Möglichkeiten und Grenzen der IgG- Aviditätsbestimmungen
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- Marielies Dunkle
- vor 7 Jahren
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1 Möglichkeiten und Grenzen der - Aviditätsbestimmungen am Beispiel der Diagnostik von Infektionen mit Cytomegalievirus, Toxoplasma gondii und Parvovirus B19
2 Was verbirgt sich hinter dem Begriff Avidität? Wozu kann man die Avidität in der Diagnostik nutzen? Testsysteme zur Bestimmung von Avidität - Was können sie leisten?
3 Avidität was genau ist das eigentlich? Avidität (lat. avidus = begierig, gierig) Avidität definiert die Gesamt-Bindungsstärke, mit der eine Mischung von polyklonalen -Molekülen an multiple antigene Epitope von Proteinen bindet. Zu unterscheiden ist die Avidität von der Affinität eines Antikörpers: Affinität ist die Stärke einer einzelnen Antigen-Antikörper-Bindung (ausgedrückt durch die Dissoziationskonstante) und die Avidität ist die Gesamtheit der Affinitäten. Die Avidität reift über mehrere Monate und spiegelt die Antigen-gesteuerte Selektion von B-Zellen wider, die zunehmender Affinität produzieren. (Quellen: Prince 2014 und Wikipedia ) 3.
4 Avidität im Infektionsverlauf (Quelle: Prince 2014) 4
5 Avidität was bringt sie uns für die Diagnostik? Wer kennt sie nicht, die diagnostischen Stolpersteine? - -Negativität alleine schließt eine Infektion nicht mit Sicherheit aus (z.b. Komplexierung von Viruspartikeln mit spez. Antikörpern, z.b. - Nonresponder) - kann persistieren - ggf. aufgrund von Kreuzreaktivitäten mit anderen Erregern falsch positiv - Kreuzreaktivität durch atypische Aktivität des Immunsystems im (RF, Autoimmunerkrankung, Schwangerschaft) > d.h. niedriger Vorhersagewert von - eine negative PCR schließt eine niedrige Viruslast nicht aus - der direkte Antigennachweis kann nicht zwischen primärer und rezidivierender Infektion unterscheiden > auch die PCR ist nicht immer aussagekräftig 5
6 Avidität was bringt sie uns für die Diagnostik? Die Aviditätsbestimmung schließt die Lücken -Antikörper, die zu einem frühen Zeitpunkt nach einer Primärinfektion gebildet werden, zeigen niedrige Avidität, während Antikörper zu einem späteren Zeitpunkt nach der Infektion gebildet werden, zeigen hohe Avidität. Durch die Bestimmung der Avidität, kann der Infektionszeitpunkt einer Infektion eingegrenzt werden. Die Kenntnis des Infektionszeitpunktes ermöglicht eine Differenzierung in frische bzw. abgelaufene Infektion. Durch die Aviditätsbestimmung können unklare Screening-Ergebnisse geklärt werden. 6
7 Parvovirus B19, CMV und Toxoplasma Avditätsbestimmung als wichtiges Tool in der Schwangerschaft Vertikale Übertragung viraler Infektionen und Krankheitsbild Insbesondere in der Schwangerschaftsdiagnostik kann die Eingrenzung des Infektionszeitpunktes von extrem wichtiger Bedeutung für die Therapieentscheidung und damit für das Ausmaß der gesundheitlichen Beeinträchtigung des Neugeborenen sein. Transmissionsrate 1. Trimenon Klinische Symptomatik schwere Sypmtomatik 2. Trimenon milde Symptomatik 3. Trimenon asymptomatisch Die Transmissionsrate ist am höchsten, wenn die Infektion in der Spätschwangerschaft erworben wird. Die Schwere der Erkrankung beim Kind ist am größten, wenn die mütterliche Infektion in der Frühschwangerschaft erworben wird. 7
8 Avidität wie können wir sie nachweisen? niedrig avides, nicht jedoch hoch avides, dissoziiert in Gegenwart von Stoffen mit leicht denaturierender Wirkung auf Proteine (wie z.b. Harnstoff, Kaliumthiocyanat, Guanidinchlorid) vom Antigen Quelle: HE Prince 2014 i.d.r. ELISA und Line-Immunoassay, auch IFT (CMIA, ELFA, CLIA, ECLIA) Mikrogen hält das Patent auf Aviditäts-Bestimmung mit dem Line-Immunoassay. 8
9 recomline Parvovirus B19 [Avidity], recomline CMV [Avidity], recomline Toxoplasmose [Avidity], recomline EBV [Avidity] [IgA], Aviditätsteste bei Mikrogen (Mikrogen hält das Patent für Avidität auf Line- Immunoassays) recomline Parvovirus B19 [Avidität] recomline Toxoplasmosis [Avidität]] recomline CMV [Avidität]] recomline EBV [Avidität]] Aviditäts-Antigene 9
10 Aviditätsbestimmung mit dem recomline von Mikrogen Niedrig avide AK = akute Infektion Hoch avide AK = abgelaufene Infektion 10
11 Parvovirus B19 Klinik Typisches Erythema infectiosum der Ringelröteln, in 20 % der Fälle asymptomatischer Verlauf oder Symptome eines grippalen Infektes; ggf. generalisierte Lymphknotenschwellung Patienten, die bereits vor der Infektion mit Parvovirus B19 an einer Änamie leiden (z.b. Sichelzellanämie), haben ein erhöhtes Risiko für eine Aplastische Krise. Infektionen in der Schwangerschaft - vor der 20. Schwangerschaftswoche - steigern das Risiko einer Fehlgeburt um ca. 5%. Ca. 10 % der Hydrops fetalis-fälle sind auf eine Parvovirus-Infektion in der Schwangerschaft zurückzuführen. Seroprävalenz in Deutschland: Kinder 4-6 Jahre: 35%, Kinder Jahre: 58%, Erwachsene Jahre: 70%, Erwachsene Jahre: 79%
12 Rekombinante Parvovirus-Antigene Grundlage unserer Mikrogen- Nachweissysteme Aviditätsantigene rekombinante VP2-Partikel VP2-Partikel zeigen im Vergleich zum nativen Virus keine immunologischen Unterschiede Die Detektion von Antikörper gegen Konformations-Epitope ist wichtiger Bestandteil einer verlässlichen Diagnostik in jeder Phase der Infektion 12
13 Typischer Verlauf einer Parvovirus B19-Infektion 13
14 recomline Parvovirus B19, [Avidität] Typischer Verlauf einer Parvovirus-Infektion 14
15 Parvovirus-Diagnostik mit dem recomline Parvovirus B19 Av. cutoff VP-2p VP-N n n VP-1S VP-C VP-2r NS-1 + low + akute Infektion Screening: recomwell Parvovirus and : positiv / /- Av. VP-2p VP-1S cutoff VP-N VP-2r VP-C NS /- + h h /- + high + kurz zurückliegende Infektion Hohe Avidiät tritt frühestens 4 Wochen nach Infektion auf; eine Infektion innerhalb der letzten 4 Wochen kann ausgeschlossen werden. Screening: recomwell Parvovirus and : positiv 15
16 Parvovirus-Diagnostik mit dem recomline Parvovirus B19 VP-2p VP-1S cutoff VP-N VP-2r VP-C NS-1 Av h h + + high - akute abgelaufene Infektion Screening recomwell : positiv, : negativ VP-2p cutoff VP-N VP-1S VP-2r VP-C NS-1 Av abgelaufene Infektion Im recomline, VP2p -AK können zur Diagnose einer abgelaufenen Infektion herangezogen werden. Screening recomwell : positiv, : negativ In ca. 10% der lang zurückliegenden Infektion mit Parvovirus B19 liegt isoliertes VP-2p vor. VP-2p ist daher unerlässlich für eine zuverlässige Diagnostik. 16
17 Typischer Verlauf einer Parvovirus-Infektion 17
18 Typische Parvovirus B19- Infektionsverläufe 18
19 recomline Parvovirus B19 [Avidity], recomline Parvovirus b19 [Avidität], [IgA] Phasen-spezifische Antigene in Kombination mit (der von Mikrogen auf dem Line-Assay patentierten) Aviditäts-Bestimmung erlauben eine Charakterisierung des Infektionsstatus einer Parvovirus B19 -Infektion und eine präzise Aussage über den Zeitpunkt der Infektion Unklare Screening-Ergebnisse können durch den recomline Parvovirus B19 genauer charakterisiert und geklärt werden. einziger verfügbarer Aviditätstest für Parvovirus B19 Infektionen Parvovirus B19- Infektionen innerhalb der letzten 4 Wochen können mit der Aviditätstestung im recomline Parvovirus B19 zuverlässig ausgeschlossen werden. 19
20 Toxoplasmose in der Schwangerschaft Durchseuchung im gebärfähigen Alter: 20 Jahre 30 Jahre 40Jahre ~ 32% ~ 32% ~ 48% Konnatale Toxoplasmose: Ø 18 Fälle pro Jahr (Germany ; BfR) 5-14% mit schwerer systemischer Erkrankung 86-95% subklinisch infiziert, postenzephalitische Symptome, irreparable Spätschäden bislang kein obligatorisches Screening Retinochoroiditis vernarbt Kongenitale Toxoplasmose Toxo-Zyste in Muskelgewebe Hydrocephalus 20
21 Stufendiagnostik Toxoplasma-Antikörper-Suchtest z.b. -Screening EIA, IFT positiv -Antikörper z.b. EIA, ISAGA negativ Wiederholung des Suchtestes während der Schwangerschaft alle 8-12 Wo. negativ V.a. inaktive Infektion (latent) positiv niedrig Bewertung der Antikörperkonzentrationen hoch hoch niedrig? Titeranstieg? low responder? persistierendes niedrig niedrig hoch hoch Inaktive Infektion Abklingende Infektion Aktive Infektion Akute Infektion Bestätigungsdiagnostik z.b. EIA, Immunoblot Aviditätsbestimmung z.b. EIA = Summenavidität z.b. Immunoblot = Antigenspezifische Avidität Bestimmung des Infektionszeitpunktes 21
22 recomline Toxoplasma: der Streifen [Avidität] und [IgA] Antigene Antigene Aviditäts-Antigene Inkubation Kontrolle IgA Cut off Kontrolle Konjugatekontrolle Intensität der Banden in Relation zur Cut off-bande ROP1c MIC3 GRA7 GRA8 p30 MAG1 GRA1 rsag1 Bande Keine Reaktion Intensität schwächer als Cut off Intensität entspricht Cut off Intensität stärker als Cut off Intensität sehr stark Intensität - +/
23 recomline Toxo und Avidität Für die Bestimmung der Avidität werden 2 Teststreifen benötigt. Die Testdurchführung und Avidität MUSS im gleichen Ansatz erfolgen. Streifen Aviditätsstreifen Inkubationkontrolle Inkubationkontrolle Konjugatekontrolle IgA IgA Konjugatekontrolle Cut offkontrolle Cut off- Kontrolle ROP1c ROP1c MIC3 GRA7 GRA8 p30 MAG1 GRA1 rsag1 Vergleich der Reaktionsintensität der korrespondierenden Bande MIC3 GRA7 GRA8 p30 MAG1 GRA1 rsag1 24
24 recomline Toxoplasma: Infektionsverlauf 25
25 Aviditätsstudie: BioMerieux versus MIKROGEN 26
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28 recomline Toxoplasma [Avidität], [IgA] Unklare Screening-Ergebnisse können durch den recomline Toxoplasma genauer charakterisiert und geklärt werden. Der recomline Toxoplasma Aviditätstest kann dem Lysat-Aviditätstest in vielen Fällen überlegen sein. Phasen-spezifische Antigene in Kombination mit (der von Mikrogen auf dem Line-Assay patentierten) Aviditäts-Bestimmung erlauben eine Charakterisierung des Infektionsstatus einer Toxoplasmose-Infektion und eine präzise Aussage über den Zeitpunkt der Infektion Schwangerschafts-relevante Infektionen können zuverlässig identifiziert werden. 29
29 recomblot CMV recomline CMV [Avidität], [IgA] Bestätigung und Bestimmung des Infektionszeitpunktes AWMF- Labordiagnostik schwangerschaftsrelevanter Virusinfektionen (Prof. Modrow) - CMV-Diagnostik Screening () bei allen Schwangeren empfohlen; bei Frauen mit Exposition mit Kindern bis zum 3. Lebensjahr soll kompletter Serostatus erhoben werden ( und ); im Falle eines positiven ist die Aviditätsbestimmung indiziert. Empfehlung zur Diagnose einer Primärinfektion: Nachweis einer CMV--Serokonversion; Nachweis niedriger Avidität in Kombination mit hoch positivem ; Fehlen von gb- mittels Immunoblot in Kombination mit niedriger Avidität 30
30 CMV in der Schwangerschaft Mütterliche CMV-Infektion in der Schwangerschaft (meist asymptomatisch) Primärinfektion in ca. 1% aller Schwangeren Reaktivierung I 30-40% geringes Risiko (ca. 1%) Infektion des Feten (0,5-1% aller Neugeborenen kommen mit einer intrauterin erworbenen CMV-Infektion auf die Welt) % 5-10 % alle übrigen symptomatisch bei Geburt (intrauterine Wachstumsretardierung, Mikrozephalie, intrazerebrale Verkalkung, Hepatitis, Hepatosplenomegalie, Thrombpzytopenie) zunächst asymptomatisch, später ggf. einseitiger Hörverlust, sensorineurale Schwerhörigkeit, Entwicklungsrückstand) gesund trotzdem oft langanhaltende Virusausscheidung (Quelle: Medizinische Virologie, Hans w. Doerr und Wolfram H. Gerlich, 2. Auflage 2010) 31
31 CMV in der Schwangerschaft - Labordiagnostik Bestimmung des Immunstatus - Analyse von / und -Avidität neg / neg seronegativ - Risiko der CMV-Inf. pos / neg CMV -Avi. hoch abgelaufene Infektion (Latenz) pos / pos CMV -Avi. hoch persist. oder rekurrierende Infekt. pos / pos CMV -Avi niedrig Primärinfektion neg / pos Verdacht auf Primärinfektion Folgeserum bei Fieber, auffälligem Altraschall etc. neg / neg or pos CMV Serokonversion CMV Primärinfektion Bei Kontakt mit Kindern unter 3 Jahren Hiegiene-Anweisungen keine weiteren Schritte nötig Bestätigungstest Immunoblot anti-gb- neg CMV- pos niedrige Avidität Primärinfektion In der 21 SS-Woche: Pränatale Diagnostik Analyse auf CMV DNA Im Fruchtwasser Folgesereum Nach 10 Tagen pos / pos Primärinfektion Folgeserum nach 10 Tagen neg / pos ( falsch pos) keine Infektion Risiko der CMV-Inf. Labordiagnostik schwangerschaftsrelevanter Virusinfektionen, Sk2 Leitlinie
32 recomline CMV - Auswertung anhand eines Punkteschemas Antigen IE1 1 1 CM2 5 3 p p gb1 1 1 gb2 1 1 Summe der Punkte Testergebnis 1 2 negativ fraglich 6 4 positiv 33
33 recomline CMV - Bewertung der Avidität p150 IE1 CM2 gb2 Interpretation (I) (II) Anitkörper mit hoher Avidität im p150 und zusätzlich Antikörper mit hoher Avidität gegenüber einem weiteren Aviditäts-Antigen Nicht (I) aber Antikörper mit niedriger Avidität gegenüber mindestens 2 Aviditäts-Antigenen Verdacht auf Infektion > 12 Wochen Verdacht auf Infektion < 14 Wochen (III) Nicht (I) und nicht (II). Intermediäre Avidität für einzelne Aviditäts- Antigene oder -Titer für eine Bewertung zu niedrig keine weitere Aussage durch Aviditätstestung Aviditätsantigene 34
34 Akute Infektion (< 6-8 Wochen) - - Kontrolle Kontrolle Kontrolle Cutoff- Reakt. Kontr. IE1 CM2 p150 p65 gb1 gb2 recomline CMV Avidität (Medac) (Vidas) Patient st2 1 Av : positiv, 7 Punkte Avidität: niedrig : positiv, 8 Punkte + niedrig (< 0, 25) 20 Av : positiv, 6 Punkte Avidität: - : positiv, 8 Punkte + nd, Titer zu niedrig 19 Av : positiv, 7 Punkte Avidität: niedrig : positiv, 7 Punkte + niedrig (0,19) 35
35 Abgelaufene Infektion (> 12 Wochen, > 24 Wochen) - - Kontrolle Kontrolle Kontrolle Cutoff- Reakt. Kontr. IE1 CM2 p150 p65 gb1 gb2 recomline CMV Avidität (Vidas) <0,4 low 0,4-0,65 borderline >0,65 high st1/25 Av : positiv, 14 Punkte >6-8 Wochen Avidität hoch ( CM2, p150, gb2) > 12 Wochen : negativ bordeline/hoch (0,65) st1/93 Av : positiv, 9 Punkte > 6-8 Wochen Avidität: hoch (IE1, p150, gb2) > 12 Wochen : negativ borderline (0,57) st1/96 Av : positiv, 15 Punkte > 6-8 Wochen Avidität: hoch (p150, gb2) > 12 Wochen : negativ borderline (0,59) st1/27 Av : positiv, 7 Punkte > 24 Wochen Avidität: - : negativ hoch (0,76) 36
36 CMV - Infektionsverlauf - - Kontrolle Kontrolle Kontrolle Cutoff- Reakt. Kontr. IE1 CM2 p150 p65 gb1 gb2 Patient 13 erste Abnahme, Verdacht auf akute Infektion Av Verdacht auf Infektion < 6-8 Wochen 8,4 Wochen nach der ersten Abnahme Av Verdacht auf Infektion < 14 Wochen 26,3 Wochen nach der ersten Abnahme Av Verdacht auf Infektion > 12 Wochen 37
37 Leistungsdaten recomline CMV 38
38 Leistungsdaten recomline CMV 39
39 Einzig verfügbarer auf rekombinanten Antigenen basierender Immunoblot zur zur Bestätigung unklarer CMV-Screening- Ergebnisse Phasen-spezifische Antigene in Kombination mit (der von Mikrogen auf dem Line-Assay patentierten) Aviditäts-Bestimmung erlauben eine präzise Charakterisierung des Infektionsstatus einer CMV-Infektion Schwangerschafts-relevante Infektionen können zuverlässig identifiziert werden. 40
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41 Möglichkeiten und Grenzen der - Aviditätsbestimmung Nicht alle Antigene eignen sich für die Bestimmung der Avidität. Bei sehr lange abgelaufenen Infektionen kann die -Antwort (durch fehlende Boosterung) sehr niedrig und für die Avidiätstestung nicht ausreichend sein. Bisher keine Standardisierung in den unterschiedlichen Aviditätstests unterschiedlicher Hersteller. Die Avditätsbestimmung unterstützt Sie bei der Optimierung Ihrer Diagnostik: Sichere Differenzierung zwischen akuter und abgelaufener Infektion Weiterführende Methode bei unklaren Screeningergebnissen im Zuge der Stufendiagnostik Für die Schwangerschaftsdiagnostik unerlässliche Nachweismethode zur Identifizierung akuter, maternaler Infektionen wichtig für Therapieentscheidung und Verringerung neonataler Komplikationen und Spätschäden beim Kind 42
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