Universität Ulm. Versuch Respiration

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1 Universität Ulm Praktikum Stoffwechselphysiologie WS 2011/2012 Versuch Respiration Gruppe XY Betreuer: Praktikanten: Versuchstag: 1

2 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Theoretischer Hintergrund Mitochondrien Glykolyse Der Citratcyclus Die Atmungskette Flugmuskulatur von Insekten Die Clark-Elektrode Aufgabenstellung des Versuchs Material und Vorbereitungen Material Chemikalien Probenmaterial Geräte Vorbereitungen Herstellung der Puffer- und Substratlösungen Vorbereitung der Clark-Elektrode Durchführung der Versuche Isolierung der Mitochondrien O 2 -Messung mit der Clark-Elektrode Ergebnisse Diskussion Isolierung der Mitochondrien O 2 -Messung mit der Clark-Elektrode

3 1. Einleitung 1.1 Theoretischer Hintergrund Mitochondrien Mitochondrien sind von einer werden sie auch als Energiekraftwerke der Zelle bezeichnet, weil ihre Hauptaufgabe die Synthese von energiereichem ATP (Adenosintriphosphat) ist. ATP ist die Energiewährung der Zelle. Zu finden sind Mitochondrien vor allem in Muskelzellen und Nervenzellen, also in Geweben, die viel Energie brauchen. Doppelmembran umgebene Zellorganellen. Umgangssprachlich Aufgrund der Doppelmembran, eigener DNA, eigener Ribosomen und auch eigener mrna wird davon ausgegangen, dass diese durch Endosymbiose in die Vorläuferzellen gelangten. Dieser evolutionär bedeutsamee Vorgang ist allgemein als Endosymbiontentheorie bekannt. Der typische Aufbau eines Mitochondriums ist in Abb. 1 gezeigt. Abb. 1 Aufbau eines Mitochondriums Quelle: Die Doppelmembran ist gut zu erkennen. Bedeutsam an der inneren Membran sind die Einstülpungen, auch Cristae genannt, die zu einer deutlichen Oberflächenvergrößerung führen. Dies ist insofern wichtig, als in der inneren Membran die Proteinkomplexe der Atmungskette sitzen und dadurch mehr Platz für diese vorhanden sind und somit auch in größerem Umfang deren Reaktionen ablaufen können. Ebenfalls in der inneren Membran vorhanden sind ATP-Synthasen, die aus einem Protonengradienten zwischen dem sauren Zwischenmembranbereich und der weniger sauren Matrix, dem Raum der von der Doppelmembran umschlossen wird, ATP synthetisieren können. 3

4 Die energetische Bedeutsamkeit des Mitochondriums ergibt sich aus den katabolen Prozessen, die in ihm ablaufen und für den Energiehaushalt der Zelle unverzichtbar sind. Dazu gehören der Citratcyclus, die Atmungskette und der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex Glykolyse Die Glykolyse findet in einer eukaryotischen Zelle im Cytoplasma statt. Dabei wird Glucose abgebaut und in mehreren Schritten zu Pyruvat umgesetzt. Dabei entstehen aus einem mol Glucose netto 2 mol NADH (Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid), 2 mol ATP, 2 mol Wasser und 2 mol Pyruvat. Die genauen Reaktionen sind in Abb. 2 dargestellt. Abb. 2 Glykolyse Quelle: http: ://de.wikipedia.org/wiki/glykolyse In einem ersten Schritt wird Glucose durch ATP-Spaltung phosporyliert. Das dabei entstehende Produkt steht mit Fructose-6-Phosphat (Frau-6-P) im Gleichgewicht. Durch weitere Phosphorylierung durch ATP entsteht Fuctose-1,6-Bisphosphat (Frau-1,6-bP). Dieses zerfällt in Glycerinaldehyd-3-Phosphat (GAP) und Dihydrocyacetonphosphat (DHAP), die untereinander ebenfalls im Gleichgewicht stehen. In einem nächsten Schritt wird GAP durch die GAP-Dehydrogenase in 1,3-Biphosphoglycerat (1,3-bPG) umgesetzt. Dabei entsteht NADH und es wird anorganisches Phosphat eingebaut. Durch Übertragen beider Phosphatgruppen auf ATP und Abspalten von Wasser wird über 3-Phospho-Glycerat (3-PG), 2-Phospho-Glycerat (2-PG) und Phosphoenolpyruvat (PEP) schließlich Pyruvat (Pyr) gewonnen. 4

5 1.1.3 Der Citratcyclus Das bei der Glykolyse entstehende Pyruvat wird in der Matrix der Mitochondrien durch den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex mit Coenzym A und NAD + in NADH+H +, Acetyl-CoA und CO 2 decaboxyliert. Acetyl-CoA kann nun in den Citratcyclus eingeschleust werden. Dieser ist in Abb. 3 dargestellt. Abb. 3 Citratcyclus Quelle: //de.wikipedia.org/wiki/citratzyklus Acetyl-CoA wird hierbei mit Oxalacetat zu Citrat umgesetzt. Dabei wird Coenzym A abgespalten. Citrat wird dannn zu Isocitrat isomerisiert. Durch 2fache Decarboxylierung und Oxidation entsteht durch Aktivierung mit CoA Succinyl-CoA, welches wiederum unter GTPdurch die Succinat- Synthese und Abspalten von CoA zu Succinat reagiert. Dieses wird Dehydrogenase, die auch als Komplex II der Atmungskette bezeichnet wird, zu Fumarat oxidiert. Die abgegeben Elektronen werden direkt auf die Atmungskette übertragen, deshalb auch die Bezeichnung Komplex II. Aus Fumarat wird durch Hydratisierung Malat und daraus in einer weiteren Redoxreaktion Oxalacetat. Damit ist der Cyclus geschlossen und kann wieder von vorne beginnen. Netto entstehen im Citratcyclus aus einem 1 mol Acetyl-CoA 2 mol CO 2, 3 mol NADH, 1 mol FADH 2 und 1 mol GTP. Aus GTP kann durch Substrakettenphosphorylierung ATP gewonnen werden. Auf 1 mol Glucose bezogen entstehen jeweils die doppelten Mengen an Produkten 5

6 1.1.4 Die Atmungskette Die aus der Glykolyse und dem Citratcyclus entstandenen Reduktionsäquivalente geben ihre Elektronen schließlich in eine Elektronentransportkette an der inneren Membran des Mitochondriums ab. Diese Transportkette, welche auch als Atmungskette bezeichnet wird, besteht aus mehreren Proteinkomplexen. Dies bestehen gewöhnlich aus Fe-S-Zentren, Eine genaue Anordnung der Komplexee ist in Abb. 4 Flavoproteinen und Chinon-Cyclen. gezeigt. Abb. 4 Komplexe der Atmungskette Quelle: Komplex I wird auch als NADH-Dehydrogenase bezeichnet. Dieser Komplex besteht aus einem Flavoprotein und einem Fe-S-Protein. Dieser Komplex oxidiert NADH zu NAD + und gibt 4 Protonen in den Intermembranraum. Komplex II ist die Succinat-Dehydrogenase des Citratcyclus. Er besteht ebenfalls aus Flavinnukleotid und Fe-S-Zentren, oxidiert aber FADH 2 FAD. Es werden keine Elektronen in den Intermembranraum gepumpt. Komplex II kann durch Malonat gehemmt werden. Komplex I und II geben ihre Elektronen beide in den Chinon-Cyclus des Komplex III. Dabei werden 4 Protonen pro oxidiertem NADH in den intermembranraum gegeben. Die Elektronen werden an Cytochrom C weitergegeben. 6

7 Komplex IV nimmt die Elektronen von Cytochrom c auf, welches damit oxidiert wird und synthetisiert mit 4 Elektronen an der Matrixseite aus Sauerstoff und 4 Protonen in einer Redoxreaktion 2 H 2 O. Dabei werden 4 Elektronen in den Intermembranraum gepumpt. Der Protonengradient der im Verlauf der Atmungskette entsteht, kann durch eine ATP- Synthase in chemische Energie in Form von ATP umgewandelt werden, indem ADP zu ATP phosphoryliert wird. Dieser Prozess wird auch als Chemiosmose bezeichnet. In der Atmungskette entstehen pro mol Glucose ca ATP Flugmuskulatur von Insekten Insekten besitzen je nach Größe indirekte oder direkte Flugmuskulatur. Bei der direkten Flugmuskulatur sitzen die Muskeln direkt am Flügel an und erzeugen durch Kontraktion die Flügelschwingungen. Die Kontraktion erfolgt über direkt über Motoneuronen. Vorteil dieser Art von Flugmuskulatur ist die Möglichkeit, direkt die Frequenz und auch die Orientierung der Flügel zu steuern. Ein Nachteil ist, dass die Frequenz durch die Refraktärzeit begrenzt ist. Ein Beispiel für ein Insekt mit direkter Flugmuskulatur ist die Libelle. Bei der indirekten Flugmuskulatur wird die Flügelschwingung nicht direkt durch Kontraktion eines Muskels hervorgerufen, sondern durch Schwingung des Thorax. Dieser wird durch die Longitudinal- und die Dorsoventralmuskeln verformt. Die Erregung dieser Muskeln erfolgt nicht direkt über Aktionspotentiale, sondern durch Dehnungen, welche durch die Antagonisten erzeugt werden. Aktionspotentiale sind nur ab und zu erforderlich um die Calciumkonzentration hoch genug zu halten, welche für die Kontraktion des Muskels erforderlich ist. Der große Vorteil dabei ist, dass die Schlagfrequenz nicht durch die Refraktärzeiten nach den Aktionspotentialen begrenzt ist, außerdem hat es höchstwahrscheinlich auch einen energetischen Vorteil. Von Nachteil ist, dass Frequenz und Orientierung der Flügel nicht direkt gesteuert werden können. 7

8 1.1.6 Die Clark-Elektrode Diese Elektrode besteht aus einer Platin-Kathode und einer Silber-Anode. Diese beiden Pole sind über eine Elektrolytlösung, z.b. KCl verbunden. Die Elektrolytlösung ist mit einer Teflonmembran als O 2 -durchlässige Trennschicht gegenüber der Sauerstoffhaltigen Lösung im Reaktionsgefäß abgetrennt. Eine Beispiel- Elektrode ist in Abb. 5 gezeigt. An den Polen laufen folgende Reaktionen ab: Kathode: O e + 2 H 2 O H 2 O OH H 2 O e 2 OH Anode: 4 Ag 4 Ag + + 4e 4 Ag + + 4Cl 4 AgCl (AgCl fällt aus.) Mit einem Schreiber wird der Strom gemessen, welcher bei ablaufenden Reaktionen fließt. Dieser ist proportional zum Partialdruck von Sauerstoff. Es kann somit der Sauerstoffgehalt gemessen werden, wenn dieser zum Beispiel bei einer Mitochondrien haltigen Lösung durch die an Komplex IV der Atmungskette ablaufende Reaktion durch Zugabe von Reduktionsäquivalenten verringert wird. Dabei wird Sauerstoff zu Wasser reduziert. Abb. 5 Eine Clark-Elektrode Quelle:

9 1.2 Aufgabenstellung des Versuchs Ziel des Versuches war es, die Wirkung von Succinat, Malonat und NADH auf die Atmungskette experimentell zu bestimmen. Dazu wurden Mitochondrien in einer Pufferlösung mit den jeweiligen Testsubstanzen in einer Clark-elektrode versetzt und dann der Sauerstoffgehalt bestimmt. 2. Material und Vorbereitungen 2.1 Material Chemikalien Dikaliumhydrogenphosphat Kaliumdihydrogenphosphat Natrium EDTA Saccharose (=Sucrose) Demineralisiertes Wasser Kalilauge Kaliumchlorid NADH Succinat Malonat Probenmaterial 15 eingefrorene Schmeißfliegen Geräte Feinwaage von Sartorius, Typ: BP 121 S Waage von Sartorius, Typ PT 610 Plastikschiffchen Spatel Erlenmeyerkolben (500 ml) Messzylinder (500 ml) 2 x Eppendorftubes (1,5 ml) ph-elektrode von phenomenal, Typ: ph 1000 L Präparierbesteck (Schere und Pinzette) Petrischalen (Kunststoff) 3 x Falcon-Tubes (15 ml) Styroporbox für Eis-Wasser-Bad Ultraturrax von Janke und Kunkel, Typ: TP Thermomixer von Eppendorf, Typ: Thermomixer

10 Tropfpipette Pipetten ( µl) von Eppendorf Pipettenspitzen 1. Zentrifuge von Eppendorf, Typ: Contrifuge 5804 R 2. Zentrifuge von Sorvall, Typ: RC 5 B Plus Rührzelle mit Clark Elektrode von Rank Brothers, Typ: 200 Electronic stirrer (Reaktionskammer mit Temperiermantel, Magnetrührwerk mit Regler, Schaltblock mit Batterie als Stromquelle, Elektrode mit Coaxial-Kable zum Schaltblock, Verbindungskabel zum Schreiber-Schaltblock, Micro-Rührfisch) Schreiber von Servogor, Typ: 210 Hamiltonspritze Teflonmembran Zigarettenpapier Stativ Laborboy 2.2 Vorbereitungen Herstellung der Puffer- und Substratlösungen Damit die Lösungen die richtige Konzentration besitzen, mussten zuerst die einzelnen Bestandteile wie in Tabelle 1 angegeben mittels einer passenden Waage eingewogen werden. Für die kleinen Mengen im Milligrammbereich war die Feinwaage von Nöten. Desweiteren brauchte man für die Einwaage die Plastikschiffchen, in welche die Stoffe mittels Spatel hineingefüllt wurden. Nachdem alle Stoffe für den Suspensionspuffer genau abgewogen waren, füllte man sie in einen Erlenmeyerkolben und gab 250 ml demineralisiertes Wasser, welches zuvor mit einem Messzylinder abgemessen wurde, hinzu. Die Substratstoffe wurden direkt in jeweils ein Eppendorftube eingewogen, welches dann mit einer bestimmten Menge demineralisiertem Wasser mittels einer Pipette versetzt wurde (siehe Tabelle 1). Die Substratlösungen wurden mit Hilfe des Thermomixers gemischt, währenddessen der Suspensionspuffer mittels eines Magnetrührers vollständig gelöst wurde. Damit der ph-wert des Suspensionpuffers stimmte, mussten noch ein paar Tropfen Kalilauge zugegeben werden, bis die ph-elektrode einen Wert von 7,4 anzeigte. 10

11 Tabelle 1: Einwaagen zur Herstellung der Lösungen Lösung Substanz Konzentration Volumen Einwaage Suspensionspuff er (Gesamtvolume n: 250 ml) Dikalium- hydrogen- Phosphat Kalium- dihydrogen- Phosphat Natrium- EDTA Tatsächlich e Einwaage Tatsächlich es Volumen 4 mm 250 ml 174,2 mg 174,2 mg 250 ml 1 mm 250 ml 34,0 mg 34,0 mg 250 ml 1 mm 250 ml 93,0 mg 93,0 mg 250 ml Saccharose 320 mm 250 ml 27,4 g 27,4 g 250 ml Substratlösung NADH µm 100 µl 14,2 mg 13,4 mg 94 µl Substratlösung Succinat 2 6 µm 100 µl 54,0 mg 49,1 mg 91 µl Elektrolytlösung Kaliumchlori für Clark- 1 M 100 ml 7,5 g 7,5 g 100 ml d Elektrode Die Malonatlösung wurde nicht extra angesetzt, es wurde die Stammlösung (5 M) verwendet Vorbereitung der Clark-Elektrode Zu Beginn mussten zuerst die Elektroden vollständig mit 1 molarer Kaliumchlorid-Lösung bedeckt werden. Dies geschah mit Hilfe einer Tropfpipette. Danach wurde über die Elektroden vorsichtig Zigarettenpapier gelegt, sodass keine Luftblasen entstehen konnten. Danach gab man über das Zigarettenpapier ein Stück Teflonmembran, sodass sowohl die Silber- wie auch die Platinelektrode bedeckt waren. Um die Membran zu fixieren, legte man in die ringförmige Vertiefung der Silberanode einen passenden Gummiring. War dies erledigt konnte auf die Clark-Elektrode vorsichtig die Rührzelle aufgesetzt werden und das ganzen auf den Magnetrührer gestellt werden, so wie in der Skizze in Abbildung 6 dargestellt. Das Ganze wurde mit Hilfe des Stativs und des Laborboys fixiert. Die Kühlung wurde jedoch nicht befüllt, da dies für die kurze Dauer des Versuches kaum einen Unterschied machte. 11

12 Abb. 6: Skizze Rührzelle mit Clark-Elektrode (aus dem Skript der Physiologischen Übungen, Stoffwechselphysiologie, Versuch Respiration, der Universität Ulm) 3. Durchführung der Versuche 3.1 Isolierung der Mitochondrien Zu Beginn wurden in einer Petrischale 15 eingefrorenen Schmeißfliegen (Protophormia spec.) mit Hilfe von Pinzette und Schere der Kopf, die Beine, die Flügel und der Rumpf abgetrennt, sodass nur noch die Thoraces übrig blieben. Diese Brustkörbe wurden dann in ein Falcon-Tube überführt und der Rest verworfen. Das Falcon-Tube mit den Thoraces musste ständig in einer Styroporbox mit Eiswasser (ca. 0 C) kühlgestellt werden. Nun wurden die Fliegenbrustkörbe mit ca. 5 ml Suspensionspuffer versetzt und mit Hilfe des Ultraturraxes homogenisiert. Damit keine Überhitzung auftritt, wurde die Homogeniesierung in drei Schritten mit ca sekündigen Abkühlungspausen durchgeführt. Das Falcon- Tube war in den Bearbeitungspausen stets kühl zu lagern (Eis-Wasser-Bad). War nun die Lösung bestmöglich homogeniesiert, stellt man das Tube mit einem passenden Gegengewicht für 2 Minuten bei 5 C und ca Umdrehungen pro Minute in die Eppendorf-Zentrifuge. Der Überstand 1 wurde in ein weiteres Falcon-Tube überführt und das Semdiment 1 im Eis-Wasser-Bad kühl gestellt. Die Mitochondrien befinden sich nach der 1. Zentrifugation im Überstand 1. Diese Lösung musste erneut zentrifugiert werden, damit sich die Mitochondrien absetzten. Dies geschah in einer Sorvall Zentrifuge (Rotor: SS34, dies entspricht einer Beschleunigung von g) durch 10-minütige Zentrifugation bei Umdrehungen pro Minute (U/min) ebenfalls bei 5 C. Nun befinden sich die Mitochondrien im Sediment 2. Der Überstand 2 wird in ein neues Falcon-Tube überführt und beide Tubes kühlgestellt. Das Sediment 2 mit den Mitochondrien musst nun in ca. 5 ml Suspensionspuffer gelöst werden. 12

13 3.2 O 2 -Messung mit der Clark-Elektrode Bei den Messungen mit der Clark-Elektrode wurden jeweils Mischungen von 1,5 ml Suspensionspuffer und 0,5 ml Mitochondriensuspension für die beiden Versuche verwendet. Nach dem Befüllen wurde die Elektrode mit einem Stopfen verschlossen und an den x-t- Schreiber angeschlossen. Aus Zeitgründen wurde auf eine Kalibrierung desselben verzichtet und sofort mit den Messungen begonnen. Nach dem Einschalten des Magnetrührers und des Schreibers wurden die Testsubstanzen mit einer Hamilton-Spritze durch den Kanal des Stopfens in die Messkammer injiziert. a) Es wurden 3 µl NADH injiziert. Nach Beendigung des Schreiberausschlags wurden zusätzlich 5 µl Succinat in die Messkammer eingebracht. Vor der nächsten Messung wurden Messkammer und Stopfen mit Wasser gereinigt und die Kammer mit frischem Puffer und neuer Mitochondriensuspension befüllt. b) Nun wurden 5 µl Succinat eingebracht und kurz darauf 1 µl Malonat zugegeben. Es folgten nach einiger Zeit zwei Injektionen von jeweils 10 µl Succinat. Zum Schluss wurden 5 µl NADH injiziert. 4. Ergebnisse Die original Ergebnisse aus dem x-t-schreiber sind im Anhang zu finden. a) Kurz nach der Injektion des NADH begann der Schreiber steil nach links auszuschlagen, die Sauerstoffkonzentration sank. Das Einbringen des Succinats nach Ende des Ausschlags führte ebenfalls zu einem Ausschlag, jedoch war dieser weniger steil als der Vorherige. b) Wie schon zuvor reagierte der Schreiber auf die Zugabe des Succinats mit einem Ausschlag, dieser wurde durch die Malonatzugabe schlagartig beendet. Auch bei mehrmaliger Injektion von Succinat war kein weiterer Ausschlag zu beobachten. Erst bei Zugabe von NADH begann der Schreiber wieder nach links auszuschlagen. 13

14 5. Diskussion 5.1 Isolierung der Mitochondrien Bei der Isolierung der Thoraces musste darauf geachtet werden, dass keine Augen mit untergemischt wurden, da deren Schirmpigmente die Messungen verfälscht hätten. Bei der ersten Zentrifugation wurden grobe Fliegenbestandteile abgetrennt, bei der zweiten Zentrifugation wurden die Mitochondrien pelletiert, welche danach wieder resuspendiert wurden. 5.2 O 2 -Messung mit der Clark-Elektrode In den Mitochondrien findet die Respiration einer Zelle statt. Der terminale Elektronenakzeptor ist hier Sauerstoff. Durch die Zugabe verschiedener Substrate und die gleichzeitige Messung der O 2 - Konzentration in der Clark-Elektrode konnte der Einfluss der Substrate auf die Respiration festgehalten werden. Eine Abnahme der Sauerstoff-Konzentration in der Messkammer, also ein Ausschlagen des Schreibers nach links, stand für Respirationsaktivität. a) Das injizierte NADH gab seine Elektronen an die Elektronentransportkette ab. Am Ende der Kette wurde O 2 zu H 2 O reduziert, die Sauerstoffkonzentration in der Messzelle sank damit und der Schreiber zeigte einen Ausschlag. Als das NADH verbraucht war erreichte der Ausschlag ein Plateau. Die darauffolgende Zugabe von Succinat führte ebenso zu einem Ausschlag, jedoch ging dieser zögerlicher vonstatten als bei NADH. Dies lag daran, dass bei Succinat ein zusätzlicher Reaktionsschritt bis zur Reduktion des Sauerstoffs nötig war. b) Beim 2. Versuch sank zuerst ganz normal die Sauerstoffkonzentration als Succinat in die Messzelle eingespritzt wurde. Sofort nach der Zugabe von Malonat wurde der Sauerstoffverbrauch gestoppt. Malonat fungierte hier als Inhibitor des Enzyms Succinat- Dehydrogenase, dadurch verhinderte es die Umsetzung des Succinats und unterbrach die Respiration. Auch durch Zugabe von insgesamt 20 µl Succinat konnte der O 2 -Verbrauch nicht wieder in Gang gebracht werden. Das Succinat konnte das Malonat also nicht kompetitiv vom Enzym verdrängen, das Malonat besaß also eine sehr große Affinität zu der Succinat-Dehydrogenase. Wurde NADH zugegeben so wurde wieder O 2 verbraucht. NADH benötigte die Succinat-Dehydrogenase nicht, deshalb musste es auch nicht erst Malonat verdrängen um seine Elektronen in die Elektronentransportkette einzuspeisen. Das NADH wurde nämlich von anderen Enzymen oxidiert. 14