Über das mit Kohlensäure verbundene und das freie Chlorophyll bei der Photosynthese

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1 583 MIT KOHLENSÄURE VERBUNDENES UND FREIES CHLOROPHYLL Über das mit Kohlensäure verbundene und das freie Chlorophyll bei der Photosynthese O t t o W a r b u r g, G ü n t e r K r ip p a h l u n d A r n o l d L e h m a n n Max-Planck-Institut für Zellphysiologie, Berlin-Dahlem (Z. Naturforschg. 24 b [969] ; eingegangen am 2. Oktober 969) Beweis, daß die Funktion des Chlorophylls bei der Photosynthese nicht nur die Absorption des Lichts ist, sondern auch die Umwandlung der Lichtenergie in chemische Energie. Chlorophyll ist also auch der chemische Katalysator der Photosynthese. Der Beweis wurde erbracht durch Messung des verbundenen und des freien Chlorophylls wäh rend der Photosynthese sowie der Oa-Entwicklung aus dem verbundenen Chlorophyll, deren Quan tenausbeute = ist und aus dem freien Chlorophyll, deren Quantenausbeute = 0 ist. Der wesentliche Fortschritt auf dem Gebiet der Photosynthese ist in diesem Jahr die Entwicklung von Methoden gewesen, um das mit C 0 2 verbundene und das freie Chlorophyll, bei allen physiologischen COo-Drucken und Lichtstärken, während der Photo synthese in lebender C hlorella zu messen. Es ist dabei möglich gewesen, zu beweisen, daß nur das mit C 0 2 verbundene Chlorophyll, nicht aber das freie Chlorophyll im Licht C 0 2 spaltet und 0 2 ent wickelt. So ist gezeigt worden, daß das Chloro phyll bei der Photosynthese nicht nur das Licht absorbiert, sondern auch die absorbierte Licht energie in chemische Energie umwandelt; daß also die Photosynthese eine chemische ChlorophyllKatalyse ist. Der Ort der Bindung der C 0 2 im Chlo rophyll-molekül ist wahrscheinlich, wie wir schon vor Jahren vermuteten2, das Kohlenstoffatom( 0 ), also ein Bestandteil des isocyclischen Rings der Chlorophyll-Formel von H a n s F is c h e r 2a. Schüttelt man CA/ore//a-Suspensionen mit C Gemischen 30 im Dunkeln, so wird die sehr große Menge C 0 2 = l/ 2 0 des Zellvolumens chemisch gebunden und zwar durch zwei zeitlich trennbare Reaktionen. Die Funktion des 0 2 ist es dabei, die Energie zur Bindung der C 0 2 zu liefern. Ohne 0 2 wird keine funktionelle C 0 2 mit dem Chlorophyll verbunden und so hat man die Möglichkeit, durch Zugabe oder Fortnahme von 0 2 die funktionelle C 0 2 von anderen C 0 2-Verbindungen zu unterschei den. Belichtet man C hlorella- Suspensionen, deren 0. W a r b u r g, G. K r i p p a h l u. A. L e h m a n n, FEBF Letters, V o l. 3, number 3, Mai W a r b u r g, G. K r i p p a h l u. W. S c h r ö d e r, Die Natur wissenschaften 43, 237 [956] ; O. W a r b u r g u. G. K r i p p a h l, Z. Naturforschg. b, 52, 79 [956]. Chlorophyll vollständig oder teilweise mit C 0 2 ver bunden ist, so nimmt die mit Chlorophyll verbun dene C 0 2 ab, bis sich nach einigen ein neuer stationärer Zustand eingestellt hat, bei dem Spaltung und Resynthese der verbundenen C 0 2 gleich schnell verlaufen. Die D ifferentialgleichung von Sp altun g und Resynthese des Photolyten Die Differentialgleichung von Spaltung und Re synthese des Photolyten können wir auf die für die meisten Anwendungen ausreichend einfache Form bringen: = k x- c - k z ( A - c ). () A ist das gesamte Chlorophyll einer gegebenen C hlorella- Suspension, c ist das mit C 0 2 verbundene Chlorophyll der Photolyt. (A c) ist das freie Chlorophyll, k ist die Geschwindigkeitskonstante der Spaltung des Photolyten im Licht und ist pro portional der Lichtintensität, k2 ist die Geschwindig keitskonstante der Resynthese des Photolyten und ist bei staker Belichtung unabhängig von der Licht intensität. Im stationären Zustand der Belichtung ist die Konzentration c des Photolyten konstant und deshalb 0 = k - c - k 2 - ( A - c ), 2a O. W a r b u r g, G. K r i p p a h l forschg. 24 b, 355 [969]. u. W. S ch röd e r, (2 ) Z. Natur Dieses Werk wurde im Jahr 203 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschung in Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.v. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht: Creative Commons Namensnennung-Keine Bearbeitung 3.0 Deutschland Lizenz. This work has been digitalized and published in 203 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution-NoDerivs 3.0 Germany License. Zum ist eine Anpassung der Lizenzbedingungen (Entfall der Creative Commons Lizenzbedingung Keine Bearbeitung ) beabsichtigt, um eine Nachnutzung auch im Rahmen zukünftiger wissenschaftlicher Nutzungsformen zu ermöglichen. On it is planned to change the License Conditions (the removal of the Creative Commons License condition no derivative works ). This is to allow reuse in the area of future scientific usage.

2 WARBURG, G. KRIPPAHL UND A. LEHMANN Wenn wir den Bruchteil des mit C 02 verbundenen Chlorophylls mit bezeichnen, so wird c ~a = k2jrk Setzen wir kx= 0, so wird e=l, was bedeutet, daß im Dunkeln bei hinreichendem C 02-Druck das gesamte Chlorophyll mit C 02 verbunden ist. Belichten wir aber so stark, daß kt groß gegen k2 wird, so wird bei allen C 02-Drucken = klein gegen was bedeutet, daß fast das gesamte Chlorophyll im stationären Zustand der Belichtung als nicht verbundenes freies Chlorophyll vorliegt. Aus Formel () erhält man so einen Überblick über die Verteilung der beiden Chlorophylle in der lebenden verten oder belichteten Chlorella. Aus A, s, kx und k2 kann man die Spaltung der C02 und die Entwicklung des 0 2, also die Photosynthese, berechnen. Anwendung auf den Quantenbedarf Als wir begannen, den Quantenbedarf der Photosynthese zu messen 4, wußten wir noch nichts von der Existenz der beiden Chlorophylle: eines mit C 02 verbundenen Chlorophylls und eines freien Chlorophylls. Trotzdem gelang es schon damals, durch rein empirische Änderungen der Versuchsbedingungen immer bessere und bessere Quantenausbeuten der Photosynthese zu erzielen und schließlich zu der Quantenausbeute vorzudringen5. Dann war, wie wir heute wissen, alles Chlorophyll mit Kohlensäure verbunden, der Faktor war gleich und der Quantenbedarf der C 02-Spaltung und 0 2-Entwicklung konnte nach der einfachen Gleichung berechnet werden: Hier ist / die in Chlorella eingestrahlte Quantenintenstät, a der von dem gesamten Chlorophyll absorbierte Bruchteil von ] und ^ 2 der gleichzeitig aus Chlorella entwickelte Sauerstoff, oder die gleichzeitig in Chlorella gespaltene Kohlensäure. Wir fan 4 0. W a r b u r g u. E. N e g e l e in, Z. p h y s ik. Chem [ ] ; 06,9 [ ]. den gleich für =. Ein Mikromol = 22,4 mm3 cp absorbierte Quanten roten oder gelben oder grünen Lichts, spaltete wenn = war, etwa 22 mm3 C02 und entwickelte etwa 22 mm3 Sauerstoff. Andererseits ist es nach dem vorigen Kapitel klar, daß Gl. (4) nur im Grenzfall gleich angewendet werden darf. Ist kleiner als, so ist J ' cl die Lichtabsorption in dem verbundenen + freien Chlorophyll, und die Ausbeuten werden um so schlechter, je kleiner ist, d. h. je weniger verbundenes und je mehr freies Chlorophyll vorhanden ist 6. Allgemeingültig jedoch wird die Gleichung zur Berechnung des Quantenbedarfs erst dann, wenn J ' a mit multipliziert wird, weil erst dann das freie Chlorophyll eliminiert wird und nur das von dem verbundenen Chlorophyll absorbierte Licht / a- übrig bleibt. Die allgemeine Gleichung zur Berechnung des Quantenbedarfs lautet also: _ J-a-s (/: <0, ( d t Die Multiplikation von ] o. mit in dieser Gleichung bedeutet keineswegs nur eine kleine Korrektur von ^, da bei höheren Lichtstärken klein gegen wird und z. B. von im Dunkel auf 0, bis 0,0 im Licht sinken kann. Dadurch steigt dann der Quantenbedarf, berechnet nach Formel (4), von auf 0 oder 00, d. h. um 000 bis 0000% seines Werts. Dies ist die einfache Erklärung dafür, daß wir in Dahlem, wo wir im wesentlichen unter der Bedingung = arbeiteten, den Quantenbedarf fanden, während andere Institute, die mit kleinem arbeiteten, den Quantenbedarf 0 bis 00 fanden. Die Folge war die bekannte Polemik um 000 bis 0000% des Quantenbedarfs der Photosynthese. Im Lauf dieser 30-jährigen Polemik konnten wir eine interessante Beobachtung machen. Die -Quantenreaktion der Photosynthese, ein Ergebnis des Dahlemer Instituts, die eine glänzende Bestätigung des photochemischen Gesetzes von Einstein war, fand zunächst weniger Glauben, als die chaotischen Quantenausbeuten von 0 bis 00, die in ändern Instituten gefunden wurden und das Gesetz von Einstein desavouierten. Offenbar hielt man es für unwahrscheinlich, daß Chlorophyll, dessen Mol- 5 O. W 'a r b u r g, G. K r ip p a h l u. E. B i r k i c h t, Biochem. Z [964] W a r b u r g u. G. K r ip p a h l, Biochem. Z. 346, 48 [967].

3 MIT KOHLENSÄURE VERBUNDENES UND FREIES CHLOROPHYLL 585 gewicht 000 ist, einheitlicher reagiert, als viele ein fachen Substanzen der unbelebten Welt, z. B. ein facher als Ammoniak. Man vergaß dabei 7 die Quan tenausbeuten, die von uns bei der Spaltung vieler Kohlenoxyd-Eisenverbindungen und Hämverbindun gen gefunden worden waren oder die Photoxydation des Chlorophylls in Pyridin, bei der im ganzen sicht baren Spektrum die Quantenausbeute ist, so daß Chlorophyll heute der brauchbarste aller chemischen Quantenzähler ist8. In der Tat ist Chlorophyll in seiner Eigenschaft als chemischer Quantenzähler oder als Katalysator der Photosynthese diejenige Substanz, die bisher das E i n s t e i n sehe Gesetz für den größten Spektral bereich besser als alle anderen Substanzen bewiesen hat. E in s t e in freute sich, daß das wichtigste photo chemische Substrat der Welt seinem Gesetz ge horchte. E m il W a r b u r g 8, von 907 bis 922 Präsident der Physikalischen Reichsanstalt, der als erster E i n s t e i n s Gesetz in der Photochemie des Unbelebten bestätigte, akzeptierte unsere Arbei ten, die übrigens in seinem Strahlungslaboratorium in der Reichsanstalt begonnen worden waren. In der Tat war das Großflächenbolometer, das den Quantenbedarf der Photosynthese gemessen hat, dasselbe Bolometer, das P l a n c k s Wirkungs konstante h bereits im Jahr 900 gemessen hat, so daß in der klassischen Zeit der deutschen Wissen schaft niemand die Richtigkeit unserer Messungen der Photosynthese bezweifeln konnte. Anders wurde es erst, als das Jahr 94 kam und E m e r s o n 83 die 2-Quantenreaktion der Photosyn these entdeckte und Jam es F r a n c k 8c die 2 Quan ten in einer 50 Seiten langen Arbeit feierte. Damit begann die Verdrängung E in s t e in s aus der Photo synthese und alsbald zögerte kein Student der Photo synthese mehr, zu den Gleichungen der Photosyn these mindestens soviele Quanten zu addieren, als er für seine Theorien der Photosynthese benötigte. Dies ist die Geschichte des 30-jährigen Krieges der Photosynthese. Es schien ein Krieg gegen unser Institut in Dahlem zu sein. In Wirklichkeit war es ein Krieg gegen die Begründer der wissenschaft lichen Photochemie, gegen A l b e r t E in s t e in 9, E m il W a r b u r g 8a und W a l t e r N e r n s t. O. W a r b u r g, Heavy Metal Prosthetic Groups and Enzyme Action. Translated from the german edition by A l e x a n d e r L a w s o n. The Clarendon Press, Oxford O. W a r b u r g and V. S c h o c k e n, Arch. Biochemistry 2, 655 [949]. 8a E. W a r b u r g, Handbuch der Experimentalphysik 8, 655 [928] (Akademische Verlagsgesellschaft Leipzig). Hier wird die hohe Quantenausbeute der Photosynthese mit den Worten kommentiert: eine wunderbare Leistung der Na tur. 8b R. E m e r s o n and C. M. L e w i s, Amer. J. Botany 28, 789 [94]. 8(5 J. F r a n c k and H. G a f f r o n, Advances in Enzymology, 99 [94]. erhielt den Nobelpreis für den lichtelektrischen Effekt, also für die Basis der -Quantenreaktionen (s. A l f r e d N o b e l and his Prizes. Edited by the Nobel Founda tion), Elsevier, Amsterdam O. W a r b u r g u. G. K r i p p a h l, Biochem. Z. 344,03 [966]. O. W a r b u r g, New Methods of Cell-Physiology. Verlag Georg Thieme, Stuttgart, and Interciences, New York Merkwürdigerweise gibt es nur ein einziges Buch über Photosynthese, dessen Basis E i n s t e i n s Gesetz ist: W. B l a d e r g r o e n, Problems in Photosynthesis, Verlag Charles C. Thomas, Springfield,., USA, s. diese Zeit schrift, 7 b, Heft 5 [962]. 7 Thermodynamik 0, n 2 Da Mol Quanten im Rot bei 680 nur cai Wärme äquivalent ist, aber die Spaltung von Mol C 0 2 nach der Bilanzgleichung der Photosyn these 3000 cai erfordert, so ist es unmöglich, daß Lichtquantum Molekül C 0 2 spaltet. Andererseits lehrt die Physik, daß unter terrestren Bedingungen sich nicht mehrere Lichtquanten vereinigen können, um sich dann mit vereinten Kräften auf ihre Opfer zu stürzen, sonst könnte die Formel des lichtelektrischen Effekts nicht i m v2 = -h'v sein, sondern müßte n-h-v sein, eine Tat sache, aus der E in s t e in das photochemische Ä qui valentgesetz gefolgert hat. Wer dieses Grundgesetz der Photochemie nicht an erkennt, für den ist die Photosynthese kein Pro blem, da nicht einzusehen wäre, warum 3 vereinigte Lichtquanten die C 0 2 nicht spalten sollten H2C03+ 3 h v H2CO + O,. So hat erst das Gesetz von E i n s t e i n die Photo synthese zu einem physikalischen Problem gemacht. Die Lösung des Problems ist, daß das mit C 0 2 ver bundene Chlorophyll um rund cai pro Mol energiereicher ist, als die freie C 02 und daß diese Energie durch eine 2/3 Rückreaktion der Lichtreak tion dem Photolyten zur Verfügung gestellt wird, so daß nunmehr ein Lichtquantum ausreicht, die mit Chlorophyll verbundene C 02 unter Entwicklung von 0 2 zu spalten. Die 4 folgenden Gleichungen zeigen, wie diese Chlorophyll-Katalyse sowohl die Forde rungen des E i n s t e i n sehen Gesetzes als auch der 9 E in s t e in

4 WARBURG, G. KRIPPAHL UND A. LEHMANN Thermodynamik erfüllt: hell Photolyt + iv0 h v = Chlorophyll + CH20 2/s CH20 + 2/ä 0 2= 2/3 H2C cal cal + H2C03+ Chlorophyll = Photolyt (6 ) (7) (8) /sh 2C 0 3+ l N0 h-v =7»CH20 + V»02 Bilanz wo also in der Bilanz 3 Lichtquanten Molekül C 0 2 spalten, aber die Zahl 3 nicht von einer Zusammen rottung von 3 Quanten herrührt, sondern von einer -Quantenreaktion mit 2/s Rückreaktion. Reagiert mehr als 2/s der Endprodukte der Licht reaktion zurück, z. B. 9/io, so wird der Quanten bedarf in der Bilanz nicht 3, sondern 0 usw., doch hat sich gezeigt, daß die 2/3 Rüdereaktion in intakter Chlorella die Regel ist. 2/3 Rückreaktion aber ist ge rade das mindeste, was zurückreagieren muß, um die Forderungen der Thermodynamik zu erfüllen. und 3 Die -Quantenreaktion des Lichts, also die Gl. (6), ist mit der automatischen Manometrie gemes sen worden 5, bei der die Photozelle die Rückreak tion der Spaltungsprodukte des Lichts eliminiert. Die Reaktion (7) ist also hierbei von der Reaktion (6) getrennt worden. Die Quantenzahl 3, die Bilanz von Lichtreaktion und Rückreaktion, ist bei kontinuierlicher Bestrah lung, im stationären Zustand der Belichtung gemes sen worden, wobei die C 02-Drucke von 2 bis 0% einer Atmosphäre und die Lichtintensitäten von 50 bis 000 mm3 Quanten pro variiert wurden 3. Die eingesetzte Zellmenge betrug 00 mm3 pro Manometriegefäß, die 0 2-Entwicklung bei Lichtsätti gung war von der Größenordnung 20 mm3 pro, die Korrektion für die Ruheatmung war klein gegen H Chloro J phyll ab sorbiert , Cd Wenn der Quantenbedarf der Spaltung des Photo lyten bei allen Wellenlängen des Sonnenlichts = ist und wenn 2/3 der Spaltungsprodukte der Licht reaktion zurückreagieren, so beträgt die Energie ausbeute von Spaltung + Resynthese des Photolyten im Rot bei 680 m «3000 cal cal Ch H Quanten. pro' ein gestrahlt Photolyt Photolyt hell A Bruch teil von Die Bedeutung der Quantenzahlen und 3 «a J mm3 (9) die Oo-Entwicklung im Licht. Die Rückreaktion die lichtinduzierte Atmung wird bei dem Verfahren der kontinuierlichen Belichtung automa tisch von dem entwickelten 0 2 abgezogen, was ein sehr großer Vorzug dieser neuen Methode ist. Der Photolyt und damit wurden immer während der kontinuierlichen Belichtung mit einer Kombination von Manometrie und optischer Methode bestimmt. Nur bei den höchsten Lichtstärken war der Fehler in e im Mittel größer als 0 Prozent. Die folgende Tab. enthält ein Versuchsbeispiel für den C 02Druck von 5% einer Atmosphäre Druck, das ist der C 0 2-Druck, bei dem die Zellen gezüchtet worden waren. Die I / 99- und l/9?*-werte der Tab. zeigen, wie durch Multiplikation von l/cp mit e aus den chaoti schen Quantenzahlen konstante Quantenzahlen ent stehen und zwar diejenigen Quantenzahlen, die das E i n s t e i n sehe Gesetz und die Thermodynamik für die Spaltung + Resynthese des Photolyten verlangen. Bemerkung über die Messung der Quantenzahlen = 90 Prozent df J X J-O t ' mm3 dt dt ki ko cp* , ,03 2,8 3,00 2, Tab.. Die Tabelle zeigt, daß durch Multiplikation von J - a mit e aus den unverständlichen Quantenzahlen die von E in s t e in s Gesetz und der Thermodynamik geforderten Quantenzahlen entstehen. CCX-Druck 5% einer Atmosphäre. Das eingestrahlte Licht war rotes Licht. O. W arburg, G. K r ip p a h l u. A. Lehm ann. Amer. J. Bot [969].

5 MIT KOHLENSÄURE VERBUNDENES UND FREIES CHLOROPHYLL 587 wobei cal die Energie von Mol Quanten der Lichtfrequenz v und 3000 cal die molare Spaltungsenergie der freien C 02 ist. Wer die Photochemie des Unbelebten kennt, wird diese Leistung der lebenden Natur bewundern, um so mehr, als die Lichtquanten, die der lebenden Natur zur Verfügung stehen, im wesentlichen die energiearmen Quanten des Sonnenlichts sind. Würden statt ~/'3 der Spaltungsprodukte der Lichtreaktion 9/io der Spaltungsprodukte zurückreagieren, so wäre die Energieausbeute 3000 cal cal 00 = 27 Prozent und diese Energieausbeute würde noch ausreichen, um das Leben auf unserem Planeten zu erhalten. Indessen haben die Quantenzahlen und 3 noch eine tiefere Bedeutung als nur die Größe der Energieausbeuten. Solange ein Chemiker, der die Bilanz einer photochemischen Reaktion untersucht, die Reaktion, deren Quantenbedarf = ist, noch nicht gefunden hat, solange weiß er nicht, was er untersucht. Deshalb ist die Entdeckung der -Quantenreaktion der Photosynthese 4 im Kaiser-Wilhelm-Institut in Dahlem, der Beginn der Wissenschaft der Photosynthese gewesen. Die Entdeckung der 2/3 Rüdereaktion der Spaltungsprodukte hat dann die physikalische Möglichkeit der -Quantenreaktion erklärt. Die Entdeckung der beiden Chlorophylle im Jahr 969 aber, mittels der Quantenzahlen und 3, ist die Entdeckung des chemischen Mechanismus der Photosynthese gewesen. Das einfachste Beispiel ist Acetaldehyd, der infolge der Reaktionen 2TPN + 2 H20 = 2TPNH, + 0 2, (0) 2 CH3CHO + 2 TPNH2= 2 C2H5OH () Alkohol bildet. Addiert man (0) und (), so entsteht die Bilanz 2 CHgCHO + 2 H20 = 2 C2H5OH (2) Ähnlich kann man durch Zusatz von Oxalessigsäure oder Oxalbernsteinsäure oder Phosphoglycerinsäure usw. aus beschallter Chlorella im Licht 0 2 entwickeln, doch sind diese Reaktionen im Vergleich zur Photosynthese aus C 02 in lebender Chlorella so langsam, daß sie bedeutungslos sind. Der Versuch der Abb. erläutert das Gesagte. In der Tat muß im Leben fast alles TPNH2 über die Atmungskette mit Sauerstoff zurückreagieren, um die cal frei zu machen, die zur Resynthese des Photolyten aus C 02 und Chlorophyll erforderlich sind. Der Weg von der reduzierten Kohlensäure zur Stärke Wenn die Spaltung des Photolyten im Licht und die Resynthese des Photolyten abgelaufen sind, so ist die Umwandlung der Lichtenergie in chemische Energie, die Photosynthese beendet. Alles weitere ist intermediärer Stoffwechsel der allgemeinen Biochemie. Wasserstoffübertragende Fermente und Photosynthese 0 Wie alle lebenden Zellen, so enthält auch Chlorella Apofermente und Wirkungsgruppen wasserstoffübertragender Fermente, von denen wir vor kurzem gezeigt haben, daß sie in beschallter belichteter Chlorella reichlich O., entwickeln können. 4 D e a n B u r k u. O. W a r b u r g, Naturwissenschaften 37, 560 [950] ; Z. Naturforschg. 6 b, 2 [95]. (J roi=930mm3 Quanten/Minute eingestrahlt) Abb.. 25 mm3 Chlorella ist supendiert in 3 cm3 Kulturlösung, der jedoch keine N03e zugesetzt ist, damit die 0 2-Entwicklung aus NO30 eliminiert ist. Die beiden Manometriegefäße enthalten im Hauptraum die Zellen und außerdem je 8 Mikromole Acetaldehyd, aber nur Gefäß I, nicht Gefäß II, enthält C02 im Gasraum, die durch Tie. Bicarbonat- Carbonat im Seitenarm konstant gehalten wird, während KOH im Seitenarm des Gefäßes II den COa-Druck auf fast Null hält. Der Versuch zeigt, daß die Oa-Entwicklung aus Acetaldehyd verschwindend klein ist im Vergleich zur 0 2-Entwicklung aus Kohlensäure.