Analyse von Proteinkomplexen

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1 Experiment 4 4 Anlyse von Proteinkomplexen Hochsensitive Flüssigkeitschromtogrphie gekoppelt mit Tndemmssenspektrometrie Grundlge für die Entwicklung der Proteomik zw. der Hochdurchstznlyse von Proteinen sind die Ergenisse der Genomsequenzierprojekte. Zu einer drmtischen Steigerung der Sensitivität und der Geschwindigkeit, mit der sich Proteine identifizieren lssen, trug uch die Entwicklung von Methoden und Geräten zur Durchführung einer utomtisierten Tndemmssenspektrometrie (MS/MS) in Komintion mit einer Mikrokpillrflüssigkeitschromtogrphie ei. Glten früher silergefärte Gele hinsichtlich der Sensitivität ls Mß ller Dinge, ist mittlerweile ein weitus sensitiverer Nchweis von Proteinen möglich. Außerdem ietet eine utomtisierte, uf Algorithmen sierende Softwre die Möglichkeit, MS/MS-Spektren mnuell uszuwerten. Mithilfe einer komplexen Softwre lssen sich die mit der Tndemmssenspektrometrie gewonnenen Peptidspektren computergestützt mit genomischen Sequenzen vergleichen und Proteine uf diese Weise schnell und eindeutig identifizieren. Auch unterliegen die Ergenisse nicht einer Erwrtungshltung, d jedes Mssenspektrum mit llen in der Dtennk gespeicherten Sequenzen geglichen wird. Mithilfe dieses Anstzes lssen sich neue und unerwrtete Proteine us einer immer länger werdenden Liste n Proteinkomplexen, suzellulären Loklistionen und zellulären Proteome identifizieren. MS/MS ist ein sehr leistungsfähiges Verfhren zur Sequenznlyse von Peptiden in komplexen Gemischen. Bei der tndemmssenspektrometrischen Sequenzierung eines Peptids liefert ds Produktion- oder Tndemmssenspektrum die Informtion üer die Aminosäuresequenz des Peptids. MS/MS-Experimente lssen sich mit einer Vielzhl von unterschiedlichen Mssenspektrometern durchführen. In der Regel werden für die Sequenzierung von Peptiden Mssenspektrometer mit räumlich getrennten und in Reihe geschlteten Anlystoren (wie ei Triple-Qudrupol-, Qudrupol-TOF-[QTOF-] oder TOF/TOF-Mssenspektrometern) und Geräte, ei denen die Ionen direkt im ionenspeichernden Anlystor untersucht werden (wie ei Ionenfllen- und FT-ICR- [Fouriertrnsformtion-Ionencyclotronresonnz-]Mssenspektrometern), eingesetzt. Bei der Peptidsequenzierung wählt mn ein estimmtes positiv geldenes Vorläuferion us dem Vorläufermssenspektrum us, isoliert es, indem mn lle nderen Ionen lenkt, und frgmentiert ds Vorläuferion schließlich durch eine kollisionsinduzierte Dissozition (collision induced dissocition, CID), um Produktionen zu gewinnen. Eine Frgmentierung von tryptischen Peptiden mit geringer Energie findet huptsächlich n den Amidindungen entlng des Peptidrückgrts sttt, wodurch usgehend von einem Peptid eine Serie von Frgmentionen entsteht, die sich in der Msse jeweils um eine Aminosäure unterscheiden. Mn ht einige Modelle vorgeschlgen, die die Vorgänge ei der Frgmentierung eschreien, wie ds Modell des moilen Protons und ds Competition -Modell (Dongré et l 1996; Wysocki et l 2000; Pizs und Suhi 2005). Anhnd der Differenzen zwischen den Mssen der Produktionen und den eknnten Mssen der Aminosäuren wird die Peptidsequenz estimmt (s. Experiment 8). Die Frgmentierungsmuster sind ußerdem chrkteristische Signturen für die in der Proe vorhndenen Proteine und werden von den Suchlgorithmen der Dtennken für die Identifizierung der Proteine genutzt. Durch die Anwendung einer Elektrospryionisierung (electrospry ioniztion, ESI) lässt sich die Flüssigkeitschromtogrphie direkt mit der MS/MS koppeln (A. 4.1), wodurch eine mssenspektrometrische Anlyse komplexer Peptidgemische möglich wird. Peptide, die in der Chromtogrphie nhnd ihrer chemischen Eigenschften ufgetrennt wurden, werden nschließend im Mssenspektrometer nch ihren m/z-verhältnis-

2 4 64 Experiment 4 A. 4.1 Schemtische Drstellung der grundlegenden Komponenten eines NnoLC-MS/MS-Mssenspektrometers für die Proteomik. sen sepriert und einer MS/MS-Sequenznlyse unterzogen. Computergestützte Methoden ermöglichen die dtenhängige Generierung von Mssenspektren in Echtzeit und die utomtisierte Generierung von MS/ MS-Spektren. Ds Gerät ist dei so progrmmiert, dss es interessnte Vorläuferionen für die MS/MS-Anlyse uswählt. In der Regel werden die m häufigsten vorkommenden Ionen für die Frgmentierung selektiert, d sie meist MS/MS-Spektren mit strken Signlen liefern. In einer mit einer Flüssigkeitschromtogrphie gekoppelten Tndemmssenspektrometrie lässt sich eine Vielzhl von MS/MS-Spektren generieren; ei Ionenfllenmssenspektrometern sind es mehr ls vier MS/MS-Spektren pro Sekunde. Die Genomsequenzierprojekte hen eine üerwältigende Menge n Informtion geliefert, einschließlich der theoretischen Aminosäuresequenzen ller Proteine in einer großen Zhl von Orgnismen. Eine Vielzhl von Computerprogrmmen wurde entwickelt, mit deren Hilfe nichtinterpretierte Tndemmssenspektren mit Sequenzen in Protein- oder Nucleinsäuredtennken geglichen werden. Die Softwre vergleicht die experimentell gewonnenen Spektren mit theoretischen Spektren, die nhnd der Informtionen us Proteindtennken erstellt wurden, und erstellt eine Liste von Peptiden und Proteinen in der Proe. Experiment 8 ehndelt den Einstz spezifischer Suchmschinen für die Prozessierung und die Anlyse der MS/MS-Dten zur Identifizierung von Proteinen und ihrer posttrnsltionlen Modifiktionen. Am wichtigsten ist jedoch, dss ds Experiment vermittelt, wie verlässlich die von den Progrmmen gelieferten Dten zur Peptid- und Proteinidentifizierung sind. In diesem Experiment wird eine Mikrokpillrflüssigkeitschromtogrphie mit einer MS/MS gekoppelt (LC-MS/MS), um komplexe Proteingemische zu nlysieren. Ds Ziel ist, die Proteine in der Proe möglichst umfssend zu identifizieren. In vorherigen Experimenten wurden Proteinkomplexe oder Gemische reduziert und lkyliert, um die Proteine zu denturieren und die Cysteinreste zu derivtisieren und so die Bildung von Disulfidrücken zu verhindern. Die Proteinkomplexe wurden mit Trypsin gesplten und die Proteine uf diese Weise in Peptide gesplten. In dieses Experiment nlysieren wir diese Peptidgemische mithilfe einer dtenhängigen Mikrokpillr-LC-MS/MS. Für die Auftrennung von komplexen Peptidgemischen werden Umkehrphsen-Mikrokpillr-HPLC-Säulen hergestellt. Die Mikrokpillrsäule wird n eine HPLC-Pumpe ngeschlossen und mit einem Tndemmssenspektrometer verunden, ds eine ESI-Quelle verwendet. HPLC-Pumpe und Ionenfllenmssenspektrometer werden so progrmmiert, dss die Proe mit einer dtenhängigen LC-MS/MS nlysiert wird. Zuerst wird ds Mssenspektrometer für einen Vorläuferscn progrmmiert, um die m/z-verhältnisse und Mengen der Ionen zu estimmen, die von der RP-(reversed phse-)säule eluiert werden. Dnch wird ds Gerät so progrmmiert, dss die Ionen, die lut den im Vorläuferscn gewonnenen Informtionen m häufigsten vorkommen, einzeln frgmentiert werden (MS/MS). Der Zyklus us Vorläuferscn, gefolgt von einer Reihe von Frgmentierungen oder MS/MS-Scns, wird so progrmmiert, dss er sich während der gesmten Elutionsphse von der LC-Säule fortlufend wiederholt.

3 Anlyse von Proteinkomplexen 65 4 Nch dem Einstellen der Flussrte der moile Phse durch die Säule wird die Qulität von Flüssigkeitschromtogrphie und Mssenspektrometer eurteilt, indem mn ds Kontrollpeptid Angiotensin I uf die Säule lädt und einen LC-MS/MS-Luf durchführt. Nch der Verifizierung der Leistungsfähigkeit und der Sensitivität des Systems erfolgt die Anlyse der in den nderen Experimenten gewonnenen Proteinproen durch LC-MS/ MS. In ll diesen Experimenten werden die Proen mnuell uf die Mikrokpillrsäule gelden und nlysiert. Ist die LC-MS/MS eendet, speichert mn die Dten uf einen Computer, uf dem Progrmme für die Dtennkrecherche instlliert sind, und prozessiert und nlysiert die Dten, um eine Liste von Peptiden und Proteinen in der Proe zu erstellen (Experiment 8). Protokoll 1 Herstellung von Mikrokpillr-HPLC-Säulen Bei der ESI von Peptiden strömt eine sure wässrige Peptidlösung durch eine feine Ndelspitze mit geringem Durchmesser. An die Ndel wird eine hohe positive Spnnung ngelegt, wodurch die Flüssigkeit ei ihrem Austritt us der Öffnung einen sogennnten Tylor-Kegel ildet. Es entsteht zunächst ein Flüssigkeitsfden, und weiter von der Ndelspitze entfernt ilden sich kleine Tröpfchen, die den Peptidnlyten enthlten. Protonen us der suren Lösung verleihen den Tröpfchen eine positive Ldung, wodurch sie sich weiter von der Ndel entfernen und sich dem negtiv geldenen Eingng zum Mssenspektrometer nähern. Während der Bewegung verringert sich die Tröpfchengröße durch Verdunstung des Lösungsmittels, die Tröpfchen teilen sich und werden immer kleiner, sodss sich schließlich einzelne protonierte Peptide in der Gsphse efinden. Die ionisierten Peptide lssen sich mithilfe von elektrischen oder mgnetischen Feldern im Mssenspektrometer lenken und mnipulieren. Eine Umkehrphsen-(RP-)chromtogrphie (reversed-phse chromtogrphy) trennt Peptide und Proteine nhnd der Wechselwirkungen zwischen den hydrophoen Bereichen uf der Oerfläche der Biomoleküle und den nichtpolren Alkylketten, die kovlent n die sttionäre Phse geunden sind. Die RP-Chromtogrphie wird in Komintion mit einer ESI eingesetzt, d die sure wässrige Lösung der polren moilen Phse mit der ESI komptiel ist. Außerdem ist eine direkt vorgeschltete RP-HPLC nützlich, um Peptide vor der ESI zu entslzen ein zusätzlicher Offline-Entslzungsschritt entfällt dher. Eine RP-HPLC fokussiert die Peptide us verdünnten Lösungen zu engen chromtogrphischen Bnden, wodurch die Sensitivität der Methode steigt. Durch die Verwendung einer suren Lösung werden lle verfügren sischen Seitenketten in einem Peptid protoniert. Dzu gehören die minoterminlen Amine wie uch die sische Seitenketten von Lysin (K), Arginin (R) und Histidin (H). Enthält ein Peptid K-, R- oder H-Seitenketten, dnn wird es mehrfch protoniert und ist mehrfch gelden. D Trypsin Peptide uf der croxyterminlen Seite von R und K spltet, neigen diese sogennnten tryptischen Peptide zu einer zweifchen Ldung (m minoterminlen Amin und n der K- oder R-Seitenkette). Tryptische Peptide mit internen sischen Seitenketten (d.h. internem H, R-P, K-P oder Schnittstellen, die von dem Trypsin nicht gesplten wurden), trgen in der Regel eine noch höhere Ldung (z.b. +3, +4 usw.). Die Sensitivität von ESI-LC-MS/MS ist umgekehrt proportionl zur Flussrte. Die geringen Flussrten (<0,5 μl min 1 ) einer Mikrokpillr-HPLC edeuten eine um Zehnerpotenzen höhere Sensitivität ls ei einer Stndrd-RP-HPLC-Säule mit Flussrten von 50 μl min 1 oder mehr. Für eine erfolgreiche Anlyse von nur geringen Peptidmengen im Femtomol-(Nnogrmm-)ereich ist dher die Durchführung einer Mikrokpillr- HPLC erforderlich. Dieses Protokoll eschreit die Herstellung einer gezogenen Mikrokpillrsäule mit einer Öffnung von 3 μm m Ende einer Fused-Silic-(Qurzgls-)Kpillre (FSC) (A. 4.2). Ein lsergetrieener Mikropipettenzieher wird eingesetzt, um die Kpillre uszuziehen und sie so m Ende zu verjüngen. Die Verjüngung verhindert, dss ds Füllmteril us der Kpillre ustritt, sie lässt Flüssigkeit jedoch pssieren. Die usgezogene Spitze dient uch ls Auslssspitze für die ESI. Für die ESI-LC-MS/MS werden integrierte Säule und Auslssspitze mit einer Elektrospryeinheit verunden. In Protokoll 2 wird die FSC mit RP-Säulenmteril gepckt. Diese Proto-

4 4 66 Experiment 4 A. 4.2 Verschiedene Größen von RP-HPLC- Säulen, die in den LC-MS/MS-Experimenten eingesetzt werden. Für eine RP-HPLC knn eine Säule mit einem Innendurchmesser von 4,6, 1 oder 0,1 mm genutzt werden. Für die hochsensitiven LC-MS/MS-Anlysen im Rhmen der Proteomikexperimente wird in der Regel eine Fused-Silic-Kpillre mit einem Durchmesser von 0,1 mm (100 μm) verwendet, die gnz unten geildet ist. kolle dienen später (in Experiment 6) uch der Herstellung von Mikrokpillrsäulen für die multidimensionle Auftrennung von Peptiden im Rhmen von 2D-LC-MS/MS-Experimenten oder einer MudPIT. Gepckte 1D- oder 2D-Fused-Silic-Mikrokpillrsäulen sind uch im Hndel erhältlich. Mterilien Achtung: Für den korrekten Umgng mit Sustnzen, die mit einem <!> gekennzeichnet sind, siehe Anhng 11. Regenzien Methnol <!> Geräte Alkohollmpe Schneidwerkzeug für Fused-Silic-Kpillren (Chromtogrphy Reserch) Fused-Silic-Kpillre (FSC) mit 100 μm ID 365 μm OD (PolyMicro Technologies) lsergetrieener Mikropipettenzieher (z.b. P-2000 Sutter Instruments) Durchführung 1. Aschneiden von c. 46 cm FSC mit einem speziellen Schneidwerkzeug (A. 4.3,). 2. In die Mitte der Kpillre mithilfe einer Alkohollmpe ein 2,5 5 cm großes Fenster rennen; die FSC dei lngsm üer der Flmme drehen (A. 4.4). Die FSC nur soweit erhitzen, is die Polyimidschicht verkohlt ist. Zu strke Hitze eschädigt die Kpillre. 3. Awischen der verkohlten Polyimidschicht mit einem mit Methnol ngefeuchteten, fusselfreien Tuch, sodss ds Qurzgls zum Vorschein kommt (A. 4.5,). Vorsicht, ds Qurz richt sehr leicht. Es sollten lle verkohlten Reste entfernt werden. 4. Einsetzen der Kpillre in den Mikropipettenzieher und Ausrichten n den Keren (A. 4.6,); Fixieren der FSC mit den Klmmern, evor der Deckel geschlossen wird; mit folgendem Progrmm zwei Säulen ziehen: Het Velocity Dely

5 Anlyse von Proteinkomplexen 67 4 Blitzt ds rote Lserlicht und entfernen sich die eiden Klemmvorrichtungen des Geräts voneinnder, wr ds Ziehen erfolgreich. Blitzt ds Licht nicht uf, uf Stopp drücken und die FSC neu usrichten. Mn erhält zwei Fused-Silic-Kpillrsäulen, jede mit einer Verjüngung n einem Ende (A. 4.6c,d). Die Einstellungen des Pipettenziehers vriieren je nch Gerätetyp. A. 4.3 Schneiden einer Fused-Silic-Kpillre (FSC). Die FSC wird mit einem speziellen Schneidwerkzeug leicht ngeritzt. Sind Plstikmntel und Qurzgls ngeritzt, richt die FSC ei leichter Krümmung in zwei Stücke. A. 4.4 Mit einer Alkohollmpe wird die Polyimidummntelung der FSC gernnt. Die FSC wird nur so lnge üer die Flmme gehlten, is die Schicht verkohlt ist. A. 4.5 Mit einem methnolgetränkten, fusselfreien Tuch wird die verkohlte Plstikhülle vorsichtig von der FSC gewischt, sodss ds Qurzgls freiliegt. Ds freiliegende Qurzgls knn nun mithilfe eines Pipettenziehers zu zwei Mikrokpillr-HPLC-Säulen gezogen werden.

6 4 68 Experiment 4 c d A. 4.6 Lsergestützter Mikropipettenzieher von Sutter für die Herstellung von Mikrokpillr-HPLC-Säulen für NnoLC-MS/ MS-Experimente. Einsetzen der freigelegten FSC in den Pipettenzieher. Ds freigelegte, gereinigte Qurzgls wird in der Mitte des Lsers zentriert. c Zwei gezogene, leere Fused-Silic-Mikrokpillrsäulen sind für ds Pcken ereit. d Verjüngung der Spitze n einem Ende der FSC. Um ein stiles Nnoelektrospry zu erzeugen, muss die Spitze symmetrisch sein. Protokoll 2 Pcken von FSC-Mikrokpillrsäulen Mterilien Achtung: Für den korrekten Umgng mit Sustnzen, die mit einem <!> gekennzeichnet sind, siehe Anhng 11. Regenzien 5 % Acetonitril <!>, 0,1 % Ameisensäure <!> Methnol <!> Säulenfüllmteril für eine Umkehrphsensäule (Phenomenex Synergi 4u Hydro-RP 80A) Geräte Glsgefäße mit Schruverschluss, 1,8 ml (Chromtogrphy Reserch) Mikrorührfische (VWR) Mikrokpillrsäule (us Protokoll 1) pneumtischer Hochdrucksäulenfüllstnd (Eigenu, von New Ojectives oder von Next Advnce, Inc.) Linel Ultrschllgerät <!> Stereomikroskop Rührerpltte Vortex

7 Anlyse von Proteinkomplexen 69 4 Durchführung 1. Plzieren eines Mikrorührfischs in ein 1,8-ml-Glsgefäß; Zuge von 0,6 ml Methnol und 8 mg RP- Säulenfüllmteril. Die Viskosität der Suspension estimmt, wie schnell sich die Säule pcken lässt. 2. Vortexen, um ds Säulenmteril zu resuspendieren, und Ultrschllehndlung für 5 min, um ds Aggregieren der Prtikel zu verhindern. 3. Üerführen der Suspension in die Druckkmmer des Säulenfüllstnds; Plzieren der Kmmer uf einem Rührer (A. 4.7,,c); Einschlten des Rührers, um ds Säulenmteril in suspendierten Zustnd zu hlten; Aufsetzen des Kmmerdeckels durch Festziehen der Bolzen, die den Deckel mit der Kmmer verinden. Achtung: Trgen Sie eim Pcken von FSC-Säulen stets eine Schutzrille. Die Säulen werden unter sehr hohem Druck gepckt. Nicht korrekt plzierte Säulen können mit hoher Geschwindigkeit us der Kmmer geschleudert werden. Fused-Silic-Kpillrsäule (365 µm OD) Bolzen, die den Deckel mit der Kmmer verinden Vespel-Ferrule mit 1/16 0,4 mm ID in einem 1/16 -Swgelok- Fitting mit einem 1/8 - NPT-Außengewinde Regultor Dreiwegeventil Lüftungsöffnung Heliumgsflsche 1/8 -NPT-Gewinde mit einem 1/8 - Swgelok-Fitting O-Ring Gefäß mit Proe oder Füllmteril für die Säule Hlter us Teflon Rührer c A. 4.7 Schem eines Hochdrucksäulenfüllstnds für Fused-Silic-Mikrokpillr-HPLC-Säulen. Druckkmmer uf einer Rührpltte. c Mithilfe von Pinzetten wird ein Glsgefäß mit der Suspension us Methnol und Umkehrphsensäulenmteril für ds Pcken der FSC-Säule in die Kmmer eingesetzt. Ds Gefäß enthält uch einen Mikrorührfisch, um Aggregtionen während des Pckens zu verhindern.

8 4 70 Experiment 4 A. 4.8 Leere FSC-Säule, die für ds Pcken in die Druckkmmer eingeführt wurde. A. 4.9 Verwendung eines Schneidwerkzeugs, um die gezogene FSC-Säule zu öffnen. Dmit ds Säulenmteril gleichmäßig einströmen knn, ist es in der Regel notwendig, die Spitze leicht schräg nzuschneiden. Beispiel für eine nicht und eine korrekt ngeschnittene FSC-Spitze. 4. Amessen der gewünschten Füllhöhe vom gefritteten Ende us; Mrkieren der Füllhöhe uf der Säule. Eine Mikrokpillrsäule (100 μm ID 365 μm OD) wird is zu einer Höhe von 9 cm mit RP-Mteril gepckt. 5. Einführen der leeren Mikrokpillrsäule durch eine Vespel-Ferrule (Dichtkonus) in einem Swgelok- Fitting uf dem Deckel der Druckkmmer, is ds Ende den Boden des Glsgefäßes erreicht; Säule wieder leicht nch oen ziehen, sodss die Kpillre etws üer dem Boden des Glsgefäßes und dem Mikrorührfisch endet; Festdrehen der Ferrule, um die Säule zu fixieren (A. 4.8). 6. Anlegen eines Druckes n die Druckkmmer, indem mn zunächst den Regler n der Heliumgsflsche uf psi einstellt und nschließend ds Dreiwegeventil öffnet. 7. Ist die Säule usreichend lng, knn ds gefrittete Ende der Säule unter einem Stereomikroskop eochtet werden, um ds Pcken zu verfolgen; Vorsicht, die Säulenspitze ist sehr zerrechlich. Es sollte ein gleichmäßiger Strom von Säulenmteril in die Kpillre zu sehen sein. Bei gezogenen Säulen knn es notwendig sein, die Spitze für ds Pcken der Säule ein wenig zu öffnen. Dzu die Öffnung der Säule ein wenig nschneiden (A. 4.9,). Ds Schneidwerkzeug in einer leichten Aufwärtsewegung schräg n der FSC voreiführen. Nicht die Spitze direkt oen schneiden, d sie für die Herstellung des Elektrosprys notwendig ist (A. 4.10). 8. Ist die Säule is zur Mrkierung gepckt, wird der Druck in der Kmmer üer ds Dreiwegeventil lngsm gelssen. Ds lngsme Verringern des Druckes verhindert, dss sich ds Säulenmteril uflockert. 9. Ersetzen des Glsgefäßes mit der Suspension durch ein 1,5-ml-Mikrozentrifugengefäß, gefüllt mit 5 % Acetonitril, 0,1 % Ameisensäure; Spülen der Säule für 10 min mithilfe des Säulenfüllstnds.

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