Abbau und Transformation von Lignin und Huminstoffen durch Pilze. Martin Hofrichter, Christiane Liers, Matthias Kinne und René Ullrich*

Transkript

1 Rundgespräche der Kommission für Ökologie, Bd. 37»Ökologische Rolle von Pilzen«, S by Verlag Dr. Friedrich Pfeil, München ISSN ISBN Abbau und Transformation von und Huminstoffen durch Pilze Martin Hofrichter, Christiane Liers, Matthias Kinne und René Ullrich* Zusammenfassung Als universelle Destruenten und ausgestattet mit einem vielseitigen Enzymbesteck sind die zahlreichen Vertreter des Pilzreiches in nahezu jedem terrestrischen Ökosystem zu finden. So begegnet man ihnen in der Streuschicht von Wäldern und Wiesen, in sich zersetzenden Überresten von Pflanzen und Tieren sowie in tierischen Ausscheidungsprodukten (Dung). In diesen Lebensräumen bilden Pilze einen Hauptteil der lebenden Biomasse und spielen eine zentrale Rolle beim Recycling des organischen Kohlenstoffs, vor allem beim Abbau persistenter pflanzlicher Polymere. Die bemerkenswerteste Abbauleistung der Pilze betrifft in diesem Zusammenhang die Zerlegung und Mineralisierung des Holzstoffes. Dabei handelt es sich um einen Hauptbestandteil der pflanzlichen Biomasse, der den Zellwänden und Geweben Festigkeit und Stabilität verleiht und die Polysaccharide (Zellulose, Hemizellulosen) vor mikrobiellen Angriffen schützt (»barriere«). ist ein komplexes aromatisches Polymer, das nicht durch herkömmliche Enzyme gespalten werden kann. Interessanterweise ist es im Laufe der Evolution nur den filamentösen Pilzen (viele Basidiomycota, einige Ascomycota) gelungen, biochemische Mechanismen zu entwickeln, um das substantiell zu zerlegen und zu mineralisieren. Sie scheiden hierzu spezielle Enzyme (Peroxidasen, Peroxygenasen, Polyphenol-xidasen/Laccasen, Feruloyl-Esterasen) aus, die das polymer bzw. seine Bindungsstellen zu den Polysacchariden spalten. Eine Schlüsselstellung nimmt dabei die Mangan-Peroxidase ein, die den abbau durch Holz und Streu zersetzende Basidio mycota (Weißfäulepilze) einleitet. Am pilzlichen Ab- und Umbau von Huminstoffen, die sich z. T. direkt vom ableiten, sind ähnliche biokatalytische Mechanismen und Prozesse beteiligt wie am abbau. Summary Fungal degradation and transformation of lignin and humic substances. As universal decomposers and equipped with a versatile set of enzymes, members of the fungal kingdom are found in almost every terrestrial ecosystem. Thus, they colonize the litter layers in forests and pastures, the remainders of plants and animals as well as animal excrements (dung). In these habitats, fungi make up a major fraction of living biomass and play an important role in the recycling of organic carbon, in particular of persistent plant polymers. In this context, the disintegration and mineralization of lignin is the most remarkable degradative capability. is a major component of the biomass of vascular plants providing strength and rigidity to their cell walls and tissues, and protecting the polysaccharides from microbial attack ( lignin barrier ). is a complex aromatic polymer that cannot be cleaved by conventional hydrolytic enzymes. Interestingly in the course of evolution, merely filamentous fungi (Basidiomycota, a few Ascomycota) succeeded in developing biochemical mechanisms to substantially degrade and mineralize lignin. To this end, they secrete special enzymes (peroxidases, peroxygenases, polyphenol oxidases/laccases, feruloyl esterases) which disintegrate the lignin polymer or cleave the bonds between lignin and polysaccharides. Manganese peroxidase is thought to play a key role in this process, since * Hofrichter, Martin, Prof. Dr.; Liers, Christiane, Dr.; Kinne, Matthias, MSc; Ullrich, René, Dr., Internationales Hochschulinstitut (IHI) Zittau, Lehrstuhl für Umweltbiotechnologie, Markt 23, Zittau. hofrichter@ihi-zittau.de Abbau von und Huminstoffen 81

2 82 it initiates lignin degradation by most wood-decay and litter-decomposing Basidiomycota (white-rot fungi). Similar biocatalytic mechanisms as in lignin conversion are involved in the biodegradation and transformation of humic substances, which at least in part originate from lignin and other plant polymers. Einführung Die Habitate saprober Großpilze 1 (Basidiomyceten, Ascomyceten ) sind sehr variabel und reichen vom stickstoffarmen Totholz der Laub- und Nadelbäume über die verschiedenen Formen der Bodenstreu (Blätter, Nadeln, Zweige) bis hin zu stickstoffreichen, tierischen Ausscheidungsprodukten (Dung). Allen diesen Habitaten gemein ist ihr Reichtum an pflanzlichen Polysacchariden (Zellulose, Hemizellulosen, vgl. Abb. 2), aromatischen Polymeren (, vgl. Abb. 2; Suberin ), phenolischen Pflanzeninhaltsstoffen (z. B. Flavonoide, Abb. 1a) sowie davon abgeleiteten Huminstoffen (Abb. 1b). Die ph-verhältnisse in den verschiedenen Lebensräumen sind allerdings recht unterschiedlich und reichen von ph 3 in der sauren Fichtenstreu über ph 5-7 in der Blattstreu bis ph 9 im Dung der Wiederkäuer. Die Konzentration der H + -Ionen (ph) hat einen großen Einfluss auf die extrazellulären Pilzenzyme (»Verdauungsenzyme«) und damit auf die biochemischen Abbaumechanismen. Im Verlauf der Evolution hat dies zur Entwicklung unterschiedlicher Strategien im Um- und Abbau dieser komplexen aromatischen Verbindungen geführt. So verfügen spezialisierte Basidiomyceten, die man auch als Weißfäulepilze bezeichnet, sowie einige Ascomyceten (Erreger der Moderfäule des Typs 2) über besondere biokatalytische Systeme, um das und andere aromatische Makromoleküle substantiell zu zerlegen und bis zum Kohlendioxid (C 2 ) abzubauen, d. h. zu mineralisieren. Bestandteile verholzter Zellwände Die verholzten Zellwände (= Lignozellulose ) der Gefäßpflanzen bestehen zu % aus Zellulose, zu jeweils % aus Hemizellulose und 1 Der taxonomisch nicht klar definierte Begriff»Großpilze«meint Vertreter der Echten Pilze (Eumycota ), die makroskopische, d. h. mit bloßem Auge sichtbare Fruchtkörper entwickeln (Champignon, Morchel, etc.). und zu weniger als 1 % aus anderen Polysacchariden und Proteinen. Die Zellulose bildet quasi das»rückgrat«der pflanzlichen Zellwand, etwa vergleichbar den Stahlträgern im Beton (Abb. 2). Sie wird umgeben von den kürzerkettigen und verzweigten Hemizellulosen. Das Ganze wird inkrustiert und zusammengehalten vom, das als molekularer»klebstoff«fungiert und der Zellwand ihre hohe Festigkeit verleiht. In der Evolution der Pflanzen hat diese Inkrustierung durch dazu geführt, dass große terrestrische Formen die Bäume entstehen konnten. Die global gebildete Menge an Lignozellulose von ca. 200 Milliarden Tonnen jährlich macht deutlich, welche immense Menge organischen Kohlenstoffs von den Pflanzen im Zellwandkomplex festgelegt wird, weshalb der Abbau seiner polymeren Komponenten, vor allem des aromatisch geprägten s (50-60 Mrd. t/a), von zentraler Bedeutung für den globalen Kohlenstoffkreislauf ist und auch zunehmend ins Blickfeld der modernen Biotechnologie rückt (Stichwort: stoffliche Verwertung nachwachsender Rohstoffe ). enthält eine Vielzahl kovalenter Bindungen zwischen den aromatischen Untereinheiten, z. B. Etherbindungen (C C) und Kohlenstoffbrücken (C C), die unter physiologischen Bedingungen nur schwer zugänglich sind und hydrolytisch nicht gespalten werden können (im Unterschied etwa zu den gut hydrolysierbaren glykosidischen Bindungen in den Polysacchariden ). Dies führt dazu, dass einmal gebildetes nicht mehr von den Pflanzen selbst angegriffen und abgebaut werden kann. Das können nur filamentöse Pilze, bevorzugt bestimmte Gruppen der Basidiomycota ; Bakterien sind nur im begrenzten Umfang in der Lage, weniger stark kondensierte e chemisch zu modifizieren. Isolierung und Kultivierung ligninolytischer Pilze Will man mit abbauenden rganismen im Labor arbeiten, müssen zunächst entsprechende Pilzkulturen aus der Natur isoliert werden. Aus- Ökologische Rolle von Pilzen

3 H H H H H H H H 2 H 2 Me H 2 H a b 2 CH Abb. 1. Beispiele für Strukturformeln von a, Flavonoiden (Quercetin, oben, und Catechin, unten) und b, Modell eines Huminstoffes. Modifiziert nach Stevenson (1994). Zellulosefasern H H H CH 2 H H H H Me H H Abb. 2. Schematische Darstellung des Aufbaus verholzter pflanzlicher Zellwände. Die polymeren Hauptkomponenten sind Zellulose, Hemizellulosen und. Modifiziert nach Fritsche (1998). Abbau von und Huminstoffen CH H Me H H CH 2 H H H H R Zellulose Hemizellulose H CH H H H Me H CH H CH 3 Me Me N Me CH 2 H H H H H H H H H H H H H H HN H NH 2 R CH 2 H H H Me NH R Me C Me CH 3 83

4 84 Radioaktives Kohlendioxid [%] C Zeit [Tage] Abb. 3. Freisetzung von 14 C 2 aus 14 C-ringmarkiertem durch Phlebia sp. Nf b19 während des Wachstums auf Weizenstroh. Nach Hofrichter et al. (1999a). gangspunkt sind meist die Fruchtkörper der Pilze, aus denen mithilfe selektiver Wachstumsmedien, die Antibiotika und/oder spezifische Fungizide enthalten, Reinkulturen gewonnen werden, die im Labor physiologisch und biochemisch untersucht werden können. Viele saprobe Basidio - und Ascomycota sind im Labor in ähnlicher Weise kultivierbar wie Bakterien oder Hefen, auch wenn sie deutlicher langsamer wachsen und höhere Ansprüche an die Kulturbedingungen stellen. So ist es unserer Arbeitsgruppe beispielsweise gelungen, Holzfäulepilze (z. B. Bjerkandera adusta, Phlebia sp. Nf b19) in Bioreaktoren (bis 300 Liter) zu kultivieren, um verschiedene Enzyme, die am Abbau des Lignozellulosekomplexes beteiligt sind, in größerer Menge zu gewinnen (Nüske et al. 2002). Zur Selektion besonders aktiver Stämme haben sich selektive Agarmedien bewährt. So zeigt z. B. die Bildung von Braunstein (Mn 2 ) in manganhaltigen Agarplatten an, dass Mangan-Peroxidase, ein Schlüsselenzym des abbaus, gebildet wird. Die Bleichung von Huminsäuren dient als Indiz für ein insgesamt aktives Enzymsystem, das hochmolekulare Substanzen zu oxidieren vermag. Am Einfachsten lassen sich relevante extrazelluläre Enzymaktivitäten nachweisen, indem man einen speziellen Heterozyklus, das di-ammoniumsalz des ABTS [2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)], als Medienzusatz verwendet. Diese farblose Verbindung wird durch Ein-Elektronen-xidation zum dunkelgrün gefärbten ABTS-Kationenradikal (ABTS + ) umgesetzt, das allgemein als Indikator für oxidative Enzymaktivitäten (Peroxidasen, Polyphenol- xidasen/laccasen ) dient. Mineralisierung von 14 C-ringmarkiertem Ende der 1990er Jahre bestand die Möglichkeit in Zusammenarbeit mit Kollegen der Universität Helsinki, Experimente mit 14 C-ringmarkiertem durchzuführen, also mit einem, bei dem alle aromatischen Ringe radioaktiv markiert vorlagen. Der Abbau dieses komplexen Polymers wurde in Strohkulturen anhand der Bildung von radioaktiv markiertem Kohlendioxid ( 14 C 2 ) verfolgt. Die Messungen verliefen über einen Zeitraum von drei Monaten unter Verwendung des Weißfäulepilzes Phlebia sp. Nf b19, einem südamerikanischem Isolat, das mit der einheimischen Art Phlebia radiata nahe verwandt ist (Hofrichter & Fritsche 1997, Hildén et al. 2008). Der Pilz mineralisierte das ab der zweiten Woche ziemlich gleichmäßig über den gesamten Kultivierungszeitraum (Abb. 3). Etwa 75 % des eingesetzten radioaktiv markierten Kohlenstoffs wurden als 14 C 2 freigesetzt. Daneben entstanden 13 % wasserlösliche fragmente, also polare Spaltprodukte; nur 4 % des eingesetzten s wurden nicht umgesetzt. Überraschend war, dass lediglich 6 % des markierten s in der pilzlichen Biomasse einschließlich des Reststrohs wiedergefunden wurden. Das führte uns zu der Annahme, dass möglicherweise eine partielle extrazelluläre Mineralisierung des s stattgefunden hat, d. h. ein Abbau des polymers bis zum C 2 außerhalb der Pilzhyphen. 2 2 Normalerweise wird der organische Kohlenstoff in die Zellen aufgenommen und nach chemischer Modifikation zu etwa gleichen Teilen im Zitronensäurezyklus mineralisiert oder in die Pilzbiomasse eingebaut (d. h. ca % des eingesetzten 14 C hätten sich in der Biomasse wiederfinden müssen). Ökologische Rolle von Pilzen

5 14 C2 [%] Malat [mm], Malat xalat Fumarat MnP 14 C Zeit [Tage] Abb. 4. Freisetzung von 14 C 2 (in %) aus 14 C-ringmarkiertem und Ausscheidung von Malat, xalat und Fumarat (in mm in Bezug auf den Wassergehalt des Strohs ) sowie des Enzyms Mangan-Peroxidase (MnP, in Units/L in Bezug auf den Wassergehalt des Strohs) während des Wachstums von Phlebia sp. Nf b19 auf Weizenstroh. Nach Hofrichter et al. (1999a). Ausgehend von dieser These wurden die Strohkulturen näher analysiert. Dabei stellte sich heraus, dass während des Pilzwachstums große Mengen an organischen Säuren ausgeschieden wurden, vorzugsweise Äpfelsäure (Malat), Fumar säure und xalsäure (Abb. 4). Daneben waren hohe Aktivitäten des Enzyms Mangan- Peroxidase (MnP) nachweisbar. Dies war ein erster Hinweis auf die besondere Rolle, die dieses Enzym beim abbau spielt. Mangan-Peroxidase Die Mangan-Peroxidase (EC ) ist wie andere Peroxidasen auch ein oxidativer Biokatalysator, der ganz unterschiedliche organische Verbindungen anzugreifen vermag. Das Enzym mit einem relativ hohem Redoxpotential (E 0 = 1,1 V) wird anscheinend ausschließlich von Vertretern der Basidiomycota gebildet und konnte, trotz langjähriger Suche, bisher nicht für Schlauchpilze (Ascomycota) oder andere rganismen nachgewiesen werden. Innerhalb der Basidiomycota ist die Bildung der Mangan- Peroxidase sowohl von Streu zersetzenden Pilzen Abbau von und Huminstoffen 85 (z. B. Vertreter der Blätterpilze (Agaricales) aus Gattungen wie Agaricus, Agrocybe, Collybia und Stropharia ) als auch von Holzfäulepilzen (z. B. aus den rdnungen Corticales und Polyporales wie Phlebia, Phanerochaete, Pycnoporus, Trametes oder Bjerkandera ) bekannt (Hofrichter 2002). Mangan-Peroxidasen enthalten ein Eisen -Protoporphyrin IX (Häm) als prosthetische Gruppe im aktiven Zentrum, sind stark glykosiliert und relativ sauer (isoelektrische Punkte zwischen ph 3 und 6) und bleiben nach ihrer Ausscheidung über mehrere Tage im Mikrohabitat der Hyphen aktiv. Das Enzym oxidiert in Boden und Holz stets vorhandenes Mangan (Mn 2+ ) zu reaktivem Mn 3+, das anschließend als diffusionsfähiges xidationsmittel (»Redoxmediator«) fungiert. In dieser Funktion kann das Mangan (Mn 3+ ) auch in den dicht gepackten Lignozellulosekomplex eindringen, was Enzymproteine aufgrund ihrer Größe nicht können. Allerdings muss das Mn 3+ aufgrund seiner Reaktivität stabilisiert werden, was durch vom Pilz ausgeschiedene xalsäure oder andere organische Säuren geschieht. In dieser stabilisierten Form haben die Mn 3+ -Chelat- Komplexe Halbwertszeiten von mehreren Stunden und können unterschiedliche aromatische xalat [mm], Fumarat [mm]* MnP [U/L]

6 86 H Phenolische Aromaten Phenoxylradikale Mn2 + + Nicht-phenolische Aromaten Mn3 + rek MnP H22 e- rganische Säuren Mn 2 + H tu r Radikale Substrate Arylkationradikale H Mn3+-Chelate R-CH2-CH Carbonsäuren 2+ Mn 2 C2 R-CH2 Alkylradikale (C-Radikale) 2 R-CH2-C PeroxylSuperradikale oxid H R1 H 2? R-CH2-S R-CH2-S Thiylradikale (reaktiv/selektiv) or R-CH2-SH Thiole R2 Ungesättigte Fettsäurereste (FS) R1 Alkylradikale (C-Radikale) R1 Zu rk R2 2 R2 FS-Peroxylradikale (reaktiv/selektiv) Abb. 5. Ausgewählte Substrate, die durch die Mangan-Peroxidase (MnP) oxidiert werden. Die xidation erfolgt über primär gebildete Mn3+-Chelat-Komplexe (z. B. Mn3+-xalsäure-Komplexe), die als Redoxmediatoren fungieren. Im Ergebnis entstehen verschiedene freie Radikale, die weiter reagieren können. Modifiziert nach Hatakka et al. (2003). Nu r oder aliphatische Strukturen oxidativ angreifen (Abb. 5). Beispielsweise werden Phenole zu Phenoxylradikalen oxidiert; organische Säuren können decarboxyliert werden, die dabei entstehenden Alkylradikale reagieren ihrerseits mit Luftsauerstoff weiter zu Peroxylradikalen und Superoxid. Besonders wichtig für den abbau sind ungesättigte Fettsäurereste und möglicherweise auch organische Schwefelverbindungen, da deren Alkyl- bzw. Thiylradikale nach Sauerstoffaddition selektive Radikalspezies bilden. Diese können z. B. die alkoholischen Funktionen in den Seitenketten des s angreifen, wozu die primär gebildeten Mn3+-Chelate nicht in der Lage sind (Hatakka et al. 2003). Umsetzung von durch Mangan-Peroxidase In verschiedenen Testreihen wurde versucht, eine»verflüssigung«, d. h. eine partielle Solubilisie- rung von Holz mithilfe des Katalysesystems der Mangan-Peroxidase zu erreichen. Dazu wurde eine Mangan-Peroxidase (MnP3) aus Phlebia radiata mit fein gemahlenem Kiefernholz im Reagenzglas unter Zugabe von Natriummalonat (Puffer und Chelator), Mangan(II)chlorid (MnCl2), Glucose-xidase und Glucose (zur Generierung von H22) sowie Tween 20 oder 80 (nicht ionische Tenside) inkubiert. Ein Teil des Holzes (ca. 20 %) ging dabei nach xidation durch die Mangan-Peroxidase als aromatisch geprägte Lignozellulosefragmente in Lösung. Dieser Effekt war besonders ausgeprägt in Gegenwart von Tween 80, das ungesättigte Fettsäurereste enthält und damit zur Bildung selektiver Peroxylradikale beitrug. Auf diese Weise konnte erstmals gezeigt werden, dass eine gereinigte Mangan-Peroxidase in der Lage ist, natives Holz partiell zu depolymerisieren und das in eine oxidierte und damit wasserlösliche Form zu überführen (Hofrichter et al. 2001). In ähnlichen Versuchen mit 14C-ringmarkierten Ökologische Rolle von Pilzen

7 CH 3 CH 3 H MnP / Mn 3+ CH 3 R-CH CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 H Phenoxylradikaradikal Kohlenstoff- spontan CH 3 [MnP / Mn 3+ ; 2] 2 Mesomerie MnP / Mn 3+ C 2 C 2 + organische Säuren (z.b. Ameisensäure, etc.) R- / 2 CH 3 H Abb. 6. Hypothetischer Mechanismus der Mangan-Peroxidase -katalysierten Ringspaltung und partiellen Mineralisierung von aromatischen strukturen. Nach Hofrichter (2002). H H Me H Pilzmyzel H CH Me H Me H Me H H H H Teil des moleküls Me Me Me Zucker und Acetat aus der Hemizellulose Pilzhyphe Lignozellulose (Holz, Stroh, Streu) Laccasen und andere Peroxidasen Cooxidantien (ungesättigte FS) H 2 2 xalsäure Mangan- Peroxidase 2 Radikale (z.b. R ) Mn 3 + CH 3 Wasserlösliche fragmente Mn 2 + Mn 3 + Mn 3+ -Chelate 2 87 C 2 Abb. 7. Zusammenfassendes Schema zum abbau durch Mangan-Peroxidase bildende Pilze (Holz und Streu zersetzende Basidiomycota ). Modifiziert nach Hofrichter (2000). präparaten wurde untersucht, was mit dem Katalyse passiert. Unter Verwendung verschiedener Mangan-Peroxidasen wurden bis zu 50 % des radioaktiven Kohlenstoff ( 14 C) im Reagenzglas während der Mangan-Peroxidase-vermittelten eingesetzten s in eine wasserlösliche Form Abbau von und Huminstoffen

8 88 überführt, noch überraschender war jedoch, dass ca. 15 % des s zu 14 C 2 abgebaut, d. h. quasi»enzymatisch verbrannt«wurden (Hofrichter et al. 1999b, Kapich et al. 1999, 2005). Hypothetischer Mechanismus der Mineralisierung von durch Mangan-Peroxidase Es stellte sich natürlich die Frage, wie es möglich ist, dass ein einzelnes Enzym einen solch komplexen Abbaumechanismus bewerkstelligen kann. Auf Grundlage der eigenen Untersuchungen und anhand umfangreichen Datenmaterials zur chemischen Delignifizierung bei der Zellstoffgewinnung konnte ein hypothetischer Mechanismus der Mangan-Peroxidase-katalysierten Ringspaltung und Mineralisierung von aromatischen strukturen erstellt werden (Gierer 1997, Hofrichter 2002; Abb. 6). Ausgangspunkt sind die phenolischen Ringe des s, die durch die Mangan-Peroxidase zu Phenoxylradikalen oxidiert werden. Diese liegen in verschiedenen mesomeren Formen vor, u. a. als Kohlenstoffradikale, die Superoxid addieren können, sodass Etherperoxide entstehen. Letztere sind instabil und zerfallen spontan unter Ringspaltung und Entstehung freier Carboxylgruppen (Muconsäurederivate), die wiederum durch die Mangan-Peroxidase angegriffen und unter Decarboxylierung als C 2 freigesetzt werden. Daneben entstehen kleinere organische Säuren (z. B. Ameisensäure). Zusammenfassend ergibt sich folgendes Bild (Abb. 7): Der Pilz scheidet Mangan-Peroxidase in sein Mikrohabitat aus und gleichzeitig Peroxide oder Peroxide erzeugende Enzyme sowie organische Säuren (z. B. xalsäure). Es wird Mn 2+ zu Mn 3+ oxidiert, dieses wird durch xalsäure chelatisiert. Die Mn 3+ -Chelat-Komplexe dringen in den Lignozelluloseverbund ein und bewirken eine radikalische xidation des s. Infolgedessen kommt es zu Bindungsspaltungen, zur Entstehung löslicher fragmente und zur Freisetzung von C 2. Der gesamte xidationsprozess wird durch weitere radikalchemische Reaktionen forciert, die u. a. zwischen den Mn 3+ -Komplexen und/ oder Cooxidantien erfolgen sowie von anderen Enzymen (Laccase, weitere Peroxidasen) unterstützt werden. Die genannten Reaktionen erfolgen nur in einem sauren Milieu (ph < 6) und sind per se unproduktive Prozesse. Der abbau entspricht somit in der Tat einer enzymatischen Verbrennung (enzymatic combustion; Kirk & Farrell 1987), bei der das unter Energieeinsatz abgebaut werden muss, damit der Pilz Zugang zu den Ressourcen der Polysaccharide erhält (cometabolischer Abbauprozess). Eigentliche Kohlenstoff- und Energiequelle sind die Zucker aus den Polysacchariden, wobei vorzugsweise die Hemizellulosen hydrolysiert und verstoffwechselt werden. Als Folge bleibt ein delignifiziertes und an Hemizellulosen verarmtes Holz zurück, das durch die übrig gebliebenen Zellulosefasern eine charakteristische weißliche Färbung annimmt (weißfaules Holz). Weitere extrazelluläre Peroxidasen der Pilze Je nach Art können Holz und Streu zersetzende Basidiomycota weitere xidoreduktasen ausscheiden, von denen angenommen wird, dass sie ebenfalls am abbau beteiligt sind. Hierzu gehören mindestens zwei weitere Peroxidasen, die -Peroxidase (LiP, EC ) und die Versatile Peroxidase (VP, ), sowie die zu den Phenol-xidasen gehörende Laccase (EC , s. unten). Mit der Mangan-Peroxidase werden die genannten Enzyme, die alle freie chemische Radikale zu erzeugen vermögen, unter dem Begriff ligninolytische Enzyme zusammengefasst (Hatakka 2001). Es muss jedoch darauf hingewiesen werden, dass selten alle vier Enzyme gleichzeitig in einem Pilz vorkommen. Meist sind es Kombinationen von ein oder zwei Peroxidasen und Laccase (Hatakka 1994); es gibt jedoch auch aktive Weißfäuleerreger, denen die Laccase fehlt (z. B. Bjerkandera adusta, Phanerochaete chrysosporium ; Kersten & Cullen 2006). Alle bisher untersuchten agaricalen Streuzersetzer (u. a. Agrocybe praecox, Collybia dryophila, Stropharia coronilla ) scheinen keine - und Versatilen Peroxidasen zu bilden und sekretieren lediglich Mangan- Peroxidase und Laccase (Steffen et al. 2002a,b). Phlebia radiata oder Pleurotus eryngii scheiden Mangan-Peroxidase und - bzw. Versatile Peroxidasen sowie Laccase aus. Weitere Kombinationen ligninolytischer Enzyme sind denkbar (Hatakka 2001), auch unter Einbeziehung gerade erst oder noch nicht entdeckter Peroxidasen (z. B. DyP-type-Peroxidasen, Peroxygenasen, Abb. 8). Ökologische Rolle von Pilzen

9 Da die meisten ligninolytischen Enzyme meist in multiplen Formen (verschiedene Isoenzyme und/ oder unterschiedlich glykosylierte Isoformen des gleichen Enzymproteins) mit z.t. variierenden katalytischen Eigenschaften vorkommen, steht den Pilzen insgesamt ein breites Arsenal an extrazellulären Biokatalysatoren zur oxidativen Modifikation und Zersetzung des s zur Verfügung (Hammel & Cullen 2008). Die -Peroxidase ist eine exklusive Peroxidase corticaler und polyporaler Holzbewohner und verfügt über ein besonders hohes Redoxpotential (E 0 = 1,5 V), was es ihr erlaubt, auch weniger reaktive methoxylierte Aromaten wie sie typisch sind für das direkt anzugreifen und zu Arylkationenradikalen zu oxidieren (Harvey et al. 1992). Die Versatile Peroxidase, die u. a. von Bjerkandera adusta und Pleurotus eryngii gebildet wird, vereint in sich die Eigenschaften von, Mangan und Phenol oxidierenden Peroxidasen und stellt folglich einen funktionellen Hybriden der genannten Enzyme dar (Martínez et al. 2005). Klassische Peroxidasen (EC , E 0 = 0,9 V) wie die des thermophilen/coprophilen Streuzersetzers Coprinopsis cinerea oxidieren in erster Linie phenolische Substrate; ihre Rolle im Abbaugeschehen ist jedoch unklar. Ähnliches gilt für die so genannten DyP-type-Peroxidasen (dye decolorizing peroxidases; EC x, E 0 ~ 1.3 V), die erst vor wenigen Jahren im Zusammenhang mit dem Abbau industrieller Farbstoffe durch einen Geotrichum -ähnlichen Bodenpilz (Teleomorphe von Thanatephorus cucumeric, einem Vertreter der Cantharellales ) entdeckt worden sind (Sugano 2009). Das Enzym wird auch von agaricalen (Marasmius scorodonius ) und auricularen (Auricularia auricularia-judae ) Basidiomycota ausgeschieden (Scheibner et al. 2008). Im letzteren Fall konnte kürzlich erstmals die Spaltung nicht phenolischer modellverbindungen durch eine DyPtype-Peroxidase nachgewiesen werden, was auf ihre unmittelbare Beteiligung am abbau hindeutet (Liers et al. unpubl.). Nicht zuletzt muss noch die so genannte aromatische Peroxygenase, die u. a. der»atypische«weißfäuleerreger Agrocybe aegerita sekretiert, erwähnt werden. Dabei handelt es sich um ein Häm-Thiolat-Protein, das wahrscheinlich eine neue Subklasse der Peroxidasen repräsentiert (EC x) und als einzig bisher bekanntes extrazelluläres Enzym Sauerstofffunktionen auf aromatische Substrate überträgt sowie lignintypische Etherbindungen spaltet (Ullrich & Hofrichter Abbau von und Huminstoffen , Kinne et al. unpubl.). Die Abbildung 8 fasst die wichtigsten Reaktionen der aromatischen Peroxygenase zusammen, die außer in A. aegerita auch in coprophilen Lamellenpilzen (Agaricales ) gefunden wurde (z. B. Coprinellus radians, Coprinopsis verticillata ; Anh et al. 2007). Welche der dargestellten Reaktionen abläuft, hängt stark von den Reaktionsbedingungen und -partnern ab (ph, Peroxidkonzentration, Molekülgröße und -geometrie, Polarität des Substrats, etc.). Von besonderer Bedeutung für den abbau könnte die Demethoxylierung sein, in deren Zuge die reaktionsträgen Aromaten des s in Phenole umgewandelt werden (Abspaltung von Methoxygruppen als Formaldehyd ). Laccasen Laccasen sind die am häufigsten vorkommenden und am einfachsten zu detektierenden extrazellulären xidoreduktasen der Pilze. Man findet sie außer in Pilzen auch in Bakterien, Tieren und Pflanzen, wo sie u. a. an Polymerisationsprozessen in den Zellwänden oder dem Exoskelett beteiligt sind. Die Laccasen sind kupferhaltige Proteine; konzentrierte, gereinigte Laccasen haben deshalb eine charakteristische blaue Farbe, die auf vier Kupferionen (Cu 2+ ) im aktiven Zentrum des Enzyms zurückgeht (Baldrian 2006). Laccasen reagieren bevorzugt mit phenolischen Verbindungen, die über Ein-Elektronen-xidation an der Hydroxylgruppe des Phenols unter Entzug von vier Elektronen und vier Protonen angegriffen werden (Abb. 9). Dabei entstehen, ähnlich wie bei der MnP-Katalyse, Phenoxylradikale ; gleichzeitig werden die Elektronen der Phenole auf die Kupferzentren übertragen, die dabei zu einwertigen Kupferionen (Cu + ) werden. Von dort erfolgt dann der Transfer der Elektronen auf den Sauerstoff ( 2 ), der zu Wasser reduziert wird. Die Phenoxylradikale, die in verschiedenen mesomeren Formen auftreten, können koppeln und polymerisieren oder sind der Ausgangspunkt für nachfolgende Bindungsspaltungen. Die Reaktionen der Laccasen hängen stark von ihrem Redoxpotential ab. Man unterscheidet so genannte Low-redox-potential-Laccasen (LRPL) und High-redox-potential-Laccasen (HRPL), deren Redoxpotentiale (E 0 ) zwischen 0,4 und 0,5 V (LRPL) bzw. 0,7 und 0,8 V (HRPL) liegen. In dieser Eigenschaft unterscheiden sich die Laccasen bodenbewohnender und phytopathogener As-

10 90 H 3 C H H 3 C H Br H 2 N 12 Br Cl Br [ABTS] + 10 H 3 C H 3 C 2 N CH 3 12 Br ABTS CH 3 Cl H C 2 H 5 H 2 + ½ 2 H 2 2 AaP Abb. 8. Ausgewählte Aktivitäten der Agrocybe-aegerita-Peroxygenase (AaP): 1 Etherspaltung, 2 Hydroxylierung, 3 Epoxidierung, 4 N-xidation, 5 N-Dealkylierung, 6 Sulfoxidation, 7 Phenol-, 8 Alkohol- und 9 Aldehydoxidation, 10 Ein-Elektronen-xidation, 11 Katalase-Reaktion, 12 Bromierung. Die chemischen Formeln der Substrate sind schwarz und die der Produkte rot dargestellt. 4 4 R R 7 H H 2 H CH 3 CH H + Polymerisation, Bindungsspaltung H N 4 N + H CH 3 HN 5 Cu 2+ H 1 H H NH 2 Cu 2+ Cu 2+ Cu 2+ H + 4 e 4 e Cu + Cu + Cu + Cu + CH 3 CH 3 H CH 3 CH 3 11 S CH 3 CH 3 CH H S CH 3 2 H H + Laccase 4 Ar-H [Ar- ] + 2 H 2 Abb. 9. Schematischer Reaktionsmechanismus einer Laccase. Ar-H: hydroxylierter Aromat (phenolisches Substrat). Modifiziert nach Liers (2007). 7 H H CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 comycota ( LRPL), die nicht zum abbau befähigt sind, von den Laccasen Holz bewohnender Basidio - und Ascomycota ( HRPL), die eine Weißfäule (Trametes spp. ) bzw. eine Moderfäule des Typs 2 (Xylaria spp. ) hervorrufen. Pilzliche Laccasen haben Eingang in die Biotechnologie gefunden und werden dort u. a. zur partiellen Bleichung von Denim-Gewebe eingesetzt (»stone-washed effect«). Dazu nutzt man das Präparat DeniLite II der Firma Novozymes A/S (Kopenhagen), das eine Laccase des Weißfäulepilzes Trametes villosa enthält. Das Enzym hat eines der höchsten für Laccasen bekannten Redoxpotentiale und wurde gentechnisch bezüglich Temperatur - und ph -Stabilität optimiert. Seine technische Herstellung erfolgt heterolog im phytopathogenen Ascomyceten Aspergillus oryzae. In der Textilbranche entfärbt das Enzym in Gegenwart eines Redoxmediators den Farbstoff Indigo und hilft dabei, Energie und Wasser in erheblichem Umfang zu sparen. Man geht davon aus, dass neben den Laccasen noch weitere extrazelluläre xidasen am H CH CH 3 Cl CH 3 CH 3 H CH 2 H H 7 H H Cl CH 3 CH 1 7 H Cl 9 CH H CH H Ökologische Rolle von Pilzen? 2 7 2

11 H H Me H H CH Me H Me H Me H H H H Teil des moleküls abbau beteiligt sind, z. B. die Arylalkohol- xidase (EC ) und die Glyoxylat-xidase (EC ), die außerhalb der Pilzhyphe für eine kontinuierliche Bildung von Wasserstoffperoxid sorgen (H 2 2 ; Cosubstrat der ligninolytischen Peroxidasen ). Abbau von Lignozellulosen durch Ascomycota Bei den Holz zersetzenden Ascomycota, die eine aggressive Moderfäule (Typ 2) hervorrufen, spielen Laccasen wahrscheinlich die zentrale Rolle als extrazelluläre oxidative Biokatalysatoren (Blanchette 1995). Im Unterschied zu den Basidiomycota verfügen sie offensichtlich über keine ligninolytischen Peroxidasen (Liers et al. 2006). In umfangreichen Screenings, in deren Verlauf hunderte von Ascomycota-Stämmen getestet wurden, konnten niemals Aktivitäten von Peroxidasen gefunden werden, wohl aber sehr aktive Laccasen. Holz abbauende Ascomycota wie Xylaria polymorpha sekretieren demnach Laccasen anstelle von Mangan-Peroxidasen (Abb. 10). Diese radikalisieren wahrscheinlich Cooxidantien (z. B. niedermolekulare phenolische Verbindungen), Me Me Me Zucker aus Hemizellulosen & Zellulose Pilzhyphe Lignozellulose (Holz, Streu) Esterase, Xylanase Cooxidantien (Phenole, ArH) Laccase C 2 2 Lösliche -Polysaccharid-Fragmente Radikale (z.b. Ar ) H Melanin, Humus Abb. 10. Schema zum abbau durch Laccase und Feruloyl-Esterase ausscheidende Ascomycota (z. B. Xylaria polymorpha ). Modifiziert nach Liers (2007). Abbau von und Huminstoffen Abb. 11. Durch lösliche organische Kohlenstoffverbindungen dunkel gefärbte Eiszapfen auf Buchenholz, das von Fomes fomentarius besiedelt wird. Foto: M. Hofrichter.

12 92 die als semistabile Radikale (ähnlich wie die Mn 3+ - Komplexe der MnP-bildenden Basidiomycota ) in den Lignozelluloseverband diffundieren, wo es nach oxidativem Angriff bestimmter strukturen zu Bindungsspaltungen kommt (Liers et al. 2007). Daneben besitzen Holz abbauende Ascomyceten aktive Xylanasen und spezifische Feruloyl- Esterasen (Phenol-Carbonsäure-Esterasen; Wong 2006), die Bindungen zwischen dem Xylan (Bestandteil der Hemizellulosen) und den aromatischen bestandteilen spalten, sodass es zur Bildung von großen -Polysaccharid- Fragmenten (> 10 kda) kommt. Die beobachteten Fragmentierungsmuster unterscheiden sich deutlich von denen der Weißfäulepilze, die vorzugsweise kleine aromatisch geprägte Fragmente (< 1 kda) bilden (Liers et al. 2007). Die Laccasen Holz bewohnender Ascomycota (Xylariaceae) sind außerdem an der Bildung von extrem stabilen Melaninen beteiligt und tragen so zur Entstehung persistenter polymerer Verbindungen im Holz (Melaninscheiden), in der Streu und im Boden bei. Ab- und Umbau von Huminstoffen Die aromatischen Bestandteile der Bodenhuminstoffe leiten sich in erster Linie vom ab, das in Form von Blättern, Nadeln und Zweigen in die Streuschicht des Bodens eingetragen wird. Chemisch gesehen geht dieses mehr oder weniger lückenlos in die Huminstoffe über, wobei die verantwortlichen Modifikationen (u. a. Demeth oxylierung, De- und Repolymerisierung) unter Beteiligung Streu zersetzender Pilze erfolgen. Vor diesem Hintergrund wurde ein Moorboden aus dem Bereich eines Hexenrings von Clitocybe nebularis, der Nebelkappe, untersucht. Hierzu wurden Proben in unmittelbarer Nähe des Myzels sowie in einiger Entfernung vom Hexenring entnommen und mittels hochauflösender Größenaufschluss-Chromatographie (HPSEC) bezüglich des Gehaltes an wasserlöslichen, aromatisch geprägten Fragmenten (modifiziertes Restlignin, Fulvinsäuren ) analysiert. Es stellte sich heraus, dass die Konzentration polarer fulvinsäure ähnlicher Substanzen im Bereich des Pilzmyzels ungefähr 20-mal höher war als im umgebenden Boden. Dies war ein deutliches Indiz für die Aktivität oxidativer Pilzenzyme in der Bodenstreuschicht, wo Restlignin und Huminstoffe in ähnlicher Art und Weise angegriffen werden wie das im Holz (Winterstein 2005). Insgesamt lässt sich für die Umsetzung von Huminstoffen ein ähnliches Schema postulieren wie für den abbau (vgl. Abb. 7), wobei in diesem Fall anstelle der wasserlöslichen fragmente säurelösliche Fulvinsäuren entstehen (Steffen et al. 2000a). Die Tendenz zur Repolymerisierung ist im Humus jedoch stärker ausgeprägt als im Holz, was sich anhand der schubweisen Entfärbung und Rückfärbung entsprechender Huminsäureagarplatten zeigen lässt. Wie hängen abbau und Humus-Turnover zusammen? Beide, das aus dem Holz und der Humus in der obersten Bodenschicht, bilden eine funktionelle Einheit (chemisches Kontinuum). Durch ligninolytische Peroxidasen (vor allem Mangan-Peroxidase ), spezielle Esterasen und Laccasen entstehen sowohl Fulvinsäuren als auch fragmente. Die verschiedenen ökophysiologischen Pilzgruppen leisten jeweils ihren spezifischen Beitrag zum Um- und Abbau der polymeren Verbindungen. Dies wird auf anschauliche Weise deutlich, wenn man sich im Winter Eiszapfen anschaut, die sich an Totholz in der Umgebung von Pilzmyzelien entwickeln. Als Beispiel zeigt die Abbildung 11 einen Buchenstamm, der vom Zunderschwamm (Fomes fomentarius ) besiedelt wird. Die Abbauprodukte des s, die aus dem Holz durch den Pilz freigesetzt werden, färben das herabrinnende Wasser, sodass es zur Bildung dunkelbrauner Eiszapfen kommt. Sie enthalten den entstandenen löslichen organischen Kohlenstoff (DC) aus dem Holz, der bei frostfreier Witterung unmittelbar in den Huminstoff-Pool des Bodens eingegangen wäre. Ausblick Zukünftig wird es im Bereich der Lignozelluloseforschung unbedingt erforderlich sein, sich mit Sekretomstudien zu beschäftigen, d. h. mit der Frage, welche Enzyme von den Pilzen tatsächlich während des Wachstums auf Holz oder Stroh ausgeschieden werden. Ein Verbundprojekt zu dieser Thematik, das von der Deutschen Bundesstiftung Umwelt gefördert wird, ist vor kurzem begonnen worden. Über großformatige 2D-Gelelektrophoresen sollen dabei alle extrazellulären Proteine der Modellorganismen Pleurotus sapidus (Basidiomycota) und Xylaria polymorpha Ökologische Rolle von Pilzen

13 (Ascomycota) während des Wachstums auf Rapsstroh erfasst werden. Erste Befunde hierzu haben gezeigt, dass bis zu 200 verschiedene Proteine in relativ kurzer Zeit durch die Pilze ausgeschieden werden. Die Analyse ist äußerst kompliziert, wird aber zukünftig genauere Rückschlüsse zulassen, welche Enzyme miteinander zusammenwirken und in welchem zeitlichen Muster sie ausgeschieden werden müssen, damit der Lignozellulosekomplex effizient zerlegt werden kann. Auf die umfangreichen molekularbiologischen Arbeiten zu ligninolytischen Pilzen und ihren Enzymen konnte an dieser Stelle nicht weiter eingegangen werden. Diese haben sich in den letzten Jahren vor allem im Zuge der Sequenzierung ganzer Genome (u. a. Phanerochaete chrysosporium, Laccaria bicolor, Postia placenta, derzeit Pleurotus ostreatus, Agaricus bisporus ) enorm entwickelt. Jetzt gilt es diese Daten mit entsprechenden Transkriptom- und Proteindaten abzugleichen, um weiter in die Phänomene der Regulation des abbaus einzudringen. So wird beispielsweise derzeit das Transkriptom des bereits erwähnten Peroxygenase -Bildners Agrocybe aegerita unter dieser Prämisse analysiert (Pecyna et al. 2009). Nicht zuletzt muss auch eine sinnvolle Verknüpfung von Freilandstudien, d. h. klassischen feldmykologischen Arbeiten, mit molekularbiologischen sowie enzymatischen Untersuchungen erfolgen. Diesem Gedanken Rechnung tragend beschäftigen sich zwei laufende DFG-Verbundprojekte im Rahmen des Sonderforschungsprogramms»Biodiversitäts- Exploratorien«mit dem Vorkommen von Peroxidasen und Laccasen in Böden und Totholz. Danksagung Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Projekte: FUPERS und FUNWD), der Deutschen Bundesstiftung Umwelt (Projekte: PILZLICHE PERXYGENA- SEN und PILZSEKRETME), dem Bundesministerium für Forschung und Bildung (FKZ , VNM 05/003), dem Deutschen Akademischen Austauschdienst (D/07/01309) und der Europäischen Union (IP BIRE- NEW, ESF ) für ihre großzügige Unterstützung. Unser besonderer Dank gilt weiterhin unseren Projektpartnern Holger Zorn (Universität Gießen), Francois Buscot und Dirk Krüger (UFZ Leipzig/Halle), Jürgen Bauhus und Tiemo Kahl (Universität Freiburg), Katrin Scheibner (Hochschule Lausitz), Annele Hatakka, Kari Steffen und Taina Lundell (Universität Helsinki), Petr Baldrian (Tschechische Akademie der Wissenschaften), Abbau von und Huminstoffen 93 Kenneth Hammel (Forest Products Laboratories Madison, USA) sowie den involvierten Doktoranden (Marek Pecyna, Martin Kluge, Danuta Kapturska, Marzena Proraj-Kobielska, Katerina Barková, Dau Hung Anh, Do Huu Nghi) und technischen Mitarbeitern am IHI Zittau (Ulrike Schneider, Constanze Stark, Monika Brandt, Andreas Elsner). Literatur Anh, D. H., D. Benndorf, A. Svatos, A. Muck, R. Ullrich & M. Hofrichter The coprophilous mushroom Coprinus radians secretes a haloperoxidase that catalyzes aromatic peroxygenation. Applied and Environmental Microbiology, 73: Baldrian, P Review: Fungal laccases occurrence and properties. FEMS Microbiological Reviews, 30: Blanchette, R. A Degradation of the lignocellulose complex in wood. Canadian Journal of Botany, 73: Fritsche, W Umweltmikrobiologie. Gustav Fischer, Jena. Gierer, J Formation and involvement of superoxide and hydroxyl radicals in TCF bleaching processes: a review. Holzforschung, 51: Hammel, K. E. & D. Cullen Review: Role of fungal peroxidases in biological ligninolysis. Current pinion in Plant Biology, 11: Harvey, P. J., R. Floris, T. Lundell, J. M. Palmer, H. E. Schoe maker & R. Wever Catalytic mechanisms and regulation of lignin peroxidase. Biochemical Society Transactions, 20: Hatakka, A modifying enzymes from selected white-rot fungi: production and role in lignin degradation. FEMS Microbiological Reviews, 13: Biodegradation of lignin. In: Steinbüchel, A. & M. Hofrichter (eds.): Biopolymers vol. 1, Humic Substances and Coal. Wiley VCH, Steinheim: Hatakka, A., T. Lundell, M. Hofrichter & P. Maijala Manganese peroxidase and its role in the degradation of wood lignin. In: Mansfield, S. & J. N. Saddler (eds.): Applications of Enzymes to Lignocellulosics. Publications of the American Chemical Society, 855: Hildén, K., R. Bortfeldt, M. Hofrichter, A. Hatakka & T. Lundell Molecular characterization of Nematoloma frowardii isolate b19 reveals reidentification of the fungal strain to the genus Phlebia, species Phlebia radiata. Microbiology, 154: Hofrichter, M Mangan-Peroxidasen: Die enzymatische Verbrennung von. BioSpektrum, 6: Review: conversion by manganese peroxidase (MnP). Enzyme and Microbial Technology, 30:

14 94 Hofrichter, M. & W. Fritsche Depolymerization of low-rank coal by extracellular fungal enzyme systems. II. The ligninolytic enzymes of the coalhumic-acid-depolymerizing fungus Nematoloma frowardii b19. Applied Microbiology and Biotechnology, 47: Hofrichter, M., T. Vares, M. Kalsi, K. Scheibner & A. Hatakka. 1999a. Production of ligninolytic enzymes and organic acids, and mineralization of 14 C-labeled lignin during solid-state fermentation of wheat straw with the white-rot fungus Nematoloma frowardii. Applied and Environmental Microbiology, 65: Hofrichter, M., K. Scheibner, F. Bublitz, I. Schneegaß, D. Ziegenhagen, R. Martens & W. Fritsche. 1999b. Depolymerization of straw lignin by manganese peroxidase from Nematoloma frowardii is accompanied by release of carbon dioxide. Holzforschung, 52: Hofrichter, M., T. Lundell & A. Hatakka Conversion of milled pine wood by manganese peroxidase from Phlebia radiata. Applied and Environmental Microbiology, 67: Kapich, A., M. Hofrichter, T. Vares & A. Hatakka Coupling of manganese peroxidase mediated lipid peroxidation with destruction of non-phenolic lignin model compounds and 14 C-labeled lignins. Biochemical and Biophysical Research Communications, 259: Kapich, A. N., K. T. Steffen, M. Hofrichter & A. Hatakka Involvement of lipid-peroxidation in the degradation of a non-phenolic lignin model compound by manganese peroxidase of the litter-decomposing fungus Stropharia coronilla. Biochemical and Biophysical Research Communications, 330: Kersten, P. & D. Cullen Review: Extracellular oxidative systems of the lignin-degrading basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Fungal Genetics and Biology, 44: Kirk, T. K. & R. L. Farrell Enzymatic combustion - the microbial degradation of lignin. Annual Reviews of Microbiology, 41: Liers, C Das Lignozellulose abbauende Enzymsystem des holzbesiedelnden Schlauchpilzes Xylaria polymorpha. Dissertation, Internationales Hochschulinstitut Zittau. Liers, C., R. Ullrich, K. T. Steffen, A. Hatakka & M. Hofrichter Mineralization of 14 C-labelled synthetic lignin and extracellular enzyme activities of wood-colonizing ascomycetes Xylaria hypoxylon and X. polymorpha. Applied Microbiology and Biotechnology, 69: Liers, C., R. Ullrich, M. Pecyna, D. Schlosser & M. Hofrichter Production, purification and partial enzymatic and molecular characterization of a laccase from the wood-rotting ascomycete Xylaria polymorpha. Enzyme and Microbial Technology, 41: Martínez, A. T., M. Speranza, F. J. Ruiz-Dueñas, P. Ferreira, S. Camarero, F. Guillén, M. J. Martínez & J. C. del Río Gutiérrez Biodegradation of lignocellulosics: microbial, chemical, and enzymatic aspects of the fungal attack of lignin. International Microbiology, 8: Nüske, J., U. Dornberger, R. Ullrich, K. Scheibner & M. Hofrichter Large scale production of manganese peroxidase using white-rot fungi. Enzyme and Microbial Technology, 30: Pecyna, M. J., R. Ullrich, B. Bittner, A. Clemens, R. Schubert, K. Scheibner & M. Hofrichter Molecular characterization of aromatic peroxygenase from Agrocybe aegerita. Applied Microbiology and Biotechnology, DI /s (INZWISCHEN GEDRUCKT?) Scheibner, M., B. Hülsdau, K. Zelena, M. Nimtz, L. de Boer, R. G. Berger & H. Zorn Novel peroxidases of Marasmius scorodonius degrade betacarotene. Applied Microbiology and Biotechnology, 77: Steffen, K., A. Hatakka & M. Hofrichter. 2002a. Degradation of humic acids by the litter-decomposing basidiomycete Collybia dryophila. Applied and Environmental Microbiology, 68: Steffen, K., M. Hofrichter & A. Hatakka. 2002b. Purification and characterization of manganese peroxidases from the litter-decomposing basidiomycetes Agrocybe praecox and Stropharia coronilla. Enzyme and Microbial Technology, 30: Stevenson, F. J Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. Second Edition. John Wiley & Sons, New York. Sugano, Y DyP-type peroxidases comprise a novel heme peroxidase family. Cell and Molecular Life Sciences, 66: Ullrich, R. & M. Hofrichter Review: Enzymatic hydroxylation of aromatic compounds. Cell and Molecular Life Sciences, 64: Winterstein, D Hexenring der Nebelkappe [Clitocybe nebularis (Batsch: Fr.) Kummer] in einer Knollenkratzdistel-Pfeifengraswiese [Cirisio tuberosi-molinietum] Einfluss auf Vegetation und Edaphon. Decheniana (Bonn), 158: Wong, D. E Review: Feruloyl esterase: a key enzyme in biomass degradation. Applied Biochemistry and Biotechnology, 133: Ökologische Rolle von Pilzen

15 W. Steglich: In den letzten Jahren hat sich das Bild des Aufbaus von gegenüber dem alten Freudenberg schen statistischen Modell sehr verändert. Inwiefern ist das für Ihre Forschungen zum abbau von Bedeutung? Kann man zum Beispiel bestimmte bevorzugte Strukturen erkennen bzw. vorhersagen oder ist die Sache noch zu komplex? M. Hofrichter: Grundsätzlich lässt sich sagen, dass das vom Nadelholz schwerer abbaubar ist als das der Laubhölzer, wie in verschiedenen Studien belegt werden konnte. Ansonsten sind diese Systeme sehr unspezifisch. Es gibt graduelle Unterschiede beim Abbau, aber im Prinzip ist jedes zum Beispiel durch das Mangan-Peroxidase -System in Kombination mit verschieden Cooxidantien abbaubar. Die Art des s spielt dabei schon eine gewisse Rolle und hat beispielsweise Folgen für die Einnischung der entsprechenden Holz abbauenden Pilze. A. Bresinsky: Gibt es eine Abschätzung, wie die Energiebilanz aussieht? Wie hoch ist der Energieaufwand bei dem enzymatischen Abbau von Lignozellulose? Was kommt im Endeffekt für die Pilze dabei heraus? M. Hofrichter: Im Endeffekt kommt so viel dabei heraus, dass Pilze zum Beispiel bei der Weißfäule die Zellulose, die letztendlich blanker Traubenzucker (Glucose) ist, liegen lassen. Der Pilz gewinnt also weitaus mehr, als er letztlich verbrauchen kann, und das erlaubt ihm, sich ein so»teures«enzymatisches System zu leisten. Man muss das Ganze also eher ökophysiologisch und vom Standpunkt des Besetzens spezieller Nischen aus betrachten. Indem der Pilz die barriere beseitigt, was andere rganismen nicht können, erschließt er sich einen Lebensraum, in dem die Polysaccharide quasi im Überschuss zur Verfügung stehen. A. Bresinsky: Dazu kommen die im Holz befindlichen Stickstoffverbindungen. Diskussion 95 W. Höll: Es gibt eine Reihe von rganismen, die sich von Holz ernähren, zum Beispiel Termiten und einige Larven von Bockkäfern. Gibt es Hinweise, dass das mithilfe von Symbionten in deren Darmsystemen abgebaut wird? M. Hofrichter: Das kann im Darmsystem von entsprechenden Insekten nicht abgebaut werden, wie Untersuchungen in Konstanz gezeigt haben. 1 Sehr effektiv wird allerdings der Lignozellulosekomplex unter den alkalischen Bedingungen im Insektendarm suspendiert, sodass anschließend die Zellulose hydrolysiert werden kann. Zudem besteht im Insektendarm ein ähnliches Problem wie im Wiederkäuermagen: die Limitierung des Sauerstoffs. hne ausreichend freien Sauerstoff als Reaktionspartner ist ein vollständiger Abbau von nicht möglich. Das war übrigens auch die Ursache, dass in geologischen Zeiträumen Kohle entstanden ist: Lignozellulose (Totholz) sank in Sumpfgebieten unter die Wasseroberfläche ab, wo nicht genügend Sauerstoff vorhanden war. Dadurch wurden das pilzliche Wachstum und damit der abbau unterdrückt, was zum Erhalt der Lignozellulosen und geologisch zu ihrer Umwandlung in Kohle geführt hat. Was aber viele der erwähnten Insekten besitzen, sind sehr effektive symbiontische Zelluloseabbauer, darunter auch Pilze aus der Torulopsis-Verwandtschaft, die unter anderem bei Käfern eine Rolle spielen. Man hat allerdings keine ligninolytischen Enzyme, sprich Peroxidasen, in diesen Symbionten gefunden. A. Bresinsky: Als Ergänzung zum Holzabbau durch Insekten : Manche dieser Insekten verfügen über pilzliche Symbionten, die sogar in eigenen rganen, d. h. in Ausstülpungen des Darmes, sog. Myzetomen, vorkommen. Auch hier leisten die Pilze also einen wichtigen Beitrag. M. Hofrichter: Das ist richtig und hier muss man im Prinzip auch die Ektosymbiosen von Blattschneiderameisen und Termiten mit einbeziehen. Sie finden außerhalb des Insektenkörpers M. Hofrichter: Das ist in der Tat im Holz der limitierende Faktor. 1 Breznak, J. A. & A. Brune Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites. Annual Review of Entomology, 39: Abbau von und Huminstoffen

16 96 statt, wobei Weißfäulepilze von diesen Insekten in ihren Nestern kultiviert werden, zum Beispiel Termitomyces spp. und Leucoagaricus -Arten. W. Höll: Es gibt Bockkäferlarven, die sich ausschließlich von Nadelholz in den Bäumen ernähren, zum Beispiel der Hausbockkäfer, Hylotrupes bajulus. Dieser hat aber keine Myzetome. M. Hofrichter: Dazu kann ich nur allgemein sagen, dass das Entscheidende die drastischen Bedingungen im Insektendarm sind, vor allem die hohen ph-werte, die zu einer partiellen Sulobilisierung des s führen. Das gleiche Prinzip wird im Übrigen in der Papierindustrie angewendet, um das zu entfernen und die Zellulose zugänglich zu machen. Das bleibt dabei in veränderter Form zurück und wird vom Insekt quasi als eine Art huminstoffreicher Dünger ausgeschieden. C. Gietl: Können Pilze Zellulose abbauen oder nicht? Ich dachte immer, das können nur Bakterien. M. Hofrichter: Sowohl Basidio - als auch Ascomyceten können Zellulose abbauen. Sie haben sehr effektive Zellulasen, die auch kommerziell nutzbar sind (z. B. Zellulasen aus Trichoderma spp. ). Weißfäulepilze bevorzugen allerdings Hemizellulosen gegenüber Zellulose. W. Höll: Warum sind die Weißfäulepilze hauptsächlich auf Laubhölzer spezialisiert? M. Hofrichter: Das kann damit zusammenhängen, dass das der Laubhölzer einfacher abzubauen ist (weniger so genannte Guajacylpropan-Einheiten). Es gibt aber auch eine ganze Reihe von Weißfäulepilzen, die auf Nadelholz wachsen, und es gibt solche, die auf beiden Holzsorten vorkommen. Hinzu kommt, dass ein alternativer Abbauprozess, die Braunfäule, bevorzugt im Nadelholz stattfindet. Die Braunfäule unterliegt allerdings vollkommen anderen Mechanismen, bei denen nicht Enzyme, sondern extrazellulär gebildete Hydroxylradikale die zentrale Rolle spielen. K. E. Rehfuess: Sie haben einerseits die wichtige Rolle der Peroxidasen für den abbau gezeigt, andererseits gesagt, diese arbeiten nur im sauren System. Wie erfolgt der abbau dann in Böden, die bis zur Bodenoberfläche carbonathaltig sind und alkalische Reaktionen aufweisen? Auch dort muss das ja abgebaut werden. M. Hofrichter: Klassische Mechanismen wie die Mangan-Peroxidase -Katalyse würden dort nicht greifen. Hier könnten die Peroxygenasen ins Spiel kommen, die beispielsweise von Agrocybe aegerita oder von Coprinopsis -Arten gebildet werden. Sie können die xidation von methoxylierten Aromaten bei höheren ph-werten katalysieren und zum Beispiel Sauerstoff außerhalb der Pilzzelle in das einbauen, sodass es leichter angreifbar wird. Aber das sind reine Hypothesen, die noch einer Klärung bedürfen. D. Herm: Sie haben das Einsinken der Lignozellulose unter die Wasseroberfläche erwähnt. Der Abbau geht dann sicher noch weiter, wir haben ja Umformungen bis zur Kohle. Inwieweit sind dort äußere Bedingungen wie Sauerstoffgehalt, Temperatur und Feuchtigkeit wichtig? M. Hofrichter: Für den vollständigen Abbau des s ist Sauerstoff unbedingt erforderlich. Selbst wenn man Wasserstoffperoxid zugibt, kommt es ohne Sauerstoff zu keinem vollständigen abbau. Es kann aber durch andere rganismen und auch durch spontane chemische Prozesse zu einem Umbau des s kommen, vor allem unter erhöhtem Druck und hohen Temperaturen, was man geologisch als Kohlebildungsprozess bezeichnet. In Bezug auf die Luftfeuchte sind Pilze relativ anspruchslos, der Echte Hausschwamm (Serpula lacrymans ) beispielsweise wächst nur bei niedrigen Wasserkapazitäten. Ganz ohne Wasser funktioniert der Abbau aber natürlich auch nicht. Ökologische Rolle von Pilzen