4 Methoden und Ergebnisse Methodenkomplex Methodenkomplex Methodenkomplex Zusammenfassung und

Transkript

1 Inhalt Inhalt... I Abbildungsverzeichnis... III 1 Motivation Aufgabenstellung Verwendete Software Grundlagen Mechanisch relevante Eigenschaften des Fadens Verschiedene Drüsen und produzierende Fadentypen einer Webspinne Der natürliche Spinnprozess Aufbau der Drüse und des Spinnkanals Spinnenseidenproteine Material Datendanken National Center for Biotechnology Information Universal Protein Resource Swiss Institute of Bioinformatics Protein Data Bank Conserved Domain Database Tools für Sequenzanalyse Hydrophobizitätsplot Sequenzalignment Dotplot BLAST ClustalW LALIGN Strukturvorhersage-Tools Chou-Fasman GOR Simple Modular Architecture Research Tool PROPKA SWISS-MODEL D-Position-Specific Score Matrices Prediction of TransMembrane Beta-Barrel Proteins I

2 4 Methoden und Ergebnisse Methodenkomplex Methodenkomplex Methodenkomplex Zusammenfassung und Auswertung Methoden Strukturbildung der Spinnenseidenproteine Quellen Erklärung zur selbständigen Anfertigung der Arbeit Anhang II

3 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Gartenkreuzspinne Araneus diadematus... 2 Abbildung 2: Spannungs-Dehnungs-Diagramm des Abseilfadens der Spinne Nephila edulis Abbildung 3: Bruchspannungs-Bruchdehnungs-Diagramm verschiedenener gesponnener Fäden des Seidenspinners Bombyx mori sowie eines Nephila edulis Spinnenfaden Abbildung 4: Abhängigkeit der Bruchspannung von der Spinngeschwindigkeit und der Körpertemperatur der Spinne Nephila edulis Abbildung 5: Die Gartenspinne Araneus diadematus mit ihren Drüsen und zugehörigen Fadentypen sowie Funktionen einiger Fäden Abbildung 6: Spannungs-Dehnungs-Diagramm der Abseilfäden von 5 verschiedenen netzbauenden Spinnen Abbildung 7: Der natürliche Spinnprozess des major ampullate spidroins Abbildung 8: Querschnitt durch einen "major ampullate" Spinnenfaden Abbildung 9: Primärstruktur von "major ampullate spidroin" Abbildung 10: Hydrophobizitätsplot nach Kyte und Doolittle der N-terminalen Region der Sequenz von major ampullate spidroin 1 der Spinne Latrodectus hesperus.. 19 Abbildung 11: Ein Dotplot, eine einfache Art des paarweisen Alignments Abbildung 12: Ein einfaches Beispiel eines multiplen Alignments Abbildung 13: Struktur von Bacteriorhodopsin innerhalb einer Doppellipidschicht, vorhergesagt mittels PRED TMBB Abbildung 14: Workflow des Arbeitsplans Abbildung 15: Stabilität der terminalen Domänen des Spinnenseidenproteins in Abhängigkeit vom ph-wert Abbildung 16: Sekundärstrukturvorhersage von MaSp1 und MaSp2 der Spinne Latrodectus hesperus mittels GOR und Chou-Fasman Abbildung 17: Hydrophobizitätsplot nach Kyte und Doolittle von MaSp1 sowie MaSp2 der Spinne Latrodectus hesperus Abbildung 18: SWISS-MODEL Secondary Structure Prediction and Domain Assignment von MaSp Abbildung 19: SWISS-MODEL Secondary Structure Prediction and Domain Assignment von MaSp Abbildung 20: Identifikation der terminalen Domänen von MaSp1 sowie MaSp2 der Spinne Latrodectus hesperus mittels SMART Abbildung 21: CDD-Suche an MaSp1 sowie MaSp2 von L. hesperus III

4 Abbildung 22: Sequenz (N-terminal) des MaSp1 von L. hesperus im Programm Dotlet Abbildung 23: Sequenz (N-terminal) des MaSp2 von L. hesperus im Programm Dotlet Abbildung 24: Sequenz (Mittelteil) des MaSp1 von L. hesperus im Programm Dotlet Abbildung 25: Sequenz (Mittelteil) des MaSp2 von L. hesperus im Programm Dotlet Abbildung 26: Betrachtung von Proteinstrukturen mittels Rasmol Abbildung 27: Vorhersage der Topologie von MaSp1 mittels Viterbi-Algorithmus des PRED TMBB Abbildung 28: Vorhersage der Topologie von MaSp2 mittels Viterbi-Algorithmus des PRED TMBB Abbildung 29: Workflow der durchgeführten Methoden Abbildung 30: Ergebnis der Identifizierung der Proteinfaltung von MaSp1 mittels 3D-PSSM IV

5 1 Motivation Spinnen existieren seit 400 Mio. Jahren, lange Zeit bevor die ersten Menschen die Erde bevölkerten. [7, S. 7] Im Laufe der Evolution entwickelten sie verschiedene Techniken im Kampf um das Überleben. Eine besondere Eigenschaft ist die Fähigkeit, Netze aus Spinnenseide zu konstruieren, um Beutetiere zu fangen. Die Netze sind wahre Meisterwerke der Natur. In kürzester Zeit geschaffen, stellen sie häufig eine erfolgreiche Beutefangmethode dar. Wie ist es möglich, dass ein Material trotz seines geringen Durchmessers und seiner geringen Masse so stabil ist, um Beutetiere wie Insekten in voller Fluggeschwindigkeit abzufangen? Es wird behauptet, dass ein Spinnenfaden, welcher den Durchmesser eines Bleistiftes besitzt, eine Boeing 747 im Flug abfangen könnte. [25] Welche Eigenschaften sind überhaupt relevant, wenn von einem stabilen Spinnennetz gesprochen wird? Bereits im Mittelalter faszinierte Spinnenseide den Menschen. In dieser Zeit wurden kleine Textilien aus Seide von Spinnen gewoben, welche jedoch sehr teuer waren. Neben der Anwendung in Fadenkreuzen von U-Booten und Flugzeugen bis zum 2. Weltkrieg, werden Spinnenfäden bis heute in Polynesien für den Fischfang benutzt. [31, S. 308] In der heutigen Zeit der Rohstoffknappheit ist es nötig, andere Ressourcen zu erschließen oder die Gewinnung bereits bestehender Ressourcen zu optimieren. Eine Hauptanwendung der Spinnenseide könnte in der Medizin liegen, beispielsweise zum Vernähen von Wunden und Zusammennähen von Nervenfasern oder als Arzneikapseln. Außerdem könnte Spinnenseide in der Oberflächenveredelung sowie in der Kosmetik- und Lebensmittelindustrie Anwendung finden. [31, S. 313] Als Vorarbeit für die Bachelorarbeit galt die im 5. Semester geschriebene Projektarbeit, sowie anschließendes Praxismodul. In der Projektarbeit wurde die Thematik zunächst aus dem biologischen Blickwinkel betrachtet. Inhalte waren zum Beispiel der Netzbau, die Soziologie der Gemeinschaft der Spinnen und einzelner Individuen, sowie die Anatomie der Spinne. Anschließend wurde der strukturelle Aufbau und die Eigenschaften der Spinnenseide untersucht und ein Blick in die Proteinzusammensetzung geworfen. Im Praxismodul wurde die Arbeit weiter fortgesetzt. Die Aufgabe des Praxismoduls bestand darin, ein Modell zu entwickeln, welches den Spinnenfaden auf molekularer Ebene beschreibt. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden möglichst viele vorhandene Daten gesammelt. Der Fokus lag auf der 1

6 Proteinzusammensetzung und dem strukturellen Aufbau des Spinnenfadens, genauer: eines bestimmten Fadens. Der Faden, welcher in Bezug auf Festigkeit und Elastizität die besten Eigenschaften aufweist, wurde detailliert untersucht. Betrachtete Organismen waren zum Beispiel die Gartenkreuzspinne Araneus diadematus (siehe Abbildung 1) sowie die Goldene Seidenspinne Nephila clavipes, an deren Fäden bereits verschiedene Experimente wie X-Ray, Raman-Spektroskopie und Gelelektrophorese durchgeführt worden waren. Abbildung 1: Gartenkreuzspinne Araneus diadematus Die Gartenkreuzspinne Araneus diadematus ist eine typische, in Deutschland beheimatete Spinnenart. 1.1 Aufgabenstellung Das Ziel der Bachelorarbeit ist das Abbilden von physiologischen Bedingungen auf die Sequenz und das Verständnis der biologischen Prozesse. Es gilt, die β-faltblatt-bildung zu verstehen und vor allem direkt nachzuweisen, in Abhängigkeit vom ph-wert. Mit dem Wissen sollten dann, insofern möglich, diese Strukturbildungen simuliert werden. (Was passiert, wenn der ph-wert verändert wird?) 1.2 Verwendete Software Neben den Daten aus den Experimenten wurde verschiedene bioinformatische Software verwendet, um jene Daten zu untermauern oder gar zu widerlegen. Hierzu mehr im Kapitel 3 Material. 2

7 2 Grundlagen 2.1 Mechanisch relevante Eigenschaften des Fadens Spinnenseide variiert je nach Typ des Fadens stark in Aufbau und mechanischen Eigenschaften. Der sogenannte major ampullate Faden, benannt nach der sekretierenden Drüse, weist die größte Festigkeit aller Spinnenseidenarten vor. [8, S. 3639] Dieser Faden bildet die Grundstruktur eines Spinnennetzes. Die Spinne zieht stets einen Faden dieser Art hinter sich her. Daher wird der major ampullate Faden auch als Abseilfaden bezeichnet. [48, S. 2339] Mehr zu den verschiedenen Fadentypen sowie den zugehörigen Drüsen siehe Kapitel 2.2. Zwei mechanische Eigenschaften sind bei Betrachtung des Spinnenfadens von Belangen. Diese sind die Festigkeit sowie die Bruchdehnung. Als Festigkeit bezeichnet man die Eigenschaft von Materialien, mechanische Spannungen zu ertragen bzw. gegen Bruch und größere Verformungen zu widerstehen. [50, S. 519] Die Bruchdehnung gibt den Grad der Verlängerung eines Materials beim Bruch an, bezogen auf die Ausgangslänge. [50, S. 519] Mechanische Eigenschaften eines Fadens bzw. einer Faser lassen sich am besten beschreiben durch eine Reaktionskurve, wenn das Material gedehnt wird. Das dabei entstehende Diagramm bezeichnet man als sogenanntes Bruchspannungs-Bruchdehnungs-Diagramm. [47, S. 542] In jenem Diagramm ist an der Abszisse die Bruchdehnung in Prozent (0,1 = 10 %) abgetragen, während an der Ordinate die Bruchspannung in GPa (Gigapascal) abgetragen wird, siehe Abbildung 2. Der Begriff Bruchspannung wird verwendet, da die Deformation eines Materials (Festigkeit) nicht nur von der einwirkenden Kraft abhängt, sondern auch von der Größe der Fläche, in diesem Falle der Querschnitt des Fadens. [12, S. 160] Laut Diagramm in Abbildung 2 verhalten sich die Spannung und die resultierenden Dehnung bei einer Spannung von 0 bis ca. 0,02 GPa direkt proportional zueinander. Wenn die Spannung ab bzw. zunimmt, nimmt die Dehnung des Materials in gleichem Maße ab bzw. zu. [12, S. 161; 16, S. 121] Dieses Verhalten gilt bis zur Proportionalitätsgrenze. Ab diesem Punkt wächst die Dehnung stärker bei zunehmender Belastung als bisher. [12, S. 161] Viele Materialien nehmen selbst nach der Proportionalitätsgrenze ihre Ausgangslänge bei nachlassender Spannung langsam wieder ein. [12, S. 161; 16, S. 121] Erst ab der Elastizitätsgrenze geht die Eigenschaft der Elastizität verloren. Dies bedeutet, dass das Material eine dauernde Formänderung beibehält, auch wenn keine Spannung mehr einwirkt. [12, S. 162; 16, S. 121] Nimmt die Spannung weiter zu, reißt das Material. Es kommt zum Bruch. Diesen Punkt kennzeichnet die Belastungsgrenze. [16, S. 121] Die unter der Kurve entstandene Fläche gibt die Belastbarkeit an; die Energie, die auf das gesamte Volumen des Fadens wirkt bis dieser bricht bzw. zerreißt. [35, S. 741] 3

8 Abbildung 2: Spannungs-Dehnungs-Diagramm des Abseilfadens der Spinne Nephila edulis. An der Abszisse ist die Bruchdehnung in Prozent (0,1 = 10 %) abgetragen, während an der Ordinate die Bruchspannung in GPa (Gigapascal) abgetragen wird. Die Bruchdehnung gibt den Grad der Verlängerung eines Materials beim Bruch an, bezogen auf die Ausgangslänge. [50, S. 519] Die Bruchspannung ist ein Begriff für die Festigkeit eines Materials. Als Festigkeit bezeichnet man die Eigenschaft von Materialien, mechanische Spannungen zu ertragen bzw. gegen Bruch und größere Verformungen zu widerstehen. [50, S. 519] Der Begriff Bruchspannung wird verwendet, da die Deformation eines Materials nicht nur von der einwirkenden Kraft abhängt, sondern auch von der Größe der Fläche, in diesem Falle der Querschnitt des Fadens. [12, S. 160] Im Diagramm erkennbar ist, dass sich ein Seidenfaden der Spinne Nephila edulis bis zu knapp 40 % seiner Länge dehnen lässt und einer Bruchspannung von 1,3 Gigapascal standhält, ehe es zum Bruch kommt. Aus: 2001; Vollrath, Fritz; Knight, David. P.: Liquid crystalline spinning of spider silk Wie bereits erwähnt, unterscheiden sich die verschiedenen Typen von Spinnenfäden stark in ihren mechanischen Eigenschaften. Außerdem sind die Eigenschaften eines Fadens abhängig von den Prozessbedingungen sowie von den Umweltbedingungen. Verschiedene Versuche an der Seide des Seidenspinners Bombyx mori ergaben, dass die mechanischen Eigenschaften des Fadens abhängig von der Spinngeschwindigkeit sind. Höhere Spinngeschwindigkeiten bewirken festere, brüchigere Fasern, während geringere Spinngeschwindigkeiten für schwächere, dehnbarere Fasern sorgen. [35, S. 741] Handelsübliche Seide des Seidenspinners besitzt eine Festigkeit von 0,5 GPa, eine Bruchdehnung von 15 %, sowie eine Belastbarkeit von 6 x 10 4 J/kg. [35, S. 741] Zum Vergleich: Nephila edulis Spinnenseide besitzt eine Festigkeit von 1,3 GPa, eine Bruchdehnung von 40 % und eine Belastbarkeit von 16 x 10 4 J/kg. [48, S. 2342] Im Diagramm in Abbildung 3 sind die Bruchspannungs-Bruchdehnungs-Kurven von Seidenfasern, welche bei unterschiedlichen Spinngeschwindigkeiten produziert worden, dargestellt. Die aufgeführten Werte wurden von gewaschenen, entschleimten Einzelfasern der Bombyx mori Seide, von Nephila edulis Abseilfaden sowie von handelsüblicher entschleimter Bombyx mori 4

9 Kokonseide unter verschiedenen Bedingungen ermittelt. Handelsübliche Kokonseide wird bei Geschwindigkeiten zwischen 4 und 15 mm/s und einer Temperatur von 20 C gesponnen, während die major ampullate Spinnenseide von Nephila edulis bei einer Geschwindigkeit von 20 mm/s und einer Temperatur von 25 C gesponnen wird. Die entschleimten Einzelfasern der Bombyx mori Seide wurden bei einer Temperatur von 25 C und bei verschiedenen Spinngeschwindigkeiten von 4-27 mm/s (siehe Diagramm) produziert. Erkennbar ist, dass ein Bombyx mori Seidenfaden, welcher bei 4 mm/s gesponnen wurde, eine vergleichbare Bruchdehnung wie der Nephila edulis Spinnenfaden besitzt (37 % zu 34 %, siehe Diagramm). Wird die Spinngeschwindigkeit auf 13 mm/s erhöht, besitzt die Seide des Seidenspinners eine ähnlich große Belastbarkeit wie die Nephila edulis Spinnenseide: Die Spinnenseide besitzt eine Belastbarkeit von 16 x 10 4 J/kg, während der Bombyx mori Faden, gesponnen bei einer Geschwindigkeit von 13 mm/s, eine Belastbarkeit von 12 x 10 4 J/kg besitzt, obwohl die Festigkeit des Bombyx mori Seidenfaden nicht merklich zunimmt. Eine Festigkeit von 0,7 GPa eines bei 13 mm/s gesponnenen Seidenfaden (die Festigkeit von Kokonseide beträgt 0,5 GPa) ist im Vergleich zur Festigkeit von Nephila edulis Spinnenseide, welche 1,3 GPa beträgt, ein geringer Anstieg. Wird die Spinngeschwindigkeit weiter erhöht, sinkt jedoch die Belastbarkeit des Bombyx mori Seidenfaden. Dies resultiert aus der abnehmenden Dehnbarkeit: Ein Seidenfaden, gesponnen bei einer Geschwindigkeit von 13 mm/s, besitzt eine Bruchdehnung von 34 %, während ein Seidenfaden, welcher bei einer Geschwindigkeit von 27 mm/s gesponnen wurde, eine Bruchdehnung von 17 % besitzt. Abhängig von der Spinngeschwindigkeit ist Bombyx mori Seide entweder fest oder dehnbar; Spinnenseide hingegen kombiniert beide Eigenschaften, bei Spinngeschwindigkeiten, die für die Konstruktion des Spinnennetzes charakteristisch sind (10-20 mm/s). [35, S. 741] 5

10 Abbildung 3: Bruchspannungs-Bruchdehnungs-Diagramm verschiedenener gesponnener Fäden des Seidenspinners Bombyx mori sowie eines Nephila edulis Spinnenfaden (pink). Die unterschiedlichen Graphen der Bombyx mori Seidenfaden resultieren aus den jeweils verschiedenen Spinngeschwindigkeiten (in mm/s) der produzierten Fäden. Erkennbar ist, dass ein Bombyx mori Seidenfaden, welcher bei 4 mm/s gesponnenen wurde, eine vergleichbare Bruchdehnung wie der Nephila edulis Spinnenfaden besitzt (37% zu 34 %). Aus: 2002; Zhengzhong, Shao; Vollrath, Fritz: Surprising strength of silkworm silk. Spinnenseide ist sehr robust und gleichzeitig sehr leicht. Die Festigkeit eines Spinnenfadens ist bemerkenswert und mit der von Nylon vergleichbar. Der Lauffaden von Araneus diadematus besitzt eine Festigkeit von 7,8 g/denier. Dies bedeutet, dass der Spinnenfaden von 9 Kilometern Länge 7,8 g wiegt. Zum Vergleich: Ein Nylonfaden hat den Wert 8,7 g/denier. Somit ist der Spinnenfaden dehnbarer als ein Nylonfaden (31 % vs. 16 %). Ein Lauffaden von Araneus diadematus kann demnach 80 Kilometer lang sein, ehe er aufgrund seines Eigengewichtes reißt. [26] Die Festigkeit von industriellem Stahl beträgt 1,5 GPa. [17, S. 3296] Da die Spinnenseide eine geringere Dichte als Stahl besitzt, ist Spinnenseide in Bezug auf das Gewicht das stärkere Material. [47, S. 542] Kevlar, ein künstlich hergestelltes Fasermaterial, ist 3x fester als Spinnenseide. Doch aufgrund der Tatsache, dass Spinnenseide 8x dehnbarer ist, ist Spinnenseide 5x belastbarer als Kevlar. [47, S. 542] 6

11 Abbildung 4: Abhängigkeit der Bruchspannung von der Spinngeschwindigkeit und der Körpertemperatur der Spinne Nephila edulis. Die schwarzen Kreise zeigen die Abhängigkeit der Bruchspannung (GPa) von der Spinngeschwindigkeit (mm/s), die weißen Kreise die Abhängigkeit von der Körpertemperatur ( C). Erkennbar ist, dass mit zunehmender Körpertemperatur die Bruchspannung zunimmt, während bei steigender Spinngeschwindigkeit ab ca mm/s die Bruchspannung abnimmt. Aus: 2001; Vollrath, Fritz; Knight, David. P.: Liquid crystalline spinning of spider silk Allein die Tatsache, dass natürlich gesponnene Seide ihre Eigenschaften in Abhängigkeit von der Spinngeschwindigkeit ändert, erschwert die Analyse und Untersuchungen der Seide. Wie kommt es, dass sich die mechanischen Eigenschaften so stark verändern, wenn die Spinngeschwindigkeit variiert? Das Geheimnis muss im Inneren des Seidenfadens liegen, in der Struktur der Proteine. Die Abhängigkeit der mechanischen Eigenschaften von den Spinnbedingungen wird in Abbildung 4 verdeutlicht. Dargestellt ist die Abhängigkeit der Bruchspannung (in GPa) von der Spinngeschwindigkeit (in mm/s) sowie von der Körpertemperatur (in C) der produzierenden Spinne Nephila edulis. Erkennbar ist, dass mit zunehmender Körpertemperatur die Bruchspannung zunimmt, während bei steigender Spinngeschwindigkeit ab ca mm/s die Bruchspannung abnimmt. 7

12 2.2 Verschiedene Drüsen und produzierende Fadentypen einer Webspinne Die Webspinnen (Araneae) gehören der Klasse der Spinnentiere (Arachnida) an, welche zum Stamm der Gliederfüßer (Arthropoda) gehört. Zu den Spinnentieren gehören die klassischen Spinnen, aber auch Weberknechte, Skorpione, Pseudoskorpione und Milben. Dabei umfasst die Familie der Araneae die, nach den Milben, artenreichste Ordnung der Arachnida. [7, S. 22] Die Webspinnen gelten oft als Vorzeigebeispiel für eine Spinne, da Spinnen üblicherweise wie folgt vorgestellt werden: Eine Spinne besitzt 8 Beine, Kieferklauen am Kopf, Warzen am Hinterleib und baut Netze. Doch neben den netzbauenden Spinnen umfasst die Ordnung der Araneae auch einige Arten, die ihre Beute im Lauf oder Sprung überfallen. [5, S. 18, S. 20] Die meisten Vertreter der Familie der Wolfsspinnen (Lycosidae) bauen keine Fangnetze und sind daher in dieser Bachelorarbeit von geringem Interesse. [5, S. 144] Da die Eigenschaften von Spinnenseide stark von den Prozessbedingungen wie Spinngeschwindigkeit, Körpertemperatur und anderen Faktoren abhängig sind, ist eine einheitliche Analyse der Seide nur schwer möglich. Erschwerend kommt hinzu, dass eine Spinne viele verschiedene Arten von Seide produzieren kann. [49, S. 68] In Abbildung 5 ist die Gartenspinne Araneus diadematus samt ihren Seidendrüsen sowie produzierende Fadentypen dargestellt. Anhand dieser Abbildung wird deutlich, wie komplex eine Spinne in Bezug auf die Fadenproduktion ist. Je nach Zweck werden unterschiedliche Fäden gebildet. Jede Drüse stellt einen anderen Fadentyp oder anderen Bestandteil des Fadens her. Eine männliche Spinne der Art Araneus diadematus kann bis zu 5 verschiedene Fadentypen produzieren, eine weibliche Spinne sogar bis zu 7 verschiedene. Die weibliche Spinne kann mit Hilfe der zylinderförmigen Drüse (Cylindrical) und der traubenförmigen Drüse (Aciniforme) die Seidenfäden herstellen, welche die Hülle für die Eier bilden. Der Faden aus der traubenförmigen Drüse kann außerdem noch als Faden zur Umwicklung der Beute dienen. [13, S. 80] Die nachfolgend genannten Drüsen existieren in weiblichen sowie in männlichen Spinnen. Die Minor Ampullate bzw. kleine ampullenförmige Drüse sekretiert den Faden für die Hilfsspirale. Die Hilfsspirale wird nur bei der Netzkonstruktion benötigt und später durch die Fangspirale ersetzt, da die Herstellung der Hilfsspirale enorm viele körpereigene Proteine benötigt. Die flagellenförmige Drüse (Flagelliforme) sekretiert den Seidenfaden für die Fangspirale, welche als Beutefangmethode dient. Die Fäden der Fangspirale sind mit kleinen klebrigen Tröpfchen besetzt und hindern so die Beute zu fliehen. Diese Tröpfchen werden von der haufenförmigen Drüse (Aggregate) hergestellt. Der Befestigungsklebstoff, welcher die einzelnen Fäden während der Netzkonstruktion miteinander verknüpft, wird in der birnenförmigen Drüse (Piriforme) 8

13 sekretiert. Die Major Ampullate oder große ampullenförmige Drüse produziert den Faden, der für die Grundstruktur des Netzes benötigt wird, sowie der Spinne als Abseilfaden dient. [49, S ] Der Faden aus der großen ampullenförmigen Drüse ist für die Forschung von besonderem Interesse, da er eine enorme Stabilität aufweist. Außerdem kombiniert er die Eigenschaft der Festigkeit mit der Eigenschaft der Elastizität in beachtlichem Maße. [13, S. 80] Aus diesem Grund wurden die meisten Experimente und Untersuchungen am major ampullate Faden durchgeführt. Abbildung 5: Die Gartenspinne Araneus diadematus mit ihren Drüsen und zugehörigen Fadentypen sowie Funktionen einiger Fäden. Die Drüsen sind nach ihren Lateinischen Namen benannt. Die Fadentypen sind entsprechend nach ihrem Entstehungsort, der sekretierenden Drüse, benannt. Jede Drüse stellt einen anderen Fadentyp oder anderen Bestandteil des Fadens her. Eine männliche Spinne der Art Araneus diadematus kann bis zu 5 verschiedene Fadentypen produzieren, eine weibliche Spinne sogar bis zu 7 verschiedene. Die weibliche Spinne kann mit Hilfe der zylinderförmigen Drüse (Cylindrical) und der traubenförmigen Drüse (Aciniforme) die Seidenfäden herstellen, welche die Hülle für die Eier bilden. Der Faden aus der traubenförmigen Drüse kann außerdem noch als Faden zur Umwicklung der Beute dienen. [13, S. 80] Die nachfolgend genannten Drüsen existieren in weiblichen sowie in männlichen Spinnen. Die Minor Ampullate bzw. kleine ampullenförmige Drüse sekretiert den Faden für die Hilfsspirale. Die Hilfsspirale wird nur bei der Netzkonstruktion benötigt und später durch die Fangspirale ersetzt, da die Herstellung der Hilfsspirale viele körpereigene Proteine benötigt. Die flagellenförmige Drüse (Flagelliforme) sekretiert den Seidenfaden für die Fangspirale, welche als Beutefangmethode dient. Die Fäden der Fangspirale sind mit kleinen klebrigen Tröpfchen besetzt und hindern so die Beute zu fliehen. Diese Tröpfchen werden von der haufenförmigen Drüse (Aggregate) hergestellt. Der Befestigungsklebstoff, welcher die einzelnen Fäden während der Netzkonstruktion miteinander verknüpft, wird in der birnenförmigen Drüse (Piriforme) sekretiert. Die Major Ampullate oder große ampullenförmige Drüse produziert den Faden, der für die Grundstruktur des Netzes benötigt wird sowie der Spinne als Abseilfaden dient. [49, S ] Aus: 2000; Vollrath, Fritz: Strength and structure of spiders' silks. 9

14 Wie bereits erwähnt variieren die Eigenschaften ein und desselben Fadentyps innerhalb verschiedener Spinnenarten stark. Aus diesem Grund wurden verschiedene netzbauende Spinnen bezüglich ihrer produzierenden Abseilfäden untersucht. Abbildung 6 zeigt ein Spannungs-Dehnungs-Diagramm der Abseilfäden von 5 verschiedenen netzbauenden Spinnen. Darin sind die Abseilfäden der Spinnen Euprosthenops sp. (1), Cyrtophora citricola (2), Latrodectus mactans (3), Araneus diadematus (4), Nephila edulis (5) dargestellt. Anhand des Diagramms ist erkennbar, dass die Seide von Euprosthenops sp. fester (benötigt mehr Kraft um zu brechen) aber weniger elastisch als die Seide von Nephila edulis ist. (Außerdem existieren Unterschiede in den Elastizitätsbereichen bis zur Elastizitätsgrenze. Das heißt bei gleicher Belastung weisen die Fäden ein unterschiedliches Verhalten im Elastizitätsbereich auf. Ein ähnliches Verhalten zeigt sich beim Vergleich eines Plastikstabes gegenüber einem Streifen Klebeband. Der Plastikstab bricht bei einer hohen Belastung ohne sichtbare Dehnungserscheinung durch, wobei das Klebeband bei einer hohen Belastung eine sichtbare Dehnung aufweist, welche jedoch irreversibel ist. Der Faden von Euprosthenops sp. verhält sich ungefähr wie der Plastikstab, während der Faden von Nephila edulis das Verhalten eines Klebebands zeigt. Der Faden von Euprosthenops sp. bricht bei einer Bruchspannung von 1,5 GPa, kann aber nur bis zu ca. 15 % seiner Ausgangslänge gedehnt werden. Der Faden von Nephila edulis reißt bei einer Bruchspannung von ca. 0,9 GPa, kann jedoch bis zu knapp 40 % seiner Ausgangslänge gedehnt werden. Der optimale Spinnenfaden in Bezug auf beide Eigenschaften ist ein Spinnenfaden, welcher einen guten Kompromiss beider Eigenschaften herstellt. Laut dem Diagramm in Abbildung 6 ist dies der Spinnenfaden von Latrodectus mactans. [47, S. 542] Es liegen daher nicht nur große Unterschiede zwischen den jeweiligen Fadentypen ein und derselben Spinne vor, sondern auch zwischen den gleichen Fadentypen von verschiedenen Spinnenarten. Jede Spinnenart sekretiert andere Proteine in den jeweiligen Drüsen. Dadurch entstehen die artspezifischen Eiweißfäden. Doch die Primärstruktur allein beeinflusst nicht die Eigenschaften eines Spinnfadens. [13, S. 83] Die Unterschiede zwischen den Arten entstehen unter anderem durch Unterschiede in der chemischen Zusammensetzung der Spinnlösung und durch verschiedene Umweltbedingungen. Die Eigenschaften des Fadens sind durch die Spinne in vielerlei Hinsicht kontrollierbar. Die Spinnbedingungen können von der Spinne selbst beeinflusst werden, indem die Geschwindigkeit, mit der der Faden mit den Beinen heraus gezogen wird, geändert wird. Indem die Spinne das Netz zu verschiedenen Tageszeiten 10

15 konstruiert, liegen unterschiedliche Temperaturen vor, welche die Eigenschaften des Fadens ebenfalls beeinflussen können. [47, S. 542] Abbildung 6: Spannungs-Dehnungs-Diagramm der Abseilfäden von 5 verschiedenen netzbauenden Spinnen. Euprosthenops sp. (1), Cyrtophora citricola (2), Latrodectus mactans (3), Araneus diadematus (4), Nephila edulis (5) Anhand des Diagrammes ist erkennbar, dass die Seide von Euprosthenops sp. fester (benötigt mehr Kraft um zu brechen) aber weniger elastisch als die Seide von Nephila edulis ist. Außerdem existieren Unterschiede in den Elastizitätsbereichen bis zur Elastizitätsgrenze. Das heißt bei gleicher Belastung weisen die Fäden ein unterschiedliches Verhalten im Elastizitätsbereich auf. Der Faden von Euprosthenops sp. bricht bei einer Bruchspannung von 1,5 GPa, kann aber nur bis zu ca. 15 % seiner Ausgangslänge gedehnt werden. Der Faden von Nephila edulis reißt bei einer Bruchspannung von ca. 0,9 GPa, kann jedoch bis zu knapp 40 % seiner Ausgangslänge gedehnt werden. Der optimale Spinnenfaden in Bezug auf beide Eigenschaften ist ein Spinnenfaden, welcher einen guten Kompromiss beider Eigenschaften herstellt. In diesem Diagramm ist dies der Spinnenfaden von Latrodectus mactans. Aus: 2001; Vollrath, Fritz; Knight, David. P.: Liquid crystalline spinning of spider silk 11

16 2.3 Der natürliche Spinnprozess Aufbau der Drüse und des Spinnkanals Die Seidenproteine werden in den Epithelzellen der jeweiligen Spinnendrüse synthetisiert. Als Epithel bezeichnet man die oberste Zellschicht des Haut- und Schleimhautgewebes von Eukaryonten (dazu zählen: Tiere, Pilze, Pflanzen, Mensch). [23, S ] Das genaue Geheimnis der Struktur der Seidenproteine ist bis heute gänzlich ungeklärt, es existieren lediglich verschiedene Theorien. Es wird davon ausgegangen, dass die Proteine keine definierte Sekundärstruktur, sondern eine Art Vorstruktur einnehmen. [8, S. 3645; 14, S. 999] Nach der Synthese werden die Proteine innerhalb der Drüse im sogenannten Lumen gespeichert. [10, S. 239] Das Lumen ist eine cytologische Bezeichnung für den Innenraum von Zellen. [23, S. 8-74, S ] Dort liegen die Proteine in einer wässrigen Natriumchlorid-Lösung in sehr hoher Konzentration vor, bis zu 50 % w/v (weight/volume = 50 Gramm Protein in 100 ml Lösung). [36, S. 999] Trotz der enorm hohen Konzentration kristallisieren oder verklumpen die Proteine nicht, sondern liegen innerhalb der Lösung flüssig vor. [13, S. 83] Während der Speicherung der Proteine in der Drüse, auch Sack oder Ampulle genannt, sorgt Natriumchlorid für die nötige Konservierung der Stabilität der Proteine. Aufgrund der einsalzenden Wirkung von Natriumchlorid können die Seidenproteine trotz der hohen Konzentration den flüssigen Zustand beibehalten. [8, S. 3645; 13, S. 83; 54] Die Proteine müssen daher zur Lösung hin eine enorm stabile Struktur aufweisen. Außerdem werden durch Natriumchlorid die Wechselwirkungen zwischen den Seidenproteinen unterbunden. [13, S. 83; 54] Abbildung 7: Der natürliche Spinnprozess des major ampullate spidroins. Der Prozess lässt sich in 5 Teilbereiche unterteilen: i) die Proteinsekretion im Epithel ii) die Speicherung der Protein innerhalb des Lumen (Innenraum) der Drüse in sehr hoher Konzentration (50% w/v) iii) die Umstrukturierung der Proteine innerhalb des Spinnkanals durch Ionenaustausch, Ansäuerung, Wasserentzug, Scherkräfte und Dehnungskräfte in eine Proteinfaser iv) die Streckung der Proteinfaser durch eine Art Ventil v) endgültige Formgebung durch Ziehen und Strecken der Seidenfaser mit Hilfe der Gliedmaßen der Spinne. Aus: 2011; Eisoldt, Lukas; Smith, Andrew; Scheibel, Thomas: Decoding the secrets of spider silk. 12

17 Abbildung 7 zeigt den typischen Weg der Spinnenseidenproteine von der Synthese bis zum fertigen Faden. Das Schema beschreibt den Assemblierungsprozess des Proteins, welches in der großen ampullenförmigen Drüse produziert wird, dem sogenannten major ampullate spidroin (MaSp oder MAS). Im Spinnkanal sorgen Veränderungen der chemischen und physikalischen Bedingungen für eine Umstrukturierung der Seidenproteine. [8, S ; 13, S. 83] Natriumchlorid wird gegen Kaliumphosphat ausgetauscht, der ph-wert nimmt von 7,0 auf ca. 6,2 ab, Wasser wird entzogen, Scher und Dehnkräfte treten auf. [31, S. 312; 14, S. 999] Solange Natriumchlorid in der Lösung vorkommt, wird ein Zusammenbau und Aggregation der spidroins verhindert. Erst wenn Kaliumphosphat das Natriumchlorid ersetzt, beginnen die Seidenproteine eine komplexe Struktur anzunehmen. [8, S. 3645] Die ph- Abnahme sowie der Wasserentzug verstärken diese Strukturbildung. [36, S. 999] Die endgültige Struktur wird aufgrund von auftretenden Scher und Dehnkräften gebildet. All die genannten Faktoren bewirken, dass das hoch konzentrierte Seidenproteingemisch eine Faserform annimmt. [8, S. 3645] Letztendlich tritt die flüssige Faser durch die Spinnenwarze aus. Mit den Gliedmaßen zieht die Spinne die Faser heraus, welche sich durch diesen Zugmechanismus endgültig verfestigt. [31, S. 312; 8, S. 3647] 13

18 2.4 Spinnenseidenproteine Spinnenseide besteht im Wesentlichen aus zwei Proteinen. Im Falle eines major ampullate Spinnenfadens werden die Proteine entsprechend als major ampullate spidroin 1 und 2 (MaSp1, MaSp2) bezeichnet. [14, S. 159; 16, S. 8] Im fertigen Faden befindet sich im Inneren des Seidenkerns überwiegend das Protein MaSp2. Dies sorgt aufgrund seines vorwiegend amorphen, unstrukturierten Charakters für die Elastizität des Spinnfadens. MaSp2 ist in MaSp1 eingebaut. Anders als MaSp2 besteht MaSp1 hauptsächlich aus β-faltblatt-kristallen, welche für die hohe Festigkeit des Fadens sorgen. Der Seidenkern ist umgeben von einer Glycoproteinschicht und einer Lipidschicht. Die Glycoproteinschicht sorgt für die Klebrigkeit des Fadens, wobei die Lipidschicht den Faden vor Mikroorganismen schützt und außerdem als sexuelles Pheromon fungiert. [14, S. 163] Zusätzlich, wenn es sich um den Faden der Hilfsspirale handelt, befindet sich zwischen dem MaSp1 und der Glycoproteinschicht eine Außenhaut, die der Hilfsspirale eine besondere Stabilität verleiht. [14, S. 160; 15, S. 23; 16, S. 8] In Abbildung 8 ist der Querschnitt durch einen major ampullate Spinnenfaden dargestellt. Darin ist der eben beschriebene Aufbau eines Abseilfadens gut zu erkennen. Abbildung 8: Querschnitt durch einen "major ampullate" Spinnenfaden. Im Innersten des Seidenkerns befindet sich überwiegend major ampullate spidroin 2 (MaSp2), welches in major ampullate spidroin 1 (MaSp1) eingebaut ist. MaSp2 sorgt aufgrund seines amorphen, unstrukturierten Charakters für die Elastizität des Spinnfadens, während MaSp1 hauptsächlich aus β-sheet-kristallen besteht, welche dem Faden die hohe Festigkeit verleihen. Zusätzlich, wenn es sich um den Faden der Hilfsspirale handelt, befindet sich zwischen dem MaSp1 und der Glycoproteinschicht eine Außenhaut, die der Hilfsspirale eine besondere Stabilität verleiht. Im Innersten des Seidenkerns entsteht ein sogenanntes 3-Phasen-Modell. Dies besteht aus überwiegend amorphen Regionen des MaSp2 und aus wenigen amorphen Regionen des MaSp1 sowie aus überwiegend β-faltblatt-kristallen des MaSp1 und aus wenigen β-faltblatt-kristallen des MaSp2. Aus: 2009; Heim, Markus; Römer, Lin; Scheibel, Thomas: Hierarchical structures made of proteins. The complex architecture of spider webs and their constituent silk proteins MaSp1 besitzt neben den in hoher Anzahl vorhandenen β-faltblatt-kristallen einige amorphe Regionen, welche keine β-faltblätter enthalten. MaSp2 dagegen besitzt neben den in hoher 14

19 Anzahl vorhandenen amorphen, unstrukturierten Regionen einige kristalline Regionen, welche β-faltblätter enthalten. Im Innersten des Seidenkerns sind einige β-faltblatt-kristalle in den amorphen Regionen eingebaut. Dabei stammt der größte Anteil amorpher Regionen aus dem MaSp2, während ein kleiner Anteil dem MaSp1 entstammt. Durch diese Anordnung der Strukturen im Innersten des Seidenkerns, entsteht ein sogenanntes 3-Phasen-Modell. Dies besteht aus überwiegend amorphen Regionen des MaSp2 und aus wenigen amorphen Regionen des MaSp1, sowie aus überwiegend β-faltblatt-kristallen des MaSp1 und aus wenigen β-faltblatt-kristallen des MaSp2. [13, S. 82, 84; 18, S. 161] Wie kommt der große Unterschied in der Struktur der beiden Seidenproteine zu Stande? Aufschluss darüber gibt die Betrachtung der Primärstruktur. Die Sequenz beider Proteine lässt sich in 3 Teilbereiche untergliedern: Der hoch konservierten N-terminalen Region, der repetitiven Kernsequenz und der hoch konservierten C-terminalen Region. [14, S. 160; 15, S. 23; 16, S. 8] Die hoch repetitive Kerndomäne besteht aus iterativen Wiederholungen (bis zu 100-mal) von Aminosäuremotiven. [31, S. 309] Die Motive bestehen überwiegend aus Alanin und Glycin, MaSp2 besitzt zusätzlich noch Pentapeptidabschnitte, welche Prolin enthalten. Die Kernsequenz ist umgeben von evolutionär hoch konservierten kleinen terminalen Regionen, welche nicht repetitiv sind. [14, S. 160; 15, S. 23] Abbildung 9 zeigt die Primärstruktur von major ampullate spidroin. Grün hervorgehoben sind die beiden terminalen Regionen, welche nicht repetitiv sind (NR). Zwischen den terminalen Regionen befindet sich die große Kernsequenz mit ihren iterativen Wiederholungen von Aminosäuremotiven (X, Y). Abbildung 9: Primärstruktur von "major ampullate spidroin". Die Sequenz besteht aus einer repetitiven Kernsequenz sowie aus einer hoch konservierten N-terminalen Region und einer hoch konservierten C-terminalen Region. Beide terminale Regionen sind nicht repetitiv (NR). Die Kernsequenz besteht aus iterativen Wiederholungen (bis zu 100-mal) von Aminosäuremotiven (X, Y). Aus: 2007; Römer, Lin; Scheibel, Thomas: Spinnenseidenproteine. Grundlage für neue Materialien. Beide spidroins, MaSp1 und MaSp2, enthalten Poly-Alanin-Muster. Außerdem enthalten beide Sequenzen glycinreiche Bereiche. MaSp2 besitzt deutlich mehr sowie deutlich größere glycinreiche Regionen und weniger Poly-Alanin-Bereiche als MaSp1. [27, S. 8] Ein weiterer 15

20 Unterschied ist, dass die Kernsequenz von MaSp2 überwiegend aus GPGXX-Motiven aufgebaut ist, anders als die Kernsequenz von MaSp1, welche aus GGX-Motiven in zwei bis vierfacher Wiederholung besteht. Das X steht hierbei für eine beliebige Aminosäure. Die Besonderheit an MaSp2 ist das enthaltene Motiv QQ (Q=Glutamin), jedoch ist die Funktion dieses Motivs noch unklar. Beide Proteinsequenzen enthalten außerdem die Aminosäure Cystein, welche vor allem in den C-terminalen Regionen vorkommt. [27, S. 8, 9] Die Daten über die Sequenzmotive wurden während der Arbeit im Praxismodul ermittelt und zusammen getragen, mit Hilfe des National Center for Biotechnology Information. Cystein ermöglicht die Bildung von Disulfidbrücken. Disulfidbrücken sind kovalente Bindungen zwischen jeweils zwei Cysteinen. Diese Bindungen entstehen aber nicht bei allen Cysteinen, sondern sind sehr spezifisch. [23, S ] Mittels verschiedener durchgeführter Experimente war es möglich, auf die Sekundärstruktur (und Tertiärstruktur) der spidroins zu schließen. Anhand von Röntgenbeugungsanalyse (X-ray) und Kernmagnetresonanz (NMR-nuclear magnetic resonance) wurden Nanokristalle (2 x 5 x 7 nm), welche aus β-faltblättern bestehen, identifiziert. [47, S. 545; 13, S. 82; 18, S. 162; 20, S. 6517] Mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM-scanning electron microscopy) und Atomkraftmikroskopie (AFM-atomic force microscopy) wurden kleine mizellenartige Unterstrukturen der sich in einer wässrigen Lösung befindenden spidroins entdeckt. [18, S. 1058] Transmissionselektronmikroskopie-Versuche belegen ebenfalls eine Bildung von mizellenartigen Strukturen. [20, S. 8908] Die Poly-Alanin-Motive der major ampullate spidroins bilden β-faltblätter aus. [47, S. 545; 13, S. 82; 20, S. 6515] Diese Faltblätter können miteinander wechselwirken, indem je ein Faltblatt über Wasserstoffbrücken mit dem Faltblatt eines benachbarten Proteins verbunden wird. [23, S ] Die GGX-Motive (in zwei bis vierfacher Wiederholung) des MaSp1 bilden eine Helix-Struktur aus. [3, S. 1; 16, S. 9; 20, S. 6516] Durch diese Struktur können keine Querverbindungen zu benachbarten Proteinen hergestellt werden, wodurch eine gewisse Beweglichkeit entsteht, die dem Faden die Elastizität verleiht. [3, S. 1-2; 16, S. 9] Anstelle der GGX-Motive des MaSp1 bilden die GPGXX- Motive des MaSp2 eine β-turn-struktur (β-turn = β-schleife) aus. Diese sorgt ebenso wie die Helix für die Elastizität des Spinnfadens. [3, S. 1-2; 16, S. 9; 20, S. 6516] All die beschriebenen Strukturmerkmale der jeweiligen Motive der Kernsequenz charakterisieren den fertigen Spinnfaden, existieren jedoch nicht zu Beginn, während der Speicherung der Seidenproteine in der Drüse. Erst im Spinnkanal entstehen die beschriebenen Strukturen der Kernsequenz beider spidroins. [13, S. 83] Die terminalen Regionen der Sequenz beider Spinnenseidenproteine verhalten sich anders. Sie falten sich direkt nach der Synthese des 16

21 Seidenproteins in eine stabile Form. Daher werden die terminalen Regionen auch als terminale Domänen bezeichnet. Eine Proteindomäne ist eine Untereinheit eines Proteins, welche eine eigene Struktur und/oder eine eigene Funktion besitzt. [23, S ] Außerdem wird davon ausgegangen, dass die terminalen Domänen einen großen Einfluss auf den Strukturbildungsprozess der repetitiven Bereiche während der Umstrukturierung im Spinnkanal haben. [20, S. 8908; 22, S. 236, 237; 23, S ] 3 Material Nachfolgend werden thematisch die einzelnen Programme und Tools sowie diverse bioinformatische Datenbanken bzw. Suchmaschinen, welche in dieser Bachelorarbeit angewandt worden sind, aufgelistet Datenbanken National Center for Biotechnology Information Das National Center for Biotechnology Information (NCBI) wurde 1988 an der National Library of Medicine der USA gegründet. Ziel und Aufgabe des NCBI ist es, mittels mathematischer Werkzeuge bzw. Computertools die molekularen Grundlagen von Krankheiten zu untersuchen. Im Groben umfasst dieses Ziel drei Hauptaufgaben: Die Analyse der Sequenz eines Gens oder Genproduktes; analysierte Gene verstehen; Strukturvorhersagen von analysierten Molekülen treffen. [29, S. 34, 35] Das NCBI beinhaltet verschiedene Software bzw. Suchmaschinen, die über die NCBI-Website frei zugänglich sind. In der Bachelorarbeit angewandte Tools des NCBI waren BLAST sowie Entrez. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) besteht aus einer Reihe bioinformatischer Programme, welche zum Auffinden ähnlicher und homologer Sequenzen einer Eingabesequenz dienen. [29, S. 38] Entrez ist eine Suchmaschine, die nach Eingabe eines Suchbegriffes die verschiedenen Datenbanken des NCBI auf Literaturzitate und biologische Daten hin durchsucht und entsprechende Treffer ausgibt. [29, S. 38] Universal Protein Resource Die Universal Protein Resource (UniProt) ist ein Konsortium aus drei verschiedenen Datenbanken. Es trägt Proteindaten des European Bioinformatics Institute (EBI), des Swiss Institute of Bioinformatics (SIB) und der Protein Information Resource (PIR) zusammen. [37, S. D142] 17

22 3.1.3 Swiss Institute of Bioinformatics Das Swiss Institute of Bioinformatics (SIB) ist eine freie akademische Stiftung, welche 1998 gegründet wurde. [38] Es enthält eine ausführliche Sammlung von Tools, welche der Untersuchung von Proteinen, Genomen, Phylogenetischen Ansätzen und anderen biologischen Daten dient. [38] Diese Sammlung wird als ExPASy bezeichnet und ist per Internetportal frei zugänglich. ExPASy enthält Verweise zu verschiedenen bioinformatischen Werkzeugen. In der Bachelorarbeit angewandte Tools waren zum Beispiel: SWISS-MODEL, SMART (Simple Modular Architecture Research Tool), ProtScale, GOR, CFSSP (Chou-Fasman Secondary Structure Prediction Server), Dotlet, sowie der Protein-3D-Viewer Rasmol Protein Data Bank Die Protein Data Bank (PDB) ist eine Sammlung über experimentell bestimmter Strukturen von Proteinen, Nukleinsäuren und Proteinkomplexen. [29, S. 48] Diese Strukturen wurden mittels Kernmagnetresonanz und/oder mittels Röntgenstrukturanalysen ermittelt. Ein PDB-Datensatz enthält Koordinaten der enthaltenen Atome, Literaturzitate, Daten über die durchgeführten Experimente sowie Informationen zur Primär- und Sekundärstruktur des Proteins bzw. der Nukleinsäure. [29, S ] Conserved Domain Database Die Conserved Domain Database (CDD) wird vom NCBI unterhalten und ist über selbige frei zugänglich. Die CDD beinhaltet eine Sammlung von Sequenzalignments und Steckbriefen, welche für verschiedene, durch molekulare Evolution konservierte Proteindomänen repräsentativ sind. Außerdem sind Alignments von Domänen bekannter dreidimensionaler Proteinstrukturen aus anderen Datenbanken enthalten. Dadurch kommt es zur teilweisen Redundanz der enthaltenen Daten. [21, S. 225] Die CDD wurde während der Bachelorarbeit genutzt, um eine ähnliche Proteindomäne des eingegeben Spinnenseidenprotein zu finden und daraufhin eine Struktur der Domäne des Spinnenseidenproteins abzuleiten. 3.2 Tools für Sequenzanalyse Hydrophobizitätsplot Mit Hilfe eines Hydrophobizitätsplots ist es möglich, eine Proteinsequenz bezüglich der hydrophoben bzw. hydrophilen Eigenschaften ihrer enthaltenen Aminosäuren zu untersuchen. Dabei existiert für jede einzelne Aminosäure ein bestimmter Zahlenwert, der die Hydrophobizität angibt. Je höher dieser Wert ist, desto hydrophober ist eine Aminosäure. [29, 18

23 S. 19] Entsprechend werden diese Daten in einem Plot dargestellt. Ein Beispiel für einen Hydrophobizitätsplot ist der Hydrophobizitätsplot nach Kyte und Doolittle, siehe Abbildung 10. Der Hydrophobizitätsplot nach Kyte und Doolittle ist beispielsweise über das Tool ProtScale des SIB (ExPASy) verfügbar. In Abbildung 10 ist der Hydrophobizitätsplot der N-terminalen Region der Sequenz von major ampullate spidroin 1 der Spinne Latrodectus hesperus dargestellt. An der Abszisse sind die Positionen der enthaltenen Aminosäuren abgetragen, während an der Ordinate die jeweiligen Zahlenwerte der Hydrophobizität angegeben sind. Eine Aminosäure ist hydrophob, wenn der Zahlenwert größer Null ist. [29, S. 19] Ist der Zahlenwert kleiner Null, ist die Aminosäure bzw. der Proteinabschnitt hydrophil. Der größte Wert der Hydrophobizität beträgt 2,889, der kleinste Wert beträgt -1,700. Gut zu erkennen ist, dass der Großteil der Aminosäuren hydrophobe Werte aufweist. Somit ist die N-terminale Domäne von major ampullate spidroin 1 der Spinne Latrodectus hesperus hydrophob. Abbildung 10: Hydrophobizitätsplot nach Kyte und Doolittle der N-terminalen Region der Sequenz von major ampullate spidroin 1 der Spinne Latrodectus hesperus. An der Abszisse sind die Positionen der enthaltenen Aminosäuren abgetragen, während an der Ordinate die jeweiligen Zahlenwerte der Hydrophobizität angegeben sind. Eine Aminosäure ist hydrophob, wenn der Zahlenwert größer Null ist. Ist der Zahlenwert kleiner Null, ist die Aminosäure bzw. der Proteinabschnitt hydrophil. Der größte Wert der Hydrophobizität beträgt 2,889, der kleinste Wert beträgt -1,700. Gut zu erkennen ist, dass der Großteil der Aminosäuren hydrophobe Werte aufweist Sequenzalignment Ein (paarweises) Sequenzalignment dient der quantitativen Erfassung von zwei ähnlichen Sequenzen. Dabei werden Entsprechungen zwischen einzelnen Bausteinen beider Sequenzen festgestellt. Je ähnlicher sich zwei Sequenzen sind, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass sie eine ähnliche Raumstruktur ausbilden bzw. eine ähnliche Funktion besitzen. Zwei zu 30% identische Sequenzen bilden mit hoher Wahrscheinlichkeit eine ähnliche Raumstruktur aus und besitzen ähnliche Funktionen. [22, S ] Es existieren verschiedene Möglichkeiten 19

24 ein Alignment durchzuführen. Alignment-Tools sind beispielsweise der Dotplot (Punktdiagramm), BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) und ClustalW Dotplot Ein Dotplot (Punktdiagramm) ist eine sehr einfache Methode, ein paarweises Sequenzalignment durchzuführen. In einer Matrix werden beide Sequenzen graphisch dargestellt. Eine Sequenz wird an der Abszisse abgetragen, während die andere Sequenz an der Ordinate abgetragen wird. Das Programm setzt überall dort, wo identische Positionen beider Sequenzen gefunden werden, einen Punkt. Liegen viele identische Positionen eng beieinander, summieren sich die Punkte zu Linien. Wenn sich beide Sequenzen sehr ähnlich sind, entsteht eine Diagonale quer durch die Matrix bzw. den Dotplot. Dies ist der Idealfall. [22, S ] Ein Dotplot kann auch genutzt werden, um repetitive Bereiche innerhalb ein und derselben Sequenz zu finden. Dabei wird an beiden Achsen der Matrix dieselbe Sequenz abgetragen. Quer durch den Dotplot ist eine durchgängige Diagonale zu erkennen, da an den gleichen Positionen die gleichen Aminosäuren vorkommen. Um sich das Ganze besser vorstellen zu können, ist die Zuhilfenahme der Abbildung 11 hilfreich. In Abbildung 11 wurde die Kernsequenz von major ampullate spidroin 2 der Spinne Latrodectus hesperus in das Programm Dotlet eingefügt. Dotlet wurde von Marco Pagni und Thomas Junier, zwei Mitarbeiter des SIB, entwickelt und 2000 veröffentlicht. Es ist frei zugänglich und über den Webbrowser ausführbar. Per Optionsfeld können verschiedene Einstellungen getroffen werden, welche die Suche nach identischen und/oder ähnlichen Positionen präzisieren bzw. anpassen. [24, S. 178] In Abbildung 11 ist die Diagonale durch die Matrix gut zu erkennen, ein Nachweis für die Identität der Eingabesequenzen. Weiterhin sind rechts und links neben der Diagonale mehrere Striche erkennbar. Überall dort sind ebenfalls identische Positionen zu finden. Je mehr Striche vorkommen, desto mehr identische bzw. ähnliche Regionen existieren innerhalb ein und derselben Sequenz. Die Striche kennzeichnen so die repetitiven Bereiche in der Sequenz. Dadurch ist klar erkennbar, dass die Sequenz von major ampullate spidroin 2 sehr viele repetitive Bereiche enthält. 20

25 Abbildung 11: Ein Dotplot, eine einfache Art des paarweisen Alignments. In das Programm Dotlet wurde die Kernsequenz von major ampullate spidroin 2 der Spinne Latrodectus hesperus eingefügt. Die Diagonale durch die Matrix ist gut zu erkennen, ein Nachweis für die Identität der Eingabesequenzen. Weiterhin sind rechts und links neben der Diagonale mehrere Striche erkennbar. Überall dort sind ebenfalls identische Positionen zu finden. Je mehr Striche vorkommen, desto mehr identische bzw. ähnliche Regionen existieren innerhalb ein und derselben Sequenz. Die Striche kennzeichnen so die repetitiven Bereiche in der Sequenz. Dadurch ist klar erkennbar, dass die Sequenz von major ampullate spidroin 2 sehr viele repetitive Bereiche enthält BLAST BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) umfasst eine Reihe ähnlicher Programme. Das gemeinsame Ziel jedes BLAST-Programms ist das Finden von ähnlichen und/oder homologen Sequenzen zu einer eingegebenen Suchsequenz. [29, S. 38] Die ausgegebenen Treffer können der Vorhersage möglicher Funktionen dienen oder bei der Erstellung einer 3D-Struktur zu Hilfe genommen werden. Bei einem BLAST-Lauf werden die Datenbanken des NCBI nach ähnlichen Sequenzen durchsucht. [29, S. 64] Die Einteilung der BLAST-Programme erfolgt nach verschiedenen Kriterien, je nachdem ob es sich bei der Eingabesequenz um eine Aminosäureoder eine DNA-Sequenz handelt. Da während der Bachelorarbeit in den Proteindatenbanken des NCBI nach der jeweiligen eingegebenen Aminosäuresequenz gesucht wurde, handelte es sich hierbei um das Programm BLASTp (protein blast). [29, S. 64; 32] ClustalW ClustalW ist ein über den Webbrowser ausführbares Programm, welches multiple Alignments erstellt. Multiple Sequenzalignments sind die konsequente Ausweitung paarweiser Alignments auf n-viele Sequenzen. Über ein Eingabefenster werden die zu alignierenden Sequenzen eingefügt. Der Vorteil gegenüber BLAST ist, dass mehrere Sequenzen miteinander verglichen 21

26 werden. [29, S ; 30, S. 243] Oftmals werden bei einer BLAST-Suche sehr viele Treffer zur Eingabesequenz ausgegeben. Um diese Treffer miteinander vergleichen zu können, eignet sich ClustalW. Außerdem gibt ClustalW zu den alignierten Sequenzen eine Konsensus-Sequenz aus. In Abbildung 12 ist ein einfaches Beispiel eines multiplen Alignments dargestellt. Es wurden drei Sequenzen auf Ähnlichkeit mit einer Zielsequenz überprüft. Ein Maß für die Ähnlichkeit ist die Anzahl molekularer Austausche (Aminosäurereste). Unterhalb wurde als Ergebnis die Konsensus-Sequenz ausgegeben. Eine Konsensus-Sequenz ist eine Sequenz, welche die höchste Übereinstimmung der verglichenen Sequenzen darstellt. Abbildung 12: Ein einfaches Beispiel eines multiplen Alignments. Die oberste Sequenz (NK1-kringle) ist die Zielsequenz. Die 3 Sequenzen darunter sind die Sequenzen (1PKR, 1PK4, 2PF1), welche auf Übereinstimmung mit der Zielsequenz überprüft wurden. Die Farbe der markierten Aminosäurereste entspricht dem Grad der Konservierung. (weiß-keine, grün-gering, blau-mittel, rosa-hoch). Pfeile kennzeichnen die Cystein-Reste. Unterhalb ist die Konsensus-Sequenz angegeben. [51] ClustalW eignet sich gut, um schnell mehrere Sequenzen auf Ähnlichkeit sowie Homologie zu überprüfen. Analog zu den in Abbildung 12 verglichenen Sequenzen wurden die Seidenproteine in ClustalW eingefügt und auf Ähnlichkeit, sowie Homologie überprüft LALIGN LALIGN ist ein Programm, welches multiple Ähnlichkeiten von Teilbereichen innerhalb zweier Sequenzen findet. Folglich müssen stets zwei Sequenzen in das Inputfenster eingegeben werden. [39] Mittels LALIGN sollten einzelne Repeats innerhalb der Sequenzen von MASp1 sowie MaSp2 gefunden werden. 22

27 3.3 Strukturvorhersage-Tools Chou-Fasman Dieses Tool ermöglicht eine schnelle Vorhersage der Sekundärstruktur eines Proteins auf Basis der Sequenz. Der Algorithmus, welcher in dem Tool angewandt wird, wurde von Chou und Fasman 1974 entwickelt. [22, S. 392] Er basiert auf der Annahme der Proteinfaltung entlang der Sekundärstrukturelemente, beruhend auf Präferenzen. Eine Präferenz gibt die Wahrscheinlichkeit an, mit der sich eine Aminosäure in einer bestimmten Sekundärstruktur (Helix, β-faltblatt, β-schleife) aufhält. [22, S. 392] Je höher der Wert der Präferenz ist, desto wahrscheinlicher bildet eine bestimmte Aminosäure eine bestimmte Sekundärstruktur aus. Der große Nachteil dieses Algorithmus liegt in der geringen Vorhersagegenauigkeit, welche ca % beträgt. Ursache hierfür ist, dass bei der Berechnung der Präferenzen die Information der Umgebung einer Aminosäure nicht berücksichtigt wird. [22, S ] GOR Der GOR-Algorithmus wurde 1978 von Garnier, Osguthorpe und Robson entwickelt. [15a, 15b, 15c] Im Laufe der Zeit wurde der Algorithmus verbessert und so existieren heute verschiedene Varianten (GOR I-IV) dieser Vorhersage-Methode. GOR beruht auf einem statistischen Modell, welches die Information der Umgebung einer Aminosäure miteinberechnet. Für die Berechnung werden drei Matrizen (für jedes Sekundärstrukturelement eine Matrix: Helix, Faltblatt, Schleife) aufgestellt, welche die Häufigkeit des Auftretens einer bestimmten Aminosäure an einer definierten Position für ein Sekundärstrukturelement angeben. Er stellt sozusagen eine Verbesserung des Chou-Fasman-Algorithmus dar, da er genauer ist. Jedoch hat der GOR-Algorithmus den Nachteil, dass für eine statistische Analyse sehr viele Daten benötigt werden. Außerdem entstehen Mehrdeutigkeiten vor allem an den Enden der Sekundärstrukturelemente. [15a, 15b, 15c] Simple Modular Architecture Research Tool Das Simple Modular Architecture Research Tool (SMART) ist ein über den zugehörigen Internetserver freizugängliches Tool. Es ermöglicht die Identifikation von sich genetisch verändernden Domänen sowie die Analyse derselben. [33, S. 231] SMART vergleicht die Eingabesequenz mit den Domänensequenzen und multiplen Alignments der Datenbanken. Die Sammlung der SMART-Alignments umfasst mehr als 250 Signal- und Extrazelluläre Domänen. In der Sammlung enthaltene Domänen werden mit verschiedenen Daten annotiert. Die Daten 23

28 beinhalten Informationen der Domänen über den zellulären Standort, der Verteilung in Arten, der Funktionsklasse, der Tertiärstruktur und über funktionelle Reste. [28, S. 226] PROPKA PROPKA ist ein bioinformatisches Tool, welches die ph-wert-abhängigen Eigenschaften eines Proteins wie Ladung und Stabilisationsenergie untersucht. [32, S. 1] Als Eingabeformat wird ein PDB-File benötigt (siehe Kapitel Protein Data Bank). Das Programm gibt anschließend für jede enthaltene Aminosäure verschiedene Daten aus, wie zum Beispiel den pka-wert. Der pka- Wert (oder pks-wert) eines Proteins bzw. einer Aminosäure beschreibt das Bestreben eines Protons, durch Reaktion mit einer Base entfernt zu werden. [6, S. 17] Je niedriger der pks-wert eines Moleküls ist, desto leichter gibt das Molekül ein Proton ab. [6, S. 2] Das Tool PROPKA gibt außerdem den pi-wert des Proteins aus. Der pi-wert gibt den ph-wert am Isoelektrischen Punkt an. Bei diesem ph-wert liegt das Protein in der Zwitterionform vor. Das Zwitterion ist eine Struktur, bei der ein Molekül zwei entgegengesetzt geladene Gruppen besitzt. Im Falle des Proteins handelt es sich um eine positiv geladene Carboxylgruppe (protoniert) sowie um eine negativ geladene Aminogruppe (dissoziiert). [23, S 3-13 ; 41, S. 29] Des Weiteren zeichnet das Programm PROPKA für das jeweilige Protein ein Diagramm, in welchem die Stabilität des Proteins in Abhängigkeit vom ph-wert dargestellt ist SWISS-MODEL SWISS-MODEL wurde unter anderem von Mitarbeitern des SIB entwickelt und bietet einen Server zur Modellierung von Proteinstrukturen an. Frei über den Webbrowser zugänglich erstellt SWISS-MODEL die Homologiemodelle von Proteinstrukturen. [1, S. 195] Außerdem beinhaltet der SWISS-MODEL-Server noch weitere Tools, sowie einen integrierten Workspace. Nach einer Registrierung ist der Workspace jederzeit zugänglich und ermöglicht eine Speicherung der bisherigen Modellierungsprojekte, jedoch ist SWISS-MODEL auch ohne Registrierung zu benutzen. Während der Bachelorarbeit wurde das Tool Secondary Structure Prediction and Domain Assignment des SWISS-MODEL-Servers an den Spinnenseidenproteinen angewandt D-Position-Specific Score Matrices 3D-Position-Specific Score Matrices (3D-PSSM) stellt eine internetbasierte Methode zur Erkennung der Proteinfaltung dar. Dabei werden Primär- und Tertiärstrukturinformationen mit Sekundärstruktur- und Löslichkeitsdaten verknüpft. So können die 3D-Strukturen von Proteinen mittels homologer Sequenzen vorhergesagt werden. Nach den neuesten Angaben 24

29 auf der Homepage von 3D-PSSM wird empfohlen, anstelle des 3D-PSSM-Servers die neue verbesserte Protein Homology/analogY Recognition Engine (Phyre) zu benutzen. [19] Während der Bachelorarbeit wurde jedoch durchgängig mit dem Server von 3D-PSSM gearbeitet Prediction of TransMembrane Beta-Barrel Proteins Prediction of TransMembrane Beta-Barrel Proteins (PRED TMBB) ist ein Tool, welches in der Lage ist, die Topologie von Transmembransträngen und β-barrel in äußeren Membranproteinen vorherzusagen. [40, S. W400] Ein β-barrel (β-fass) ist eine bestimmte Anordnung der Polypeptidkette innerhalb einer Membran. Es besteht aus Transmembransträngen, welche eine β-faltblattstruktur besitzen und eine fassförmige Struktur annehmen. Das Besondere ist, dass die Primärstruktur solcher Membranproteine der Struktur von löslichen Proteinen stark ähnelt. Nichts innerhalb der Sequenz deutet zunächst auf die endgültige Struktur hin. β-barrels können daher nicht anhand der Primärstruktur vorhergesagt werden. [23, S ] Hier besteht eine große Ähnlichkeit zu den Spinnenseidenproteinen, welche zunächst löslich sind und deren Struktur ebenfalls nicht anhand der Sequenz vorhersagbar ist. Das Tool PRED TMBB beruht auf einem Hidden Markov Modell, welches mittlerweile 16 nicht-homologe äußere Membranproteine enthält, von denen die Strukturen in atomarer Auflösung bekannt sind. [40, S. W400] Detaillierte Informationen zu Hidden Markov Modellen im Buch: Gernot A. Fink: Mustererkennung mit Markov- Modellen: Theorie, Praxis, Anwendungsgebiete. Teubner, 2003, ISBN Der Benutzer kann über den Webserver des PRED TMBB zur Strukturvorhersage eine von drei verschiedenen Erkennungsmethoden (Algorithmen) auswählen. Entsprechend gibt der Server die vorhergesagte Topologie, einen Score für die Wahrscheinlichkeit, dass das eingegebene Protein ein äußeres Membranprotein ist, sowie die Wahrscheinlichkeit für die Vorhersage von Transmembransträngen, aus. Außerdem werden die errechneten Daten der Transmembranstränge graphisch dargestellt. [40, S. W400] In Abbildung 13 ist ein Beispiel für ein Ergebnis der Strukturvorhersage mittels PRED TMBB aufgeführt. Es wurde die Struktur von Bacteriorhodopsin (PBD-Identifikationsnummer 3NS0 ) innerhalb einer Doppellipidschicht vorhergesagt. Entsprechend der Abbildung befindet sich die Aminogruppe sowie die Carboxylgruppe im Inneren, während sich ein kleiner Teil des Proteins außerhalb der Membran, im umgebenden Medium, befindet. 25

30 Abbildung 13: Struktur von Bacteriorhodopsin (PDD-ID 3NS0 ) innerhalb einer Doppellipidschicht, vorhergesagt mittels PRED TMBB. Farblich hervorgehoben sind die Aminosäuren nach ihrer Hydrophobizität. Eine blaue bis grüne Farbe kennzeichnet eine hydrophile Aminosäure, eine gelbe Farbe eine hydrophobe Aminosäure. Erkennbar ist, dass sich die Aminogruppe im Inneren befindet, während sich ein kleiner Teil des Proteins außerhalb der Membran, im umgebenden Medium befindet. Auf der Abbildung nicht eingezeichnet ist die Carboxylgruppe, welche sich analog zur Aminogruppe im Inneren befindet. Die Skala der Hydrophobizität stammt aus dem Handbuch zum Tool, aus: Spyropoulos, Ioannis C.; Liakopoulos, Theodore D.; Bagos, Pantelis G.; Hamodrakas, Stavros J.: TMRPres2D High quality visual representation of transmembrane protein models. 26

31 4 Methoden und Ergebnisse Zu Beginn der Bachelorarbeit galt es, bisherigen Arbeiten, darunter die Belegarbeit im 4. Semester sowie das Praxismodul im 5. Semester, zusammenzufassen. Es wurde ein Überblick geschaffen, wie der Wissenstand zum Thema Der Spinnenfaden auf molekularer Ebene untersucht mit bioinformatischen Tools war und was bisher erreicht wurde. Ferner wurde ein erster grober Plan erstellt, was in der Zeit der Bachelorarbeit stofflich bearbeitet werden sollte. Der grobe Plan wurde in einzelne kleinere Aufgaben geteilt, die es pro Woche zu erledigen galt. Daher erweist es sich als sinnvoll, den Inhalt sowie die Ergebnisse der einzelnen Wochenaufgaben chronologisch zu berichten. In Abbildung 14 ist ein Schema des groben Arbeitsplans dargestellt. Abbildung 14: Workflow des Arbeitsplans. Hier ist der Ablaufplan der Bachelorarbeit grob dargestellt. Der grobe Plan wurde in 3 einzelne Methodenkomplexe unterteilt. Im Plan aufgeführt sind lediglich die Inhalte, welche bearbeitet werden sollten. Nicht enthalten sind die Ergebnisse sowie die tatsächlich durchgeführten Arbeiten. Der eigentliche Plan wurde im Laufe der Arbeit verändert und angepasst, da einige Inhalte nicht bearbeitet werden konnten. (z. B. LALIGN). 4.1 Methodenkomplex 1 Das Hauptziel des ersten Methodenkomplexes war die Suche nach Programmen, welche in der Lage sind, ph-wert-abhängige Strukturen vorherzusagen. Die Literatur sollte nach 27

32 Informationen über Proteine durchsucht werden, von denen bekannt ist, dass sie bei zwei unterschiedlichen ph-werten zwei unterschiedliche Strukturen ausbilden. Anschließend sollten Abbildungen generiert werden, welche die Sekundär- bzw. Tertiärstrukturen der fertig gefalteten Proteine in Abhängigkeit vom ph-wert darstellen. Außerdem sollten mit Hilfe der Protein Data Bank die 3D-Strukturen der Spinnenseidenproteine verglichen werden und so viele Daten wie möglich zu den terminalen Domänen herausgefunden werden. Es wurde mittels verschiedener Suchanfragen im Internet (Suchmaschinen) ein bioinformatisches Tool gefunden, welches in der Lage ist, ph-wert-abhängige Eigenschaften von Proteinen wie Ladung und Stabilisationsenergie zu untersuchen. Das Tool trägt den Namen PROPKA. Der Nachteil dieses Tools ist, dass als Eingabeformat eine alleinige Sequenz eines Proteins nicht ausreicht. Es wird ein PDB-File benötigt, in welchem die Informationen über die Topologie der Atome innerhalb eines Proteins enthalten sind (siehe Kapitel 3.1.4). Daher wurde das major ampullate spidroin 1 der Spinne Euprosthenops australis (E. australis), welches die PDB-Identifikationsnummer 3LR2 besitzt, mittels PROPKA auf ph-wertabhängige Eigenschaften von Proteinen, wie Ladung und Stabilisationsenergie untersucht. Es handelt sich hierbei jedoch nicht um die Sequenz des kompletten Proteins, sondern lediglich um die Sequenz der N-terminale Domäne des MaSp1 von E. australis. Mittels PROPKA 2.0 wurde herausgefunden, dass die Stabilität der N-terminalen Domäne bei einem neutralen ph- Wert geringer ist als bei einem sauren ph-wert. Im Diagramm in Abbildung 15 ist die Stabilität der N-terminalen Domäne des MaSp1 von E. australis in Abhängigkeit vom ph-wert dargestellt. Erkennbar ist, dass bei einem neutralen ph-wert von 7, welcher während der Speicherung des Seidenproteins innerhalb der Drüse vorliegt, die Stabilität der N-terminalen Domäne geringer ist als bei einem sauren ph-wert. Ein saurer ph-wert (ca. 6) liegt während der Umstrukturierung der Seidenproteine innerhalb des Spinnkanals vor. (siehe Kapitel 2.3). Nach der Untersuchung der Eigenschaften der N-terminalen Domäne, folgte die Untersuchung der C-terminalen Domäne. Da keine genaueren atomaren Daten der C-terminalen Domäne von MaSp1 der Spinne E. australis existieren, wurden die Daten der C-terminalen Domäne eines anderen Proteins untersucht. Als Ersatz wurde die C-terminale Domäne des Fibroins 3 der Spinne Araneus diadematus (ADF-3) untersucht, welches sich hinter der PDB- Identifikationsnummer 2KHM verbirgt. Mit Hilfe des bioinformatischen Tools PROPKA 2.0 stellte sich heraus, dass die Stabilität der C-terminalen Domäne von ADF-3 bei einem neutralen ph-wert größer ist als die Stabilität bei einem sauren ph-wert. Die Stabilität der C-terminalen Domäne von ADF-3 verhält sich genau umgekehrt wie die Stabilität der N-terminalen Domäne 28

33 von MaSp1 von E. australis in Abhängigkeit vom ph-wert. Die Art der Stabilität beider terminaler Domänen variiert ebenfalls. Die N-terminale Domäne des MaSp1 von E. australis weist überwiegend negative Werte der Stabilität und erst ab einem ph-wert kleiner gleich 4 positive Werte auf. Dagegen besitzt die C-terminale Domäne von ADF-3 durchgängig positive Werte der Stabilität. Die Stabilität der C-terminale Domäne von ADF-3 in Abhängigkeit vom ph- Wert ist in Abbildung 15 graphisch dargestellt. Abbildung 15: Stabilität der terminalen Domänen des Spinnenseidenproteins in Abhängigkeit vom ph-wert. Im linken Diagramm ist die Stabilität der N-terminalen Domäne von MaSp1 der Spinne Euprosthenops australis dargestellt, im rechten Diagramm die Stabilität der C-terminalen Domäne von Fibroin 3 der Spinne Araneus diadematus (ADF-3). Erkennbar ist, dass bei einem neutralen ph-wert von 7 die Stabilität der N-terminalen Domäne (links) geringer ist als bei einem sauren ph-wert. Die Stabilität der C-terminalen Domäne (rechts) von ADF-3 verhält sich genau umgekehrt. Die N-terminale Domäne (links) des MaSp1 von E. australis weist überwiegend negative Werte der Stabilität und erst ab einem ph-wert kleiner gleich 4 positive Werte auf. Dagegen besitzt die C-terminale Domäne (rechts) von ADF-3 durchgängig positive Werte der Stabilität. Die Suche nach Informationen über Proteine, von denen bekannt ist, dass sie bei zwei unterschiedlichen ph-werten zwei unterschiedliche Strukturen ausbilden, blieb erfolglos. Demnach konnten auch keine Abbildungen generiert werden, welche die Sekundär- bzw. Tertiärstrukturen der jeweiligen fertig gefalteten Proteine in Abhängigkeit vom ph-wert darstellen. Die 3D-Strukturen der Spinnenseidenproteine konnten nur teilweise verglichen werden. Die praktischen Experimente und Untersuchungen wurden nur an den terminalen Domänen der Spinnenseidenproteine durchgeführt, somit konnten nur deren Strukturen verglichen werden. Das eigentliche Ziel war es, die β-faltblatt-bildung zu verstehen. Da sich an den terminalen Domänen ohnehin keine β-faltblätter bilden, konnte das Ziel nicht allein durch die Analyse terminaler Domänen erreicht werden. Während der Recherchen über Informationen von 3D-Strukturen der Spinnenseidenproteine konnte eine komplette Sequenz der Proteine MaSp1 sowie MaSp2 von Latrodectus hesperus in der Universal Protein Resource (UniProt) gefunden werden. [42; 43] Bisherige Arbeiten wurden nur anhand von Segmenten der Seidenproteinsequenzen von Araneus diadematus und Euprosthenops australis durchgeführt. Daher galt der Fund der kompletten Sequenz von L. hesperus als erfreulicher 29

34 Fortschritt und erleichterte nachfolgende Arbeiten. Außerdem konnten alle weiteren Aufgaben anhand einer Sequenz durchgeführt werden, ohne eine komplette Sequenz mittels verschiedener Datenbanken zusammensetzen zu müssen. Hierbei wird ein Nachteil der großen Datenbanken wie zum Beispiel der NCBI deutlich: Viele Daten liegen mehrmals vor, so dass es Dopplungen und Überschneidungen der enthaltenen Informationen gibt. Die Sekundärstruktur der Proteine MaSp1 und MaSp2 von L. hesperus wurde mit Hilfe der Tools GOR und Chou-Fasman vorhergesagt. Beide Tools sagten eine Helix-Struktur-Bildung der Poly- Alanin-Muster vorher. Diese Daten sind als falsch bzw. als nicht aussagekräftig zu werten. Kernmagnetresonanzexperimente, sowie Röntgenbeugungsanalyse, welche am Abseilfaden von Nephila clavipes durchgeführt worden waren, belegen die Bildung von β-faltblättern der Poly-Alanin-Muster. [47, S. 545; 13, S. 82] In Abbildung 16 sind die Ergebnisse der Sekundärstrukturvorhersage von MaSp1 und MaSp2 der Spinne Latrodectus hesperus dargestellt. Beide Sequenzen bestehen aus über 3000 Aminosäuren. Daher ist nur ein Ausschnitt der Sekundärstrukturelemente der jeweiligen Sequenzen aufgeführt. Die Farbgebung der Sekundärstrukturelemente beider Tools variieren. Bei GOR (linker Teil der Abbildung) sind die Helices blau, die Faltblätter rot und die Schleifen grün hervorgehoben. Bei Chou-Fasman hingegen sind die Helices rot, die Faltblätter grün und die Schleifen blau markiert. Die Zufallsknäul (coil) sind bei beiden Tools gelb dargestellt. Deutlich erkennbar ist, dass beide Tools Helix-Strukturen der Poly-Alanin-Muster vorhersagen. Die vollständigen Ergebnisse von GOR und Chou-Fasman sind in einer gleichnamigen Datei gespeichert und mit Hilfe eines Computers abrufbar. [40; 41] 30

35 Abbildung 16: Sekundärstrukturvorhersage von MaSp1 und MaSp2 der Spinne Latrodectus hesperus mittels GOR und Chou-Fasman. Beide Sequenzen bestehen aus über 3000 Aminosäuren. Daher ist nur ein Ausschnitt der Sekundärstrukturelemente der jeweiligen Sequenzen aufgeführt. Die Farbgebung der Sekundärstrukturelemente beider Tools variieren. Bei GOR (linker Teil der Abbildung) sind die Helices blau, die Faltblätter rot und die Schleifen grün hervorgehoben. Bei Chou-Fasman (rechts) hingegen sind die Helices rot, die Faltblätter grün und die Schleifen blau markiert. Die Zufallsknäul (coil) sind bei beiden Tools gelb dargestellt. Deutlich erkennbar ist, dass beide Tools Helix-Strukturen der Poly-Alanin-Muster hervorsagen. Die vollständigen Ergebnisse von GOR und Chou-Fasman sind in einer gleichnamigen Datei gespeichert und mit Hilfe eines Computers abrufbar. [40; 41] 4.2 Methodenkomplex 2 Nachdem die bioinformatischen Vorhersagetools GOR und Chou-Fasman keine aussagekräftigen Ergebnisse über die Sequenzen beider major ampullate spidroins von Latrodectus hesperus lieferten, sollten andere Vorhersagetools angewandt werden. Das Hauptziel des zweiten Methodenkomplexes war die Erstellung von Homologiemodellen aus der kompletten Spidroinsequenz von Latrodectus hesperus. Hauptsächlich sollte nur der Teil der Sequenz benutzt werden, welcher β-faltblätter bildet. Es sollte von den beiden β-faltblattabschnitten, genauer den repetitiven Kernsequenzen beider Spidroins, je ein PDB-File erstellt werden. Zu diesem Zweck sollten die kompletten Sequenzen von MaSp1 und MaSp2 in die einzelnen drei Sequenzabschnitte unterteilt werden. Es galt, die N-terminale Domäne, die Cterminale Domäne sowie den repetitiven Mittelteil in der kompletten Sequenz zuzuordnen. 31

36 Unter Zuhilfenahme der Domänensequenz der major ampullate spidroins einer anderen Spinne und des Programms LALIGN sollten so die einzelnen terminalen Domänen in der gesamten Sequenz des MaSp1 bzw. MaSp2 von L. hesperus gefunden werden. Anschließend sollte der repetitive Mittelteil des MaSp1/MaSp2 in das Tool SWISS-MODEL Template Identification eingefügt werden, um ein Template zu finden. Ein Template ist eine Vorlage. Template Identification von SWISS-MODEL ist ein Tool, welches zu einer eingegeben Sequenz mit Hilfe verschiedener Datenbanken und Programmen ähnliche Sequenzen sucht, um eine Vorlage einer ähnlichen Struktur zu liefern. [34] Anhand dieser Vorlage sollte ein Strukturmodell erstellt werden, falls möglich. Dieses Strukturmodell sollte ein PDB-File liefern, welches anschließend auf die ph-wert-abhängigen Eigenschaften wie Ladung und Stabilisationsenergie mittels PROPKA untersucht werden sollte. Ferner sollte eine Bestandsaufnahme angefertigt werden, die das gesamte bisherig gesammelte Wissen über die terminalen Domänen der Spinnenseidenproteine enthielt. Eine weitere Aufgabe bestand darin, mit Hilfe des Tools SMART die terminalen Domänen innerhalb der major ampullate spidroins von L. hesperus zu identifizieren. Außerdem sollte die CDD-Suche an den Seidenproteinen von L. hesperus durchgeführt werden, um ähnliche Proteindomänen zu den eingegebenen Seidenproteinen zu finden. Parallel zu den genannten Aufgaben sollte die Suche nach Programmen fortgesetzt werden, welche ph-wert-abhängige Sekundär- bzw. Tertiärstrukturen von Proteinen vorhersagen können. Der Grundidee der Benutzung von LALIGN erwies sich als nicht umsetzbar, da von den anderen Spinnenseidenproteinen nur einzelne Fragmente in den Datenbanken existierten. Die jeweiligen terminalen Domänen konnten aus den existierenden Fragmenten nicht vollständig herausgefiltert werden. Mit anderen Worten, es konnte nicht zugeordnet werden, ob vorliegende Sequenzfragmente eine komplette terminale Domäne charakterisierten. Glücklicherweise waren in der zu den UniProt-Einträgen beider major ampullate spidroins von L. hesperus gehörenden wissenschaftlichen Veröffentlichung die kompletten Sequenzen aufgeführt. Anhand dieser Veröffentlichung konnten die N-terminalen Domänen, die C- terminalen Domänen, sowie die repetitiven Kernsequenzen beider kompletter Sequenzen identifiziert werden. Die N-terminale Domäne von MaSp1 erstreckt sich von der ersten Aminosäure (MTW ) bis einschließlich zur Aminosäure 202 ( PVS). Die C-terminale Domäne von MaSp1 beginnt bei der Aminosäure 3011 (SGP ) und erstreckt sich bis zum Ende der Sequenz ( AFA). Zwischen N-und C-terminaler Domäne befindet sich der repetitive Mittelteil von Aminosäure 203 (YGQ ) bis 3010 ( AAA). MaSp1 besteht insgesamt aus 3129 Aminosäuren. [3, S. 2-3; 45] MaSp2 dagegen besteht aus insgesamt 3779 Aminosäuren. Die N- 32

37 terminale Domäne von MaSp2 beginnt bei der ersten Aminosäure (MTT ) und endet einschließlich bei der Aminosäure 217 ( AAA). Es folgt der repetitive Mittelteil ab Aminosäure 218 (GSG ) bis zur Aminosäure 3657 ( AAA). Schließlich erstreckt sich die C-terminale Domäne von Aminosäure 3658 (SGS ) bis zur letzten Aminosäure der Sequenz ( AMG). [3, S. 3-4; 46] Die Bestandsaufnahme, die das gesamte bisherig gesammelte Wissen über die terminalen Domänen der Spinnenseidenproteine enthielt, wurde angefertigt. Wissenschaftliche Experimente und zugehörige Veröffentlichungen besagen, dass sowohl die C-terminale als auch die N-terminale Domäne einen hohen Anteil an α-helices, sowie eine hohe thermische Stabilität besitzen. [11, S. 310; 23, S ] Beide terminale Domänen weisen hydrophobere Eigenschaften als der repetitive Mittelteil auf. [10, S. 239; 19, S. 3] Die hydrophobste Stelle in MaSp1 und MaSp2 befindet sich am Beginn der N-terminalen Domäne, wie in Abbildung 17 erkennbar ist. [3, S. 6; 48] Diese Abbildung dient dem bioinformatischen Nachweis der hydrophoben Eigenschaften der verschiedenen Sequenzabschnitte. 33

38 Abbildung 17: Hydrophobizitätsplot nach Kyte und Doolittle von MaSp1 sowie MaSp2 der Spinne Latrodectus hesperus. Die Hydrophobizitätsplots wurden pro Sequenzabschnitt, siehe Beschriftung, bei einer Fensterlänge von 7 durchgeführt. Anhand der Hydrophobizitätsskala ist erkennbar, dass die N-terminale Domäne von MaSp1 (links unten) der hydrophobste aller verglichenen Sequenzabschnitte ist. Die repetitiven Kernsequenzen (oben rechts und oben links) beider spidroins bestehen aus abwechselnd hydrophoben und hydrophilen Bereichen. Diese Eigenschaft wird auch als Amphiphilie bezeichnet. Erkennbar ist auch, dass die terminalen Domänen (mitte rechts, mitte links, unten rechts, unten links) hydrophober als die repetitiven Kernsequenzen (oben links, oben rechts) sind. Die hydrophobste Stelle in MaSp1 und MaSp2 befindet sich am Beginn der N-terminalen Domäne (unten rechts, unten links). Die vollständigen Ergebnisse der Hydrophobizitätsplots sind in einer gleichnamigen Datei gespeichert und mit Hilfe eines Computers abrufbar. [44] 34

39 Experimente, welche an den Spinnenproteinen unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt worden waren, belegen, dass sowohl die C-terminale als auch die N-terminale Domäne eine große Rolle für die korrekte Assemblierung der Seidenfaser spielen. [2, S. 236; 23, S ] Die C-terminale Domäne wird für die Aggregation der Spinnenproteine während der abnehmenden Natriumchloridkonzentration innerhalb des Spinnkanals benötigt (siehe Kapitel Der natürliche Spinnprozess Aufbau der Drüse und des Spinnkanals ). [3, S. 9; 23, S. 241] Außerdem sorgt die C-terminale Domäne für die Bildung kristalliner Strukturen. [3, S. 9] Die N-terminale Domäne unterstützt diese Faserassemblierung, indem sie für die nötige Stabilität des Proteins verantwortlich ist. [3, S. 10; 47, S. 312] Einer N-Terminalen Domäne ist es möglich mit einer anderen N-terminalen Domäne ein Dimer auszubilden. Diese Dimerisierung ist stark von der umgebenden Salzkonzentration sowie vom ph-wert abhängig. [10, S. 238; 47, S. 312] Durch die Bildung der kristallinen Strukturen, initiiert durch die C- terminale Domäne, sowie die Dimerisierung der N-terminalen Domänen entstehen kontrollierte Wechselwirkungen zwischen den Seidenproteinen und ermöglichen so ein Verlängerung der Proteinketten. [10, S. 238; 47, S. 312] Das Resultat ist die Entstehung der charakteristischen Faserstrukturen. Kernmagnetresonanzexperimente zeigten, dass die N- terminale Domäne bei einem ph-wert von 6 ein stabiles Dimer mit einer anderen N- terminalen Domäne ausbildet, unabhängig von der umgebenden Salzkonzentration. [11, S. 311] Während der Speicherung der Seidenproteine innerhalb der Spinndrüse, bei einem ph- Wert von 7, sorgt Natriumchlorid für eine Stabilisierung der Monomerstruktur der N- terminalen Domäne. Gleichzeitig wird die Dimerisierung unterbunden. [10, S. 239; 47, S ] So ist es möglich, dass selbst bei einer sehr hohen Proteinkonzentration die Seidenproteine innerhalb der Drüse weder eine Faserstruktur einnehmen noch verklumpen. [10, S. 239] Wie kommt diese enorm hohe Stabilität der Seidenproteine während der Speicherung in der Spinndrüse zu Stande? Diese Frage kann mit einer von zwei Theorien beantwortet werden, welche von unterschiedlichen Forschungsgruppen postuliert worden sind. Doch um sich nicht ohne eigens durchgeführte Experimente auf diese beiden Theorien zu beziehen, wurden MaSp1 sowie MaSp2 der Spinne Latrodectus hesperus mit Hilfe anderer bioinformatischer Strukturvorhersagetools untersucht. Der repetitive Mittelteil des MaSp1/MaSp2 wurde in das Tool SWISS-MODEL Template Identification eingefügt, um ein Template zu finden. Anhand dieses Template sollte ein Strukturmodell erstellt werden, falls möglich. Dieses Strukturmodell sollte ein PDB-File liefern, welches anschließend auf die ph-wert-abhängigen Eigenschaften wie Ladung und Stabilisationsenergie mittels PROPKA untersucht werden sollte. Die Suche nach einem 35

40 Template blieb erfolglos. Es existierten keine homologen Daten zu der repetitiven Kernsequenz des MaSp1 bzw. MaSp2 von L. hesperus, weder ähnliche Sequenzen noch ähnliche Strukturen. Ohne das Template konnte somit kein Strukturmodell erzeugt werden. Ein Modell des repetitiven Mittelteils des MaSp1 von L. hesperus konnte daher mittels SWISS-MODEL nicht erstellt werden. Lediglich die Informationen der N-terminalen Domäne sind vorhanden. Der Automated Mode von SWISS-MODEL lieferte ebenfalls kein Ergebnis. Der Automated Mode sucht mit automatisch konfigurierten Parametern nach Templates und erstellt anschließend ein Homologiemodell falls möglich, ebenfalls automatisch. Mit Hilfe des Tools Secondary Structure Prediction and Domain Assignment von SWISS-MODEL konnten die terminalen Domänen beider major ampullate spidroins identifiziert werden. Zur Identifikation von Sekundärstrukturen und zur Lokalisation von Proteindomänen verwendet das Tool Programme von verschiedenen Datenbanken wie z. B. Hidden Markov Modelle der Pfam, des SMART, der PIR und andere. [34] Pfam ist eine Datenbank, welche konservierte Proteinfamilien sowie Proteindomänen enthält. [9, S. D211 ] In Abbildung 18 (MaSp1) und 19 (MaSp2) ist ein Ausschnitt des Ergebnisses von Secondary Structure Prediction and Domain Assignment dargestellt. Die Vorhersage der Helixstrukturen am Anfang und Ende beider spidroin- Sequenzen stimmt mit den Ergebnissen aus den Röntgenanalysen-Experimenten der Forschungsgruppen überein. [2, S. 237; 23, S ] Diese Bereiche kennzeichnen die terminalen Domänen des Seidenproteins. Der repetitive Mittelteil der Sequenz bildet laut diesem Tool Coil-Strukturen aus, da noch keine genaueren Informationen zu diesen Sekundärstrukturen existieren. Das Ergebnis der Secondary Structure Prediction and Domain Assignment stellt somit eine gute Zusammenfassung der bisherigen Informationen über die Strukturen der Seidenproteine MaSp1 und MaSp2 dar. Die experimentell gewonnenen Daten über die Strukturen der terminalen Domänen wurden so bioinformatisch nachgewiesen. 36

41 Abbildung 18: SWISS-MODEL Secondary Structure Prediction and Domain Assignment von MaSp1. Die Sequenz besteht aus 3129 Aminosäuren (oben im Bild zu erkennen). Die Darstellung enthält daher nur 2 zusammengefügte Teilabschnitte des Ergebnisses (Abschnitt 1 von Aminosäure 1 bis 362 und Abschnitt 2 von Aminosäure 2881 bis 3129). Die laut diesem Tool vorhergesagten Sekundärstrukturen sind über der Sequenz abgebildet. Die Sekundärstrukturen werden in Abhängigkeit von der Wahrscheinlichkeit in einer Art Diagramm dargestellt. Je höher die Wahrscheinlichkeit der Ausbildung einer bestimmten Sekundärstruktur ist, desto höher ist der jeweilige Graph im Diagramm. Unterhalb des Wahrscheinlichkeitsplots ist der Typ des Sekundärstrukturelementes aufgeführt, welcher farblich mit dem Graphen der Wahrscheinlichkeit übereinstimmt: rot-h-helix; grün-c-coil; gelb-e-strand. blau-sonstiges. Erkennbar ist, dass sich am Anfang (N-terminale Domäne) und Ende der Sequenz (C-terminale Domäne) Helixstrukturen bilden. Dazwischen (repetitiver Mittelteil) bilden sich ausschließlich Coil-Strukturen. Das vollständige Ergebnis des Tools ist in einer gleichnamigen Datei gespeichert und mit Hilfe eines Computers abrufbar. 37

42 Abbildung 19: SWISS-MODEL Secondary Structure Prediction and Domain Assignment von MaSp2. Die Sequenz besteht aus 3779 Aminosäuren (oben im Bild zu erkennen). Die Darstellung enthält daher nur 2 zusammengefügte Teilabschnitte des Ergebnisses (Abschnitt 1 von Aminosäure 1 bis 362 und Abschnitt 2 von Aminosäure 3481 bis 3779). Die laut diesem Tool vorhergesagten Sekundärstrukturen sind über der Sequenz abgebildet. Die Sekundärstrukturen werden in Abhängigkeit von der Wahrscheinlichkeit in einer Art Diagramm dargestellt. Je höher die Wahrscheinlichkeit der Ausbildung einer bestimmten Sekundärstruktur ist, desto höher ist der jeweilige Graph im Diagramm. Unterhalb des Wahrscheinlichkeitsplots ist der Typ des Sekundärstrukturelementes aufgeführt, welcher farblich mit dem Graphen der Wahrscheinlichkeit übereinstimmt: rot-h-helix; grün-c-coil; gelb-e-strand. blau-sonstiges. Erkennbar ist, dass sich am Anfang (N-terminale Domäne) und Ende der Sequenz (C-terminale Domäne) überwiegend Helixstrukturen bilden. Dazwischen (repetitiver Mittelteil) bilden sich ausschließlich Coil-Strukturen. Das vollständige Ergebnis des Tools ist in einer gleichnamigen Datei gespeichert und mit Hilfe eines Computers abrufbar. 38

43 Des Weiteren wurden keine bioinformatischen Programme oder Tools gefunden, welche eine ph-abhängige Struktur vorhersagen können. Mit Hilfe des Tools SMART konnten die terminalen Domänen innerhalb der major ampullate spidroins von L. hesperus nicht identifiziert werden. In Abbildung 20 ist ein Ausschnitt des Ergebnisses von SMART abgebildet. Beide kompletten Sequenzen von MaSp1 und MaSp2 wurden eingefügt. Unabhängig von der Wahl der SMART-Modi (Genome oder Normal) wurden die gleichen Ergebnisse ausgegeben. [45] Abbildung 20: Identifikation der terminalen Domänen von MaSp1 (oben) sowie MaSp2 (unten) der Spinne Latrodectus hesperus mittels SMART. Es handelt sich hierbei um einen Ausschnitt des gesamten Ergebnisses, da beide Sequenzen zu groß sind, um komplett in der Abbildung dargestellt zu werden. Unabhängig vom gewählten SMART-Modus (Genome oder Normal) werden die gleichen Ergebnisse ausgegeben. Die pink hervorgehobenen Sequenzbereiche kennzeichnen Regionen von geringer Komplexität. Die grauen Bereiche markieren Regionen, über die keine Informationen vorliegen. Die vollständigen Ergebnisse der SMART-Anwendung sind in einer gleichnamigen Datei gespeichert und mit Hilfe eines Computers abrufbar. [45] Außerdem wurde die CDD-Suche des MaSp1, sowie MaSp2 von L. hesperus durchgeführt, um ähnliche Proteindomänen zu den eingegebenen Seidenproteinen zu finden. Die Suchanfrage beider Proteine gab jeweils ein und denselben Treffer aus. Es wurde eine Übereinstimmung mit dem Pfam-Eintrag gefunden. Der Pfam-Eintrag enthält Informationen über sowohl MaSp1 als auch MaSp2, zusammengetragen aus verschiedenen Datenbanken des NCBI. Aus diesen Daten geht die Ähnlichkeit der Strukturen der C-terminalen Domänen einher. So ähnelt die C-terminale Domäne der Proteine MaSp1/MaSp2 von L. hesperus stark der C- terminalen Domäne des Fibroins von Araneus diadematus. Dadurch wird die in vorherigen Kapiteln erwähnte Konservierung der C-terminalen Regionen bioinformatisch bestätigt. Abbildung 21 zeigt das Ergebnis der Suche mittels CDD. Die Übereinstimmung der 39

44 eingegebenen Sequenzen mit den Sequenzen des Pfam-Eintrags ist durch einen roten Rahmen gekennzeichnet. Beide Suchergebnisse sind lokal gespeichert und können über einen Computer abgerufen werden. [46] Abbildung 21: CDD-Suche an MaSp1 (oben) sowie MaSp2 (unten) von L. hesperus. Die CDD-Suche wurde durchgeführt, um ähnliche Proteindomänen zu den eingegebenen Seidenproteinen zu finden. Die Suchanfrage beider Proteine gab jeweils ein und denselben Treffer aus. Es wurde eine Übereinstimmung mit dem Pfam-Eintrag gefunden, durch den roten Rahmen gekennzeichnet. Aus diesen Daten geht die Ähnlichkeit der Strukturen der C-terminalen Domänen einher. So ähnelt die C-terminale Domäne der Proteine MaSp1/MaSp2 von L. hesperus stark der C-terminalen Domäne von Araneus diadematus. Dadurch wird die in vorherigen Kapiteln erwähnte Konservierung der C-terminalen Regionen bioinformatisch bestätigt. Beide Suchergebnisse sind lokal gespeichert und können über einen Computer abgerufen werden. [46] 40

45 4.3 Methodenkomplex 3 Anhand der Anwendung der bioinformatischen Tools SWISS-MODEL, SMART und CDD ist auffällig, wie wenig strukturelle Informationen über die Proteine des Spinnenfadens bekannt sind. Es existierten weder Templates einer homologen Sequenz (SWISS-MODEL), noch konnten bestimmte Domänen innerhalb der Seidenproteine identifiziert werden (SMART). Lediglich die Suche in der CDD des NCBI nach ähnlichen Sequenzen war erfolgreich. Es konnte die Ähnlichkeit der C-terminalen Domänen innerhalb verschiedener Spinnenarten festgestellt werden. Wieso sind weder Sekundärstrukturvorhersagetools noch Tools, die Homologiemodelle erstellen erfolgreich? Trotz der einfachen, stark repetitiven Primärstruktur der Seidenproteine, konnten bisher keine 3D-Strukturen modelliert bzw. simuliert werden. Die Strukturbildung scheint zu komplex zu sein, um sie mit bioinformatischen Programmen nachzuweisen oder zu verstehen. Aus diesem Grund sollte der nächste Aufgabenbereich den praktischen Experimenten gewidmet werden. Die Ergebnisse der Kernmagnetresonanz, Röntgenbeugungsanalyse und weitere an den Proteinen des Spinnenfadens durchgeführte Experimente sollten noch genauer analysiert werden. Außerdem sollte das Programm 3D- PSSM genutzt werden, um die Faltung der Spinnenseidenproteine vorherzusagen. Mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM-scanning electron microscopy) und Atomkraftmikroskopie (AFM-atomic force microscopy) wurden kleine mizellenartige Unterstrukturen der sich in einer wässrigen Lösung befindenden spidroins entdeckt. [18, S. 1058] Transmissionselektronmikroskopie-Versuche belegen ebenfalls eine Bildung von mizellenartigen Strukturen. [20, S. 8908] Die Forschungsgruppe um Fritz Vollrath entdeckte eine andere Strukturbildung. Entgegen der Mizellentheorie wird von einer Flüssigkristalltheorie ausgegangen, bei der die neusynthetisierten Seidenproteine zunächst eine flüssigkristalline Phase innerhalb der Spinnlösung annehmen. [8, S 3644] Beide Theorien scheinen auf den ersten Blick sehr gegensätzlich zu sein, jedoch schließt die Mizellentheorie von Jin und Kaplan die Flüssigkristallinität nicht aus. [8, S. 3646] Im weiteren Verlauf der Arbeit galt es, diese beiden Theorien zu untersuchen, zu vergleichen und durch das Einbringen eigener Erkenntnisse zu verstehen. Außerdem wurde ein weiteres bioinformatisches Tool namens 3D- PSSM benutzt, um homologe Strukturen bzw. Sequenzen zu finden. Das Problem war hierbei, dass die Eingabesequenz nur aus 30 bis 800 Aminosäuren bestehen durfte. Um eine gezielte Suche nach homologen Sequenzen zu ermöglichen, mussten die einzelnen Muster, genauer die einzelnen Repeats der Proteine MaSp1 und MaSp2 in das Programm eingefügt werden. Zu diesem Zweck wurde die Analysemethode Dotplot angewandt, um die einzelnen Repeats 41

46 innerhalb der Sequenzen beider spidroins zu identifizieren. Ein einfaches Programm, Dotlet genannt, wurde an den Seidenproteinen angewandt, um die enthaltenen Repeats zu erkennen. Anhand des paarweisen Alignments mittels Dotlet konnte der repetitive Mittelteil des MaSp1 und des MaSp2 eindeutig identifiziert werden. Die terminalen Domänen heben sich deutlich von dem Mittelteil ab. In Abbildung 22 ist die Sequenz des MaSp1 von L. hesperus im Programm Dotlet dargestellt, in Abbildung 23 die Sequenz von MaSp2. Beide Sequenzen wurden jeweils gegen sich selbst paarweise aligniert, um identische Bereiche innerhalb ein und derselben Sequenz zu finden. Diese identischen Bereiche kennzeichnen die Repeats, die es galt herauszufinden, um sie anschließend in das Programm 3D-PSSM einzufügen. Die eingestellten Parameter (Fenstergröße 15; Gray Scale 100%-12%) sind bei beiden Proteinsequenzen identisch, um einen einheitlichen Vergleich zu ermöglichen. Im oberen Teil der Abbildungen (grün gekennzeichnet) befinden sich der Eingabebutton, sowie die Auswahlfenster, um verschiedene Einstellungen (Fenstergröße, Zoom, u.a.) anzupassen. Im linken Teil befindet sich der Dotplot, der das Ergebnis des paarweisen Alignments zeigt. Im Dotplot kann der Cursor durch den Benutzer innerhalb des Sequenzalignments gesteuert werden. Die Markierung mittels Cursor ist durch den Schnittpunkt der beiden blauen Geraden gekennzeichnet. Unterhalb des Dotplots befinden sich beide Sequenzen, die aligniert wurden. Je nachdem, welchen Teil der Cursor im Dotplot markiert hat, wird unterhalb des Dotplots dieser Teil in der Sequenz gezeigt. In der Abbildung befindet sich der Cursor genau in der Mitte des Dotplots. Unterhalb des Dotplots ist erkennbar, dass beide Eingabesequenzen an dieser Position identisch sind (da es sich um ein und dieselbe Sequenz handelt). Ebenfalls gut erkennbar ist die Diagonale durch die Matrix, ein zweiter Nachweis für die Identität der Eingabesequenzen. Rechts neben dem Dotplot kann die Grauskala (Kontrast- bzw. Helligkeitseinstellung) konfiguriert werden. In Abbildung 24 gut erkennbar ist, dass zu Beginn der Sequenz keine Repeats existieren. Erst ab ca. 200 Aminosäuren sind Repeats erkennbar. Repeats sind im Dotplot mit schwarzen Linien gekennzeichnet. Je mehr Linien es sind und je dichter diese Linien aneinander sind, desto häufiger und desto größer sind die Repeats. Erstaunlich ist, dass die Kernsequenzen der Seidenproteine MaSp1 und MaSp2 enorm viele Repeats enthalten. Außerdem sind die Repeats ineinander geschachtelt, das bedeutet, (kleinere) Repeats befinden sich in (größeren) Repeats. Die Sequenz besteht aus immer wiederkehrenden Mustern. Gut erkennbar ist dies in Abbildung 24 und 25. In Abbildung 24 ist der Mittelteil des MaSp1 von L. hesperus im Dotplot dargestellt, in Abbildung 25 der Mittelteil des MaSp2. Deutlich zu sehen sind die repetitiven Muster. Aufgrund der hohen Anzahl an identischen Bereichen, welche von wenigen nicht- 42

47 identischen Bereichen umgeben sind, entstehen quadratähnliche Formen im Dotplot. Die Dotplots beider major ampullate spidroins zeigen regelmäßige Quadrate innerhalb der Sequenzen. Die Quadrate von MaSp1 sind größer als die Quadrate von MaSp2. Außerdem ordnen sich kleinere Quadrate so an, dass ein größeres Quadrat entsteht. Diese größeren Quadrate sind besonders gut zu erkennen, wenn im Programm Dotlet durch den Dotplot gescrollt wird. Abbildung 22: Sequenz (N-terminal) des MaSp1 von L. hesperus im Programm Dotlet. Die komplette Sequenz von MaSp1 wurde gegen sich selbst paarweise aligniert, um identische Bereiche in der Sequenz zu finden. Diese identischen Bereiche kennzeichnen die Repeats. Die eingestellten Parameter (Fenstergröße 15; Gray Scale 100%-12%) sind mit denen in Abbildung 23 identisch, um einen einheitlichen Vergleich zu ermöglichen. Im oberen Teil der Abbildung (grün gekennzeichnet) befinden sich der Eingabebutton sowie die Auswahlfenster, um verschiedene Einstellungen (Fenstergröße, Zoom, u.a.) anzupassen. Im linken Teil befindet sich der Dotplot, der das Ergebnis des paarweisen Alignments zeigt. Im Dotplot kann der Cursor durch den Benutzer innerhalb des Sequenzalignments gesteuert werden. Die Markierung mittels Cursor ist durch den Schnittpunkt der beiden blauen Geraden gekennzeichnet. Unterhalb des Dotplots befinden sich beide Sequenzen, die aligniert wurden. Je nachdem, welchen Teil der Cursor im Dotplot markiert hat, wird unterhalb des Dotplots dieser Teil in der Sequenz gezeigt. In der Abbildung befindet sich der Cursor genau in der Mitte des Dotplots. Unterhalb des Dotplots ist erkennbar, dass beide Eingabesequenzen an dieser Position identisch sind (da es sich um ein und dieselbe Sequenz handelt). Ebenfalls gut erkennbar ist die Diagonale durch die Matrix, ein zweiter Nachweis für die Identität der Eingabesequenzen. Rechts neben dem Dotplot kann die Grauskala (Kontrast- bzw. Helligkeitseinstellung) konfiguriert werden. Weiße Stellen im Dotplot kennzeichnen nicht-identische Bereiche. Repeats sind im Dotplot mit schwarzen Linien gekennzeichnet. Je mehr Linien es sind und je dichter diese Linien aneinander sind, desto häufiger und desto größer sind die Repeats. Zu Beginn der Sequenz existieren keine Repeats. Erst ab ca. 200 Aminosäuren sind Repeats erkennbar. 43

48 Abbildung 23: Sequenz (N-terminal) des MaSp2 von L. hesperus im Programm Dotlet. Die komplette Sequenz von MaSp2 wurde gegen sich selbst paarweise aligniert, um identische Bereiche in der Sequenz zu finden. Diese identischen Bereiche kennzeichnen die Repeats. Die eingestellten Parameter (Fenstergröße 15; Gray Scale 100%-12%) sind mit denen in Abbildung 22 identisch, um einen einheitlichen Vergleich zu ermöglichen. Im oberen Teil der Abbildung (grün gekennzeichnet) befinden sich der Eingabebutton sowie die Auswahlfenster, um verschiedene Einstellungen (Fenstergröße, Zoom, u.a.) anzupassen. Im linken Teil befindet sich der Dotplot, der das Ergebnis des paarweisen Alignments zeigt. Im Dotplot kann der Cursor durch den Benutzer innerhalb des Sequenzalignments gesteuert werden. Die Markierung mittels Cursor ist durch den Schnittpunkt der beiden blauen Geraden gekennzeichnet. Unterhalb des Dotplots befinden sich beide Sequenzen, die aligniert wurden. Je nachdem, welchen Teil der Cursor im Dotplot markiert hat, wird unterhalb des Dotplots dieser Teil in der Sequenz gezeigt. In der Abbildung befindet sich der Cursor genau in der Mitte des Dotplots. Unterhalb des Dotplots ist erkennbar, dass beide Eingabesequenzen an dieser Position identisch sind (da es sich um ein und dieselbe Sequenz handelt). Ebenfalls gut erkennbar ist die Diagonale durch die Matrix, ein zweiter Nachweis für die Identität der Eingabesequenzen. Rechts neben dem Dotplot kann die Grauskala (Kontrast- bzw. Helligkeitseinstellung) konfiguriert werden. Weiße Stellen im Dotplot kennzeichnen nicht-identische Bereiche. Repeats sind im Dotplot mit schwarzen Linien gekennzeichnet. Je mehr Linien es sind und je dichter diese Linien aneinander sind, desto häufiger und desto größer sind die Repeats. Zu Beginn der Sequenz existieren keine Repeats. Erst ab ca. 200 Aminosäuren sind Repeats erkennbar. 44

49 Abbildung 24: Sequenz (Mittelteil) des MaSp1 von L. hesperus im Programm Dotlet. Die Sequenz besteht aus immer wiederkehrenden Mustern. Erstaunlich ist, dass die Kernsequenz des Seidenproteins MaSp1 enorm viele Repeats enthält. Außerdem sind die Repeats ineinander geschachtelt, das bedeutet, (kleinere) Repeats befinden sich in (größeren) Repeats. Deutlich zu sehen sind die repetitiven Muster. Aufgrund der hohen Anzahl an identischen Bereichen, welche von wenigen nicht-identischen Bereichen umgeben sind, entstehen quadratähnliche Formen im Dotplot. Der Dotplot zeigt regelmäßige Quadrate innerhalb der Sequenz. Außerdem ordnen sich kleinere Quadrate so an, dass ein größeres Quadrat entsteht. Diese größeren Quadrate sind besonders gut zu erkennen, wenn im Programm Dotlet durch den Dotplot gescrollt wird. Abbildung 25: Sequenz (Mittelteil) des MaSp2 von L. hesperus im Programm Dotlet. Die Sequenz besteht aus immer wiederkehrenden Mustern. Erstaunlich ist, dass die Kernsequenz des Seidenproteins MaSp1 enorm viele Repeats enthält. Außerdem sind die Repeats ineinander geschachtelt, das bedeutet, (kleinere) Repeats befinden sich in (größeren) Repeats. Deutlich zu sehen sind die repetitiven Muster. Aufgrund der hohen Anzahl an identischen Bereichen, welche von wenigen nicht-identischen Bereichen umgeben sind, entstehen quadratähnliche Formen im Dotplot. Der Dotplot zeigt regelmäßige Quadrate innerhalb der Sequenz. Außerdem ordnen sich kleinere Quadrate so an, dass ein größeres Quadrat entsteht. Diese größeren Quadrate sind besonders gut zu erkennen, wenn im Programm Dotlet durch den Dotplot gescrollt wird. 45