Hämoglobin: Proteinfunktion und Mikrokosmos (Voet Kapitel 9)

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1 Hämoglobin: Proteinfunktion und Mikrokosmos (Voet Kapitel 9) 1. Funktion des Hämoglobins 2. Struktur und Mechanismus 3. Anormale Hämoglobine 4. Allosterische Regulation

2 A. Struktur von Myoglobin Strukturaufklärung des Pottwal-Myoglobins wurde 1959 von John Kendrew gemacht. Später wurde die Struktur verschiedener Spezies und auch von Hb Mutationen durchgeführt. Das Hämoglobin wurde zum besterforschten Protein überhaupt. Myoglobin aus 8 Helices (A-H). ellipsoid Helices zwischen 7 und 26 AS lang meistens α-helices Enden der Helices A, C, E und G bilden 310-Helix Bezeichnung von Resten: B5 = 5. AS in B-Helix (N-term nach C-term) FG3= 3. AS im Interhelicalen Segment zw. F u. G NA = nicht helicales aminoterminales Segment HC= nicht helicales carboxyterminales Segment Manchmal auch kombinierte Bezeichnung Glu EF6(83)= Glu 83 im interhelicalen Segment EF 6. AS.

3 Räumliche Darstellung des OxyMb distales His proximales His H-Brücke Häm in hydrophobe Tasche eingebettet. DesoxyMb -> sechste koord. Stelle von Fe(II) unbesetzt. Fe(II) rückt auch weiter aus Porphyrinebene Distales His senkt Autooxidationsrate und erhöht Sauerstoffaffinität -> nicht ersetzbar durch andere AS Fe durch O2 Bindung vor Oxidation geschützt -> paradox Oxidation von Häm-Fe in Desoxyform jedoch Säurekatalysiert. Protonen werden durch Fe reduziert und diese reduzieren O2 zu Superoxid. Das distale His wirkt als Protonenfalle und schützt somit Fe vor oxitation. Die Sauerstoffsättigung verändert die Konformation von Mb nur geringfügig. Struktur von Oxy und Desoxy Mb gleich.

4 B. Struktur von Hämoglobin Hämoglobin = sphäroides Tetramer, besteht aus αβ Protomeren. 2 zählige Rotationsachse. Untereinheiten besetzen die Ecken eines Tetraeders -> verzerrte D2-Symmetrie. α und β Untereinheiten (UE) sind strukturell sehr ähnlich (auch zu Mb) obwohl nur 18% AS identisch α2 β1 Nicht identische UE im Hb ausgeprägte Wechselwirkungen α1 β1 Kontakt 35 AS α1 β2 Kontakt nur 19 AS αβ-heterodimere -> hydrophobe WW Homodimere -> keine WW da durch Flüssigkeit gefüllten Kanal getrennt β2 α1 (see Model 1HBB Deoxy, 1BBB Oxy film)

5 Unterschiedliche Quartärstruktur von Desoxy- und Oxy- Hämoglobin Desoxy-Form = T-Zustand β1 α2 β2 Oxy-Form = R-Zustand α1 α2 t-zustand β2 Tertiärstruktur UE Oxygenierung verengt Kanal β1 α1 r-zustand Tertiärstruktur UE DesoxyHb Kristall zerplatzt an der Luft α1 β2 Kontakt nur 19 AS dagegen α1 β1 Kontakt 35 AS -> stärkerer Kontakt unverändert d.h. Veränderung entlang α1 β2 Kontakt -> Verdrehung von α1 β1 Dimer um ca. 15 gegen α2 β2 Dimer

6 Blick von rechts auf vorherige Darstellung -> α1 β1 Dimer gefärbt dargestellt α2 β2 Dimer nur Umriss Durch Oxygenierung verschieben sich die 2 α β Dimere gegeneinander OxyHb ist kompakter als DesoxyHb Beachte: Lage von His FG4(97)β (schwarz) relativ zu gelb markierten AS.

7 C. Mechanismus der Kooperativität bei der Sauerstoffbindung Sauerstoffbindung an ein Häm beeinflusst Bindungsaffinität von Sauerstoff an anderen Häm Gruppen im Hämoglobin. Häm Gruppen zu weit voneinander entfernt -> keine direkte Beeinflussung -> WW wird über den Proteinteil vermittelt.basierend auf Röntgenstrukturanalysen -> Perutz-Mechanismus proximales His t-zustand Häm-Gruppe und Umgebung in α Untereinheit. in β-untereinheit versperrt ValE11 die O2-Bindungsstelle aber nicht in α Untereinheiten. F-Helix distales His

8 Einwandern von Fe(II) in Porphyrin- Ebene löst T-> R Transformation aus t-zustand Fe(II) 60 pm aus Porph. Ebene.-> pyramidale durchgebogen O2-Bindung ändert Elektr.konfig. von Fe -> Fe-N porph.-bindung kontrahiert -> Fe in Phorphyrinebene und O2 Bindung F-Helix muss Lage verändern, damit HisF8 dem Porphyrinring nicht zu nahe kommt. Dadurch wird Fe- O2-Bindung stabilisiert.

9 Die α1 β2 und α2 β1 Kontakte haben zwei stabile Positionen Desoxy-Form = T-Zustand β2 α1 Oxy-Form = R-Zustand β2 α1

10 Versetzen von 3 Seitenketten. Äquivalenter Satz von H-Brücken. Wie ein Schalter, nur 2 Zustände.

11 T-Zustand durch Ionenbindungen stabilisiert, brechen auf bei Übergang zu R-Zustand R-Zustand durch Bindung von Sauerstoff stabilisiert. Warum T-Zustand aber stabiler als R-Zustand? C-terminale AS sind im R-Zustand flexibel im T-Zustand aber nicht, sie sind über Ionenbrücken stabilisiert. deprotoniert bei Bohr effekt Netzwerk von ionischen WW und H-Brücken am Carboxyende der α und β Untereinheiten. Alle diese Bindungen werden beim T-> R Übergang geöffnet

12 Die Kooperativität der Sauerstoffbindung an Hämoglobin ergibt sich aus dem T -> R Übergang Bindung von Sauerstoff erfordert eng abgestimmte Molekülbewegungen: 1) Fe(II) gleitet nur in Porphyrinringebene wenn gleichzeitig sich die räumliche Orientierung vom proximalen His sich ändert. 2) Das proximale His ist fest mit Nachbarn verbunden -> Neuorientierung nur möglich wenn sich F-Helix über Porphyrinebene bewegt. 3) F-Helix kann sich nur dann bewegen wenn α1-β2 und α2-β1 Kontakte sich um eine Windung verschieben 4) Die Unbeweglichkeit der α1-β1 und α2-β2 Kontakte erzwingt die Konformationänderung in 3) -> Untereinheiten oder Dimere können Konformation nicht unabhängig voneinander ändern. Da nur 2 stabile α1-β2 (bzw. α2-β1) Kontakte möglich -> Quartärstruktur von Hb nur in 2 Zustandsformen Was heisst Kooperativität? 1. UE bindet O2 muss aber in t-zustand verharren da andere UE ohne O2 im t-zustand. Je mehr O2 gebunden desto höher O2 Affinität da UE im r-zustand.

13 Sigmoidale O2-Bindungskurve von Hb ist Überlagerung der Kurven von R- und T-Zustand Freie Enthalpie des Hb in R- und T- Zustand als Funktion des Sättigungsgrades (YO2) Sättigungsgrad in Abhängigkeit des Sauerstoff Partialdruckes.

14 D. Untersuchung des Perutz Mechanismus Umwandlung von T zu R-Zustand kann nicht gefilmt werden. -> Perutz-Mechanismus nicht bewiesen. Es gibt jedoch gute experimentelle Hinweise das der Mechanismus stimmt. 1) Verändert man AS am Carboxyende der Untereinheiten die an Ionenbindungen beteiligt sind so wird der T-Zustand instabil. Kristallisiert man ein solch midifiziertes DesoxyHb hat es eine Konformation wie OxyHb. 2) Inositolhexakisphosphat (IHP) bindet stärker als BPG an DesoxyHb und stabilisiert T-Zustand -> es zieht also das proximale His von Porphyrinebene weg. Dagegen bindet NO stärker an OxyHb als O2 -> NO zieht Fe stark in Porphyrinringebene. Werden nun gleichzeitig IHP und NO an Hämoglobin gebunden -> Entgegengesetzte Kräfte ziehen an His -Fe Bindung die grösser sind als normal -> Bindung bricht, was spektorskopisch Nachgewiesen werden kann.

15 E. Ursprung des Bohr-Effektes Bohr-Effekt= Abspaltung von H+ aus Hb bei Bindung von Sauerstoff. Reaktion von Cyanat mit Aminogruppen: Läuft nur ab bei terminalen Aminogruppen die pk von 8 haben. Bei physiol. ph Lys pk von 10.8 reagiert nicht. Carbamyloirung destabilisiert T-Form T-Form bindet mehr Protonen weil Chlorid Polarität der N-terminalen Aminogruppe erhöht -> pk steigt

16 F. Strukturvoraussetzungen für die BPG-Bindung BPG senkt Sauerstoffaffinität des Hb verbindet b UE über Salzbrücken und stabilisiert somit T-Form Bei Übergang in R-Form wird BPG herausgedrückt da sich Kanal verengt. Fötales Hb (HbF) hat anstelle von HisH143 ein ungeladenes Serin. BPG kann DesoxyHb nicht stabilisieren im Fötus -> höhere Sauerstoffaffinität. Salz- und H-Brücken