Instrumentelle Analytik AFS - Fluorimetrie Seite
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- Holger Hermann
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1 N1_Emission_Fluorimetrie2_a_BAneu.doc - 1/ 2.6 Fluorimetrie und Phosphorimetrie AES: Thermische Anregung der Atome Fluorimetrie: Anregung der Atome oder Moleküle durch Strahlungsabsorption. (Linienstrahler: HKL, Laser; Kontinuumstrahler: Xe- oder Hg(Xe)-Hochdrucklampe) Proben: gasförmig (z.b. Atome im Plasma) flüssig (z.b. Moleküle in Lösung) fest Atom-Fluoreszenz-Spektrometrie AFS Im Unterschied zur AES erfolgt bei der Atom-Fluoreszenz-Spektrometrie AFS die Anregung der Atome optisch mit Hilfe von: HKL (schmalbandige Einstrahlung und Absorption elementspezifischer Wellenlängen) Xenonhochdrucklampe (spektral gefilterter Kontinuumstrahler) Laser (z.b. auf eine Absorptionswellenlänge abgestimmte Farbstofflaser) Messprinzip eines AF-Spektrometers Probe wird in heißer Flamme (ICP) atomisiert. Die Atome befinden sich in der Flamme überwiegend im Grundzustand (Boltzmannfaktor). Resonanzabsorption der schmalbandigen Anregungsstrahlung entsprechend hf = W Absorption, d.h. die Anregungswellenlänge wird auf einen Absorptionsübergang abgestimmt. Unter Emission der Anregungsenergie oder Teilen davon in Form von Fluoreszenzlicht kehren die Atome in den Grundzustand oder einen niedrigeren Anregungszustand zurück. Die Wellenlänge des emittierten Fluoreszenzlichtes ist charakteristisch für die Atomsorte und wird mit Hilfe eines Filters bzw. Monochromators isoliert und mit einem geeigneten Detektor gemessen. Der Monochromator beseitigt dabei störende Fluoreszenz bei anderen Wellenlängen. Um die störende Eigenemission der Flamme zu eliminieren, moduliert man die Anregungsstrahlung. Damit wird vom Detektor nur das Fluoreszenzlicht registriert, das durch die Anregungsstrahlung hervorgerufen wird (Lock-In-Verstärker).
2 Arten der Atomfluoreszenz Man unterscheidet verschiedene Arten von Atomfluoreszenz: N1_Emission_Fluorimetrie2_a_BAneu.doc - 2/ 1) Resonanzfluoreszenz (Fluoreszenzstrahlung besitzt die gleiche Wellenlänge wie die absorbierte Strahlung) 2) Thermisch unterstützte Resonanzfluoreszenz 3) Direktlinienfluoreszenz (Fluoreszenz bei größeren Wellenlängen, als es der absorbierten Strahlung entspricht). Beispiel: Thallium Anregungswellenlänge 377,6 nm; Fluoreszenz 535,0 nm in metastabilen Zustand 4) Stufenweise Fluoreszenz (Das in einen höheren Zustand angeregte Atom geht zunächst durch Deaktivierung in den ersten angeregten Zustand über). Beispiel: Natrium Anregungswellenlänge 330,3 nm (3 2 S 1/2 4 2 P 3/2 ); Fluoreszenz 589,0 nm (3 2 P 3/2 3 2 S 1/2 ) 5) Thermisch unterstützte Anti-Stokes-Fluoreszenz 6) Thermisch unterstützte Direktlinien-Fluoreszenz 7) Thermisch unterstützte stufenweise Anti-Stokes-Fluoreszenz Bedeutung der AFS AFS ist eine Emissionsmethode hoher Dynamikbereich bis zu 5 Zehnerpotenzen. Daher: Erweiterung des Arbeitsbereichs z.b. bei der Quecksilberbestimmung mit Kaltdampf-AAS durch die Kaltdampf-AFS. Die strengsten Normen für die Quecksilberbestimmung in den USA und Europa basieren auf der Methode der Atomfluoreszenz. - Für die USA wurde mit der EPA Methode 1631 Mercury in Water by Oxidation, and Cold Vapor Atomic Fluorescene Spectrometry eine Bestimmungsgrenze von 0,5 ng/l bei einer Nachweisgrenze von 0,2 ng/l festgeschrieben. - Für Europa gilt die CEN TC 230, die auf Trinkwasser, Oberflächenwasser, Grund- und Regenwasser anwendbar ist. Der Arbeitsbereich hier liegt von 1 ng/l bis 0 ng/l und die dazugehörige Verfahrensnachweisgrenze bei < 1 ng/l..
3 2.6.1 Fluoreszenzspektrometrie (Molekülfluoreszenz) N1_Emission_Fluorimetrie2_a_BAneu.doc - 3/ Lumineszenz: (Oberbegriff) Emission von Licht im UV/VIS/IR nach vorangegangener Anregung des Elektronensystems. Unterscheidung nach Anregungsart: Chemolumineszenz - Anregung durch chemische Reaktionen Biolumineszenz - Anregung durch biochemische Reaktionen Thermolumineszenz - thermische Elektronenanregung Radiolumineszenz - Anregung durch - Teilchen, Ionen oder -Quanten Photolumineszenz - analytisch genutzte Anregung durch Absorption von Licht Photolumineszenz ist der Oberbegriff für Fluoreszenz und Phosphoreszenz. Fluoreszenzintensität Nach der Anregung des Elektronensystems durch Absorption existieren drei Möglichkeiten für die Rückkehr in den Grundzustand: strahlungslose Deaktivierung (Energieabgabe durch Stoß, Umwandlung in Wärme) Fluoreszenzemission (Strahlungsübergang zwischen Singulettzuständen S 1 S 0 ) Phosphoreszenz (ISC in einen angeregten Triplettzustand, Emission daraus ist spinverboten und deshalb wesentlich langsamer - µs bis s) Anzahl der emittierten Photonen F Anzahl der absorbierten Photonen Fluoreszenzquantenausbeute cd I I0 Lambert-Beer I I A Fl cd cd I0 I0 I0(1 ) von der Probe absorbiert cd F I A F I0(1 ) für A cd 0, 05 liefert Entwicklung I F I 0 (ln cd) Intensität des Fluoreszenzlichtes c Fl Kalibration erfolgt üblicherweise in einer Messreihe mit Standards Für eine vereinfachte Einpunktkalibration gilt I (Probe) I (Standard) Fl Fl c(probe) c(standard)
4 N1_Emission_Fluorimetrie2_a_BAneu.doc - 4/ Entstehung des Fluoreszenzsignals (nach Franck-Condon-Prinzip) Potentialdiagramm, Franck-Condon Prinzip Kasha-Regel: Fluoreszenz geht nur vom relaxierten (= schwingunslosen) S 1 - Zustand aus. Ungefähre Spiegelsymmetrie zwischen Absorptionsspektrum (Anregung) und Fluoreszenzspektrum (Emission) Ursache: Franck-Condon Prinzip, Schwingungsrelaxation im ps-bereich, Fluoreszenz im ns-bereich
5 Prozesse bei der Photolumineszenz (Übersicht nach Jablonskischema) Absorption A (S 0 S n ) Fluoreszenz (S 1 S 0 ) Phosphoreszenz P (T 1 S 0 strahlend)) Interne Conversion IC (S 1 S 0 ) Intersystem Crossing ISC (S 1 T 1 ) Vibronische Relaxation R, VR (Schwingungsrelaxation N1_Emission_Fluorimetrie2_a_BAneu.doc - 5/ Fluoreszenzfähigkeit und Molekülstruktur Konkurrenzprozesse: IC zum Grundzustand und ISC zum Triplettzustand. Folglich ist die Fluoreszenzquantenausbeute groß, wenn Konkurrenzprozesse vergleichsweise langsam sind. Starke Fluoreszenz: Starrer Molekülbau mit großen mesomeren Systemen und Doppelbindungen (kleine IC-Raten): Aromaten, kondensierte Aromaten, Heterocyclen, Carbonylverbindungen Keine Fluoreszenz: Flexible Moleküle (sehr schnelle IC-Raten): Halogensubstituierte Substanzen (Jod) haben meist hohe ISC-Raten. Beispiel: Chininsulfat fluoresziert, Chininhydrochlorid fluoresziert nicht
6 N1_Emission_Fluorimetrie2_a_BAneu.doc - 6/ Mitunter steigt die Fluoreszenz drastisch, wenn flexible Moleküle starr fixiert werden, z.b. durch Adsorption, Kondensation, Bildung von Komplexen. Aufbau eines Spektralfluorimeters Lichtquelle: Hochdruckgasentladungslampe (Xe, Hg, Hg(Xe)) Anregungsmonochromator: Selektion des Anregungslichtes, meist Wellenlänge des langwelligsten oder intensivsten Absorptionsmaximums der Probe Emissionsmonochromator: Messung der spektralen Verteilung des Fluoreszenzlichtes Empfänger: PMT, Korrektur der spektralen Empfindlichkeit erforderlich Küvetten: meist vierseitig polierte Quarzglasküvetten
7 Messgeometrie: a) Beobachtung unter 90 bei schwach absorbierenden Proben. Zusätzlich kann noch ein Hohlspiegel hinter der Probe angebracht werden. N1_Emission_Fluorimetrie2_a_BAneu.doc - 7/ b) Beobachtung in Re-Emission (z.b. 30 /60 ) bei stark absorbierenden oder trüben Proben, sowie bei Feststoffen. Bei einem Einfallswinkel von 53 tritt kein störender Reflex auf (Brewster-Winkel für n H2O = 1,33). Zwei unterschiedliche Messmodi (Zunächst wird meist das Absorptionsspektrum gemessen.) Anregungsspektrum Emissionsmonochromator: steht fest auf E Emissionsintensität wird als Funktion der Anregungswellenlänge A registriert: A < E Emissions/Fluoreszenzspektrum Anregungsmonochromator: steht fest auf A Emissionsintensität wird als Funktion der Emissionswellenlänge E registriert: E > A Wichtig: Fluoreszenzanregungsspektrum gleicht dem Absorptionsspektrum unter folgenden Bedingungen: Absorption der Probe muss hinreichend klein sein (A < 0,01), damit die Zahl der absorbierten Quanten proportional zur Absorption ist. Die Fluoreszenzquantenausbeute ist unabhängig von der Anregungswellenlänge (meist erfüllt). Es sind keine absorbierenden Verunreinigungen vorhanden, die zur Fluoreszenz der Substanz beitragen! Wichtiges Reinheitskriterium! Anregungs- und Emissionsspektrum von Anthrazen
8 Lösungsmittel Ethanol, Isopropanol, Acetonitril, Wasser, Dioxan, Aceton, Cyklohexan, Pentan hohe Reinheitsanforderungen: keine Eigenabsorption, keine Eigenfluoreszenz. Störungen: Quencheffekte (Fluoreszenzlöschung): z.b. gelöster Luftsauerstoff, polare Lösungsmittel oder Matrixbestandteile Selbstabsorption bei zu hoher Konzentration (keine Linearität von Fluoreszenz und Konzentration). spektrale Verschiebungen und Änderungen in der Fluoreszenzausbeute (besonders in polaren Lösungsmitteln und bei Änderung des ph-wertes) Vorteile der Fluoreszenzmessung "Null-Methode" Nachweisempfindlichkeit bis in den ppb-bereich hohe Selektivität und Spezifität (besser als bei Absorptionsmessung): Differenzierung bezüglich Anregung und Emissionswellenlänge möglich. hohe Selektivität: wenige Substanzen zeigen Fluoreszenz Messung auch in Gegenwart anderer (nichtfluoreszierender) Stoffe N1_Emission_Fluorimetrie2_a_BAneu.doc - 8/ Quantenausbeute der Fluoreszenz und Phosphoreszenz für einige wichtige Verbindungen F Fluoreszenzquantenausbeute Phosphoreszenzquantenausbeute P
9 Dreidimensionale Darstellung der Fluoreszenzspektren eines Polycyclen-Gemisches N1_Emission_Fluorimetrie2_a_BAneu.doc - 9/ Beispiel aus der Pharmazie: Protease-Hemmstoffentwicklung mit Fluoreszenzmarkern Enzyme, die Proteine spalten können, spielen eine wichtige Rolle bei der Tumorbildung. Ein potenter Protease-Hemmstoff inaktiviert z.t. die Protease. Fluoreszierender Substituent Quenchender Substituent Hemmstoff Ein Substratprotein der Protease wird zunächst mit einem Fluorophor und in räumlicher Nähe dazu mit einem quenchenden Substituenten versehen. Das so modifizierte Protein zeigt keine Fluoreszenz Aktive Protease zerschneidet das Substratprotein, u. a. zwischen Fluorophor und Quencher Fluorophor und Quencher sind nun nicht mehr durch Protein miteinander verbunden und entfernen sich voneinander. Die Fluoreszenz nimmt mit der Zeit bis zu einem Maximalwert zu. Ein potenter Protease-Hemmstoff inaktiviert z.t. die Protease. Die Fluoreszenzintensität nimmt dann nur langsam zu
10 Fluorimetrische und phosphorimetrische Nachweisgrenzen N1_Emission_Fluorimetrie2_a_BAneu.doc - / Verbindung Fluorimetrie 1. Aromatische Kohlenwasserstoffe Benzo[a]pyren Benzo [ghi]perylen Dibenz[a, c]anthracen 20 -Methyl-cholanthren 2 Aminosäuren Phenylalanin Tryptophan Tyrosin 3. Alkaloide Cocain Strychnin Reserpin Chinin Tetrahydrocannibino 4. Vitamine Folsäure Riboflavin Vitamin-A-Acetat Nachweisgrenze in µg/l ,1 0, ,1 1 Phosphorimetrie 1. Aromatische Kohlenwasserstoffe Phenanthren Coronen Triphenylen 2. Aromatische Carbonylverbindungen Benzaldehyd Benzoesäure Anthrachinon Anthron 3. Aminosäuren Phenylalanin Tryptophan Tyrosin 4. Pharmazeutjka und Alkaloide Aspirin Phenacetin Atropin Cocain Codein Morphin Nicotin
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