Abteilung Toxikologie

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1 Abteilung Toxikologie Direktor: Prof. Dr. med. Ingo Just Forschungsprofil Schwerpunktmäßig bearbeitet die Abteilung die biologische Wirkung von bakteriellen Proteintoxinen. Hierzu gehören die Aufklärung des molekularen und zellulären Wirkmechanismus der Toxine und die detaillierte Beschreibung des zellulären Aufnahmewegs sowie die Charakterisierung der funktionellen Konsequenzen der Toxinwirkung für die Zielzelle. Im Aufbau begriffen ist der Proteomic-Ansatz zur Aufklärung der Toxinwirkung. Die Kenntnisse über die Toxinwirkung führen zu einem vertieften Verständnis des Krankheitsgeschehens, an dem das Toxin pathogenetisch beteiligt ist und ermöglichen so, therapeutische Ansätze zu definieren bzw. zu optimieren. Darüber hinaus erlaubt die detaillierte Kenntnis des molekularen Toxin-Wirkmechanismus die Etablierung der Proteintoxine als hochspezifische, zellbiologische Werkzeuge oder als Therapeutikum; zurzeit werden Botulinus Neurotoxin und C3-Exoenzym von Clostridium botulinum auf ihre pharmakotherapeutische Wirkung hin untersucht. Forschungsprojekte Validierung eines in vitro Modells zur Bestimmung der Aktivität clostridialer Neurotoxine und Identifizierung von Rezeptormolekülen Botulinus Neurotoxin vermindert die Freisetzung von Azetylcholin aus peripheren Nerven. Dieser Effekt ist sowohl in vivo als auch in vitro auslösbar. In vivo kommt es in Folge einer Vergiftung mit Botulinus Neurotoxin zur Paralyse unter anderem der Atemmuskulatur und das vergiftete Tier stirbt an Sauerstoffmangel. Die Paralyse kann auch in vitro beobachtet werden, wenn ein isoliertes Nerv-Muskel-Präparat dem Toxin exponiert wird (Hemidiaphragma Assay, HDA). In beiden Ansätzen ist der Endpunkt die Erschlaffung eines quergestreiften Muskels, die beim Tier zum Tode führt. Im Organbad nimmt die Kontraktionsamplitude des Muskels durch Stimulation des Nervs nach Applikation des Toxins kontinuierlich ab, bis sie schließlich nicht mehr messbar ist. Im Hemidiaphragma Assay (HDA) können die Kontraktionen des Zwerchfells isometrisch über einen kommerziell erhältlichen Dehnungsmessstreifen registriert und auf einen PC mittels ebenfalls kommerziell verfügbarer Software aufgezeichnet werden. Die Zeit, die zwischen der Applikation von Toxin in das Organbad und einer Halbierung der Kontraktionsamplitude verstreicht (hier Paralysezeit oder t 1/2 genannt), dient als Messgröße zur Charakterisierung der Wirksamkeit des Toxins. Die Paralysezeit korreliert streng mit der medianen letalen Dosis MHH Forschungsbericht

2 (MLD), die üblicherweise in Mäusen bestimmt wird. Es wird angestrebt, den Tierversuch durch den HDA zu ersetzen und zur Chargenfreigabe von Botulinus Neurotoxin als Wirkstoff zu verwenden, denn der Tierversuch ist für eine große Anzahl von Tieren sehr belastend. Der HDA soll als Methode der Wahl in das Europäische Arzneibuch aufgenommen werden. Zur Validierung wurde der HDA hinsichtlich Spezifität und Selektivität überprüft. Die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen wurden für den linearen Bereich bestimmt. Die Akzeptanzgrenzen für die Präzision wurden für die Parameter Vergleichbarkeit, Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit festgelegt. Mit Hilfe von spezifischen, gegen Botulinus Neurotoxin Serotyp A (BoNT/A) gerichteten Antikörper wurde die Richtigkeit geprüft. Weiterhin wurden für die Präparation des Zwerchfells und die Durchführung des Tests Standard Operation Procedures (SPO) verfaßt. Da der Test für die Zulassung von Arzneimitteln eingesetzt wird, wird nach good manufacturing praxis (GMP) gearbeitet. Abb. 1: Der intraluminare N- Terminus von Synaptotagmin I und II (Aminosäuren 1-52 bzw. 1-60) wird nach Exozytose in den synaptischen Spalt exponiert und bindet die Botulinus Neurotoxine B und G. Mit dem gleichen Versuchsaufbau können Titer von spezifischen, toxinneutralisierenden Antikörpern bestimmt werden, denn neutralisiertes Botulinus Neurotoxin trägt nicht mehr zur Paralyse des Muskels bei. Wird nur ein Teil des in der Lösung enthaltenden Toxins neutralisiert, verlängert sich die Paralysezeit. Anhand der Verlängerung kann die Höhe des Titers in Patientenseren errechnet werden (Dressler und Bigalke 2004). Zur Standardisierung beider Testverfahren stehen ein Toxin- und ein Antitoxinstandard vom National Institute of Biological Standardization and Control zur Verfügung. Mit Hilfe des HDA gelang es, den Proteinrezeptor für Botulinus Neurotoxin Serotyp G (BoNT/G) zu identifizieren (Rummel et al., 2004). Botulinus Neurotoxine sind zweikettige Proteine. Die größere der beiden Ketten bindet an einen nervenzellmembranständigen Rezeptor, und navigiert die kleinere Kette, die eine Protease darstellt, über mehrere Stufen in das Zytosol von Nervenendigungen, wo sich das Substrat des Toxins befindet. Wird das Substrat verdaut, versiegt die Transmitterfreisetzung und der vom Nerven versorgte Muskel paralysiert. Viele Hinweise existieren, dass Botulinus Neurotoxine über zwei unabhängige Rezeptoren aufgenommen werden. Eine Gruppe von Rezeptoren sind Polysialoganglioside, die in hohen Konzentrationen in der Plasmamembran von Nervenzellen vorkommen. Der 566 MHH Forschungsbericht 2004

3 zweite Rezeptor soll ein Protein darstellen, denn die Wirkung der Toxine kann durch Vorbehandlung von Nervenzellen mit Trypsin unterdrückt werden. Da die Aufnahme der Toxine in Nervenzellen von der Exozytose abhängig ist, lag der Verdacht nahe, dass ein möglicher Kandidat in der Membran der neurotransmitterhaltigen Vesikel enthalten ist, die während der Exozytose mit der Plasmamembran fusioniert. Weiterhin sollte sich der toxinbindende Teil des Rezeptors intraluminal befinden, denn nach Fusion der beiden Membranen zeigt die innere Schicht der Vesikelmembran in den synaptischen Spalt, wo sich das Toxin befindet. Kürzlich wurde gezeigt, dass Synaptotagmin Botulinus Neurotoxin Serotyp B (BoNT/B) bindet. Dieses Protein zeigt mit einem N-terminalen Fragment in das Lumen neurosekretorischer Vesikel (Abb. 1). Der größere C-terminale Teil ist in das Zytosol gerichtet und stellt einen Ca 2+ -Sensor dar. Bindet Ca 2+ an diesen Sensor, gibt Synaptotagmin den Weg für die Fusion der beiden Membranen frei. Synaptotagmin fungiert also als Ein/Aus-Schalter für die Transmitterfreisetzung. Im ersten Teil des Projektes wurde mittels GST-Pull-Down Experimenten gesucht, ob Synaptotagmin neben BoNT/B auch andere BoNT bindet. Eine Bindung konnte ausschließlich für die Serotypen B und G nachgewiesen werden. Mit Hilfe von rekombinant hergestellten Synaptotagmin-Fragmenten konnte ein kleines, intraluminales Fragment als Bindungsdomäne identifiziert werden. Dieses intraluminale Fragment wurde nun im zweiten Teil des Projekts mit BoNT/B, BoNT/G und BoNT/A vorinkubiert. Die Mischungen wurden anschließend zum HDA gegeben und die Paralysezeiten gemessen. Es zeigte sich, dass das Fragment die Aktivität von BoNT/B und BoNT/G unterdrückte, nicht aber die Aktivität von BoNT/A und somit die in vitro Daten eindruckvoll untermauerte. Synaptotagmin (Abb. 1) zeigt nur für wenige Millisekunden in den synaptischen Spalt, denn die Vesikelmembran wird sehr schnell wieder endozytiert. Eine Bindung einer für eine Vergiftung ausreichenden Menge Toxins ist in dieser kurzen Zeitspanne nicht möglich, denn trypsinierte Nervenzellen sind unempfindlich für die Toxine. Daher postulieren wir, dass die oben erwähnten Ganglioside Toxinmoleküle aus der die Nervenenden umspülenden Lösung herausfiltern und in großer Menge auf der Außenseite der Plasmamembran anreichern. Das in enger Nachbarschaft während der Exozytose auftauchende N-terminale Fragment von Synaptotagmin wird nun sehr effektiv vom Toxin belegt. Sozusagen als Trittbrettfahrer gelangt BoNT während der Endozytose in das Zellinnere. Phylogenetisch interessant ist, dass ausgerechnet der Freisetzungsschalter als Rezeptor fungiert. Projektleiter: Prof. Dr. H. Bigalke, SET, Industriemittel. Das Projekt wurde in enger Zusammenarbeit mit der Abteilung für Biochemie (Projektleiter Dr. Binz) durchgeführt. MHH Forschungsbericht

4 Weitere Forschungssprojekte Pro-inflammatorische Wirkung des Clostridium difficile-toxin A In diesem Projekt wird die Aktivierung pro-inflammatorischer Signalwege durch Toxin A von Clostridium difficile und ihre Bedeutung bei der Genese der antibiotika-assoziierten pseudomembranösen Colitis untersucht. Projektleiter: Dr. R. Gerhard, SFB 621, Projekt B5 C. botulinum C3-Exoenzyme als neurotropher Wachstumsfaktor Die bakterielle ADP-Ribosyltransferase C3 (23 kda, einkettig) von Clostridium botulinum zeigt unabhängig von ihrer Enzymaktivität eine neurotrophe Wirkung, die zu einem selektiven Axonwachstum von kultivierten Hippocampusneuronen führt. Der neuronale Rezeptor und die intrazellulären Signalwege werden charakterisiert und die Domäne des C3 Proteins identifiziert, die die neurotrophe Wirkung vermittelt. Projektleiter: PD Dr. F. Hofmann; Förderung: DFG Clostridium difficile-toxin B als zellbiologisches Werkzeug Die beiden Clostridium difficile-toxine A und B mono-glucosylieren spezifisch die Rho-Proteine, die positive Regulatoren des Aktinzytoskeletts darstellen. Die Glucosylierung der Rho- Proteine führt zu einer Funktionsveränderung, die im Detail untersucht wird. Projektleiter: Dr. H. Genth; Förderung: DFG Schwerpunkt SSP 1150 Massenspektrometrische Analyse der zellulären Toxinwirkungen Bakterielle Proteintoxine führen zu zellulären Veränderungen auf der Proteom-Ebene. Diese Veränderungen werden mittels MALDI-TOF-TOF und ESI-Ion-Trap analysiert. Projektleiter: PD Dr. A. Pich Originalpublikationen Kaiser, T., Wittke, S., Just, I., Krebs, R., Bartel, S., Fliser, D., Mischak, H., Weissinger, E.M. Capillary electrophoresis coupled to mass spectrometer for automated and robust polypeptide determination in body fluids for clinical use. Electrophoresis 2004; 25: Ahnert-Hilger, G., Höltje, M., Große, G., Pickert, G., Mucke, C., Nixdorf-Bergweiler; B., Boquet, P., Hofmann, F., and Just, I. Differential effects of Rho GTPases on axonal and dendritic development in hippocampal neurons. J. Neurochem. 2004; 90:9-18. Bade S, Rummel A, Reisinger C, Karnath T, Ahnert-Hilger G, Bigalke H, Binz T. Botulinum neurotoxin type D enables cytosolic delivery of enzymatically active cargo proteins to neurones via unfolded 568 MHH Forschungsbericht 2004

5 translocation intermediates. J Neurochem. 2004; 91: Dressler D, Bigalke H. Antibody-induced failure of botulinum toxin type B therapy in de novo patients. Eur Neurol. 2004; 52: Voller B, Moraru E, Auff E, Benesch M, Poewe W, Wissel J, Muller J, Entner T, Bigalke H, Schnider P. Ninhydrin sweat test: a simple method for detecting antibodies neutralizing BoNT/A Mov Disord. 2004; 19: Reisinger C, Yelamanchili SV, Hinz B, Mitter D, Becher A, Bigalke H, Ahnert-Hilger G The synaptophysin/synaptobrevin complex dissociates independently of neuroexocytosis. J Neurochem. 2004; 90: 1-8. Rummel A, Karnath T, Henke T, Bigalke H, Binz T. Synaptotagmins I and II act as nerve cell receptors for botulinum neurotoxin G. J Biol Chem. 2004; 279: Herrmann J, Geth K, Mall V, Bigalke H, Schulte Monting J, Linder M, Kirschner J, Berweck S, Korinthenberg R, Heinen F, Fietzek UM. Clinical impact of antibody formation to botulinum toxin A in children. Ann Neurol. 2004; 55: Wohlfarth K, Kampe K, Bigalke H. Pharmacokinetic properties of different formulations of botulinum neurotoxin type A. Mov Disord. 2004; 19: S65-7. Rummel A, Mahrhold S, Bigalke H, Binz T. The HCC-domain of botulinum neurotoxins A and B exhibits a singular ganglioside binding site displaying serotype specific carbohydrate interaction. Mol Microbiol. 2004; 51: Tammen, H., Mohring, T., Kellmann, M., Pich, A., Kreipe, H.H., Hess, R. Mass spectrometric phenotyping of Val34Leu polymorphism of blood coagulation factor XIII by differential peptide display. Clin. Chem. 2004; 50: Rauh, D., Graentzdoerffer, A., Granderath, K., Andreesen, J.R., Pich, A. Tungsten-containing aldehyde oxidoreductase of Eubacterium acidaminophilum. Eur. J. Biochem. 2004; 271: Makdessi, K., Fritsche, K., Pich, A., Andreesen, J.R. Identification and characterization of the cytoplasmic tungstate/molybdatebinding protein (Mop) from Eubacterium acidaminophilum. Arch. Microbiol. 2004; 181: Übersichtsarbeiten Aktories, K.; and I. Just. editors of Special issue on Emerging Bacterial Toxins in Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. Vol. 152; Just, I. and R. Gerhard.. Large clostridial cytotoxins. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 2004; 152: Buchbeiträge Bigalke, H., Just, I., Bakterielle Toxine. in Lehrbuch der Toxikologie (Marquardt und Schäfer Hrsg.) Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbh Stuttgart; 2004, pp Bigalke, H. Benecke, R. Anfallserkrankungen in Pharmakotherapie (Lemmer und Brune Hrsg.) Springer Verlag Heidelberg; 2004, pp MHH Forschungsbericht

6 Bigalke, H. Botulinus Neurotoxin: Spannendes aus toxikologischer und molekularbiologischer Sicht in Botulinus Neurotoxin Visionen und Realität (Erbguth und Naumann Hrsg.) Wissenschaftsverlag Wellingsbüttel Hamburg; 2004, pp Abstracts 2004 wurden 26 Abstracts publiziert. Habilitationen Dr. rer. nat. Andreas Pich: Thema: Untersuchungen von Enzymsystemen aus anaeroben Mikroorganismen mit Pyruvylgruppen, Selen, Wolfram und Eisen als katalytisch aktive Komponenten Promotionen Silke Burger (Dr. rer. nat.): Darstellung und Charakterisierung von rekombinantem Clostridium difficile Toxin A. Cornelia Frisch (Dr. med.): Charakterisierung der Rezeptorbindedomäne von Clostridium difficile Toxin A. Melanie Lange (Dr. med.): Etablierung eines in vitro Test zur quantitativen Bestimmung von anti-bont/b Antikörper Ulrich Pörtner (Dr. med.): Untersuchung zur Wirkung eines Hybridproteins auf die Mastzelldegranulation. 570 MHH Forschungsbericht 2004