Fernstudium "Molekulare Evolution" Bernhard Lieb Michael Schaffeld. Institut für Zoologie Universität Mainz

Transkript

1 Fernstudium "Molekulare Evolution" ernhard Lieb Michael Schaffeld Institut für Zoologie Universität Mainz 1

2 Ziel des Kurses Wie erhalte ich aus meinen (Sequenz-) aten einen Stammbaum, und was sagt mir dieser? Sequenz 1 Sequenz 1: KIKNFTYRHHNQLV Sequenz 4 Sequenz 2: KVEKNMTFRRFNII Sequenz 2 Sequenz 3: KIKFTYRHW-QLV Sequenz 4: KVKNFSYRHHNNVV Sequenz 3 Sequenz 5: KLKQFTFRHH-QLV Sequenz 5 2

3 Programm atenbanken Sequenzalignment Stammbaumerstellung Statistische uswertung 3

4 Warum Phylogenie? => Verständnis von phylogenetischen Zusammenhängen: Organismische Evolution Evolution von Proteinfamilien Medizin Forensik (Systematik) (Funktion) (Epidemiologie) (SI Miami) => Stammbäume 4

5 Evolution vollzieht sich durch Veränderungen GTT GGT GGTT GGGT TGT GTT GGGT TG TGTT G GGTT heute E 5

6 Gemeinsame Vorfahren Vorfahre as Leben ist nur einmal enstanden. => alle Organismen sind miteinander verwandt, d.h. haben einen Vorfahren, der in der Vergangenheit gelebt hat Nachkomme 1 Nachkomme 2 an Graur 6

7 Vorfahre (~5 MY) Einige Organismen haben einen Vorfahren, der erst vor kurzem gelebt hat. an Graur 7

8 Vorfahre (~1 MY) ndere gemeinsame Vorfahren haben früher gelebt. 8 an Graur

9 Vorfahre (1.5 MY) ber: lle Organismen haben einen gemeinsamen Vorfahren! an Graur 9

10 Hierarchie und Stammbaum GTT GGT TGGTT GGGT TGT GTT GGGT TG TGTT G GGTT heute E 1

11 (1.5 MY) (1 MY) (5 MY) an Graur 11

12 Ein korrekter Stammbaum GGGT TG TGTT G GGTT heute E 12

13 Rekonstruktion Rekonstruktion GGGT TG TGTT G GGTT aten E 13

14 as große Ziel us den aten (Sequenzen u.a.) einen Stammbaum erstellen, der die historischen Verwandtschaftsverhältnisse widerspiegelt. 14

15 Warum molekulare Phylogenie? Rekonstruktion von Verwandtschaftsverhältnissen. morphologische aten (Fossilien, Merkmale, Ontogenie ). molekulare aten (N- u. S-Sequenzen, Gene ) ie Methoden der molekularen Evolution erlauben die Extraktion der in der N bzw. den Proteinen gespeicherten Informationen. Vorteil der Sequenzdaten: - leichte Zugänglichkeit - grosse atenmenge - können aber dennoch zu falschen Ergebnissen führen! 15

16 Molekulare Phylogenie Vorgehensweise zur Stammbaumerstellung:. Evolution der Proteine Wo liegt der Ursprung eines Proteins oder einer Proteinfamilie? uswahl ähnlicher Sequenzen aus atenbanken Sequenzalignment Molekularphylogenetische nalyse Statistische Überprüfung. Evolution der Organsimen (Tree of Life) Verwandschaft bestimmter Taxa miteinander verwandt? uswahl geeigneter Sequenzen Sequenzierung (atenbanken, Klonierung, PR) Sequenzalignment usw. (wie oben) 16

17 atenbanken NI Genank J - N EML-EI SWISS-PROT PIR UniProt pdb 17

18 atenbanksuche z.. usgangspunkt: eigene ermittelte Sequenz (Query) LST (asic Local lignment Search Tool) => vergleicht zwei Sequenzen miteinander LSTN: Vergleicht eine Nukleinsäuresequenz mit Nukleinsäuredatenbank => nahe verwandte Sequenzen LSTP: Vergleicht eine minosäuresequenz mit Proteindatenbank. => entfernt verwandte Sequenzen 18

19 atenbanksuche. LSTX: Vergleicht eine Nukleinsäuresequenz translatiert in allen 6 Leserastern mit Proteindatenbank. => Für welches Protein kodiert meine Sequenz? TLSTN: Vergleicht eine minosäuresequenz mit Nukleinsäuredatenbank, die in allen 6 Leserastern translatiert wird. => findet z.. nicht annotierte Proteine in N-aten TLSTX: Vergleicht die Translationsprodukte aller 6 Leseraster einer Nukleinsäuresequenz mit den Translationsprodukten aller 6 Leseraster einer Nukleinsäuredatenbank. => z.. entfernte Verwandtschaft unbekannte N-Sequenzen 19

20 LST (asic Local lignment Search Tool) 2

21 LST (asic Local lignment Search Tool) PRXIS 1 21

22 Multiples Sequenz- lignments Gegeben: Seq Seq Seq Seq N F L S N F S N K Y L S N Y L S Indel: Gesucht: Seq Seq Seq Seq N - F L S N - F - S N K Y L S N - Y L S Insertion/eletion 22

23 LUSTLX lle Sequenzen werden paarweise miteinander verglichen erechnung der istanzen guide tree

24 LUSTLX Ähnliche Sequenzen werden zu einem luster gruppiert lignment innerhalb der luster Lücken = "gaps" 24

25 LUSTLX Sukzessives globales lignment alte Lücken = "gaps" neue Lücken = "gaps" 25

26 lignment Parameter PRXIS 1 26

27 Was ist ein Stammbaum? arstellung der Verwandtschaftsverhältnisse E F Schwestergruppen E F t t F auch "operational taxonomic units" (s) Taxon/Taxa 27

28 Phylogenetische Grundbegriffe ußengruppe (outgroup) Innengruppe (ingroup) E st (branch) ichotomie Polytomie E Wurzel (root) Knotenpunkt (node) F auch "operational taxonomic units" (s) 28

29 Mono-, Para- und Polyphylie E F Monophyletische Taxa: lle Nachkommen einer gemeinsamen Stammform Paraphyletische Taxa: Nicht alle Nachkommen einer gemeinsamen Stammform Polyphyletische Taxa: Keine gemeinsame Stammform (unterschiedliche Vorfahren) 29

30 Phylogenetische Grundbegriffe Paraphylum aufgrund von homologen (ursprünglichen) Merkmalen Schildkröten "Reptilien" Eidechsen + Schlangen Krokodile Vögel aber nicht alle Nachkommen werden erfasst 3

31 Phylogenetische Grundbegriffe Polyphylie => verschiedenen Ursprungs Neuwelt- Geier "Geier" ltwelt- Geier Raubvögel Storchenvögel aufgrund von Homoplasien (Konvergenzen) 31

32 lado-, Phylo- und endrogramm E E E F ladogramm Änderungen F Phylogramm (metrisch) F Änderungen & Zeit endrogramm (ultrametrisch) dditive Phylogramme 32

33 Stammbaum Ohne ußengruppe: Mit ußengruppe: Neunauge Hai Hai Maus Neunauge Flösselhecht Goldfisch Zebrafisch Stahlenflosser Mensch Flösselhecht Forelle Lungenfisch Molch Forelle Molch Ochsenfrosch Landwirbeltiere Ochsenfrosch Krallenfrosch Zebrafisch Goldfisch Krallenfrosch Maus Lungenfisch Mensch Evolutionsrichtung? Evolutionsrichtung 33

34 Vorgehensweise Sequenzen (Input) Multiple Sequence lignment uswahl der Methode Evolutionsmodell/lgorithmus Stammbaumberechnung Ergebnisüberprüfung (output) 34

35 Stammbaumerstellung 1. istanz-orientierte Methoden UPGM (Unweighted Pair-Group Method with rithmetric Means) Neighbor-joining Minimal Evolution => Sequenzen werden in istanzmatrix konvertiert Sequenzen Multiples lignment uswahl der Methode Evolutionsmodell/lgorithmus 2. harakter-orientierte Methoden Parsimony Maximum Likelihood => jede Position wird als informative Einheit betrachtet Stammbaumberechnung Ergebnisüberprüfung 35

36 istanz-orientierte Methoden us jedem atensatz kann eine istanzmatrix erstellt werden Zwei Schritte: 1.erechnen der paarweisen bstände zwischen den Sequenzen 2. Erstellen eines Stammbaums anhand dieser bstandsdaten Sequenzen Multiples lignment uswahl der Methode Evolutionsmodell/lgorithmus Stammbaumberechnung Ergebnisüberprüfung 36

37 erechnung einer istanzmatrix Sequenz 1 TTGTGTGTG Sequenz 2 TTTGTGTGGT Sequenz 3 TTTGGTGTGGG Sequenz 4 TGTTGGTTGT Sequenz 5 GTGTTGGGG istanz = durchschnittliche Änderung pro Position hier: 3 von 2 Positionen verändert Sequenz Sequenz Sequenz Sequenz 4..5 Sequenz 5. 37

38 Korrektur der istanzen % tatsächlicher bstand = nzahl der Mutationen Korrektur beobachteter bstand t 38

39 Korrektur der istanzen Frage: Wie korrigieren wir? Wir wollen die tatsächliche nzahl der evolutiven Ereignisse rekonstruieren. Wir brauchen also ein Evolutionsmodell, welches die Wahrscheinlichkeit von multiplen ustauschen, Rückmutationen etc. berücksichtigt. 39

40 Korrekturmodelle (Evolutionsmodell) Modelle für Proteinevolution sind meist empirisch 4

41 Evolutionsmodelle Transmembran-Proteine Globuläre Proteine K K R N 41

42 Stammbaumberechnung lustalx aten lignment Protdist neighbor istanzmatrix Stammbaum Evolutionsmodell z.. JTT; PM; LOSUM... lgorithmus z. UPGM; NJ NJ- Tree UPGM-Tree 42

43 Stammbaumberechnung output PRXIS 3 43

44 er aum 95 Ente 36 Gans 95 Taube 79 Huhn Krokodil lligator Schildkrot? 1 Mensch Wal Long branch attraction? Salamander 1 Zebrafisch Lachs 44

45 UPGM - NJ F UPGM Unweighted Pair-Group Method with rithmetric Means E ussengruppe festgelegt konstante Evolutionsrate E F NJ Neighbor Joining ussengruppe wählbar unterschiedliche Evolutionsraten 45

46 UPGM Unweighted Pair-Group Method with rithmetric Means =3 3 3 d + d 2 d + d 2 / / / / =5, / 46

47 UPGM Unweighted Pair-Group Method with rithmetric Means // Sequenz // Sequenz nimmt konstante Evolutionsraten an ußengruppe wird automatisch bestimmt 47

48 UPGM Unweighted Pair-Group Method with rithmetric Means usgangsmatrix rekonstruierte Matrix UPGM setzt absolute molekulare Uhr voraus, aber in Realität müssen Evolutionsraten berücksichtigt werden 48

49 Problem UPGM (21,7) (21,7) 25(21,7)

50 a b e Neighbor-joining NJ Star-tree E S = ( d ji )/N-1 i j d c S = Summe aller stlängen d = istanzen zwischen allen s S =78,5 S =a+b+c+d+e E E E E Paare werden kombiniert ber: Welche Paare werden kombiniert? Ziel N = nzahl NJ der => s Minimierung der Summe aller stlängen modified Star-tree S mn = [( d im +d in )/2(N-2)]+d mn /2+ d ij /N-2 i und j alle Sequenzen ausser m und n, wobei i<j S =67,7 S =81 S =76 S E =7 a b f e E d c 5

51 Neighbor-joining NJ modified Star-tree Star tree Grouping stlängen -> aumlänge -> aumlängen -> FM a b f e E d c Neues taxon () -> neue Matrix Grouping -> aumlängen stlängen -> FM Neues taxon -> neue Matrix Neues taxon (XY) -> neue Matrix Grouping stlängen Neues taxon -> aumlängen -> FM -> neue Matrix 51

52 Neighbor-joining NJ Errechnen der durchschnittlichen istanzen von jedem Taxon zu jedem anderen. ies geschieht mit folgender Formel: E E Summe Summe E E und errechnen der istanzunterschiede =d (S +S )/N-2 E E Summe Summe ,3-47, ,3-57, E E ,3-57,3-6,6-6,

53 Neighbor-joining NJ E E Summe Summe E E Reduzierte Matrix E E Summe Summe E E erechnen der stlängen nach FM Und so weiter.. 53

54 Neighbor-joining NJ final tree b=12 c=9 c f=2 a=1 d=4 g=5 e=6 E E E Summe Summe E E

55 Neighbor-joining NJ Ähnlicher lgorithmus wie UPGM Sukzessives Gruppieren der Taxa ohne Verlust eines stlängenunterschiedes Minimierung der Gesamt-stlängen des aums => Stammbaum wird aufgelöst => berücksichtigt unterschiedliche Evolutionsraten (Rekonstruierte istanzmatrix=usgangsmatrix) 55

56 Was bisher geschah... aten lignment lustalx, ialign Evolutionsmodell JTT, PM, LOSUM... istanzmatrix lgorithmus Stammbaum z. UPGM; NJ NJ FM LS ME UPGM 56

57 Statistische uswertung.oder. Wie gut passt mein Stammbaum zu den aten? häufigste Methode ist ootstrapping 57

58 ootstrapping Ziehen MIT Zurücklegen 58

59 ootstrapping Orginalsequenzen Position Sequence G T G G G T G G G T T G G T G Pseudosample 1 Position Sequence G G G G G G G G G T G G G Pseudosample 2 Position Sequence T G G G T G G G T T T G G T z.. 1 Wiederholungen 1 Stammbäume 59

60 ootstrapping Majority-rule consensus tree Taxon 1 Taxon 2 Taxon 3 Taxon 8 Taxon 9 Taxon 4 Taxon 5 Taxon 6 Taxon Freq ** ** ** **** ****** ** ****.* *****. 5..*******. 3..**...*. 1..**...* 1. 6

61 ootstrapping 61

62 Stammbaumerstellung 1. Matrix-orientierte Methoden 2. harakter-orientierte Methoden 62

63 harakter-orientierte Methoden rbeiten direkt mit dem lignment indem Nukleotide bzw. minosäuren als diskrete haraktere behandelt werden er phylogenetische Stammbaum wird anhand des Musters der Änderungen der haraktere berechnet Extrahieren mehr Information als Matrix-orientierte Methoden 1. Maximum Parsimony (MP) 2. Maximum Likelihood (ML) 63

64 Maximum Parsimony Maximaler Geiz" nnahme: Evolution ging stets den kürzesten Weg und somit wird der Stammbaum berechnet, der die wenigsten evolutiven Schritten benötigt. Methode: lle Möglichkeiten analysieren 64

65 Maximum Parsimony Position Sequenz G G T G G G T G G G T T G G T G * * * 3 mögliche Stammbäume 1 Mutationen 15 Mutationen 14 Mutationen 65

66 Maximum Parsimony ber: Ort der Mutation nicht (immer) eindeutig definiert => Parsimony kann keine stlängen berechnen. Position Sequenz G G T G G G T G G G T T G G T G G = G 2 Mutationen G 2 Mutationen 66

67 Maximum Parsimony ber: Ort der Mutation nicht immer eindeutig definiert => Parsimony kann keine stlängen berechnen. Position Sequenz G G T G G G T G G G T T G G T G = = =... 1 Mutationen 1 Mutationen 1 Mutationen 67

68 Maximum Parsimony Proteinparsimony: 1. Modell (z.. PUP): lle Substitutionen sind gleich wahrscheinlich (1 Schritt). eispiel Ile -> Trp Ile -> Met Ile -> la Modell: liegt genetischen ode zugrunde, wobei "silent site mutations" ignoriert werden (PROTPRS-Modell in PHYLIP). eispiel: Ile -> Met: T//T -> TG: ein Schritt Ile -> la: T//T -> GN: zwei Schritte Ile -> Trp: T//T -> TGG: drei Schritte 68

69 Maximum Parsimony Vorteile: gesamter atensatz Nachteile: empfindlich gegenüber: stark unterschiedliche Evolutionsraten Evolutionsmodelle eingeschränkt möglich hoher Rechenaufwand bei >2 Taxa 69

70 Maximum Parsimony Vorteile: Nachteile: gesamter atensatz empfindlich gegenüber stark unterschiedliche Evolutionsraten Evolutionsmodelle eingeschränkt möglich hoher Rechenaufwand bei >2 Taxa 7

71 Stammbaumberechnung lustalx aten lignment Protpars Evolutionsmodell kürzester Weg Maximum Parsimony Stammbaum 71

72 Stammbaumberechnung PRXIS 5 72

73 Likelihood Hypothese Ereignisse sind unabhängig lle Kopfwürfe besitzen gleiche UNEKNNTE Kopfwahrscheinlichkeit p aten: KKZKZKKZZZ L = P(aten Hypothese ) => Likelihood L( H) = pp(1-p)(1-p)p(1-p)pp(1-p)(1-p)(1-p) Keine Verteilung, Plot der selben aten (KKZKZKKZZZ) gegen verschiedene Werte von p (Hypothese) => Mit welcher Kopfwahrscheinlichkeit p bekomme ich am ehesten diese aten? Likelihood,,2,4,6,8 1, [p] 73

74 Maximum Likelihood L = P(data hypothesis) Wahrscheinlichkeit der beobachteten aten (Sequenzen!) im Lichte der Hypothese (Stammbaum). d.h, es wird der Stammbaum errechnet, der die beobachteten aten (also die alignierten Sequenzen) am besten (unter der nnahme des Modells) erklärt. Evolutionsmodell Ein aum wird generiert und man prüft dann ob die gegebenen aten den aum generieren könnenk 74

75 ML - Prinzip Sequence 1 Sequence 2 Sequence 3 Sequence 4 GG GG GTTT GGTT X,Y =, T, G, oder T G 1,,1,2,4 T 1,,3,6 1,,1 G 1, erechnen Likelihood einer aller Möglichkeiten vorgegebenen für Topologie eine Topologie 1x1x1x,1x,1=,1 ist das und Produkt eine Position aller Wahrscheinlichkeiten jeder Position 75

76 ML - eispiel: Stammbaum : Stammbaum : Gesamt"wahrscheinlichkeit": =,12427 => logl = -,9563 Gesamt"wahrscheinlichkeit": =,232 => logl = -1,

77 Maximum Likelihood Vorteile Mathematisch gut definiert Funktioniert gut in Simulationsexperimenten Erlaubt explizite Verbindung von Evolutionsmodell und aten (Sequenzen) "Realistische" nnahmen zur Evolution Verschiedene Modelle und Stammbäume lassen sich testen 77

78 Maximum Likelihood Nachteile Maximum likelihood ist nur konsistent (ergibt einen "wahren" Stammbaum) wenn die Evolution nach den gegebenen Modell ablief: Wie gut stimmt mein Modell mit den aten überein? omputertechnisch nicht zu lösen wenn zu viele Taxa oder Parameter berücksichtigt werden müssen. 78

79 Maximum Likelihood ei vielen Taxa sind computertechnisch nicht alle möglichen Stammbäume berechenbar Lösung: "Intelligente lgorithmen" - Quartet puzzling - ayessche Methode + MMM 79

80 ML, MP versus NJ und UPGM ML, MP Stammbaum vorgegeben nalyse aller Möglichkeiten diesen Stammbaum zu erhalten MP: kürzester ML: zutreffenster NJ, UPGM Sukkzessive Rekonstruktion des Stammbaumes NJ: echte Evolutionsraten UPGM: gemittelte Evolutionsraten 8

81 Stammbaumberechnung Protdist lustalx aten lignment Evolutionsmodelle neighbor istanzmatrix proml protpars NJ UPGM ML MP 81

82 Was können oder kennen wir!? harakter lignment Matrix Max.Parsimony Max. Likelihood Evolutionsmodelle istanz matrix Neigbor Joining UPGM Stammbaum 82

83 Kritik, nregungen Vorschläge Verbesserungen. oder was auch immer, bitte an ernd oder Michael 83