwendung. Auf Grund der fehlenden Zellwand sind zellwandspezifische Antibiotika unwirksam. Inzidenz/Prävalenz M. pneumoniae-infektionen gehören zu den häufigsten Ursachen von ambulant erworbenen Tracheobronchitiden und Pneumonien im Kindesalter und bei Jugendlichen. ie höchste Inzidenz liegt zwischen dem 5. und 15. Lebensjahr. Bis zu % aller ambulant erworbenen respiratorischen Erkrankungen sind auf M. pneumoniae zurückzuführen. In 5-10 % der Erkrankungen entwickeln sich atypische Pneumonien. ie Antikörperprävalenz, gemessen in einer gesunden Population, ist altersabhängig. So schwankt die Seroprävalenz für IgG zwischen 1 bei Kleinkindern und etwa bis 50% bei Erwachsenen. IgAAntikörper sind bei Kleinkindern nicht nachweisbar. In einer gesunden Population Erwachsener sind bis zu 30% IgA-Antikörper beschrieben worden. iagnostik a die klinische Symptomatik einer M. pneumoniae-infektion nicht erregerspezifisch abläuft, ist eine ifferenzialdiagnostik zu anderen Erregern, wie Viren und grampositiven Bakterien, entscheidend für die adäquate Therapie. ie iagnostik ist mittels irektnachweis und Serologie möglich. er Erreger-/Antigennachweis stellt die effiziente iagnostik in der akuten, frühen Phase der Erkrankung dar. Als Referenzmethode gilt hier die Erregeranzucht, die jedoch zu unempfindlich und zeitintensiv (6-14 Tage) ist. er Erreger-NA-Nachweis (PCR) steht kommerziell nicht in der erforderlichen Qualität zur Verfügung. Bisher stellt die Serologie die Methode der Wahl für die iagnose einer M. pneumoniae-infektion dar. Als klassischer Antikörpernachweis gilt die Komplementbindungsreaktion (KBR). ie KBR kann nicht zwischen den Antikörperklassen unterscheiden. Auch mit den Agglutinationstesten können die Antikörper nicht differenziert werden. Beide Testarten erfassen vorrangig die IgM-Antwort. Bei Reinfektionen fallen sowohl die KBR als auch der Agglutinationstest überwiegend negativ aus. Gegenwärtig dominiert die ELISA-Technik, mit deren Hilfe IgG-, IgA- und IgM-Antikörper differenziert werden können. Entscheidend für einen spezifischen und sensitiven ELISA ist das Antigen. 3

4 Antigene Strukturen A ls entscheidender Virulenzfaktor für M. pneumoniae gilt die Adhärenz an die Wirtszelle. as Andocken des Erregers erfolgt über die Terminal- oder Tip-Struktur, die charakteristisch für den Erreger ist (Abbildungen ). Tip-Struktur Tip-Struktur Tip-Struktur Abb.: Elektronenmikroskopische Aufnahme von M. pneumoniae: Mit freundlicher Erlaubnis von Prof. G. Christiansen, Prof. S. Birkelund, Universität Aarhus, änemark, 04. ie wichtigen hochimmunogenen Proteine sind grundsätzlich über die gesamte Oberfläche des Erregers verbreitet. Auf der Terminal-Struktur können sie auch als größere Cluster vorkommen. Von den mehr als 10 bekannten immunogenen Proteinen kommt dem P1- (170 ka) Protein eine vorrangige Bedeutung zu. Vor diesem Hintergrund wurde das Antigen für den -ELISA ausgewählt. as Antigen des -IgG- und IgA-ELISA stellt ein Gemisch aus mehreren rekombinant hergestellten Proteinen dar. Für den -IgM-ELISA wird ein natives, aufgereinigtes Antigen eingesetzt. 4

5 IgG-, IgA-, IgM-ELISA Quantifizierung ie Quantifizierbarkeit der -IgG- und IgA-ELISA bietet eine gute Voraussetzung für das Monitoring bei nachgewiesener Infektion. Für das IgM ist eine Ja-NeinAussage State of the Art. ie Einpunktquantifizierung stellt eine anwenderfreundliche, kostengünstige Methode zur Ermittlung von quantitativen Ergebnissen dar. ie -Einpunktquantifizierung ist einfach durchzuführen, leicht programmierbar und softwaregestützt schnell auswertbar. Formel zur Konzentrationsberechnung a Konzentration [ AU/ml ] = b/ Okorrigiert -1 ) ( AU = arbiträre Einheit ie Kurvenparameter a und b sind dem chargenspezifischen atenblatt zu entnehmen. Okorrigiert = O-Sollwert des Kalibrators O-Messwert des Kalibrators x Ogemessen Konzentrationsbestimmung über Standardkurve und Kalibrator (Einpunktquantifizierung) ie Einpunktquantifizierung von ist eine hochpräzise Methode, die gleichwertige Ergebnisse, wie die Mitführung einer konventionellen Standardkurve, liefert (Abb.). er Messbereich erstreckt sich von 9 bis 125 AU/ml. IgG IgA y = 1,039x - 0,056 R2 = 0, n = Konz. (AU/ml) 0 y = 1,034x - 0,963 R2 = 0,993 1 Kit Kalibrator Kit Kalibrator Interne Kalibrationskurve Konz. (AU/ml) n = Interne Kalibrationskurve er Cut off liegt bei 10 AU/ml. er Grenzbereich erstreckt sich von 9 bis 11 AU/ml. Proben mit Werten unterhalb des Grenzbereichs (< 9 AU/ml) sind als negativ und Werte > 11 AU/ml als positiv zu bewerten. 5

6 Sensitivität/Spezifität Z ur Ermittlung von Sensitivität und Spezifität wird ein Referenzsystem benötigt. Für die MycoplasmaSerologie liegt jedoch kein Goldstandard vor. araus ergibt sich die Schwierigkeit, diese Zielgrößen zu bestimmen. Um dennoch eine Richtgröße zu erhalten, wurde eine Referenz (I), bestehend aus einem Partikelagglutinationstest (PAT) und einem kommerziellen ELISA (C-EIA), definiert. Zur Bestimmung von Sensitivität* und Spezifität* wurden Seren ausgewählt, die sowohl im PAT als auch C-EIA übereinstimmend negativ oder positiv waren. ie Seren wurden in den -IgG-, IgA-, IgM-ELISA (MP-ELISA) gemessen. Alle sog. falsch negativen Ergebnisse im -ELISA wurden erneut in einem weiteren kommerziellen ELISA (Referenz II) überprüft. Unter Berücksichtigung des Ergebnisses wurde die Sensitivität neu berechnet (korrigierte Sensitivität). MP-ELISA IgG Spezifität Sensitivität NPV PPV Korrelation Referenz I % 84% 84% 84% 83 V on den 6 im -IgG-ELISA falsch negativ bewerteten Seren waren in der zweiten Referenz 5 ebenfalls negativ oder grenzwertig, so dass sich unter Berücksichtigung dieses Ergebnisses eine korrigierte Sensitivität von 98% ergab. MP-ELISA IgA Spezifität Sensitivität NPV PPV Korrelation Referenz I % 61% % 73 V on den 13 im -IgA-ELISA falsch negativ bewerteten Seren waren in der zweiten Referenz 9 ebenfalls negativ oder grenzwertig, so dass sich unter Berücksichtigung dieses Ergebnisses eine korrigierte Sensitivität von 88% ergab. MP-ELISA IgM Spezifität Sensitivität NPV PPV Korrelation Referenz I % 80% 8 100% 90% 79 V on den 8 im -IgM-ELISA falsch negativ bewerteten Seren waren in der zweiten Referenz alle ebenfalls deutlich negativ, so dass sich unter Berücksichtigung dieses Ergebnisses eine korrigierte Sensitivität von 100% ergab. 6 * Grenzwertige Seren wurden in die Berechnung nicht einbezogen.

7 IgG-, IgA-, IgM-ELISA Häufigkeiten ie Häufigkeit von M. pneumoniae-infektionen und deren serologische Widerspiegelung wird sehr unterschiedlich diskutiert. Um einen aktuellen Einblick zu erhalten, wurden Seren von drei Probandengruppen verglichen: Blutspender (allgemeine urchseuchung) sowie hospitalisierte Kinder und Erwachsene mit akuten respiratorischen Erkrankungen. Kranke und gesunde Probandengruppen können anhand der Antikörperkonstellationen gut differenziert werden. Auffallend ist jedoch die hohe Anzahl grenzwertiger Seren im IgG und IgA beim kommerziellen Vergleichstest/C-EIA (Tab.). IgG IgA IgM C-EIA C-EIA C-EIA B l u t s p e n d er (n = 300) /- 39% 11% 50% 30% 2 48% 6% 91% 7% 17% 76% 96% 1% 1% 98% Kranke Kinder (n = 166) /- 67% 4% 29% 6 10% 27% 9% 88% 1 16% 71% 28% 67% 3 % Kranke Erwachsene (n = 189) /- 44% 51% 29% 14% 57% 10% 87% 1 84% 21% 74% 2 1% 74% er Partikelagglutinationstest (PAT) ist ein Screeningtest für M. pneumoniae-antikörper. 193 Seren von Patienten mit respiratorischen Erkrankungen wurden mit dem PA-Test gemessen (negativ: n = 31; Titer - 1: n = 107; Titer 3-6: n = 27; Titer 1280: n = 28). In der Abbildung sind die PAT-Ergebnisse denen der M. pneumoniae-igg-, IgA-, IgM-ELISA gegenüber gestellt. 100% MP-ELISA positiv 90% 80% IgG IgA IgM 70% % 50% % 30% % 10% 0% Neg PAT Titer ie -ELISA liefern differenzierte Ergebnisse für IgG, IgA und IgM. amit kann der Krankheitsverlauf konkret eingeschätzt werden. Im Gegensatz dazu ist mit dem PAT eine ifferenzierung der drei Immunglobulinklassen nicht möglich. 7

8 Automatisierbarkeit ie Automatisierbarkeit des -IgA-, IgG-, IgM-ELISA wurde an mehreren offenen Systemen/ELISA-Prozessoren überprüft. ie Übereinstimmung zwischen automatisierter und manueller Testdurchführung zeigt sich in der guten Korrelation der erhaltenen Werte (Abb.) IAS: y = 0,94x 0,85 R2 = 0,98 Automat Automat BEP III: y = 0,97x - 0,91 R2 = 0,99 BEP III: y = 0,90x 0,22 R2 = 0, Konz. 0 (AU/ml) IAS: y = 0,83x 2,28 R2 = 0, Konz. 0 (AU/ml) Manuell IgM 2,0 IAS: y = 1,02x 0,03 R2 = 0,99 Automat 1,6 1,2 0,8 BEP III: y = 0,98x 0,01 R2 = 0,99 0,4 0,0 O 0,0 0,4 0,8 1,2 Manuell 8 1,6 2,0 Manuell

9 IgG-, IgA-, IgM-ELISA Präzision ie Messungen zur Ermittlung der Intra- und Interassay-Varianz wurden mit jeweils fünf unterschiedlich reaktiven Seren durchgeführt (manueller Ansatz). Zur Bestimmung der Intraassay-Varianz wurden diese Seren jeweils in 22-fach Bestimmung in einem Testlauf untersucht. Zur Feststellung der Interassay-Varianz wurden die Seren jeweils in 13 unabhängigen Testläufen gemessen. Intraassay-Varianz IgG Serum IgA IgM AU/ml VK AU/ml VK O VK 1 6 6% 6 0,021 18% % 12 6% 0, ,792 6% % 27 0,990 4% ,480 4% Interassay-Varianz IgG Serum IgA IgM AU/ml VK AU/ml VK O VK 1 3 4% 6 0,033 11% % 0, , % 1, % 126 1,611 9

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12 Ausgabedatum: Juni 04 Weitere Infos unter