Tierärztliche Hochschule Hannover

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1 Tierärztliche Hochschule Hannover Effekte der exokrinen Pankreasinsuffizienz auf die Quantität und Qualität endogener Stickstoff- bzw. Protein-Verluste - geprüft an pankreasgangligierten, ileocaecal fistulierten Miniaturschweinen INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae- ( Dr. med. vet. ) vorgelegt von Harry Loock Stadtoldendorf Hannover 2010

2 Wissenschaftliche Betreuung: Univ-Prof. Dr. Josef Kamphues Institut für Tierernährung 1. Gutachter: Univ-Prof. Dr. Josef Kamphues 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Michael Wendt Tag der mündlichen Prüfung:

3 Meinen Eltern 3

4 Teile dieser Dissertation wurden bereits auf folgender Tagung vorgestellt: 11 th Conference of the European Society of Veterinary and Comparative Nutrition MOESSELER, A., LOOCK, H., CLASSEN, J., GREGORY, P.-C., KAMPHUES, J.: Investigations on the ileocaecal flux of crude protein in minipigs fed an almost N-free diet in case of reduced prececal digestion (experimentally inducted by ligation of the pancreatic duct). In: Coenen, M., I. Vervuert (Hrsg.): Congress Proceedings - 11th Congress of the European Society of Veterinary and Comparative Nutrition, Leipzig, , S. 59, ISBN

5 INHALTSVERZEICHNIS 1. Einleitung Schrifttum Protein- bzw. N-Stoffwechsel beim Schwein Aufgaben und Funktionen von N-Verbindungen im Körper Proteinbedarf N-Flux im Gastrointestinaltrakt Bedeutung der endogenen N-Verluste für die Bewertung der Verdaulichkeit 19 von Proteinen 2.2. Quantifizierung der endogenen N-Verluste Ileocaecaler Fluss von endogenem N N-Sekretion über Speichel N-Sekretion in Magen und Dünndarm (Muzine und Mukoproteine) N-Sekretion über das Pankreassekret Zusammensetzung der N-Fraktionen der Galle N-Sekretion über die Dünndarmwand Praecaecale Harnstoffsekretion und Harnstoffkonzentration im Blut Endogene N-Verluste über die Faeces sowie Aminosäurenmuster in den 32 Faeces unter den Bedingungen einer N-freien Diät Postileale endogene N-Verluste Einflüsse auf die endogene N-Ausscheidung Methoden zur Quantifizierung endogener N-Verluste Einsatz einer N-freien Diät Einsatz einer Diät mit enzymatisch hydrolysiertem Casein (EHC) Regressionsanalyse (Extrapolation der N/Rp-Aufnahme gegen Null) N-Isotopendilution Einfluss der Pankreasgangligatur auf Milieubedingungen im praecaecalen 41 und postilealen Bereich sowie den Proteinstoffwechsel und die Proteinverdauung 3. Eigene Untersuchungen Material und Methoden Versuchsziel Versuchstiere 46 5

6 3.1.3 Aufstallung und Haltung Fütterungsmanagement Fütterung Eingesetztes Mischfutter Ermittlung der Körpermasse Entnahme von Blutproben Versuchsdurchführung Chymussammlung (mit paralleler Kollektion von Kot und Harn) Kotsammlung Analyseverfahren Statistische Methoden Berechnung der Ergebnisse Eigene Ergebnisse 62 Versuchsphase A: Bestimmung der endogenen N-Abgaben über den Chymus Untersuchung des ilealen Chymus zur Bestimmung der endogenen N- 63 Anflutung am terminalen Ileum (Versuch A) Körpermasse und KM-Entwicklung Futteraufnahme (Versuch A) Chymusmasse (g us), TS-Gehalt (g/kg us) und TS-Masse (g) ph-werte im Chymus des terminalen Ileums Rohprotein- und Reinproteinkonzentration im Chymus Absolute Rohprotein- und Reinproteinanflutung am terminalen Ileum NH 3 - Konzentration im Ileumchymus und ileocaecaler Fluss von NH Aminosäuren-Konzentration (g/kg TS) und Aminosäurenmuster (%) im 80 Chymus Mikrobiologische Untersuchungen N-Ausscheidung über den Harn während der Chymussammlung (Versuch A) Harnmenge Rp- und Harnstoffkonzentration im Harn Ausscheidung von Rohprotein und Harnstoff über den Harn Kotkollektion während der Chymussammlung

7 Kotmasse g (us/ts)/d, TS-Konzentration im Kot (g/kg us) Rp-Konzentration und Rp-Ausscheidung 91 Versuchphase B: 92 Bestimmung der endogenen N-Verluste über den Kot Bestimmung der endogenen N-Verluste über den gesamten Verdauungstrakt 92 mittels Methode der Kotkollektion (Versuch B) Körpermasse Futteraufnahme (Versuch B) Kotmasse (g us/d, TS-Gehalt (g/kg us), Kotmasse (g TS/d) Rp-Ausscheidung (g/d) und Rp-Gehalt (g/kg TS) im Kot Gesamteiweiß und Harnstoff im Serum (Versuch A und B) Zusammenfassung der Ergebnisse (Versuch A und B) Diskussion Kritik der Methoden N-Gehalt des eingesetzten Versuchsfutters Futteraufnahme sowie Anflutung des Markers Cr 2 O 3 am terminalen Ileum Einfluss der N-freien Diät auf die Chymusqualität Dauer der Versuche Versuchstiere Anzahl der verwendeten Tiere Chymussammlung, sowie Kollektion von Harn und Kot (Versuche A, B) Versuch zur Bestimmung der prc. endogenen N-Abgaben Analytik Messung der NH 3 Konzentration im Chymus Harnstoffkonzentration im ilealen Chymus Berechnungen Berechnungen der Kotmengen Ausgangswerte für die Kinetik der N-Verluste und Vergleich der 111 Basalwerte bei der Kotsammlung Berechnung der Basalwerte, bzw. unvermeidlichen N-Verluste über Harn 111 und Kot Harnsammlung Erörterung der eigenen Ergebnisse Endogene N-Verluste bei Kontrolltieren mit intaktem Pankreas 113 7

8 4.2.2 Endogene N-Verluste bei PL-Schweinen Effekte der Pankreasgangligatur auf die endogenen N-Verluste Direkter Effekt der Pankreasgangligatur auf die endogenen N-Verluste Indirekte Effekte der Pankreasgangligatur auf die endogenen N-Verluste Vergleich der N-Fraktionen im ilealen Chymus der K- und PL-Tiere 122 nach Einsatz des N-freien Mischfutters Schlussfolgerungen Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis Tabellenanhang 159 8

9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS % Prozent Glu Glutamin eingetragenes Warenzeichen Gly Glycin Durchschnitt GPT Glutamat-Pyruvat- Transaminase C Grad Celsius h Stunde 5N* Sammlung im nächtlichen HF Haltungsfutter Zeitraum von Tag 5 auf Tag 6 A Amylase His Histidin Abb. Abbildung Hrsg. Herausgeber Abk. Abkürzung i- isoacc. accessorius I.E. Internationale Einheiten AG Aktiengesellschaft Ileu Isoleuzin Ala Alanin i.e.s. Im eigentlichen Sinne ANF antinutritiver Faktor i.m. intramuskulär Arg Arginin jew. jeweils Asp Aspartat K Kalium bzw. beziehungsweise kg Kilogramm ca. circa KH Kohlenhydrate Cl Chlorid KM Körpermasse Cr 2 O 3 Chromoxid K-Tiere Kontrolltiere Cys Cystin LDH Laktatdehydrogenase d Tag Leu Leuzin dest. destilliert LFGB Lebensmittel- und Futtermittel-Gesetzbuch DGE Deutsche Gesellschaft für LPS Lipopolysaccaride Ernährung DLG Deutsche landwirtschaftliche Lys Lysin Gesellschaft EHC enzymatisch hydrolisiertes Met Methionin Casein et al. et alii; und andere mg Milligramm EPI exokrine Pankreasinsuffizienz ml Milliliter Fa. Firma µl Mikroliter FFS Flüchtige Fettsäuren mmol Millimol FIP Fédération Internationale MW Arithmetischer Mittelwert Pharmaceutique FS Fettsäuren N Stickstoff g Gramm n Anzahl ges. gesättigt Na Natrium NfE Stickstoff-freie Extraktstoffe n.f. nach Farbumschlag NH 3 Ammoniak os organische Substanz Nr. Nummer p Irrtumswahrscheinlichkeit opt. optimal ph Potentia hydrogenii 9

10 Phe Phenylalanin PL pankreasgangligiert ppr. postprandial Pr Protease Rfe Rohfett Rp Rohprotein Ser Serin SD Standardabweichung sv scheinbare Verdaulichkeit Tab. Tabelle Tau Taurin Thr Threonin Try Tryptophan TS Trockensubstanz TSA Trockensubstanzaufnahme U Umdrehung us ursprüngliche Substanz Val Valin VDLUFA Verband deutscher landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten VF Versuchsfutter Vit. Vitamin VQ Verdaulichkeit Wdf. Wiederfindung 10

11 Einleitung 1. Einleitung Zur Erforschung der exokrinen Pankreasinsuffizienz (EPI) des Menschen wurde bereits vielfach auf das Schwein als Modelltier zurückgegriffen (ABELLO et al. 1989), da das porcine Verdauungssystem im Bezug auf anatomische und physiologische Gegebenheiten mit dem des Menschen eine gute Übereinstimmung aufweist und daher besonders gut zur Untersuchung ernährungsphysiologischer Fragestellungen geeignet ist. Im Rahmen des Projektes Untersuchungen am pankreasgangligierten Miniaturschwein wurden bereits Auswirkungen der EPI auf die Verdauung der verschiedenen Nährstoffe sowie mögliche Therapieansätze geprüft (TABELING 1998; FASSMANN 2001; HELDT 2001; MANDISCHER 2002; FUENTE-DEGE 2003; KAMMLOTT 2003; KARTHOFF 2004; BECKER 2005; ZANTZ 2006; CLASSEN 2008; KALLA 2009). Dabei erhielten die Schweine sowohl unterschiedliche Mischfutter als auch verschiedene substituierte Verdauungsenzyme pankreatischer und / oder mikrobieller Herkunft. Dabei erfolgte stets die Bestimmung der scheinbaren Rohprotein-Verdaulichkeit im praecaecalen Bereich sowie über den gesamten Verdauungstrakt bei Einsatz sehr verschiedener Rationen; Vorstellungen zum Einfluss der Pankreasgangligatur auf die endogene N-Sekretion im Verdauungstrakt des Schweins fehlen bisher. Zur Beurteilung der Verdaulichkeit von Proteinen unterschiedlicher Qualität und Herkunft ist die Bestimmung der prc. Rp-Verdaulichkeit erforderlich, da im Dickdarm nicht unerhebliche N-Mengen (unter anderem als Ammoniak) resorbiert werden (SAUER u. OZIMEK 1986), die jedoch bezüglich des ernährungsphysiologischen Wertes und Nutzens für das Tier mehr als fraglich sind. Daneben führen endogene N-Verluste im Gastrointestinaltrakt (GIT) auch zu einer Unterschätzung der Verdaulichkeit von Proteinen und Aminosäuren (LETERME et al. 1996). Es existieren diverse Untersuchungen (FULLER u. CROFTS 1977; MARISCAL-LANDIN et al. 1995) zu endogenen N-Verlusten (faecal/renal) an pankreasintakten Versuchstieren (u. a. Schwein und Ratte), wie auch zahlreiche Studien sowohl über die Herkunft, Sekretion und Resorption verschiedener N-Metaboliten (SOUFFRANT 1991) als auch über Abschilferungen des Darmepithels und den Einfluss der bakteriellen N-Fixierung (WÜNSCHE et al. 1991; BARTELT et al. 1999). Jedoch liegen derzeit keine Ergebnisse an Tieren mit einer EPI vor, so dass mögliche Effekte nicht bewertet werden können und eine Quantifizierung möglicher Unter- / Überschätzungen der Rp-Verdaulichkeit bei diesen Tieren aktuell nicht möglich ist. 11

12 Dabei sind gegenläufige Prozesse zu erwarten - während zum einen die endogenen N- Abgaben über das Pankreassekret bei Tieren mit experimentell induzierter EPI fehlen (und daher die endogenen N-Abgaben geringer ausfallen dürften), sind bekanntermaßen - aufgrund der deutlich reduzierten Verdaulichkeit der Nährstoffe - größere Chymusmengen sowie höhere endogene N-Verluste zu erwarten. Welcher dieser beiden Effekte schlussendlich überwiegt und die Höhe der endogenen N-Abgaben bzw. Verluste dominiert, ist aus bisher vorliegenden Studien nicht sicher abzuleiten. Um den Einfluss der Pankreasgangligatur auf die endogenen N-Verluste charakterisieren und einschätzen zu können, erfolgte in dieser Untersuchung an pankreasgangligierten (PL-Tieren) und an gesunden Kontrolltieren (K-Tiere) die Bestimmung der N-Sekretion bei Gabe einer auf Maisstärke basierenden nahezu N-freien Diät im praecaecalen und postilealen Abschnitt des Verdauungstraktes sowie über den Harn. Folgende Fragestellungen waren dabei von Interesse: Unterscheiden sich die endogenen N-Abgaben bis zum terminalen Ileum, über den gesamten Verdauungstrakt sowie über den Harn bei K- und PL-Tieren qualitativ und quantitativ? Lässt sich daraus ein direkter Effekt der Pankreasgangligatur auf die endogenen N-Verluste ableiten? Welche Schlussfolgerungen lassen sich aufgrund der hier ermittelten prc. und postilealen N- Sekretion in Bezug auf Ergebnisse vorangegangener Untersuchungen (Verdaulichkeitsstudien und Screeningtests zur Beurteilung der Wirksamkeit von Proteasen) ziehen? Welche Empfehlungen können aus den Untersuchungen zu den unvermeidbaren endogenen N-Verlusten für die bedarfsdeckende Versorgung des an EPI erkrankten Patienten abgeleitet werden? 12

13 Schrifttum 2. Schrifttum 2.1 Protein- bzw. N-Stoffwechsel beim Schwein Aufgaben und Funktionen von N-Verbindungen im Körper Unabhängig von ihrer Komplexität bestehen alle Lebewesen (vom Einzeller bis zum Säugetier) unter anderem aus Proteinen, welche als charakteristisches Merkmal Stickstoff (N) enthalten. Die Proteine selbst bestehen aus Aminosäuren. Durch Kombination der insgesamt 20 so genannten kanonischen Aminosäuren entsteht eine Vielzahl verschiedener N-haltiger Verbindungen, die im Organismus diverse lebensnotwenige Funktionen erfüllen (MURRAY u. KIRSCHNER 1991). Den größten Anteil des gesamten Proteinpools im Säugetierorganismus bildet das Muskelgewebe. Weitere Strukturproteine erfüllen Stütz- und Schutzfunktionen in Knochen, Sehnen, Muskeln, Faszien, Haut und Haaren. So gewährleistet z.b. das Faserprotein Kollagen, das einen Anteil von ca. 30 % an der Gesamtmasse aller Eiweiße im Körper hat, die hohe Zugfestigkeit von Sehnen, Knorpel, Knochen, Haut und anderen Bindegeweben. Nicht zuletzt dienen Proteine bzw. Aminosäuren jedoch auch als Energiequelle zur Aufrechterhaltung der Vitalfunktionen (unter anderem im Hungerstoffwechsel bei der Glukoneogenese) bzw. zur Deckung des Leistungsbedarfs (CAHILL 1976). Des Weiteren ist ein wenn auch mengenmäßig geringer Anteil der N-Verbindungen des Proteinpools an einer Vielzahl regulativer Aufgaben beteiligt: Transportproteine, wie z.b. Hämoglobin oder Transferrin, sichern den Transport kleiner Moleküle oder Ionen. Transportkanäle dienen dem gezielten Transfer von Substanzen in verschiedene Kompartimente des Körpers (z.b. Absorption von Nährstoffen aus dem Dünndarm in das Blut). Eine weitere wichtige Funktion von N-haltigen Verbindungen im Organismus ist die Katalyse verschiedener biochemischer Reaktionen (Enzymwirkung). Regulative Wirkungen haben unter anderem auch die Peptidhormone (z.b. Insulin, Glukagon) und weitere, der Kontrolle von Wachstums- und Differenzierungsvorgängen von Zellen im Organismus dienende N-Verbindungen sowie Proteohormone (als Botenstoffe im ZNS). Bei der Übertragung von Nervenimpulsen vermitteln Rezeptorproteine die Antwort von Nervenzellen auf spezifische Reize. Im Immunsystem sind hochspezifische Proteinmoleküle, die Antikörper, für die Abwehr von Fremdsubstanzen wie Viren, Bakterien und Zellen fremder Organismen verantwortlich (STRYER 1995). 13

14 Schrifttum Proteinbedarf Im Eiweißstoffwechsel findet ein Wechsel und Zusammenspiel von anabolen (Proteinsynthese) und katabolen (Proteolyse) Vorgängen statt. Erstere dominieren in der Wachstumsphase bis zum Erreichen des adulten Stadiums. Danach stellt sich im N-Pool des adulten, bedarfsgerecht ernährten Tieres zwischen beiden Vorgängen ein Gleichgewicht ein, wenn der Organismus kein zusätzliches Protein für Leistungen wie z.b. Trächtigkeit, Laktation oder zum Ansatz von Muskelprotein benötigt. Die zur Aufrechterhaltung der Körperfunktionen erforderliche Menge und Qualität an Nahrungsproteinen wird als Erhaltungsbedarf bezeichnet (KIRCHGESSNER 2004). Der Proteinbedarf der Schweine repräsentiert dabei, wie auch bei allen anderen Monogastriern, eher einen Bedarf an Aminosäuren als einen absoluten Proteinbedarf. Aufgrund von unvermeidbaren N-Verlusten (s. u.) und der Essentialität einzelner Aminosäuren, ist das Schwein auch im Erhaltungsstoffwechsel auf die Zufuhr von exogenem Protein mit einem geeigneten Aminosäurenmuster angewiesen. Damit werden Aminosäurenverluste ersetzt, die bei der Ausscheidung von Sekreten (z. B. im Verdauungskanal), bei der Erneuerung von Geweben wie Darmepithel, Haut und Haaren sowie über die renale Harnstoffausscheidung entstehen und daher als endogene Verluste bezeichnet werden. Um diese endogenen N-Verluste auszugleichen, benötigt ein adultes Miniaturschwein im Erhaltungsstoffwechsel täglich 0,77-0,96 g Rohprotein/kg KM 0,75 (GLODEK u. OLDIGS 1981). N-Verbindungen, welche nicht zur Synthese von Proteinen und anderen N-haltigen Biomolekülen im Organismus verwendet werden, können im Gegensatz zu Fetten im Körper nicht gespeichert werden. Übersteigt die Rp-Aufnahme den Bedarf, so werden diese Verbindungen ebenso wie bei knapper Energieversorgung des Organismus als Energiequelle im Stoffwechsel genutzt. Beim Abbau von Proteinen, beziehungsweise von Aminosäuren, entstehen im Intermediärstoffwechsel als Abbauprodukte hauptsächlich NH 3 und Derivate des Ammoniaks, wie Amine und Amide. Aufgrund seiner Toxizität wird Ammoniak in der Leber bei Säugern zu Harnstoff metabolisiert und als Endprodukt des N- Stoffwechsels renal und intestinal ausgeschieden (ENGELHARDT u. BREVES 1999). 14

15 Schrifttum N-Flux im Gastrointestinaltrakt Der N-Flux im Magen-Darm-Trakt von Schweinen bei oraler Aufnahme von Proteinen mit der Nahrung ist in Abbildung 1 schematisch dargestellt. Das mit dem Futter aufgenommene Protein (= exogenes Protein) vermischt sich im Lumen des Verdauungskanals mit N-Verbindungen endogener Herkunft, die im Wesentlichen aus Proteinen, Peptiden, freien Aminosäuren sowie Harnstoff und NH 3 bestehen (BURACZEWSKI 1986). Sie entstammen dem Speichel, diversen Magen- und Intestinalsekreten, dem Pankreassekret und der Galle (LOW u. ZEBROWSKA 1989; SOUFFRANT 1991; TAMMINGA et al. 1995) sowie desquamierten Epithelzellen der Mukosa (MOUGHAN u. SCHUTTERT 1991; SOUFFRANT 1991), welche zuvor aus exogenem Protein gebildet wurden (KRAWIELTZKI u. BOCK 1976). Eine Resorption der im Lumen des Gastrointestinaltraktes vorhandenen N-haltigen Verbindungen (sowohl endogener als auch exogener Herkunft) erfolgt vor allem im mittleren und distalen Abschnitt des Dünndarms, und lediglich zu einem sehr geringen Teil im proximalen Bereich des Blinddarms. Eine Fixierung durch Bakterien des im Lumen des GIT befindlichen Stickstoffes findet bereits in geringem Umfang im Dünndarm statt, im Wesentlichen jedoch im Dickdarm. Unabhängig von der Herkunft (exogen oder endogen) werden diese N-Verbindungen durch die dort ansässige intestinale Flora abgebaut bzw. zur Bildung von bakteriellem Protein genutzt. Das Bakterienprotein wird beim Schwein, vergleichbar den anderen Monogastriern, über den Kot ausgeschieden (s. Abbildung 1). Im proximalen Abschnitt des Dickdarms werden noch etwa 15 % der originär sezernierten endogenen N-Menge als Aminosäuren über die Epithelzellen aufgenommen (SHULMAN et al. 1995, KRAWIELITZKI et al. 1994). Eine nennenswerte Resorption von N aus dem Dickdarm erfolgt vor allem - oder fast ausschließlich - in Form von NH 3 (MASON 1984; DROCHNER u. MEYER 1991). 15

16 Schrifttum Sekretion endogener N Resorption endogener N + exogener N Kot endogener N + exogener N exogener N exogener N endogener N Bakterien N (aus exogenem & endogenem N) Fixierung von N durch Bakterien Magen Dünndarm Dickdarm Abbildung 1: Schematische Darstellung der N-Resorption und Sekretion im Magen-Darm- Trakt bei Aufnahme von Nahrungsprotein (KAMPHUES et al. 2009, modifiziert) Werden Tiere hingegen mit einem proteinfreien Futter ernährt (s. Abbildung 2), so sind die ermittelten N-Verluste per definitionem endogener Herkunft. Dabei muss hier eine gewisse Zeitspanne einkalkuliert werden, in welcher sich noch Ingesta im Lumen des GIT befindet, die ihren Ursprung in dem zuvor verabreichten N-haltigen Futter hat. Die sezernierten endogenen N-Verbindungen, die bis zum terminalen Ileum durch Resorption nicht in den N-Pool zurückgelangen, werden zu einem geringen Anteil bereits im Dünndarm, zum überwiegenden Teil jedoch im Dickdarm durch Mikroorganismen fixiert. Viele Bakterien sind in der Lage, NH 3 als ausschließliche N-Quelle für den Aufbau bakteriellen Proteins zu nutzen. Ein Teil der Mikroorganismen fixiert hauptsächlich Aminosäuren (WRONG et. al 1984). Die mikrobielle Umsetzung von N-isotopenmarkiertem Ammoniumchlorid zu Lysin im Dünndarm, welches anschließend im Ileum absorbiert wird, verdeutlicht neben der hier dominierenden enzymatischen Verdauung die Beteiligung mikrobieller Prozesse am N-Stoffwechsel im praecaecalen Bereich (TORRALLARDONA et al. 2003). Die mit dem Chymus in den Dickdarm weitergeleiteten N-Verbindungen sind zu 25 bis 30 % bakteriell gebunden (POPPE u. MEIER 1983; DROCHNER 1984). Im Unterschied zur Situation bei 16

17 Schrifttum Aufnahme von exogenem Protein (s. Abbildung 1) enthält das bakterielle Protein im Kot bei Ernährung der Versuchstiere mit einer N-freien Diät ausschließlich N endogener Herkunft (s. Abbildung 2). Sekretion Resorption Kot endogener N endogener N endogener N N-freies Futter endogener N Bakterien N (aus endogenem N) Fixierung von N durch Bakterien Magen Dünndarm Dickdarm Abbildung 2: Schematische Darstellungen der N-Resorption und Sekretion im Magen-Darm- Trakt bei Ernährung mit einer N-freien Diät (KAMPHUES et al. 2009, modifiziert) An Schweinen (18,8 kg KM 0,75 ) quantifizierten OTTO et al. (2003) bei Einsatz eines N-freien Versuchsfutters (TS-Aufnahme: 83 g TS/kg KM 0,75 ) tägliche endogene N-Verluste in Höhe von 0,21 g N/kg KM 0,75. Der wesentliche Anteil entfiel davon auf die Harnexkretion und der geringere Anteil auf die fäkale N-Ausscheidung (Harn-N: Kot-N = 60 %: 40 % nach OTTO et al. 2003; 68,5 %: 22,2 % FAO/WHO 1973). Lediglich ein sehr geringer Anteil (bis zu 9,3 %) ging dem Organismus durch Haare und Hautschuppen verloren (FAO/WHO 1973). Die endogenen N-Verluste spielen bei der Aufrechterhaltung der Aminosäurenhomöostase im Organismus sowohl für anabole als auch für katabole Stoffwechselprozesse (WU 1998; REEDS u. BURRIN 2000) eine Schlüsselrolle (FAN u. SAUER 2002). Sie werden als unvermeidliche oder basale endogene Verluste bezeichnet (s. Abbildung 3), wenn sie mit dem Erhaltungsstoffwechsel des Organismus assoziiert sind. Dieser basale endogene Protein- und Aminosäurenfluss ist unabhängig von der Art des Futters, wird jedoch durch die Höhe der 17

18 Schrifttum TS-Aufnahme beeinflusst. Dahingegen variiert der spezifische endogene Protein- und Aminosäurenfluss in Abhängigkeit von der Qualität des Futtermittels, wie z.b. dem Rohfasergehalt (SCHULZE et al. 1994; LETERME et al. 1996b) oder dem Gehalt an antinutritiven Faktoren, wie Lektinen, Tanninen und Proteaseinhibitoren (LE GUEN et al. 1995). Aminosäurenfluss proteinfreies Futter Rp- bzw. AS-Fluss aus dem Futter basaler endogener AS-Fluss spezifischer endogener AS-Fluss Aminosäurengehalt im Futtermittel Abbildung 3: Schematische Darstellung des Ursprungs des Aminosäurenflusses am terminalen Ileum (GfE 2005) In der Literatur werden die endogenen N-Verluste in verschiedenen Dimensionen angegeben: Die Bezugsgrößen sind dabei die Körpermasse der Versuchstiere (g/kg KM/Tag), die metabolische Körpermasse (g/kg KM 0,75 /d) oder die Körperoberfläche (g/m 2 /d). Eine weitere oftmals verwendete Bezugsgröße ist die Trockensubstanzaufnahme (g/kg TSA/d). Am Weitesten verbreitet sind die Dimensionen g/kg KM 0,75 sowie g/kg TSA. 18

19 Schrifttum Bedeutung der endogenen N-Verluste für die Bewertung der Verdaulichkeit von Proteinen In diesem Abschnitt soll der Hintergrund, vor dem zahlreiche Studien der letzten Jahrzehnte über endogene N-Verluste beim Monogastrier durchgeführt wurden, kurz beleuchtet werden. In vielen Studien stand die Charakterisierung des ernährungsphysiologischen Wertes von Proteinen in Futtermitteln im Vordergrund. Hierzu ist die Kenntnis der wahren Verdaulichkeit dieser Nährstoffe unverzichtbar (SCHUMANN 1985). Die Ableitung der wahren Verdaulichkeit erfordert aber, wenn keine Protein- oder AS-Markierung vorgenommen wird, die Quantifizierung der endogenen N-Verluste im praecaecalen Bereich und über den gesamten Gastrointestinaltrakt, da sich Menge und Qualität (Aminosäurenmuster) des Proteins durch fermentative Prozesse im Dickdarm verändern (SAUER u. OZIMEK 1986; SAUER u. DE LANGE 1992). Nach Korrektur der scheinbaren praecaecalen Verdaulichkeit um den unvermeidlichen (basalen) endogenen Aminosäuren- und Proteinfluss erhält man die wahre Rp-Verdaulichkeit des Futtermittels. Im Unterschied zur scheinbaren Verdaulichkeit ist diese vom Rohprotein- und Aminosäurengehalt des Futtermittels unabhängig. Wenn die wahre Verdaulichkeit sowohl um den unvermeidlichen als auch um den spezifischen endogenen Aminosäuren- und Proteinfluss korrigiert wird (s. Abbildung 3), spricht man von der realen Proteinverdaulichkeit (LOW 1982). 2.2 Quantifizierung der endogenen N-Verluste Die Bestimmung der endogenen N-Verluste im praecaecalen Bereich ist unter ernährungsphysiologischer Sicht von besonderer Bedeutung, da die Resorption von Aminosäuren (und damit ein Wiedereinschleusen in den N-Pool) beim Monogastrier im Wesentlichen im Dünndarm erfolgt. Nur ein sehr geringer Anteil von Aminosäuren (bislang nicht näher quantifiziert) wird auch noch im proximalen Bereich des Dickdarms absorbiert (KRAWIELITZKI et al. 1994). Im postilealen Abschnitt des Gastrointestinaltraktes werden aber erhebliche Mengen von NH 3 resorbiert, die letztlich sogar zu einer Belastung des Organismus (Leber) führen können. Die verschiedenen Untersuchungsmethoden beeinflussen dabei die Ergebnisse der qualitativen und quantitativen Bestimmung der N-Fraktion 19

20 Schrifttum (s. Kapitel 2.3). Beispielsweise werden mit einer enzymatisch hydrolysiertes Casein (EHC) enthaltenden Diät signifikant höhere N-Mengen ermittelt (s. Tabelle 1) als bei Einsatz eines N-freien Versuchsfutters (BUTTS et al. 1993b; HODGINSON et al. 2000). Nachfolgend werden die verschiedenen N-Quellen der endogenen N-Abgabe beim Schwein im praecaecalen Bereich des Magen-Darm-Traktes ausführlicher beschrieben Ileocaecaler Fluss von endogenem N Im Folgenden wird auf die endogene N-Anflutung im praecaecalen Bereich zunächst allgemein und darauf folgend bezüglich Herkunft, Quantität und Qualität differenzierend eingegangen. Über Sekrete und Abschilferungen von Epithelzellen des Darms gibt ein Schwein (21,6 kg KM 0,75 ) bei Einsatz einer N-freien Diät täglich 0,84-1,0 g N/kg KM 0,75 in das Dünndarmlumen ab (DE LANGE et al. 1989a), wobei etwa % des Stickstoffs praecaecal resorbiert werden, so dass 0,63-0,75 g N/kg KM 0,75 in den N-Pool des Tieres zurückgelangen (SOUFFRANT 1991; SOUFFRANT et al. 1993; KRAWIELITZKI et al. 1994). In der Digesta am terminalen Ileum verbleiben demnach 0,21-0,25 g N/kg KM 0,75 endogener Herkunft. Die endogene N-Abgabe über den ilealen Chymus variiert bei Schweinen zwischen 2,22 (WÜNSCHE et al. 1987) und 3,17 g/kg TSA (DE LANGE et al 1989a) und ist mit der prc. endogenen N-Sekretion (bei N-freier Fütterung: 2,01 g/kg TSA) von Menschen vergleichbar (MOUGHAN et al. 2005). Studien über die endogenen N-Verluste (prc./gesamter Verdauungstrakt) von HODGKINSON et al. (2000, 2003) verdeutlichen, dass bei Einsatz einer EHC-Diät sowohl bei Schweinen als auch bei Menschen ein deutlich höherer ileocaecaler N-Fluss und eine höhere N-Exkretion über den Harn im Vergleich zu Untersuchungen unter Verwendung einer N-freien Diät bestimmt werden. Allerdings unterscheidet sich die N-Ausscheidung über den Kot (bei N-freier Ernährung: 1,02; bei Fütterung der EHC-Diät: 1,05 g/kg TSA) bei vergleichender Anwendung beider Diäten kaum (OTTO et al. 2003). Die Ergebnisse von WÜNSCHE et al. (1987), die aus 17 verschiedenen Studien unter Anwendung des Ausreißertests berechnet wurden, zeigen, dass die fäkale N-Ausscheidung (1,36 g/kg TSA) etwa der Hälfte des ileocaecalen N-Flusses (2,22 g/kg TSA) entspricht. 20

21 Schrifttum Die endogene N-Menge, die vom Dünndarm in den Dickdarm fließt besteht aus folgenden Fraktionen: N-Fraktionen des Ileumchymus Die mit der Ingesta in den Dickdarm flutenden praecaecal unverdauten bzw. nicht reabsorbierten N-Verbindungen bestehen vor allem aus dekonjungiertem Glycin, Mukoproteinen und abgeschilferten Epithelzellen, welche nach Eintritt in den Dickdarm fermentativen Prozessen unterliegen (FULLER u. CADENHEAD 1991; MOUGHAN u. SCHUTTERT 1991). Obwohl die endogenen N-Verluste bei N-freier Ernährung beim Schwein deutlich geringer sind als bei Fütterung einer Diät mit einem niedrigen Anteil eines hochverdaulichen Proteins wie Casein (s. Tabelle 1), sind die Anteile der verschiedenen N-Quellen an den endogenen Verlusten (Tabelle 1) bei beiden Untersuchungsverfahren ähnlich (MINIER-WILLIAMS et al. 2009). Tabelle 1: N-Fraktionen im Ileumchymus bei gesunden Schweinen bei Ernährung mit einer EHC-Diät mit einem niedrigen N-Anteil (ges. pc. N-Abgabe: 100 %) proteingebundener-n (73 %) NPN (27%) bakteriell fixiert Epithelzellen lösliches freies Protein Muzin gebunden DNA Harnstoff NH 3 Kreatin * 44,7 4,90 13,4 10,4 0,20 5, ,80 8,30 1 :KM: 79 ± 4,8 kg (MINIER-WILLIAMS et al. 2009) *: unbestimmt EHC: Enzymatisch hydrolisiertes Casein Beim gesunden Schwein besteht bei Ernährung mit einer stärkereichen Diät der proteingebundene Anteil der endogenen N-Verbindungen in der Digesta des terminalen Ileums zu 25 bis 45 % aus bakteriellem Protein (WÜNSCHE et al. 1987; BARTELT et al. 1994), zu etwa 11 % aus muzingebundenem Protein (MINER-WILLIAMS et al. 2009) als auch aus abgeschilferten Epithelzellen und frei löslichem Eiweiß (SNOOK 1973). Die NPN-Fraktion besteht vermutlich sowohl aus freien Aminosäuren, Nukleinsäuren (RNA), und kleinmolekularen N-Verbindungen wie Harnstoff, Aminen und Amiden (MOSENTHIN et al. 1994), als auch aus Kreatinin, Bilirubin und Biliverdin (MINER-WILLIAMS et al. 2009). 21

22 Schrifttum Jedoch haben freie Aminosäuren mit 5-6 % und peptidgebundene Aminosäuren nur einen geringen Anteil an der gesamten endogenen N-Ausscheidung, was sich zum Einen durch die hohe Resorptionsrate der Aminosäuren im Dünndarm erklärt (MOUGHAN u. SCHUTTERT 1991). Zum Anderen verringert sich sowohl die Sekretion von Aminosäuren (Recyclierung) als auch die Diffusion kleinerer N-Metabolite wie Harnstoff (und Ammoniak) in das Darmlumen, wenn dem intermediären N-Stoffwechsel bei Ernährung mit einer N-freien Diät weniger Aminosäuren zur Verfügung stehen (BARTELT et al. 1994). Im Folgenden werden die N-Abgaben differenziert erläutert, wobei die Gliederung im Allgemeinen dem Weg durch den Verdauungstrakt folgt (Maulhöhle, Magen, Dünndarm, Dickdarm) N-Sekretion über Speichel Mit dem Sekret der Speicheldrüsen vermischt sich schon bei der Aufnahme üblichen Futters, d.h. bereits während der Nahrungsaufnahme zu Beginn der Verdauung, Stickstoff endogener Herkunft mit dem aufgenommenen Nahrungsprotein. Die Speichelbildung wird unter anderem durch die Höhe der Futteraufnahme und die Konfektionierung des Futters beeinflusst. Bei Aufnahme eines Flüssigfutters (TS-Gehalt ca. 30 %) ist die gebildete Speichelmenge ca. dreimal bis viermal geringer als bei dem Einsatz eines Trockenfutters (TKACEV 1980; KAMPHUES et al. 2009). An wachsenden Schweinen (17,4 kg KM 0,75 ), die ein Flüssigfutter (Futter:Wasser = 1:1) erhielten, ermittelte CORRING (1980) mittels einer Oesophagusfistel eine N-Sekretion über den Speichel von 23 mg N/kg KM 0,75 in 24 Stunden. Zu ähnlichen Ergebnissen (25,2-31,3 mg N/KM 0,75 ) kamen auch JUSTE (1982) in Studien an Schweinen mit einer etwas geringeren KM (12,8-15,9 kg KM 0,75 ). Im glykoproteinhaltigen Speichel sind N-haltige Verbindungen wie Enzyme (vor allem Amylase), freie Aminosäuren, Harnstoff, Harnsäure sowie geringe Mengen an Serumproteinen (Albumine, Globuline) enthalten (ELLISON 1967) N-Sekretion in Magen und Dünndarm (Muzine und Mukoproteine) Die N-Sekretion im Magen und Dünndarm erfolgt vor allem über Mukoproteine als Bestandteile von Muzinen und nur zu einem geringeren Teil in Form desquamierter Epithelzellen. Obwohl Muzine hauptsächlich aus Kohlenhydraten (Oligosacchariden) 22

23 Schrifttum bestehen, tragen sie dennoch erheblich zur N-Sekretion im praecaecalen Bereich bei (LIEN et al. 1997). Um dies zu verdeutlichen, wird in diesem Unterkapitel zur Übersicht neben der N- Sekretion auch auf die chemische Zusammensetzung der Muzine eingegangen. Muzine werden zum Schutz der Schleimhaut des Gastrointestinaltraktes vor chemischen und mechanischen Einwirkungen sezerniert und bestehen im Wesentlichen aus so genannten Aminozuckern (Aminosäuren, die mit einem Kohlenhydratrest wie Fruktose, Galaktose bzw. Glukose verbunden sind). Entsprechend ihrer Funktion, d.h. zum Schutz der Schleimhaut, werden Muzine aufgrund ihres Aufbaus nur zu einem geringen Teil von den proteolytischen Enzymen hydrolysiert. Diese Schutzfunktion wird durch eine Ummantelung des Mukoproteins der Muzine mit Oligosacchariden gewährleistet (HOSKINS 1984). Von der am terminalen Ileum angefluteten Rp-Menge stammen etwa 11 % aus Muzinen (HOSKINS 1984; LIEN et al. 1997), wobei die Aminosäuren Threonin, Serin und Prolin dominieren (SOUFFRANT 1991; LIEN et al. 1997). Obwohl nur 5-11 % der gesamten endogenen Aminosäurenmenge in der ilealen Digesta aus Muzinen (Mukoproteinen) stammen, ließen sich die erheblichen Anteile der Aminosäuren Threonin (28-35 %), Serin (13-16 %) und Prolin (7-24 %) an der endogenen Aminosäuren-Flussmenge in der ilealen Digesta auf die Muzinsekretion zurückführen (LIEN et al. 1997). Nach LIEN et al. (1997) beträgt die praecaecale Muzinabgabe beim Schwein (20,2 kg KM 0,75 ) nach Einsatz eines proteinfreien Futters über einen Zeitraum von acht Tagen und intravenöser Zugabe einer kochsalzhaltigen, respektive aminosäurenhaltigen Lösung 5,32 bis 5,56 g/24 h. Dies entspricht einer Menge von ca. 0,26 g bis 0,28 g /kg KM 0,75 pro Tag. Hierbei hatten die unterschiedlichen Infusionslösungen keinen Einfluss auf den Proteinanteil der Muzine. Davon entstammen 27 % aus dem Magen und 73 % aus dem Dünndarm. Aus dieser Muzinmenge (5,2-5,6 g/d) mit einer N-Konzentration 5,55-5,62 % lässt sich bei einer Körpermasse von 20,2 KM 0,75 eine tägliche N-Ausscheidung (0,29-0,32 g N/d) von etwa 15 mg /kg KM 0,75 ableiten (LIEN et al. 1997). Die mittels 14 C-Leuzin-Tracertechnik ermittelte tägliche endogene N-Exkretion über Speichel und Magensaft beträgt beim Schwein (14,4 kg KM 0,75 ) 226 mg N pro kg KM 0,75 (SIMON et al. 1986). Demnach stammen ca. 200 mg N pro kg KM 0,75 aus dem Magen (Verhältnis von Speichel-N zu Magen-N = 1:10). 23

24 Schrifttum N-Sekretion über das Pankreassekret Die N-Sekretion über den Pankreassaft kann durch Katheterisierung oder Fistulierung des Pankreasausführungsganges quantifiziert werden (HEE et al. 1985; PIERZYNOWSKI et al. 1988, 1990; THAELA et al. 1995). Diese Methoden ermöglichen neben der quantitativen Kollektion zudem die Gewinnung von Probenmaterial zur weiteren qualitativen Untersuchung und Charakterisierung. Zusammensetzung und Sekretion von Pankreassaft Verschiedenste Faktoren beeinflussen die Zusammensetzung des Pankreassekretes: Alter der Tiere, Stimulation der Sekretion, Zusammensetzung des Futters (CORRING u. JUNG 1972) und die Fütterungsfrequenz (HEE et al. 1988). Bezüglich der Sekretion des exokrinen Pankreas muss berücksichtigt werden, dass das Pankreasgewebe zwei verschiedene Arten von Epithelzellen aufweist, welche sich morphologisch und funktionell unterscheiden: Während die Zellen des Gangsystems des Pankreas vor allem Bikarbonat sezernieren, produzieren die Zellen der Azini die pankreatischen Enzyme und chloridreichen Sekrete (ENGELHARDT u. BREVES 1999). Sekretionsrate des Pankreas Im nüchternen Zustand sezerniert das Pankreasgewebe beim Schwein lediglich geringe Mengen an Sekret (0,39 ± 0,12 µl / g Pankreasgewebe / Minute bei Ferkeln im Alter von vier bis zwölf Wochen), nach Stimulation durch Futteraufnahme steigt die Sekretionsrate deutlich an (Steigerung auf Werte bis zu 30,3 ± 4,3 µl / g Pankreasgewebe / Minute; KVASNITSKII 1951; HICKSON 1970). Beeinflussung der Sekrekretionsrate durch das Alter der Tiere Ferkel im Alter von ca. 20 bis 30 Tagen weisen eine tägliche Sekretionsrate von ca. 150 bis 350 ml Pankreassekret auf, während bei Tieren im Alter von 35 bis 42 Tagen eine Sekretionsrate von 500 ml, bei adulten Tieren (Alter: Tage) eine Sekretionsleistung von 8-9 Litern pro Tag ermittelt wurde (KVASTNITSKII 1951). Bei Börgen mit einer Körpermasse von 70 kg ermittelten MOSENTHIN et al. (1994) mittlere tägliche Sekretionsraten von 3,8 bis 4,7 l. Vergleichbare Werte der täglichen Sekretionsrate (3,5 bis 4 24

25 Schrifttum Liter) dokumentierten auch HEE et al. (1985) an Tieren mit einer KM von 35 kg (s. Tabelle 2). Vergleicht man die Ergebnisse der verschiedenen Studien, so wird ein deutlicher Effekt des Alters auf die relative Sekretionsleistung sichtbar: jüngere Tiere, bis zu einem Alter von ca. 30 Tagen, weisen geringere Sekretionsraten je kg KM auf als ältere Tiere (Tabelle 2). Tabelle 2: Tägliche Sekretionsraten des Pankreas beim Schwein Alter der Tiere (d) KM der Tiere (kg) Pankreassekret (ml/24 h) Rel. Sekretionsrate (ml/kg KM/h) Autor ,50 PIERZYNOWSKI ,63 1,46 KVASTNITSKII KVASTNITSKII kg ,17 4,76 HEE et al ,50 PIERZYNOWSKI kg ,28 2,80 MOSENTHIN u. SAUER KVASTNITSKII 1951 mod. nach MOESSELER et al Zusammensetzung des Pankreassekrets Das Sekret des Pankreas weist einen hohen Wassergehalt (ca %) auf und ist aufgrund des Muzingehaltes fadenziehend. Enzyme und Proenzyme, die über 90 % der Proteinfraktion bilden, sind die einzigen nennenswerten organischen Substanzen im Pankreassekret. Für die Proteinsynthese werden überwiegend Aminosäuren aus dem extrazellulären Raum herangezogen. Die Prozesse Synthese, Konzentrierung und Sekretion der gebildeten Proteine dauern beim Schwein ca Minuten (SIMON et al. 1983). Das Pankreassekret von Schweinen enthält nach KIDDER und MANNERS (1987), SCHULZ (1987) und LOWE (1994) folgende Enzyme: α-amylase Chymotrypsinogen (A, B, C) Colipase Pro-Elastase (1, 2) Carboxylesterhydrolase Pro-Carboxypeptidase (A1, A2, B1 und B2) Phospholipase A2 Ribonuklease Esterase Desoxy-Ribonuklease Trypsinogen (1, 2, 3) 25

26 Schrifttum Bezüglich der Pankreassekretion bestehen beträchtliche individuelle Unterschiede (MOSENTHIN et al. 1994). Beim Schwein existieren nach FEUERHERDT (1987) zudem Einflüsse der Rasse auf die Enzymaktivitäten der pankreatischen Amylase und der Lipasen. Zu berücksichtigen ist, dass die Sekretion des Pankreas innerhalb von Minuten stark variieren kann (PEKAS et al. 1966), wobei dieses Phänomen nicht nur beim Schwein, sondern auch bei Kälbern beobachtet wurde (ZABIELSKI et al. 1993, 1997a). Einfluss der Zusammensetzung der Nahrung auf die N-Sekretion über das Pankreas und die Aktivität pankreatischer Enzyme bzw. den Enzymgehalt Die Zusammensetzung des Pankreassekretes wird wesentlich durch die Nährstoffzusammensetzung der aufgenommenen Nahrung beeinflusst. Bei abruptem Wechsel (z.b. Umstellung von Muttermilch auf stärkereiche Nahrung nach Absetzen der Ferkel) kommt es bereits innerhalb von 7 Tagen zu einer Adaptation der Pankreassekretion an das neue Substrat (starker Anstieg der amylolytischen Aktivität). Der Einfluss des Futters auf die Zusammensetzung des Pankreassekretes ist auch bei älteren Schweinen vorhanden. Nach Einsatz von kohlenhydratreichen und fettarmen Rationen kann eine erhöhte Aktivität von Saccharase, Maltase und Amylase beobachtet werden (FLORES et al. 1988). Eine Reduktion des Stärkegehaltes der Testration (16 % Rohprotein, 10 % Dextrose, 4 % Öl) bei gleichzeitiger Erhöhung des Gehaltes an Pektinen bzw. Öl führte hingegen zu einer signifikanten Reduktion der α-amylaseaktivität im Pankreassekret (s. Tabelle 4), während das Volumen und die Gesamtsekretion an Stickstoff, Lipase, Laktase, Trypsin und Chymotrypsin unbeeinflusst blieben (FLORES et al. 1988; MOSENTHIN et al. 1994; OZIMEK et al. 1995). Eine Erhöhung des Fettgehaltes der Ration bewirkte einen Anstieg der Lipaseaktivität im Pankreassekret (CORRING 1980; HEE et al. 1988; FLORES et al. 1988; CORRING et al. 1989; OZIMEK et al. 1985). Der Proteingehalt des Futters beeinflusst nach AUMAITRE (1971) zudem die Sekretion von Chymotrypsin. Der Anstieg der Chymotrypsinsekretion erfolgt dabei bereits etwa 48 Stunden nach Erhöhung des Proteingehaltes der Ration (CORRING u. SAUCIER 1972). 26

27 Schrifttum Tabelle 3: Mittlere Sekretionsleistung des exokrinen Pankreas bei Börgen (70 kg KM; n=4) in Abhängigkeit von der Futterzusammensetzung (nach MOSENTHIN et al. 1994) Kontrollgruppe Pektin (7,5 % der Ration) Volumen (ml/24 h) Stickstoff (mg/24 h) Gesamtenzymaktivität (I.U./24 h x 10-3 ) Trypsin Chymotrypsin α-amylase Lipase Jedoch haben eine geringe Erhöhung der Rp-Konzentration (im Bereich von %) und die Proteinquelle selbst keinen Effekt auf die tägliche Volumensekretion des Pankreassaftes, die N-Ausscheidung sowie die Aktivität der Enzyme (s. Tabelle 5). Die Enzymaktivitäten des Pankreassekretes wurden vergleichend bei Einsatz fünf verschiedener Mischfutter (EHC, sowie Rationen, welche Sojaschrot, Rapsschrot, Weizen und Gerste enthielten) bestimmt. Nach PÖHLAND et al. (1993) scheinen erst wesentlich größere Unterschiede in der Rp- Konzentration im Futter einen Einfluss auf die Pankreassekretion und die Enzymaktivitäten zu haben. Bei Einsatz eines proteinhaltigen Mischfutters mit einem Rp-Gehalt zwischen 112 und 186 g/kg TS variierte die N-Sekretion über das Pankreas bei Schweinen (KM: 15,9-22,9 kg 0,75 ) zwischen 2364 und 2831 mg am Tag (PÖHLAND et al. 1993). Während diese Ergebnisse in Übereinstimmung mit den Daten von ZEBROWSKA et al. (1983) und HEE et al. (1988) waren, ermittelten MOSENTHIN u. SAUER (1991) eine deutlich höhere N- Ausscheidung (4360 mg/d) über das Pankreassekret. Im Gegensatz dazu quantifizierten PARTRIDGE et al. (1982) sowie CORRING et al. (1990) deutlich niedrigere Werte (unter 2000 mg N/d). Bei Einsatz einer auf enzymatisch hydrolysiertem Casein -basierten Diät sezernieren pankreasgangfistulierte Schweine (45 kg KM) täglich 1850 ml Pankreassekret, welches insgesamt 1910 mg N (s. Tabelle 4) enthält (CORRING et al. 1990). Auch frühere Untersuchungen von CORRING et al. (1976) und LANGLOIS et al. (1987) erbrachten vergleichbare Ergebnisse. 27

28 Schrifttum Tabelle 4: Einfluss der N-Quelle und N-Gehalte im Futter auf die tägliche N-Ausscheidung im Pankreassekret beim Schwein Futterinhaltsstoffe (%) Pankreassekret Futter basiert auf 1 Rp-Gehalt Rfa-Gehalt Volumen (ml/d) N (mg/ml) N (mg/d) EHC 2,3 15,0 6, , Sojaschrot (35,5) 4 18,6 1, , Rapsschrot (44,5) 4 16,9 5, , Weizen (93,9) 4 14,4 5, , Gerste (93,9) 4 11,2 5, , Die auf Soja- und Rapsschrot basierenden Mischfutter enthielten 48,3 und 40,5 % Maisstärke sowie 10 % Zucker 1 Anteile der Komponenten in der Ration 2 EHC: enzymatisch hydrolysiertes Casein 3 CORRING et al. (1990) (Körpermasse der Versuchstiere: 45 kg) 4 PÖHLAND et al. (1993) (Körpermasse der Versuchstiere: kg) Insgesamt werden aber nach LOW (1980) beim Schwein täglich ca. 18 g N durch Sekretion und Zellabschilferungen in den cranialen Teil des Verdauungskanals (bis zum mittleren Dünndarm) abgegeben. Das Pankreassekret hat daran einen Anteil von 10,5 % (CORRING et al. 1990). Die N-Fraktion des Pankreassekretes besteht zu 90 % aus Enzymen und Proenzymen, Harnstoff, Aminozuckern und Aminen (CORRING u. JUNG 1972; SOUFFRANT et al. 1985). Harnstoff repräsentiert dabei % (LETERME et al. 1996), beziehungsweise % (MOSENTHIN u. SAUER 1991) des Gesamtstickstoffs. Tabelle 5: Einfluss der N-Quelle im Futter auf die Enzymaktivitäten im Pankreassekret beim Schwein Enzymaktivitäten (I.U./24 h x 10-3 ) Lipase α-amylase Trypsin Chymotrypsin Sojaschrot (35,5) Rapsschrot (44,5) Weizen (93,9) Gerste (93,9) PÖHLAND et al. (1993) (Körpermasse der Versuchstiere: kg) Tageszeitliche Schwankungen der N-Konzentration des Pankreassekrets (0,77 bis 1,22 mg/ml) sind gering (CORRING et al. 1990). Das Aminosäurenmuster im Pankreassekret (s. Tabelle 6) wird von Aspartat und Glutamat, aber auch Leucin und Valin dominiert (CORRING u. JUNG 1972; PÖHLAND et al. 1993). 28

29 Schrifttum Zusammensetzung der N-Fraktionen der Galle Durch Katheterisierung des Gallenganges kann die Gallenflüssigkeit direkt quantitativ und qualitativ untersucht werden. Bei einer Körpermasse von 45 kg sezernieren Schweine täglich ca ml Galle, in welcher 1,7 g N enthalten sind; dies entspricht einer N-Sekretion über die Galle von 97,7 mg N/kg KM 0,75 (CORRING et al. 1990). Im Unterschied zum Fettgehalt haben die Proteinqualität und die Proteinkonzentration im Futter nach SAMBROCK (1981) keinen wesentlichen Einfluss auf die N-Abgabe über die Gallenflüssigkeit. Die N-Fraktion der in Wasser gelösten Substanzen der Gallenflüssigkeit besteht zu 75 % aus α-amino Stickstoff (s. Abbildung 4). In der Literatur wird diese Bezeichnung (α-amino-nitrogen, bzw. α-amino-n) für lösliche Proteine und freie Aminosäuren verwendet, die im gesamten Organismus vorkommen. Die Benennung erfolgt aufgrund der Position der Aminogruppe zur Carboxylgruppe an der Kohlenstoffatomkette der Aminosäuren und Proteine. Der wesentliche Teil des α-amino-n (95 %) besteht aus Glycin (s. Tabelle 6) in Form von Glycocholsäure (Gallensäure, die mit Glycin konjugiert ist). Der übrige Teil (5 %) wird von Glycoproteinen gebildet, die hohe Prolin- und Glycingehalte aufweisen (LOW 1982). In der ilealen Digesta werden primäre Gallensäuren (Cholsäure und Chenodesoxycholsäure) durch bakterielle Enzyme zu sekundären Gallensäuren (Desoxycholsäure und Lithocholsäure) abgebaut und in konjugierter Form (vorrangig an Glycin, zu einem geringeren Anteil an Taurin gebunden) über sekundäre Na-Kotransporter im Ileum absorbiert. Auf diese Weise gelangen 90 % der Gallensäuren in den enterohepatischen Kreislauf zurück. Bei dem bakteriellen Abbau wird ein Teil der konjugierten Gallensäuren durch Abspaltung des Glycins (bzw. Taurins) in die dekonjugierte Form überführt. Das dekonjugierte Glycin wird zum Teil zur bakteriellen Proteinsynthese verwendet. Der verbleibende Rest gelangt neben dem bakteriellen Protein in den Dickdarm (SHIAU 1987; NEWSHOLME u. LEECH 1988). Der restliche Teil der N-Fraktion der Gallenflüssigkeit (25 %) besteht überwiegend aus NPN Verbindungen (LOW 1982). In der Fraktion der NPN- Verbindungen entfallen ca. 60 % auf Harnstoff (LETERME et al. 1996) und ca. 32 % auf Ammoniumsulfat (JUSTE 1982). 29

30 Schrifttum N-Fraktion der Gallenflüssigkeit α-amino-n (75 %) NPN (25 %) Glycin (95%) Glykoprotein (5 %) Harnstoff (60 %) Ammoniumsulfat (32 %) Abbildung 4: Zusammensetzung der N-Fraktion der Gallenflüssigkeit nach LOW (1982), JUSTE (1982) und LETERME (1996) N-Sekretion über die Dünndarmwand Um die endogenen N-Ausscheidung im Dünndarm des Schweins bewerten zu können, eignet sich die Untersuchung einzelner zeitweise isolierter Darmabschnitte, welche mit verschiedenen Lösungen perfundiert werden. Unabhängig von der eingesetzten Perfusionslösung (proteinhaltig oder proteinfrei) wird beim Schwein im proximalen und mittleren Abschnitt des Dünndarms eine zweifach höhere N-Menge je Meter Dünndarmabschnitt sezerniert als im distalen Bereich des Jejunums und Ileums. Vergleicht man die N-Ausscheidung über den Dünndarm bei Einsatz verschiedener Perfusionslösungen, so wird bei Perfusion der cranialen, medialen und caudalen Darmabschnitte mit einer proteinhaltigen Lösung eine Menge von 14,6 g N/24 h (respektive 0,78-0,57 g N/KM 0,75 ) ermittelt, während bei Einsatz einer proteinfreien Lösung nur halb so viel N (7 g N/d, respektive 0,37-0,27 g N/KM 0,75 ) in das Darmlumen abgegeben wird. Die N-Fraktion des Dünndarmsekretes wird von den löslichen N-Fraktionen dominiert (s. Abbildung 5). Die desquamierten Epithelzellen der Bürstensaummembran tragen mengenmäßig keinen wesentlichen Teil zur N-Fraktion des Dünndarmsekretes bei. 30

31 Schrifttum N-Fraktion im Dünndarmsekret lösliche N-Fraktion (86-90 %) nicht lösliche N-Fraktion (10-14 %) 1 Epithelzellen der Bürstensaummembran A α-amino-n (50-70 %) Harnstoff, Aminozucker, Amide (30-50 %) freie Aminosäuren (67 %) Protein (33 %) Abbildung 5: Zusammensetzung der N-Fraktion im Dünndarmsekret in % nach BURACZEWSKA (1979) 1 abhängig von der Erneuerungsrate der Zellen ( turnover nach h); MC DOUGALL (1966) Das Aminosäurenmuster des Dünndarmsekrets (s. Tabelle 6) weist bei Ernährung mit einer proteinfreien Lösung an isolierten Darmabschnitten einen hohen Anteil an Aminosäuren, wie Glutamat (14,4 %), Aspartat (10,0 %), Leucin (9,70 %) und Valin (6,20 %) auf (BURACZEWSKA 1979). Diese Aminosäuren sind im Aminosäurenmuster des Pankreassekretes ebenfalls sehr stark vertreten (JUSTE 1982). Im Unterschied zum Pankreassekret kommen diese Aminosäuren in der Gallenflüssigkeit nur zu einem geringen Teil vor (s. Tabelle 6 nach JUSTE 1982). Tabelle 6: Aminosäurenmuster von Pankreassekret, Galle und Dünndarmsekret 1 von Schweinen (in % der gesamten Aminosäuren) nach JUSTE (1982) Aminosäure Asp Thr Ser Glu Pro Gly Ala Val Pankreassaft 2 11,3 5,90 7,80 10,2 5,40 5,90 5,80 6,50 Galle 3 0,43 0,25 0,26 1,10 0,25 94,9 n.n. 0,30 Dünndarmsekret 4 C 10,0 6,14 5,96 14,4 5,77 5,51 5,63 6,19 Aminosäure Ile Leu Tyr Phe Lys His Arg Cys Met Pankreassaft 2 5,10 8,10 5,50 4,70 5,50 2,50 5,10 3,40 1,20 Galle 3 0,21 0,40 0,19 0,24 0,34 0,23 0,27 0,56 0,09 Dünndarmsekret 4 4,36 9,68 3,26 4,96 8,39 2,61 6,50 n.n. 1,37 1 Dünndarmsekret beinhaltet Muzine und abgeschilferte Zellen 2 CORRING u. JUNG (1972) Summe von 17 Aminosäuren war 74,3 g je 16 g N 3 JUSTE, CORRING u. CALMES (unveröffentlicht) Summe von 16 Aminosäuren war 65,45 g je 16 g N 4 BURACZEWSKA (1979) Summe von 16 Aminosäuren war g je 16 g N n.n.: nicht nachweisbar 31

32 Schrifttum Sowohl an der löslichen Fraktion im Dünndarmsekret (s. Abbildung 4 u. 5) als auch im Pankreassekret und Gallensaft besteht der wesentliche Anteil der NPN-Verbindungen aus Harnstoff Praecaecale Harnstoffsekretion und Harnstoffkonzentration im Blut Praecaecale Harnstoffsekretion Obwohl die Ausscheidung von Harnstoff in allen Teilen des Verdauungstraktes stattfindet, wird der größte Anteil über den Pankreassaft, die Galle und den Dünndarm sezerniert (BERGNER et al. 1986). Hingegen ist der Anteil der Sekretion von Harnstoff in den Dickdarm gering (MOSENTHIN et al. 1992). Die über Speichel, Magensaft, Galle und Pankreassaft in den Gastrointestinaltrakt abgegebene Harnstoffmenge (170 mg/kg KM 0,75 ) beim Schwein (14,1 kg KM 0,75 ) entspricht etwa der täglichen renalen Harnstoffexkretion (BERGNER et al. 1986). Harnstoffkonzentration im Blut Die Harnstoffkonzentration im Plasma variiert beim gesunden Schwein zwischen 20 und 50 mg/dl (KRAFT u. DÜRR 2005) und wird von der Protein- und Rohfaserkonzentration des Futters bzw. der aufgenommenen Proteinmenge pro Tier und Tag wesentlich beeinflusst (BERGNER u. TEGTMEIER 1985). Für das adulte Miniaturschwein wird bei Einsatz eines Alleinfutters zur Erhaltung (Rp-Gehalt: 189 g/kg TS) von GLODEK u. OLDIGS (1981) ein Referenzbereich für die Harnstoffkonzentration im Plasma von 16,3 bis 19,3 mg/dl angegeben Endogene N-Verluste über die Faeces sowie Aminosäurenmuster in den Faeces unter den Bedingungen einer N-freien Diät Die endogenen N-Verluste über den Kot betragen bei Einsatz einer N-freien Diät und einer Futteraufnahme von 65 g TS/kg KM 0,75 bei 60 kg schweren Schweinen in Abhängigkeit von der aufgenommenen Rfa-Menge 1,9-2,5 g N/d (11,9-15,6 g Rp), bzw. 0,09-0,12 g N/kg KM 0,75. 32