Thiole und Disulfide 1

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1 Thiole und Disulfide 1

2 Redoxpotential im Cytoplasma ist negativ => reduzierende Bedingunegn Glutathion ist Reduktionsmittel im Cytoplasma Glutathion reduziert Disulfide im Cytoplasma 2

3 Redox equlibria Redox shuffling: Einfügen von Disulfidbrücken in einem Redoxpuffer, meist Glutathion (GSH) und Glutathiondisulfid (GSSG). Redox equlibria 3

4 Thiolbestimmung DTNB: Dithionitrobenzoesäure: Messung bei ph Δ Absorption bei 412 nm. ε= 13,600 M -1 cm -1 pro Thiol. Riddles P.W., Blakeley R.L., Zerner B. (1983) Reassessment of Ellman's reagent, Methods Enzymol. 91, Thiolbestimmung DTP: Dithiopyridin: Messung bei ph 4; Delta Absorptionbei 343 nm. ε= 7,600 M -1 cm -1 per Thiol. Pedersen, A. O., and Jacobsen, J. (1980) Reactivity of the thiol group in human and bovine albumin at ph 3-9, as measured by exchange with 2,2'-dithiodipyridine. Eur. J. Biochem. 106,

5 Disulfidbestimmung NTSB: Nitro-sulfonobenzoesäure: Messung bei ph 9.5; Delta Absorptionbei 343 nm. ε= 13,600 M -1 cm -1 pro Dissulfid. Thannhauser TW, Konishi Y, Scheraga HA. (1987) Analysis for disulfide bonds in peptides and proteins. Methods Enzymol. 143, Cofaktoren Was kann man sehen, wie kann man Sie detektieren? 5

6 Cofaktoren Organische Cofaktoren Anorganische Cofaktoren Cofaktoren Coenzyme= Organische / Metallorganische Cofaktoren Andere Prostethische Gruppe, wenn fest/kovalent an das Protein gebunden. Apo-protein/-enzym (- p. Gruppe) Holo-protein/-enzym (+ p. Gruppe) 6

7 Einschub Absorptionsspektroskopie Viele organsiche Cofaktoren besitzen konjugierte Π Elektronen Systeme und absorbieren Licht im sichtbaren Bereich. Die Proben haben eine Farbe! Ist eine Probe gefärbt => Absorptionsspektrum Einschub Absorptionsspektroskopie Schnell, einfach, zuverlässing Beachte: Nur klare, partikelfreie Lösungen messen. Lichtstreuung beinträchtigt Spektren.=> Zentrifugieren, Filtern Lambert- Beer: A= ε c d Konzentrationsbestimmung Lambert-Beer nicht mehr linear bei zu hoher Absorption oder auch Konzentration von Molekülen (z.b. durch Lichtstreuung) 7

8 Einschub Fluoreszenzspektroskopie Schnell, einfach, zuverlässing Fluoreszenz meist sensitiver als Absorption. Einschub Fluoreszenzspektroskopie Anregungswellenlänge < Emittierte Wellenlänge Messprinzip Absorption Fluoreszenz 8

9 Einschub Fluoreszenzspektroskopie Anregungsspektrum Emittiertes Licht wird beobachtet, Anregungswellenlänge wird abgefahren / abgerastert. Emissionsspektrum Es wird bei einer Wellenlänge angeregt; das emittierte Licht wird als Spektrum aufgezeichnet. Organische Cofaktoren Häm, Chlorophylle Cofaktoren Häm b Ausgeprägte Absorption, großes konjugiertes Doppelbindungssystem Cytochrom c, ε 410 nm = M -1 cm -1 Quantifizierung / Identifizierung über Absorptionsspektren Bei Häm: Spektren oxidiert und reduziert sehr charakteristisch für unterschiedliche Häm-Spezies. Reduktionsmittel z.b. NaDithionit 9

10 Absorptionsspektren Häm, Chlorophylle Ausgeprägte Absorption, ε M -1 cm -1 Quantifizierung / Identifizierung über Absorptionsspektren Bsp. 9 Hämgruppen/Protein Wavelength [nm] Biopterin Biologisch aktiv Tetrahydrobiopterin Oxidation an Luftsauerstoff zu Dihydropterin Bsp: NO Synthase; Aromatische Aminoäuren Stoffwechsel, DOPA Synthese Nicht kovalent gebunden 10

11 Biopterin Biologisch aktiv Tetrahydrobiopterin Oxidation an Luftsauerstoff zu Dihydropterin HPLC High Performance Liquid Chromatography 11

12 HPLC High Performance Liquid Chromatography HPLC: RP = Reversed Phase Historisch: Normal Phase Normalphase bezeichnet polare Stationäre Phase und unpolare Mobile Phase; z.b. Dünnschichtchromatografie Reversed Phase bezeichnet unpolare Stationäre Phase und polare/mittelpolare Mobile Phase. 12

13 Biopterin Oxidation zu Dihydropterin = Biopterin Detektion mittels HPLC und Fluorezenz, Anregung 360 nm, Emission 450 nm. Thiamin -pyrophosphat/-diphosphat TPP/TDP Bindung Mg 2+ abhängig C-Umlagerungen Bsp. Oxidative Decarboxylierung durch Pyruvatdecarboxylase Nicht kovalent gebunden 13

14 Thiamin -pyrophosphat/-disphosphat Detektion, Quantifizierung: reine Thiamin-species über Umwandlung in Thiochrom und Fluoreszenzdetektion oder Gemische über HPLC mit Fluoreszenzdetektion; Anregung 377 nm, Emission 450 nm. Ref. J Chromatogr. 307: (1984) Flavine 14

15 Flavine Flavine FMN FAD 15

16 Flavine (Flavus, lat. gelb) Flavine Meist FMN oder FAD in Proteinen nicht kovalent aber sehr fest gebunden. Sehr sehr wenige Enzyme mit Riboflavin. Flavoprotein sind meist Redoxenzyme. Manche Enzyme binden Flavine kovalent. 1. Nachweis: per Auge und Absorptionsspektrum. Flavin fungiert als Redoxkatalyst. Kovalent gebundene Flavine 16

17 Flavine: Absorption Flavine: Absorption Absorption Flavin und andere Cofaktoren überlagern sich oft. Hier z.b. 4Fe-4S Cluster und FAD 17

18 Flavine Flavine / Redoxwechsel z.b. Reaktion mit NADH Chemisch reduziert mit NaDithionit 18

19 Flavine: Redoxmediatoren Flavine können je nach Proteinumgebung 1 e - und/oder 2 e - Elektrontransfer katalysieren. 19

20 Flavine Flavine: Analyse Proteinfällung mit z.b. Trichloressigsäure, Abzentrifugieren Überstand abnehmen und neutralisieren mit K 2 HPO 4 oder Na 2 CO 3. Entsalzen Reversed Phase HPLC, Fluoreszenzdetektion 20

21 Flavine: Analyse FMN vs FAD Fluoreszenz FMN (0.27) hat eine höhere Quantenausbeute als FAD (0.03). Isoalloxazin Fluoreszenz ist gequench t durch Adenin. Flavine: Analyse FMN vs FAD Fluoreszenz 21

22 Flavine: Analyse FMN vs FAD Fluoreszenz Flavine: Analyse FMN vs FAD Fluoreszenz 22