Identifikation und Charakterisierung von porenbildenden Proteinen der inneren Chloroplastenmembran

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1 Identifikation und Charakterisierung von porenbildenden Proteinen der inneren Chloroplastenmembran von Dipl.-Biol. Tom Alexander Götze Dem Fachbereich Biologie/Chemie der Universität Osnabrück zur Verleihung des akademischen Grades Doktor der Naturwissenschaften vorgelegte Dissertation Osnabrück, im Mai 2009

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3 Inhalt Inhalt 1 EINLEITUNG Der Plastid Proteintranslokation über die Hüllmembranen des Chloroplasten Präprotein-Erkennung und Sortierung im Cytosol Der TOC-Komplex Der TIC-Komplex Regulation des Proteinimports am Tic-Komplex Alternative Importwege Die PRAT-Proteine des Plastiden Zielsetzung der Arbeit PRAT-C Tic MATERIAL UND METHODEN Material PRAT-C PRAT-C2.1, -C2.2 und -C2.1-ΔSam Tic N-terminal verkürztes Tic110 rek Tic110 nat Peptide: TrOE33 und pcoxiv Antikörper Biochemische Methoden Massenspektrometrie Probenvorbereitung Auftrennung der Peptide mittels HPLC und Massenspektrometrie Rekonstitution der Proteine Nycodenz-Flotation SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Extraktion nativer Proteinkomplexe Blaue-native-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) Bioinformatische Methoden Elektrophysiologische Methoden Bilayer-Technik Elektrischen Eigenschaften biologischer Membranen Aufbau der Messkammer Ag/AgCl-Elektroden Aufbau des Messstandes Herstellung des Bilayers Fusion von Proteoliposomen mit dem Bilayer Leitwert-Messung Der Leitwert ermittelt aus Schaltereignissen Der Gesamtleitwert Die Leitfähigkeit i

4 2.3.3 Berechnung der Porengröße ausgehend vom Leitwert Offenwahrscheinlichkeit Umkehrpotential und Selektivität Liquid Junction Potentiale Goldman-Hodgkin-Katz Gleichung Selektivität in Abhängigkeit der Elektrolyt-Konzentration Zugabe von Effektoren Redox-aktive Substanzen Auswertung der Daten ERGEBNISSE PRAT-C Strukturvorhersage anhand der Primärsequenz Massenspektrometrie und biochemische Untersuchungen Leitwert und Schaltverhalten Porengröße, Offenwahrscheinlichkeit und die Abhängigkeit des Leitwertes von Spannung und Konzentration Einfluss des spezifischen Antiköpers auf das Schaltverhalten Selektivität der PRAT-C2 Aktivität Einfluss der Peptide TrOE33 und pcoxiv Gegenüberstellung der Kanaleigenschaften unterschiedlicher Proben Tic Zusammenfassung der Ergebnisse vorangegangener molekularbiologischer und biochemischer Untersuchungen Erste elektrophysiologische Ergebnisse Kanaleigenschaften von Tic110 aus nativen Membranen Leitwert und Schaltverhalten Selektivität von Tic110 nat Einfluss von Mg 2+ und Ca 2+ auf Tic110 nat Einfluss von Cu 2+ und anderen Redox-aktiven Substanzen auf Tic Elektrophysiologische Eigenschaften der verkürzten Formen Tic110-ΔN und M2-Tic DISKUSSION PRAT-C Zur Proteinstruktur Funktionelle Domänen der PRAT-Proteine Oligomerisierung Porengröße Orientierung und Insertion von PRAT-C2 in die innere Hüllmembran Die Asymmetrie der untersuchten Kanaleigenschaften Gesamtstrom und Leitwertsättigung Rektifizierung, Schaltverhalten und Offenwahrscheinlichkeit Umkehrpotential und Selektivität Reaktionen auf Antikörper und Peptide Zur Identität des Kanals Schlussfolgerungen Tic Die Struktur von Tic Leitwert und Schaltverhalten Selektivität Einfluss der zweiwertigen Kationen Ca 2+ und Mg Redox-Regulation von Tic ii

5 Inhalt 5 ZUSAMMENFASSUNG PRAT-C Tic ANHANG... I Literaturverzeichnis... I Publikationen... XV Abbildungsverzeichnis... XVI Tabellenverzeichnis... XVII Abkürzungen... XVIII Proteinogene Aminosäuren... XIX Einheiten... XIX Erklärung... XX iii

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7 Einleitung 1 EINLEITUNG 1.1 Der Plastid Plastiden sind Organellen prokaryotischen Ursprungs in den Zellen von Pflanzen, Algen und einer Reihe eukaryotischer Einzeller. Es wird davon ausgegangen, dass vor ca Milliarden Jahren der Vorläufer heutiger Cyanobakterien von einer eukaryotischen Zelle endosymbiotisch aufgenommen und als permanenter Zellbestandteil an nachfolgende Generationen weitergereicht wurde (Mereschkowsky, 1905; Margulis, 1971; Dyall, 2004; Gould, 2008). Die unmittelbare Verwandtschaft aller Plastiden begründet sich auf der Vermutung, dass dieser Prozess ein singuläres evolutives Ereignis war (Palmer, 2000). Im Gegensatz zu den primären Plastiden der drei Algengruppen Glaucophyta, Rhodophyta und Chlorophyta, aus letzteren gingen letztendlich die Pflanzen hervor, unterscheidet man die sekundären bzw. komplexen Plastiden einer heterogenen Gruppe einzelliger Eukaryonten. Ein bekannter Vertreter dieser Organismen ist der Malariaerreger aus der Gattung Plasmodium. Ein wichtiger Vorteil, den die Aufnahme eines photosynthetisch aktiven Cyanobakteriums mit sich brachte, war die Befähigung zur autotrophen Lebensweise. Aber auch der Zugang zu Stoffwechselwegen, die bis dahin ausschließlich prokaryotischen Zellen vorbehalten waren, brachte dem Eukaryonten einige Vorteile. In den Plastiden moderner Landpflanzen finden viele essentielle, metabolische Prozesse statt, die den Primär- und Sekundärstoffwechsel betreffen. Allem voran steht die Fixierung atmosphärischen Kohlendioxids und die Bildung von Kohlenhydraten mit Hilfe der Photosynthese. Außerdem sind Plastiden Ort der Fettsäure- und Lipidsynthese, der Nitrit- und Sulfat- Reduktion und des Aufbaus vieler Aminosäuren, Nucleotide, Chromophoren sowie einer großen Anzahl sekundärer Metabolite. Der allgemeine Aufbau eines Plastiden zeichnet sich durch 6 unterschiedliche Kompartimente aus. Die beiden begrenzenden Hüllmembranen (engl. outer und inner envelope), die jeweils der Plasma- bzw. Außenmembran des ehemaligen Prokaryonten entsprechen, werden vom Intermembranraum getrennt. Das Stroma im Inneren des Organells beherbergt ein komplexes internes Membransystem die Thylakoide. Die Thylakoidmembran enthält unter anderem die Chromophoren und Proteinkomplexe der Photosynthese und umschließt wiederum das letzte Kompartiment, das Thylakoidlumen. 1

8 Alle Plastiden entwickeln sich aus sogenannten Proplastiden in embryonalen oder meristematischen Zellen, die eine relativ unspezifische Struktur mit wenigen internen Membranen vorweisen. An die Funktion des jeweiligen Gewebes angepasst können sie sich im Dunkeln zunächst zu Etioplasten differenzieren, deren Prolamellarkörper sich bei Lichteinstrahlung schnell zum Thylakoidmembransytem des Chloroplasten entwickelt. Chromoplasten werden vornehmlich in reifen Früchten, Blüten und im herbstlichen Laub (Gerontoplasten) vorgefunden. Die Leukoplasten im Speichergewebe dienen der Einlagerung von Stärke (Amyloplasten), Lipiden (Elaioplasten) oder Proteinen (Proteinoplasten). Eine spezialisierte Form der Amyloplasten (Statolithen) gilt als Sensor des Gravitropismus insbesondere beim Wurzelwachstum (Morita, 2004). Je nach Umweltbedingung sind viele Formen der Plastiden durch Umdifferenzierung ineinander überführbar (Lopez-Juez, 2005). Ein maßgeblicher Schritt zur Integration des ehemaligen Endosymbionten in die eukaryotische Zelle war ein massiver Gentransfer aus dem Organell in den Kern. Das gemeinsame Schicksal erforderte eine weitgehend zentrale Steuerung insbesondere auf der Ebene der Genexpression, um z.b. wechselnden Umwelteinflüssen mit aufeinander abgestimmten Reaktionen zu begegnen oder die Anzahl der sich weiterhin selbstständig teilenden Plastiden innerhalb der Zelle zu regulieren (Timmis, 2004). Die Synthese plastidärer Proteine an cytosolischen Ribosomen gewann jedoch erst an Bedeutung, nachdem sich eine geeignete Maschinerie zum Import von Proteinen in den Hüllmembranen des Plastiden entwickelt hatte. Da der Endosymbiont ursprünglich nur über Mechanismen zum Proteinexport verfügte, bedurfte es der Kombination und Modifikation verschiedener prokaryotischer und eukaryotischer Komponenten, um ein Translokationssystem hervorzubringen (Vothknecht, 2005; Reumann, 2005). Daraufhin setzte eine starke Reduktion des plastidären Genoms ein, so dass von den ca verschiedenen Proteinen eines funktionellen Chloroplasten (Leister, 2003; Kleffmann, 2004; Stengel, 2007) über 90 % im Zellkern codiert sind. Das Genom des Plastiden umfasst heute nur noch 120 bis 160 Kilobasenpaare (kbp). Es codiert hauptsächlich für sehr hydrophobe Proteine der photosynthetischen Komplexe, für einige Komponenten des Proteinsyntheseapparates und für die große Untereinheit der Ribulose-1,5-bisphosphat- Carboxylase/-Oxygenase (Rubisco), insgesamt zwischen 50 und 150 Proteine (Lopez-Juez, 2005). Ein Grund für den Verbleib eines autonomen Genoms könnte die starke Hydrophobizität und daher komplizierte Translokation und Assemblierung einiger dieser Proteine sein (Dyall, 2004). Eine alternative Erklärung wäre die Möglichkeit zur schnellen 2

9 Einleitung Regulation der plastidären Expression abgestimmt auf den Redox-Zustand des Organells bei wechselnden Lichtbedingungen, um der Bedrohung durch Überoxidation zu entgegnen (Allen, 2003). 1.2 Proteintranslokation über die Hüllmembranen des Chloroplasten Kernkodierte plastidäre Proteine werden im Cytosol an freien Ribosomen meist als Vorstufe mit einer N-terminalen Transitsequenz synthetisiert. Die Information dieser Aminosäuresequenz ist notwendig und ausreichend, um eine korrekte Translokation der Präproteine in den Plastiden zu gewährleisten. Der Proteinimportprozess wird durch das koordinierte Zusammenspiel zweier Multiproteinkomplexe in der äußeren und inneren Hüllmembran ermöglicht. In Anlehnung an ihre Funktion und Lokalisation werden diese als TOC- (Translokon at the Outer envelope membrane of Chloroplasts) und TIC-Komplex (Translokon at the Inner envelope membrane of Chloroplasts) bezeichnet, während die einzelnen Proteinkomponenten durch Hinzufügen des Molekulargewichts (in kda) voneinander unterschieden werden (Schnell, 1997). Angetrieben durch die Hydrolyse von Guanosintriphosphat (GTP) und Adenosintriphosphat (ATP) gelangt das Präprotein ins Stroma des Plastiden, wo es nach Abspaltung des Transitpeptids entweder in die native Konformation überführt wird oder mittels einer zusätzlichen Zielsequenz innerhalb des Organells z.b. zur Thylakoidmembran weitergeleitet wird Präprotein-Erkennung und Sortierung im Cytosol Nach der Synthese erreichen plastidäre Präproteine in Assoziation mit cytosolischen Chaperonen die Oberfläche des Organells, binden dort an Rezeptorkomponenten des Translokationsapparates und werden posttranslational importiert. Da viele Präproteine der Mitochondrien und des Endoplasmatischen Retikulums ebenfalls eine N-terminale Zielsequenz tragen, ist eine spezifische Erkennung der plastidären Präproteine notwendig, um fehlerhaftes targeting und damit einhergehende cytotoxische Effekte zu vermeiden. Es ist jedoch bisher nicht eindeutig geklärt, wie diese Spezifität zustande kommt. Darüber hinaus wird auch von zweifach, also mitochondrial und plastidär, lokalisierten Proteinen berichtet (Chew, 2004; Murcha, 2007). Die Transitpetide der plastidären Präproteine haben eine sehr unterschiedliche Länge ( Aminosäuren) und weisen keine konservierten Motive innerhalb der Primärsequenz auf 3

10 (Bruce, 2001). Allenfalls eine gewisse Häufigkeit hydroxylierter Aminosäuren und ein Mangel an sauren Resten verleiht ihnen meist eine positive Gesamtladung. Im Gegensatz zu mitochondrialen Signalpeptiden wurde bisher auch keine einheitliche Sekundärstruktur in wässriger Lösung festgestellt (Krimm, 1999; Wienk, 2000). Unter Umständen ist die räumliche Nähe zu Galactolipiden der Plastidoberfläche für eine Sekundärstruktur der Transitpeptide von Bedeutung (Bruce, 1998; Chen, 1998). Die Bindung von molekularen Chaperonen aus der Hsp70-Familie (heat shock protein, 70 kda) an das Präprotein wurde mehrfach nachgewiesen (Ivey, 2000; Rial, 2000; Zhang, 2002). Die Chaperone ermöglichen die Aufrechterhaltung einer entfalteten Konformation als Voraussetzung für die Translokation durch die Toc- und Tic-Maschinerie. Es wurde außerdem postuliert, dass die Phosphorylierung des Transitpetids eine zusätzliche Assoziation mit Proteinen zum sogenannten guidance complex zur Folge hat, wodurch die Importeffizienz erhöht wird. Möglicherweise trägt diese Bindung auch zur Unterscheidung mitochondrialer und plastidärer Präproteine bei (Waegemann, 1996; May, 2000; Qbadou, 2006), wenn auch die Relevanz der Phosphorylierung in diesem Kontext noch diskutiert wird (Nakrieko, 2004). Der guidance complex wird direkt vom primären Toc-Rezeptor Toc34 erkannt. Andere Präproteine, die keine Bindestelle zu Proteinen aufweisen, interagieren mit einem cytosolischen Hsp90 Chaperon. Es wurde vorgeschlagen, dass ein solcher Präproteinkomplex Toc64 als erste Kontaktstelle an der Plastidoberfläche nutzt (Qbadou, 2006). Andere Studien auf der Basis von Knock-out Mutationen in Arabidopsis thaliana stellen die Funktion von Toc64 als Importrezeptor wiederum in Frage (Aronsson, 2007) Der TOC-Komplex Der Kernkomplex des Translokationsapparates der Außenmembran besteht aus den drei Untereinheiten Toc75, Toc159 und Toc34 und hat eine molekulare Masse zwischen 500 und 1000 kda (Schleiff, 2003c; Kikuchi, 2006; Chen, 2007). Auf der Grundlage von elektronenmikroskopischen Untersuchungen wurde eine Stöchiometrie von 1 : 4 : 4-5 (Toc159 : Toc75 : Toc34) vorgeschlagen (Schleiff, 2003c). Die beiden Rezeptorkomponenten Toc34 und Toc159 besitzen einen membranständigen C- Terminus (M-Domäne) und eine homologe Domäne mit GTPase-Funktion (G-Domäne), über die sie sich zu einem Dimer zusammenlagern können. Toc159 enthält N-terminal 4

11 Einleitung zusätzlich einen Bereich mit sauren Aminosäuren (A-Domäne), dessen negative Ladungen für eine Wechselwirkung mit dem positiv geladenen Transitpeptid in Frage kommen. Als Mechanismus zur Erkennung von Präproteinen werden zwei verschiedene Modelle vorgeschlagen. Nach dem sogenannten targeting-modell bindet eine lösliche Form von Toc159 das Präprotein bereits im Cytosol, geleitet dieses zum Translokon und übergibt seine Fracht an Toc34 (Hiltbrunner, 2001; Bauer, 2002; Smith, 2004). Die Existenz einer löslichen Form von Toc159 in vivo wird jedoch bezweifelt (Becker, 2004b). Nach dem motor-modell stellt Toc34 den primären Rezeptor für das Präprotein dar und leitet es an Toc159 weiter. Dieses treibt das Präprotein durch die von Toc75 gebildete Pore, indem es mehrere GTP-Hydrolyse-Zyklen und damit verbundene Konformationsänderungen durchläuft (Sveshnikova, 2000; Schleiff, 2003b; Schleiff, 2003c; Becker, 2004b). Die Bindung des Präproteins aktiviert die GTPase-Funktion der Rezeptoren, deren Affinität zum Präprotein nach Hydrolyse wieder abnimmt. Die Interaktion mit dem Präprotein kann durch Phosphorylierung der Rezeptoren inhibiert werden (Sveshnikova, 2000; Kessler, 2006). Die im Genom von A. thaliana identifizierten Isoformen der beiden Toc-Rezeptoren (Toc159: attoc159/132/120/90; Toc34: attoc34/33) ermöglichen die Zusammensetzung verschiedener Komplexe mit unterschiedlichen Substratspezifitäten. Einige Ergebnisse deuten daraufhin, dass auf diese Weise eine Konkurrenz von gering exprimierten Haushaltsproteinen und hoch exprimierten photosynthetischen Proteinen um die Bindung am Translokon vermieden wird (Jarvis, 1998; Bauer, 2000; Kubis, 2004). Toc75 gehört zur Omp85-Superfamilie, deren prokaryotische Vorläufer ursprünglich für den Proteinexport und die Membraninsertion verantwortlich waren. Es bildet eine β-fass- Struktur mit 18 antiparallelen β-faltblättern in der äußeren Membran (Schleiff, 2003a). Elektrophysiologisch zeigt die Pore eine ausgeprägte Selektivität für Kationen und einen Hauptleitwert von 1.3 ns in 1 M KCl. Die Sensitivität gegenüber Transitpeptiden, der ermittelte Porenradius von 2-3 nm (Clark, 1997; Hinnah, 2002) und die Existenz einer POTRA-Domäne (polypeptide transport associated) (Sanchez-Pulido, 2003; Gentle, 2005) verweisen auf die Funktion als Proteintranslokase. Toc75 besitzt als einziges Außenmembranprotein ein ungewöhnlich großes, zweiteiliges Transitpeptid (Tranel, 1995; Tranel, 1996). Während der N-terminale Teil ein typisches Signal für den Import durch die Toc- und Tic-Maschinerie darstellt, enthält der C-terminale Teil hydrophobe Aminosäuren und eine stop-transfer-sequenz, welche zur Insertion in die Außenmembran benötigt werden könnte (Eckart, 2002; Gentle, 2005). 5

12 Toc12 ist eine weitere membrangebundene Komponente des Toc-Komplexes mit einer zum Intermembranraum exponierten J-Domäne. Durch die Rekrutierung von Hsp70 und Tic22 sowie in Assoziation mit Toc64 entsteht im Intermembranraum ein Komplex, der das ankommende Präprotein vom Toc- auf das Tic-Translokon überträgt (Becker, 2004a; Qbadou, 2007). Abhängig vom Redox-Zustand der Zelle bildet Toc12 unter oxidierenden Bedingungen eine intramolekulare Disulfidbrücke, woraufhin die Übergabe des Präproteins auf den Tic-Komplex unterbunden wird. Abbildung 1.1: Das Toc- und Tic-Translokon Toc/Tic: Translocon at the Outer/Inner envelope membrane of Chloroplasts; TP: Transitpeptid; Hsp: Heat Shock Protein; CaM: Calmodulin; FNR: Ferredoxin-NAD(P)-Oxidoreduktase; SPP: Stromal Processing Peptidase; Cpn: Chaperonin; TPR: Tetratricopeptide Repeat; Sti: Sti-like domain (Stress-induced); P: Phosphorylierungsstelle; st: stromal; im: Intermembranraum Der TIC-Komplex Derzeit werden 8 unterschiedliche Komponenten zum Tic-Komplex gezählt, die für den größten Teil der Proteintranslokation über die innere Hüllmembran verantwortlich sind. Tic22 stellt den ersten Kontaktpunkt zum Präprotein her und ist als lösliches Protein im Intermembranraum peripher an die innere Membran assoziiert. Die Entdeckung von Toc- Tic-Superkomplexen führte zu der Annahme einer simultanen Translokation des 6

13 Einleitung Präproteins über beide Membranen. Tic22 ist Teil des Komplexes im Intermembranraum, über den die Translokationsapparate in Verbindung stehen (Nielsen, 1997; Kouranov, 1998). Zur Bildung der Translokationspore werden mehrere Komponenten in Betracht gezogen. Für Tic20 spricht eine vorhergesagte Sekundärstruktur von 4 transmembranen α-helices mit Ähnlichkeiten zu den Kanälen der mitochondrialen Tim-Komplexe (translocase of the inner mitochondrial membrane) und einer gewissen Homologie zu bakteriellen Aminosäuretransportern (Reumann, 1999). Die chemische Quervernetzung von Präproteinen mit Komponenten der Importmaschinerie offenbart eine direkte Interaktion mit Tic20 (Kouranov, 1997; Kouranov, 1998). Außerdem zeigen Pflanzen, deren Expression von Tic20 durch antisense RNA reduziert ist, phänotypische Defekte des Proteinimports auf der Ebene der Innenmembran (Chen, 2002). Die Deletion von Tic20 im photosynthetisch inaktiven, sekundären Plastiden eines eukaryotischen Parasiten ist letal, was eine zentrale Funktion unterstreicht (van Dooren, 2008). Dennoch konnte bisher keine Kanalaktivität des rekombinant exprimierten Proteins nach Rekonstitution im planaren Bilayer nachgewiesen werden. Ebenso wie Tic20 ist auch Tic21 ein integrales Membranprotein mit 4 α-helices, das in der inneren Hüllmembran nachgewiesen wurde. Tic21 Null-Mutanten von A. thaliana zeigen einen ähnlichen Phänotyp, gekennzeichnet durch chlorotische Blätter und eine Akkumulation nicht-prozessierter Präproteine. Aufgrund einer differenziellen Expression wurde vorgeschlagen, dass Tic20 und Tic21 abhängig vom Entwicklungszustand der Pflanze überlappende Funktionen erfüllen (Teng, 2006). Im Gegensatz dazu wurde das Protein in einer anderen Studie mit dem Transport von Eisenionen in Verbindung gebracht und daher als PIC1 (permease in chloroplasts 1) bezeichnet (Duy, 2007). Ein mit Sicherheit zentraler Bestandteil des Tic-Translokons ist Tic110. Die homozygote Deletion ist embryoletal (Kovacheva, 2005) aber auch heterozygote knock-out Mutationen oder Deletionen von Teilen des Proteins zeigen deutliche Defekte des Proteinimports (Inaba, 2005). Während die Existenz von zwei vorhergesagten transmembranen α-helices im N-Terminus weitgehend akzeptiert ist (Kessler, 1996), war die Topologie des angrenzenden C-terminalen Bereichs lange Zeit umstritten. Einem Modell zufolge wird davon ausgegangen, dass der größte Teil des Proteins zum Stroma hin exponiert ist, um dort als eine Art Gerüst zwischen Präproteinen und stromalen Chaperonen zu vermitteln (Jackson, 1998; Inaba, 2003; Inaba, 2005). Diese lösliche Domäne besitzt Bindestellen für das Präprotein, Hsp93 sowie Cpn60, auf deren Funktion später eingegangen wird. Eine 7

14 Funktion als zentrale Pore wird in diesem Modell aufgrund der geringen Hydrophobizität dieses Bereiches nicht in Betracht gezogen. Im Gegensatz dazu konnte in elektrophysiologischen Experimenten eine Kanalaktivität für rekombinant exprimiertes Tic110 und eine um die beiden N-terminalen α-helices verkürzte Mutante nachgewiesen werden (Heins, 2002). Der Kanal reagierte spezifisch und sensitiv auf die Zugabe eines gereinigten, plastidären Transitpeptids. Mehrere Kanaleigenschaften wie Leitwert und Ionenselektivität entsprachen zudem einer Aktivität, die in isolierten, nativen Vesikeln der inneren Hüllmembran gefunden wurde. Bestärkt durch die elektrophysiologischen Ergebnisse und aufgrund der Häufigkeit und Relevanz des Proteins in der inneren Hüllmembran, wurde Tic110 als Kandidat für die Translokationspore vorgeschlagen. Die dafür notwendigen transmembranen Domänen liegen demnach innerhalb des C-Terminus. Sekundärstrukturanalysen sagen einen hohen α-helikalen Anteil in diesem Bereich mit mindestens zwei amphipatischen Helices voraus (Inaba, 2003). Der Motor des Tic-Translokons setzt sich vermutlich aus Tic110, Tic40 und einem stromalen Chaperon (Hsp93 bzw. ClpC) zusammen. Tic40 ist über eine N-terminale α- Helix in der Membran verankert. Die Interaktion mit Tic110 erfolgt über eine zentrale TPR-Domäne (tetratricopeptide repeat), insbesondere dann, wenn Tic110 ein Präprotein gebunden hat (Inaba, 2003). Durch die Wechselwirkung mit Tic40 wird die Affinität von Tic110 zum Präprotein herabgesetzt, so dass dieses von Hsp93 im Stroma entgegen genommen werden kann. Das Chaperon bindet an eine C-terminale Domäne von Tic40 (Sti-like domain), woraufhin die ATPase-Aktivität von Hsp93 stimuliert wird (Kovacheva, 2005; Chou, 2006; Kovacheva, 2007; Bedard, 2007). Das wiederholte Binden und Ablösen des Präproteins vom Motorkomplex führt letztendlich zu einer unidirektionalen Bewegung ins Stroma und kann mit dem Mechanismus einer molekularen Ratsche beschrieben werden. Neuere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Tic40 auch an der Insertion einiger Membranproteine in die inneren Hüllmembran beteiligt ist (postimport mechanism (Chiu, 2008)). Im Stroma wird das Transitpeptid vom Präprotein durch die stromal processing peptidase (SPP) abgetrennt (Richter, 2003; Zhong, 2003; Rudhe, 2004) und von der presequence protease (PreP) weiter degradiert (Johnson, 2006). Das reife Protein faltet sich daraufhin entweder im Stroma mit Unterstützung von Chaperonen wie Hsp70 und Cpn60, einem Homolog des bakteriellen Chaperonins GroEL (Kessler, 1996; Jackson-Constan, 2001; Ishikawa, 2003), oder es wird weiter zu plastidären Subkompartimenten wie z.b. der Thylakoidmembran geleitet (Schünemann, 2007; Aldridge, 2009). 8

15 Einleitung Regulation des Proteinimports am Tic-Komplex Viele Ergebnisse der letzten Jahre deuten darauf hin, dass der Proteinimport des Chloroplasten einer strengen Kontrolle unterworfen ist. Es ist naheliegend, dass der Import an die metabolischen Bedürfnissen angepasst sein sollte, die je nach Umweltbedingung (z.b. Licht oder Dunkelheit) variieren. Während sich die Befunde zum Toc-Translokon auf die Rezeptoren Toc159, Toc34 und Toc12 konzentrieren (Sveshnikova, 2000; Becker, 2004a; Kessler, 2006), kommen auf der Ebene der inneren Hüllmembran insbesondere die drei Tic-Komponenten Tic62, Tic32 und Tic55 als Ansatzpunkte einer Regulation in Frage. Dabei spielt der Redox-Zustand des Chloroplasten eine tragende Rolle. Beispielsweise konnte der differenzielle Import mehrerer plastidärer Präproteine in Abhängigkeit vom Licht nachgewiesen werden (Hirohashi, 2001). Außerdem wurde die Möglichkeit einer Calcium/Calmodulin-vermittelten Kontrolle demonstriert (Chigri, 2005; Chigri, 2006). Tic62 ist Mitglied der erweiterten Familie der short-chain Dehydrogenasen/Reduktasen (SDRs) und gilt als putativer Redox-Sensor mit einer Bindestelle für NADP am evolutiv konservierten N-Terminus, dessen Dehydrogenase-Aktivität in vitro bereits nachgewiesen wurde (Stengel, 2008). Die Interaktion von Tic62 mit dem Tic-Komplex ist sehr dynamisch (Kuchler, 2002; Hörmann, 2004; Chigri, 2006; Balsera, 2007; Stengel, 2008). Unter oxidierenden Bedingungen bindet es an Tic110 und ist zusätzlich über einen hydrophoben Bereich im N-Terminus mit der Membran assoziiert. Wenn reduzierende Bedingungen vorherrschen, löst sich Tic62 von der Membran und liegt zunehmend als lösliches Protein im Stroma vor. Über Prolin- und Serin-reiche Abschnitte im C-Terminus interagiert Tic62 dann vermehrt mit der Ferredoxin-NADP-Oxidoreduktase (FNR), welche am Ende der photosynthetischen Elektronentransportkette steht und Elektronen von Ferredoxin auf NADP überträgt. Eine weitere, essentielle und regulatorische Komponente des Tic-Translokons ist Tic32. Als Mitglied der konservierten Familie der short-chain Dehydrogenasen/Reduktasen (SDRs) besitzt es eine NADP-Bindestelle am N-Terminus, deren Dehydrogenaseaktivität spezifisch für NADPH und abhängig von der Lipidumgebung ist (Chigri, 2006). In Analogie zu Tic62 ist die Interaktion von Tic32 mit dem Translokon vom Redox-Zustand des Chloroplasten abhängig (Hörmann, 2004; Chigri, 2006). Die Bindung zu Tic110 wird bei einem hohen NADPH/NADP-Verhältnis, also reduzierenden Bedingungen, annähernd aufgehoben. 9

16 Tic32 ist darüber hinaus Ansatzpunkt eines weiteren regulatorischen Signals. Der C-Terminus im Stroma weist eine Bindestelle für Calmodulin (CaM) auf, die jedoch nur in Anwesenheit von Calciumionen (Ca 2+ ) besetzt wird (Chigri, 2005; Chigri, 2006). Im Ca 2+ /CaM-gebundenen Zustand ist Tic32 mit Tic110 assoziiert. Es konnte gezeigt werden, dass der Proteinimport Ca 2+ -abhängig ist und Calmodulin-Inhibitoren sowie Calcium- Ionophoren den Import von cytosolischen Präproteinen mit N-terminalem Transitpeptid beeinflussen. Die Vorstufe von Tic32 besitzt selber keine abspaltbare Präsequenz und dessen Importweg ist bisher ungeklärt (Nada, 2004). Während das Calcium-Signal außerhalb des Chloroplasten z.b. als Folge äußerer Umweltreize generiert wird, entspricht das Redox-Potential im Stroma einem Plastid-internen Signal. Beide Regulationsmechanismen scheinen sich gegenseitig zu beeinflussen, da die Interaktion zwischen Calmodulin und Tic32 durch Zugabe von NADPH abgeschwächt wird. Somit könnte Tic32 die beiden Signale integrieren, indem es frei oder gebunden an Tic110 vorliegt und auf diese Weise die Effektivität oder Spezifität des Translokons modifiziert (Chigri, 2006). Bereits vor einigen Jahren wurde Tic55 als Bestandteil des Tic-Komplexes nachgewiesen. Für diese Komponente werden zwei transmembrane Domänen vorhergesagt, wobei der größte Teil des Proteins zum Stroma exponiert ist. Es enthält eine mononukleare Eisenbindestelle und ein Rieske-Eisen-Schwefel-Zentrum (2 Fe-2 S), das für Proteine von Elektronen-Transportketten charakteristisch ist. DEPC (Diethylpyrocarbonat) ein Inhibitor des Elektronentransports über Rieske-Eisen-Schwefel-Zentren unterbricht auch den plastidären Proteinimport der inneren Hüllmembran (Caliebe, 1997). Neuere Ergebnisse identifizieren Tic55 außerdem als Interaktionspartner stromaler Thioredoxine mit einem entsprechenden Cystein-Motiv (CXXC-Motiv) (Bartsch, 2008). Das stromale Ferredoxin-Thioredoxin-System verbindet den Elektronentransport der photosynthetischen Lichtreaktion mit der Aktivität vieler Enzyme des Chloroplasten durch Reduktion regulatorischer Disulfidbrücken (Buchanan, 2005). Die Ferredoxin-Thioredoxin- Reduktase (FTR) überträgt Elektronen auf Thioredoxine, eine Familie kleiner, löslicher Proteine im Stroma (Thioredoxin f, m, x und y) mit einem konservierten Motiv als Redoxaktives Reaktionszentrum (WC[G/P]PC). Das reduzierte Thioredoxin überträgt seinerseits Elektronen auf entsprechende Zielproteine, welche daraufhin ihre katalytische Aktivität verändern. Obwohl Thioredoxine ursprünglich im Zusammenhang mit der Regulation des Calvin-Zyklus entdeckt wurden, sind sie im Laufe der Zeit in fast allen Organismen als Redox-Regulatoren identifiziert worden. 10

17 Einleitung Trotz der Hinweise auf eine dynamische Assemblierung des Tic-Translokons und der identifizierten Redox-aktiven Gruppen der drei beschriebenen Tic-Komponenten, bleibt bisher ungeklärt, wie sich die Signale funktionell auf den Proteinimport übertragen. Die Existenz einer putativen Elektronentransportkette am Tic-Translokon konnte bisher nicht experimentell nachgewiesen werden. Auch ist noch nicht geklärt, wie das cytosolische Calcium/Calmodulin Signal das Stroma erreicht. 1.3 Alternative Importwege Einige cytosolisch synthetisierte Präproteine gelangen nicht über den zuvor beschriebenen, klassischen Importweg (Toc- und Tic-Translokon) in den Plastiden, sondern werden auf andere Weise importiert. Die Vielfalt alternativer Mechanismen und die Anzahl der beteiligten Komponenten ist bisher noch nicht abzuschätzen, allerdings weisen einige Befunde auf verschiedene Möglichkeiten hin. Die meisten Proteine der äußeren Hüllmembran (z.b. Toc-Rezeptoren und outer envelope Proteine (OEPs)) werden ohne abspaltbares Transitpeptid synthetisiert und besitzen vermutlich interne Zielsequenzen. Zum Insertionsmechanismus von OEP14 und Toc64 gibt es deshalb verschiedene Modellvorstellungen. Einerseits wird eine spontane Insertion vorgeschlagen, die ohne Unterstützung eines Proteins oder einer Energiequelle in Form von GTP oder ATP auskommt. Eine wichtige Rolle für den plastid-spezifischen Import wird bestimmten Ladungen in der Nähe einer Transmembrandomäne sowie der besonderen Lipidzusammensetzung der Membran (Galactolipide) zugesprochen (Schleiff, 2001; Lee, 2001). Andere Studien bestreiten die physiologische Relevanz einer spontanen Insertion (Tu, 2000; Tu, 2004; Hofmann, 2005). Weiterhin wurde gezeigt, dass für den Import von Tic32 keine Toc-Komponenten notwendig sind und dass bereits geringe ATP-Konzentrationen (20 µm) ausreichen. Die ersten 10 Aminosäuren des N-Terminus tragen essentielle Targeting-Informationen, wobei es sich jedoch nicht um ein typisches Transitpeptid handelt, dass nach der Translokation abgespalten wird (Nada, 2004). Insbesondere der verminderte Energiebedarf deutet darauf hin, dass keine stromalen Chaperone beteiligt sind. Auch wenn der Mechanismus bisher ungeklärt ist, wäre es denkbar, dass Tic32 mit Hilfe von Tic22 im Intermembranraum direkt in die innere Hüllmembran inseriert. 11

18 Ein weiteres Beispiel für alternative Importprozesse stellen Glykoproteine dar. Deren Vorstufen tragen im Allgemeinen eine N-terminale Signalsequenz, die für den Sec- Komplex-vermittelten Weg ins Endoplasmatische Retikulum (ER) spezifisch ist. Sie werden im ER-Lumen glykosyliert und anschließend zur Plasmamembran transportiert. In einer Reihe von Studien wurden Proteine im plastidären Stroma nachgewiesen, deren Vorstufen ebenfalls eine Sec-spezifische Signalsequenz tragen und zumindest Teile des sekretorischen Pfades beschreiten. Detaillierte Untersuchungen zur Carboanhydrase 1 aus A. thaliana (CAH1) (Villarejo, 2005) und zur Nucleotid Pyrophosphatase- Phosphodiesterase 1 (NPP1) (Nanjo, 2006) lassen vermuten, dass die Proteine durch Fusion von Vesikeln des Endomembran-Systems und der äußeren Hüllmembran des Chloroplasten in den Intermembranraum gelangen. Auf welchem Weg sie das Stroma erreichen, ist jedoch unklar. Es werden drei unterschiedliche Möglichkeiten in Betracht gezogen (Radhamony, 2006): Entweder wird das Protein über den Tic-Komplex transportiert oder es verlässt den Intermembranraum durch Vesikelabschnürung der inneren Hüllmembran. Es wäre allerdings auch die Existenz eines unbekannten Translokons denkbar. Die dafür notwendigen Komponenten konnten bisher nicht identifiziert werden, jedoch gibt es eine Reihe putativer Kanalproteine in der inneren Hüllmembran mit unbekannter Funktion (siehe Abschnitt 1.4). 1.4 Die PRAT-Proteine des Plastiden Die sogenannten PRAT-Proteine (Preprotein and Amino acid Transporter) bilden eine Familie von Membranproteinen, die sich durch Sequenzhomologie und eine ähnliche Topologie bestehend aus 4 transmembranen Helices auszeichnen. Der Name leitet sich von der Funktion einiger Vertreter dieser Familie ab. Beispielsweise wurden die Kanal- Proteine der Importkomplexe in der inneren Hüllmembran von Mitochondrien Tim22, Tim23 und Tim17 (Translocase of the Inner Mitochondrial membrane) bereits detailliert untersucht (Truscott, 2001; Kovermann, 2002; Rehling, 2003; Meinecke, 2006; Neupert, 2007). Die Kanalaktivität von Tim17 konnte bisher jedoch nicht eindeutig nachgewiesen werden. Ein weiteres Mitglied dieser Proteinfamilie ist OEP16, das sich im Gegensatz zu den Tim-Proteinen in der äußeren Hüllmembran von Chloroplasten befindet und dort einen Aminosäure-selektiven Kanal bildet (Pohlmeyer, 1997; Linke, 2000; Steinkamp, 2000b; Linke, 2004). Darüber hinaus wurde OEP16 mit dem Import der Protochlorophyllid- Oxidoreduktase A (PorA) in Verbindung gebracht (Reinbothe, 2004a; Reinbothe, 2004b). 12

19 Einleitung Die PRAT-Proteine zeigen eine auffällige Sequenzähnlichkeit zu Vertretern prokaryotischer Aminosäure-Permeasen (Rassow, 1999). LivH in der Plasmamembran von Escherichia coli ist beispielsweise für die Aufnahme von verzweigten Aminosäuren verantwortlich. In Pflanzen ist die Anzahl der Mitglieder dieser Proteinfamilie stark erhöht. Während im Genom der Hefe Saccharomyces cerevisiae jeweils nur ein Gen für Tim17, Tim22 und Tim23 kodiert ist, werden in A. thaliana 17 und in Oriza sativa 24 Gene dieser Proteinfamilie gefunden (Murcha, 2007). Vermutlich war ursprünglich Genduplikation dafür verantwortlich, jedoch weisen unterschiedliche Expressionsprofile und erhebliche Variationen der Primärsequenz mit Proteinlängen zwischen 133 und 261 Aminosäuren auf eine funktionelle Spezialisierung hin. Die Abbildung 1.2 zeigt das Ergebnis einer phylogenetischen Analyse der PRAT-Familie in A. thaliana unter Einbindung der Tim- Proteine aus Hefe (S. cerevisiae) und OEP16 der Erbse (Pisum sativum). Abbildung 1.2: Phylogenetische Analyse der PRAT-Familie in A. thaliana Stammbaum der 17 PRAT-Proteine von A. thaliana mit Beteiligung von Tim17, Tim22 und Tim23 aus der Hefe S. cerevisiae sowie OEP16 aus P. sativum, erstellt nach dem neighbor-joining-algorithmus. Die Abbildung wurde in Anlehnung an (Murcha, 2007) erstellt und modifiziert; (C)/(M): chloroplastidäre/mitochondriale Lokalisation; *: nach (Murcha, 2003; Murcha, 2007) nicht an Proteintranslokationsprozessen beteiligt. Die Genorte wurden auf der Basis von Sequenzähnlichkeit und subzellulärer Lokalisation der Proteine den bekannten Mitgliedern der Familie zugeordnet. Dabei fällt auf, dass das Genom von A. thaliana jeweils zwei bis drei Isoformen für Tim17, Tim22 und Tim23 sowie OEP16 aufweist. Außerdem finden sich PRAT-Proteine ohne zugewiesene Funktion. 13

20 Zu diesen zählen die Proteine der Genorte At4g26670/At5g55510 (PRAT-C1.1/1.2) und At3g49560/At5g24650 (PRAT-C2.1/2.2). Bioinformatische und experimentelle Ergebnisse zur subzellulären Lokalisation (in vitro und in vivo) identifizierten PRAT-C1.1, 1.2 und 2.1 als chloroplastidäre Proteine (Ferro, 2003; Froehlich, 2003; Murcha, 2007). Für PRAT- C2.2 ist eine duale Lokalisation in Mitochondrien und Chloroplasten möglich. Durch Auftrennung der verschiedenen Kompartimente von Chloroplasten aus P. sativum wurden PRAT-C2.1 und 2.2 als integrale Bestandteile der inneren Hüllmembran identifiziert. Eine homozygote knock-out-mutation, hervorgerufen durch T-DNA-Insertion, jeweils eines der vier PRAT-Gene zeigte keinen offensichtlichen Phänotyp der betroffenen Pflanzen. Erst die kombinierte Deletion von PRAT-C2.1 und 2.2 führte zu einem stark verminderten Wachstum und einem chlorotischen Phänotyp. Die Chloroplasten waren im Vergleich zum Wildtyp kleiner und zeigten ein unterentwickeltes Thylakoid-Membransystem. Bei vergleichbaren Mutationen von PRAT-C1 trat kein ungewöhnlicher Phänotyp auf. Diese Beobachtungen lassen den Schluss zu, dass die beiden PRAT-C2 Proteine eine essentielle wenn auch überlappende Funktion erfüllen, die mit der Biogenese des Chloroplasten im direkten Zusammenhang steht. 14

21 Einleitung 1.5 Zielsetzung der Arbeit PRAT-C2 Vor dem Hintergrund, dass die gleichzeitige Deletion der Proteine PRAT-C2.1 und 2.2 zu erheblichen Entwicklungsstörungen des Chloroplasten und der gesamten Pflanze führt, stellt sich die Frage, welche Aufgabe die beiden integralen Membranproteine in der inneren Hüllmembran des Plastiden übernehmen. Die nahe Verwandtschaft zu den bereits charakterisierten Proteintranslokasen Tim22 und Tim23 lässt eine Funktion im Proteinimport vermuten. Um zu testen, ob die beiden PRAT-C2 Proteine in der Lage sind Poren zu bilden und gegebenenfalls Hinweise auf Substrate zu erhalten, wird versucht die rekombinant exprimierten Proteine funktionell zurückzufalten und im planaren Bilayer- System zu vermessen Tic110 In Folge der Ergebnisse molekularbiologischer und biochemischer Arbeiten aus der Arbeitsgruppe von Prof. Soll in München (siehe Abschnitt 3.2.1) fokussiert sich die elektrophysiologische Fragestellung zu Tic110 hauptsächlich auf zwei Gesichtspunkte: Der Vergleich von N-terminal unterschiedlich stark verkürzten Varianten von Tic110 mit dem Wildtyp soll Aufschluss darüber geben, welcher Anteil des Proteins für eine Kanalaktivität notwendig ist. Aus vorangegangenen, elektrophysiologischen Ergebnissen konnte gefolgert werden, dass die beiden vorhergesagten Transmembranhelices im N- Terminus nicht direkt an der Porenbildung beteiligt sind (Heins, 2002). Das darauf aufbauende Modell von (Balsera, 2009) vereinigt viele, scheinbar gegensätzliche Befunde zur Topologie und Struktur des angrenzenden, C-terminalen Bereichs. Funktionelle Einzelkanalmessungen des nativen Tic110 und der N-terminal trunkierten Varianten bieten die Möglichkeit, einige Aspekte dieses Modells zu verifizieren. Desweiteren steht die Frage im Mittelpunkt, ob und in wie weit sich der Redox-Zustand des Kanals auf die Poreneigenschaften auswirkt. Es wurde eine Regulation des Proteinimports vorgeschlagen, die durch das chloroplastidäre Thioredoxin-System vermittelt wird (Balsera, 2009). Sofern dieser Mechanismus einen direkten Einfluss auf die Kanalaktivität ausübt, kann der Effekt durch Zugabe geeigneter Oxidations- und Reduktionsmittel mit der planaren Bilayertechnik charakterisiert werden. 15

22 16

23 Material und Methoden 2 MATERIAL UND METHODEN 2.1 Material PRAT-C PRAT-C2.1, -C2.2 und -C2.1-ΔSam Die Expression der in dieser Arbeit untersuchten PRAT-C2 Proteine fand heterolog in Escherichia coli Zellen des Stammes BL21(DE3) statt und wurde von Dr. Manuela Baumgartner und Sabrina Kraus aus der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Jürgen Soll in München durchgeführt. Die ursprünglichen Sequenzen (PRAT-C2.1: At3g49560 und PRAT-C2.2: At5g24650) stammen aus dem Genom von Arabidopsis thaliana. Das pflanzliche Gen wurde über die Restriktionsschnittstellen Nco1 und Sal1 in das Plasmid ppro ExHT kloniert, so dass das rekombinant exprimierte Protein über einen um 25 Aminosäuren erweiterten N-Terminus verfügt. Die darin enthaltene Hexa-Histidinsequenz ermöglichte die Aufreinigung über Metall-Affinitätschromatographie (Ni-NTA Superflow, Qiagen) aus isolierten inclusion bodies. Beide Proteine lagen denaturiert in 8 M Urea, 100 mm NaCl, 2 mm ß-Mercaptoethanol, 20 mm Tris/HCl, ph 8.0 vor und hatten eine Konzentration von 0.5 mg/ml (PRAT-C2.1) bzw. 0.6 mg/ml (PRAT-C2.2). Außerdem wurde eine C-terminal um 80 Aminosäuren verkürzte Variante von PRAT-C2.1 verwendet, die analog exprimiert und aufgereinigt wurde. Dem Protein (PRAT-C2.1-ΔSam) fehlt die sogenannte Sam-Domäne und es lag in Konzentrationen von mg/ml vor Tic N-terminal verkürztes Tic110 rek. Nach der heterologen Expression des N-terminal verkürzten Tic110 (Aminosäuren der Sequenz aus Pisum sativum) in E. coli BL21(DE3) Zellen wurde das Protein aus inclusion bodies durch Metall-Affinitäts-Chromatographie (= IMAC; Ni-NTA Superflow, Qiagen) und Gelfiltration sowie über eine Strep-Tactin-Matrix aufgereinigt. Die elektrophoretische Trennung im SDS-Gel ergab drei unterschiedlich lange Teilfragmente des Proteins, die im folgenden Tic110-ΔN, M2- und M3-Tic110 genannt werden und jeweils ein Molekulargewicht von 99, 60 und 20 kda aufwiesen. Alle drei Fragmente waren 17

24 wasserlöslich und konnten durch Gelfiltration voneinander isoliert werden. Letztendlich lagen die Proben in 150 mm NaCl, 1 mm EDTA, 2.5 mm Desthiobiotin, 100 mm Tris/HCl ph 8 vor und hatten eine Proteinkonzentration von ca. 0.5 mg/ml. Alternativ wurden die Proben nach IMAC direkt auf ein SDS-Gel aufgetragen und korrespondierende Banden ausgeschnitten. Das Protein wurde danach entweder elektroeluiert oder in Anwesenheit von 80 mm Mega9 in Lösung gebracht. Die Arbeiten wurden hauptsächlich von Dr. Bettina Bölter, Dr. Mónica Balsera und Erika Kovács- Bogdán aus der Arbeitsgruppe von Prof. Soll in München durchgeführt. Weitere Informationen zur Aufreinigung finden sich in (Balsera, 2009) Tic110 nat. Das native Protein Tic110 nat. stammt aus Chloroplasten von Tage alten Erbsenpflanzen (Pisum sativum). Die Fraktion der inneren Chloroplastenhüllmembran wurde zunächst angereichert wie in (Waegemann, 1995) beschrieben. Nach Auftrennung der Proteine mittels SDS-PAGE wurde die Bande des nativen Tic110 aus dem Gel ausgeschnitten und in Anwesenheit von 80 mm Mega9 eluiert. Das Protein lag in 25 mm Tris, 192 mm Glycin, 0.1 % SDS und 80 mm Mega9 vor Peptide: TrOE33 und pcoxiv Das Peptid TrOE33 entspricht der zweiteiligen, N-terminalen Transitsequenz der 33 kda- Untereinheit des Sauerstoff-produzierenden Komplexes in der Thylakoidmembran (Abbildung 2.1). Von den insgesamt 81 Aminosäuren stellen die ersten 43 das Signal für den Import ins Stroma dar (blau unterstrichen), während der C-terminale Bereich für die Translokation ins Thylakoidlumen verantwortlich ist (rot unterstrichen). Das Peptid wurde heterolog in E. coli exprimiert und aus inclusion bodies mittels IMAC von Philipp Benz aus der Arbeitsgruppe Soll in München aufgereinigt. Die Stammlösung hatte eine Konzentration von ca. 2.4 mg/ml und wurde vor der Verwendung 10-fach mit 20 mm KCl, 10 mm Mops/Tris ph 7 verdünnt. Das Peptid pcoxiv (25 Aminosäuren) wurde in Anlehnung an die N-terminale Signalsequenz der mitochondrialen Cytochromoxidase Untereinheit IV synthetisiert. Dieses kernkodierte Membranprotein ist Bestandteil der Atmungskette und wird posttranslational 18

25 Material und Methoden über beide Mitochondrien-Membranen in die Matrix transportiert. pcoxiv stellt ein Substrat für den Tim23-Komplex dar. Das Peptid trägt ca. 5 positive Ladungen (bei ph 7) und hat ein Molekulargewicht von 3 kda. Als Sekundärstruktur wird angenommen, dass es eine amphiphile α-helix ausbildet, die typisch für die Struktur N-terminaler Signalsequenzen von mitochondrialen Präproteinen ist. Die Stammlösung lag in 20 mm Hepes/KOH ph 7 vor und hatte eine Konzentration 5 mg/ml. Eingesetzt wurde es in einer 20-fachen Verdünnung mit 20 mm KCl, 10 mm Mops/Tris ph 7. Das Peptid wurde in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Richard Zimmermann in Homburg synthetisiert und freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Abbildung 2.1: Sequenz der verwendeten Peptide TrOE33 und pcoxiv Rot markierte Aminosäuren sind bei ph 7 positiv, blau markierte negativ geladen, hydroxylierte Aminosäuren sind unterstrichen. Die farbigen Linien zeigen die Signalsequenzen für den Import ins Stroma (blau) und ins Thylakoidlumen (rot) an Antikörper Die im elektrophysiologischen Experiment eingesetzten Antikörperseren wurde im Vorfeld gereinigt, um auf diese Weise zu vermeiden, dass andere Serumbestandteile außer den Immunglobulinen (IgG) einen Effekt auf die Kanalaktivität ausüben. Diese Arbeiten wurden von Dr. Manuela Baumgartner aus der Arbeitsgruppe Soll in München durchgeführt.dazu wurden das Prä-Immunserum und das Antikörperserum gegen PRAT- C2.1 rek. (175. Tag nach Impfung) über eine Protein-A-Agarose-Säule gereinigt, an der Immunglobuline spezifisch binden. Nach dem Waschen der Säule mit Phosphatpuffer (20 mm, ph 7), wurden die Antikörper mit 100 mm Glycin/HCl ph 3 eluiert. Daraufhin wurde der ph-wert des Eluates mit 1 M Tris/HCl ph 8 im Verhältnis 1:10 neutralisiert. Die Lösung wurde mit Hilfe einer weiteren Säule (PD-10, GE-Healthcare) entsalzt und in 20 mm Na + -Phosphatpuffer ph 7 aufgenommen. Die Proteinkonzentration betrug 1.9 mg/ml für das PRAT-C2.1 rek. Antikörperserum und 1.6 mg/ml für das Prä-Immunserum (ermittelt nach (Bradford, 1976)). 19

26 2.2 Biochemische Methoden Massenspektrometrie Probenvorbereitung Ausgangsmaterial der massenspektrometrischen Untersuchungen waren die rekombinanten PRAT-C2 Proben nach Aufreinigung mittels immobilisierter Metall-Affinitäts- Chromatographie (IMAC). Das Protein befand sich im Elutionspuffer (8 M Urea, 100 mm NaCl, 2 mm β-mercaptoethanol, 60 mm Imidazol, 20 mm Tris/HCl, ph 8) und wurde zunächst durch saure Fällung präzipitiert. Der Ansatz wurde mit Trichloressigsäure (10 %) im Überschuss (10-faches Volumen) versetzt und anschließend für 60 Minuten auf Eis gelagert. Nach Zentrifugation des gefällten Proteins (22000 g, 4 C, 15 Minuten) und mehrfachen Waschschritten mit kaltem Aceton (-20 C), wurde der ph-wert neutralisiert und das Proteinpellet im Vakuum getrocknet. Die Fragmentierung in einzelne Peptide wurde durch Trypsin (Endkonzentration 0.05 g/l) bewirkt. Das Protein wurde für diesen Schritt in 2 mm CaCl, 100 mm Tris/HCl ph 8.5, 20 % Acetonitril aufgenommen. Außerdem wurde dem Ansatz eine definierte Menge eines Testproteins (Carboanhydrase 2, aus Bos taurus) zugefügt, um einen Hinweis über das quantitative Auflösungsvermögen der Massenspektrometrie zu erhalten. Die Trypsinisierung fand für 17 Stunden bei 37 C statt. Für die nachfolgenden chromatographischen Verfahren wurden Rückstände sedimentiert und der Acetonitrilgehalt durch Verdampfen auf 10 % verringert Auftrennung der Peptide mittels HPLC und Massenspektrometrie Vor der eigentlichen massenspektrometrischen Analyse wurden die Peptide mit Hilfe der Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (reversed phase-hplc, Agilent 1100) entsprechend ihrer Hydrophobizität aufgetrennt. Als stationäre Phase diente eine C8-Säule (Durchmesser: 1 mm, Länge: 15 cm), während die Polarität der mobilen Phase variiert wurde. Die Gradiententrennung wurde durch ansteigende Konzentrationen Acetonitril (0-100 %) mit einer Flussrate von 50 µl/min über einen Zeitraum von 25 Minuten erreicht. Ein vorgeschalteter Probeninjektor (Gilson G215) automatisierte dabei den Durchsatz größerer Probenanzahlen. Für die endgültige Analyse stand ein Massenspektrometer der Firma Bruker (Esquire HCT) zur Verfügung. Das Gerät ist mit einer Elektrospray-Ionisations-Einheit (ESI) ausgerüstet, 20

27 Material und Methoden in der die Peptide ionisiert und in die Gasphase übertragen werden. Nach der Passage einer Kapillare und zweier Oktopole findet die Massenbestimmung der Peptide in einer Ionenfalle statt (MS-Spektren). Durch das Verfahren des Collision Induced Decay (CID) ist es desweiteren möglich die Peptide durch Beschuss mit Helium Atomen in einzelne Aminosäuren zu fragmentieren und auf diese Weise zu sequenzieren (MS/MS-Spektren). Ausgewertet wurden die Spektren mit der Software Biotools 3.1 (von Bruker Daltonics), die auf die Mascot -Datenbank ( zurückgreift. Der verwendete Algorithmus zur Signifikanz der Ergebnisse wird in (Perkins, 1999) dargestellt und die Parameter der Eingabemaske waren wie folgt: Massentoleranzwert der MS-Daten: 0.5 %; Toleranz der MS/MS-Daten: 0.5 Da; Ladungszustand: 2+ und Rekonstitution der Proteine Prinzipiell ist das Ziel einer Rekonstitution, rekombinant exprimierte oder native Membranproteine funktionell in die Membran von Lipidvesikeln zurückzufalten. Zu Begin liegt das Protein entweder denaturiert in Harnstoff oder solubilisiert in einer Detergenslösung vor. Protein und Vesikel werden in einem ersten Schritt für einige Zeit zusammen mit Detergens inkubiert, so dass Mischmizellen, die alle drei Komponenten enthalten, entstehen. Durch das sukzessive Entfernen des Detergens aus dem Ansatz, lagern sich Protein und Lipid in der Art zusammen, dass sich Proteoliposomen bilden. In einigen Fällen sind die Membranen der Proteoliposomen multilamellar und somit für die elektrophysiologische Vermessung im Bilayer schlecht geeignet. Die Behandlung mit Ultraschall oder das Extrudieren der Probe durch ein feinmaschiges Sieb stellen eine Möglichkeit dar, um unilamellare Vesikel mit einer definierten Größenverteilung zu erhalten. Bei dem für die Proteoliposomen verwendeten Lipid handelte es sich um reines L-α- Phosphatidylcholin (PC, >98 % (w/w)) aus Ei (Larodan Fine Chemicals; Schweden) oder Soja (Lipoid; Deutschland). Die typische Fettsäure-Zusammensetzung war wie folgt: Linolsäure (59-70 % der Gesamtfettsäuren), Palmitinsäure (12-17 %), Ölsäure (11-15 %), Linolensäure (3-7 %) und Stearinsäure (2-5 %); (Angaben nach Lipoid). Zur Herstellung von Vesikeln wurde das Lösungsmittel der Lipid-Stammlösung (50 mg/ml; in Methanol/Chloroform, 1:1 (v/v)) zunächst für Minuten im Vakuum verdampft und das getrocknete Lipid in 100 mm NaCl, 10 mm Mops/Tris ph 7 aufgenommen, so dass die 21

28 Konzentration 20 mg/ml betrug. Gegebenenfalls wurde der Ansatz für einige Sekunden im Wasserbad beschallt, so dass eine homogen getrübte Lösung vorlag. Diese Liposomen- Emulsion wurde mit den Detergentien Mega9 (Endkonzentration: 80 mm) oder SDS (Endkonzentration: %) und der Proteinlösung versetzt und für zwei Stunden zur Entstehung von Mischmizellen bei Raumtemperatur gelagert. Das Verhältnis Protein zu Lipid lag in der Regel bei 1:40 bis 1:400 (w/w). Um das Detergens im Anschluss daran wieder zu entfernen, wurden zwei unterschiedliche Methoden angewandt. Detergentien mit einer hohen kritischen Mizellenkonzentration (CMC) wie Mega9 (CMC: mm) wurden gegen 5 l 100 mm NaCl, 10 mm Mops/Tris ph 7 über einen Zeitraum von mindestens 14 Stunden bei Raumtemperatur dialysiert. Die verwendeten Dialyseschläuche (Spectra/Por 3, Ausschlussgröße 3500 Da; Spectrum Laboratories) wurden zuvor zweimal für 10 Minuten in 2 % Natriumhydrogencarbonat, 1 mm EDTA bei 90 C eingeweicht, um mehrwertige Kationen zu entfernen, deren oxidative Wirkung zu einer Aggregation von Protein führen kann (Chang, 1980). Vor der Verwendung wurden die Schläuche mit Dialysepuffer gespült. Die Porengröße der Dialysemembran verhindert die Dialysierbarkeit von Mizellen und Mischmizellen, sofern deren Gesamtmasse, gegeben durch das Molekulargewicht und die Aggregationszahl der beteiligten Moleküle, groß genug ist. Den Dialyseschlauch können daher nur einzelne Moleküle (<3.5 kda) verlassen. Aus diesem Grund eignet sich die Dialyse nicht zur Entfernung von Detergentien mit einer niedrigen CMC, da der notwendige Zeitaufwand durch eine geringe Konzentration monomerer Moleküle erheblich zunimmt. Abbildung 2.2: Ablauf einer Rekonstitution 22

29 Material und Methoden Das Detergens SDS (CMC: 7-10 mm) wurde deshalb mit Hilfe eines hydrophoben Granulats (5-10 % (v/v) Calbiosorb, Calbiochem) aus dem Rekonstitutionsansatz entfernt. Durch die Porosität des Materials ergibt sich eine sehr große Oberfläche, an der Detergentien und zum gewissen Anteil auch Lipide und Proteine durch hydrophobe Wechselwirkungen adsorbiert werden. Nachdem das Granulat jeweils nach 1, 3 und 8 Stunden gewechselt wurde, war die Detergenskonzentration soweit reduziert, dass eine trübe Emulsion von Proteoliposomen entstanden war. Der Grad der Trübung war von vielerlei Parametern abhängig wie z.b. der Art des Detergens oder der eingesetzten Protein-, Lipid- und Granulatmenge. Eine Übersicht der Zusammenhänge gibt (Rigaud, 1998). Tabelle 2.1: Bedingungen der Rekonstitution Detergens CMC [mm] eingesetzt [mm] entspr. der CMC entfernt durch Mega x Dialyse SDS x Calbiosorb Protein:Lipid [w/w] Endkonzentration Lipid Protein [mg/ml] [mg/ml] 1: ca CMC: critical micellar concentration Nycodenz-Flotation Um den Erfolg der Rekonstitution zu überprüfen, wurde eine Dichtgradienten- Zentrifugation der Proben durchgeführt. Dafür wurde in einem Zentrifugenröhrchen (Beckmann, Polyallomer Centrifuge Tubes, 13x51 mm) eine diskontinuierliche Überschichtung verschieden konzentrierter Nycodenz-Lösungen (je 0.8 ml: 2, 5, 10, 20, 40 % (w/v) Nycodenz, in 100 mm NaCl, 10 mm Mops/Tris, ph 7) hergestellt, wobei sich am Boden des Röhrchens 100 µl der zu untersuchenden Probe befand (Abbildung 2.3). Durch Zentrifugation ( g, 1 h, 20 C) flotierten die Bestandteile der Probe nach oben und sammelten sich entsprechend ihrer Dichte auf einer bestimmten Höhe. Anschließend wurde der Inhalt des Röhrchens vorsichtig in 5-10 horizontale Fraktionen getrennt. Leere Liposomen waren meist als trübe Grenzschicht im Bereich zwischen 2 und 5 % Nycodenz zu erkennen, während Proteoliposomen in den Fraktionen 5-10 % detektiert wurden. Aggregiertes Protein, das nicht in die Membran zurückgefaltet werden konnte, verblieb in den Fraktionen hoher Dichte (10-20 % Nycodenz). Nycodenz (Axis-Shield, Schweden) ist ein Derivat der Triiodbenzoesäure (Iohexol, MW: 821 g/mol) und hat gegenüber Sucrose den Vorteil weniger osmotisch aktiv zu sein, so dass die 23

30 Proteoliposomen, hervorgerufen durch den Stoffgradienten über der Membran, nicht kollabieren. Zur Analyse des Proteingehalts wurden die einzelnen Fraktionen durch Zugabe des 1-2 fachen Volumens von Trichloressigsäure (TCA, 10 %) gefällt, zentrifugiert und mehreren Waschschritten mit kaltem Aceton (-20 C) unterzogen, um letztendlich für die Auftrennung in einem SDS-Polyacrylamidgel vorbereitet zu werden. Abbildung 2.3: Nycodenz-Dichtegradientenzentrifugation A) Diskontinuierlicher Gradient und schematische Verteilung der Probenbestandteile vor und nach der Zentrifugation; rek.: rekonstituiert B) Dichte von Nycodenz- im Vergleich zu Sucroselösungen (in 10 mm Mops/Tris ph 7) SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Mit Hilfe der SDS-PAGE (Sodium Dodecylsulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese) lassen sich Proteine unter denaturierenden Bedingungen im elektrischen Feld nach ihrer molekularen Größe auftrennen. Die intrinsische Ladung der Proteine spielt dabei eine zu vernachlässigende Rolle, da das negativ geladene Detergens Dodecylsulfat sich an das Protein anlagert, es denaturiert und ihm eine negative Gesamtladung verleiht, die im Verhältnis zur Größe des Proteins steht. Nach Anfärben des Gels mit dem Farbstoff Coomassie Brillantblau R250 (Serva) erscheinen die Proteinfraktionen als blaue Banden. Die SDS-Gele wurden im Mini-Gel-System hergestellt (Sigma). Das Puffersystem entsprach den Angaben von (Laemmli, 1970) und ist in Tabelle 2.2 zusammengefasst. Zur verbesserten Fokussierung durchliefen die Proteine zunächst ein 4 % Sammelgel bei 100V und wurden nachfolgend im 12 % Polyacrylamidgel bei 150V aufgetrennt. 24

31 Material und Methoden Tabelle 2.2: Puffersystem der SDS-PAGE Lösung Inhalt Puffer SDS ph Probenpuffer 2 % (v/v) β-mercaptoethanol 62.5 mm Tris/HCl 2 % (w/v) % (w/v) Bromphenolblau 18 % (v/v) Glycerin Elektrodenpuffer 25 mm Tris 0.1 % (w/v) 192 mm Glycin Trenngelpuffer 1.5 M Tris/HCl 8.8 Sammelgelpuffer 0.5 M Tris/HCl 6.8 Acrylamid:Bisacrylamid 12 % (w/v); 37.5 : Extraktion nativer Proteinkomplexe Zur Untersuchung der nativen Komplexstruktur wurden Vesikel der inneren Hüllmembran von Chloroplasten aus Pisum sativum verwendet. Die Proteoliposomen wurden nach einem Protokoll von (Keegstra K., 1986; Waegemann, 1991) aufgereinigt und freundlicherweise von der Arbeitsgruppe von Prof. Soll aus München zur Verfügung gestellt. Die Wahl des geeigneten Detergens und dessen optimale Konzentration sind von entscheidender Bedeutung für die unversehrte Extraktion von Proteinkomplexen aus biologischen Membranen. Außerdem kommt erschwerend hinzu, dass die beiden Parameter für unterschiedliche Komplexe derselben Membran sehr variabel sein können. Demnach kann sich je nach eingesetztem Detergens ein anderes Bandenmuster ergeben (vgl. Abbildung 3.2). Alle Arbeitsschritte müssen zum Schutz der nativen Struktur bei niedrigen Temperaturen (4 C) durchgeführt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Digitonin und Dodecylmaltosid (DDM) in Konzentrationen zwischen 0.5 und 3 % als Detergentien verwendet. Digitonin (Calbiochem; high purity) ist ein nicht-ionisches Detergens aus der Stoffklasse der Steroid-Glycoside und hat eine kritische Mizellenkonzentration (CMC) von <0.5 mm (<0.06 %). Die Stammlösung (10 % (w/v)) wurde vor jeder Extraktion in Solubilisierungspuffer (Tabelle 2.3) erneut angesetzt. Dazu wurde es für 15 Minuten bei 100 C geschüttelt und anschließend auf Eis gekühlt. Da kommerziell erhältliches Digitonin % anderer Bestandteile enthält, wurde nur der Überstand nach Zentrifugation ( g, 20 C, 3 Minuten) verwendet. Dodecyl-β-D-maltosid (Biomol; Hamburg) ist ebenfalls ein nicht-ionisches Detergens mit einer CMC zwischen 0.1 und 0.6 mm ( %). Die Stammlösung wurde in Solubilisierungspuffer angesetzt und hatte eine Konzentration von 10 % (w/v). 25

32 Um die Proteinkomplexe aus der Membran der Vesikel zu extrahieren, wurde der Ansatz bis zur gewünschten Endkonzentration mit Detergens versetzt, für Minuten auf Eis gelagert und im Anschluss zentrifugiert ( g, 4 C, 20 Minuten). Solubilisierte Proteine befanden sich im Überstand und wurden nach Zugabe von Probenpuffer (Tabelle 2.3) auf das Gel aufgetragen Blaue-native-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) Die blaue, native Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist eine Methode, die es ermöglicht, Proteinkomplexe nativ und ihrem molekularen Gewicht entsprechend elektrophoretisch aufzutrennen (Schägger, 1991; Schägger, 1994; Kugler, 1997). Die dafür notwendige Ladungsverschiebung wird durch die Anlagerung des negativ geladenen Farbstoffs Coomassie Brillantblau G250 (Serva) erreicht. Es wurden vorgefertigte Gele mit einem kontinuierlichen Polyacrylamid-Gradienten verwendet (Serva, Native-PAGE 4-16 %, BT 1.0). Das Puffersystem ist in Tabelle 2.3 zusammengefasst. Zum Schutz der Komplexe wurde die Elektrophorese bei 4 C und einer konstanten Stromstärke von 15 ma durchgeführt. Nach einem Drittel des Gesamtlaufs wurde der dunkle Kathodenpuffer gegen einen hellen ausgetauscht, so dass sich am Ende der Elektrophorese Proteinbanden vom Hintergrund abhoben. Zur Größenbestimmung diente ein Proteinstandard, der speziell den Ansprüchen der nativen Elektrophorese entspricht (HMW Calibration Kit, GE-Healthcare). Tabelle 2.3: Puffersystem der BN-PAGE Lösung x-fach Inhalt ph Solubilisierungspuffer mm NaCl 4 mm Aminocapronsäure mm Imidazol/HCl 2 mm EDTA Kathodenpuffer mm Tricine 0.02 % Coomassie G (dunkel) 37.5 mm Imidazol Kathodenpuffer mm Tricine % Coomassie G (hell) 37.5 mm Imidazol Anodenpuffer mm Imidazol/HCl 7 Probenpuffer 5 50 % Glycerol 50 % Solubilisierungspuffer 0.5 % Coomassie G250 7 ph-wert bei 4 C eingestellt 26

33 Material und Methoden Bioinformatische Methoden Mit Hilfe bioinformatischer Algorithmen wurde versucht diejenigen Sequenzabschnitte, die eine transmembrane Domäne bilden, vorherzusagen, um auf diese Weise ein Topologiemodell der untersuchten PRAT-C2 Proteine zu erstellen. Es wurde eine Reihe unterschiedlicher Programme verwendet, die sich dadurch auszeichneten, dass der jeweilige Algorithmus unter Berücksichtigung bekannter Proteinstrukturen mit Hilfe von Markov- Modellen (HMM: Hidden Markov Model) trainiert wurde und teilweise evolutionäre Informationen mit einbezog (Elofsson, 2007). Insgesamt waren die Übereinstimmungen der 5 verwendeten Programmen sehr groß (HMMTOP, PRODIV_TMHMM, S_TMHMM, PRO_TMHMM, top_mod und Poly-phobius (Tusnady, 1998; Tusnady, 2001b; Viklund, 2004; Kall, 2005; Viklund, 2006)). Die Projektion der als membranständig vorhergesagten Bereiche entlang der Helixachse wurde mit dem Programm EMBOSS-Pepwheel von Alan Bleasby (European Bioinformatics Institute, Cambridge, England) erstellt und nachträglich modifiziert. Dabei wurden die Aminosäuren entsprechend der Hydrophobizität nach der Skala von (Kyte, 1982) eingefärbt (von rot: hydrophob; bis blau: hydrophil). Die N-terminale Aminosäure der α-helix liegt bei dieser Art der Darstellung an der oberen Position des Rades und die Sequenz setzt sich durch Linien verbunden im Uhrzeigersinn fort. Bei einem Winkel von 100 pro Aminosäure und damit 3.6 Aminosäuren pro Umdrehung deckt sich die Position der 18. Aminosäuren mit der ersten. Die ermittelten Sequenzen waren teilweise länger, so dass die Positionen in einigen Fällen doppelt besetzt sind. 27

34 2.3 Elektrophysiologische Methoden Bilayer-Technik Die Bilayer-Technik ist eine elektrophysiologische Methode, die es ermöglicht die elektrischen Eigenschaften von biologischen Membranen bzw. der darin enthaltenen Ionenkanäle zu untersuchen (Abbildung 2.4A). Eine planare Lipiddoppelschicht (Bilayer) trennt zwei elektrolytgefüllte Halbkammern. Bringt man in den Bilayer ein membranständiges Kanalprotein ein, so stellt die Pore des Kanals die maßgebliche, elektrische Verbindung zwischen den Halbkammern her. Über zwei Elektroden, die jeweils in eine der elektrolytgefüllten Halbkammern ragen, kann eine elektrische Spannung über der Membran angelegt werden (Voltage-Clamp). Im Fall eines geöffneten Kanalproteins ist es möglich, den resultierenden Ionenstrom zu messen. Stromänderungen, hervorgerufen durch Konformationsänderungen des Proteins (Öffnen oder Schließen) als auch Wechselwirkungen durch hinzugefügte Effektormoleküle, können beobachtet und quantifiziert werden. Ein Vorteil gegenüber der Patch-Clamp-Technik ist die Möglichkeit, die Elektrolytbedingungen auf beiden Seiten der Membran frei zu bestimmen und während einer laufenden Messreihe zu variieren. Abbildung 2.4: Die Bilayer Technik A) Schematischer Aufbau der Messkammer; zwei elektrolytgefüllte Halbkammern sind durch den Bilayer voneinander getrennt. Das Kanalprotein stellt die eigentliche elektrische Verbindung zwischen den Halbkammern her. Die Elektrode der cis-kammer ist geerdet, während die der trans-kammer an den Messverstärker angeschlossen ist, der seinerseits wiederum geerdet ist. Die Steuerung der Parameter und Aufzeichnung der Daten findet über einem PC statt. B) Ersatzschaltbild der Messanordnung; C M und R M : Kapazität und Widerstand der Membran; R EL : Widerstand der Elektroden, U: Spannungsquelle; I: Amperemeter; U und A im Messverstärker integriert 28

35 Material und Methoden Elektrischen Eigenschaften biologischer Membranen Die elektrischen Eigenschaften des Bilayers können durch die Parallelschaltung eines Widerstandes (R M ) und eines Kondensators (C M ) beschrieben werden (Abbildung 2.4B). Dabei entspricht der hydrophobe Querschnitt der Membran dem Dielektrikum und die angrenzende Elektrolytlösung den Platten des Kondensators. Ein in die Membran integriertes Kanalprotein verhält sich in erster Näherung wie ein Ohmscher Widerstand. Ein weiterer von den Elektroden ausgehender Widerstand (R El ) wird in einem Ersatzschaltbild hingegen seriell abgebildet und ist im Vergleich zum Kanalwiderstand zu vernachlässigen. Die spezifische Kapazität von biologischen Membranen (spez. C M ), gegeben durch den Querschnitt und die Dielektrizitätskonstante der Membran, ist relativ konstant und liegt bei ca. 1 µf/cm 2. Der Widerstand des Kanals wird im Allgemeinen reziprok als Leitwert (G) angegeben Aufbau der Messkammer Die Messkammer besteht aus zwei zylindrischen Halbkammern aus PTFE (Polytetrafluorethylen; Teflon) mit einem Volumen von 4-5 ml (Abbildung 2.5). Das Volumen des eingesetzten Elektrolyten betrug jeweils 3 ml. Die Halbkammern sind durch einen 25 µm starken PTFE-Folie (Dielectric Corporation) voneinander getrennt. In die Folie wird mit Hilfe einer feinen Metallspitze eine Fehlstelle erzeugt, die in einer Funkenstrecke (Kfz-Zündspule, umgebaut durch die Elektronikwerkstatt, FB4 Universität Osnabrück) zu einem Loch mit einem Radius von µm aufgeweitet und abgerundet wird. Die Kontaktflächen zwischen den Teflon-Halbkammern und der Folie werden mit Vakuumfett (Glisseal, Borer Chemie) abgedichtet. An den nach außen weisenden Enden jeder Halbkammer befinden sich Sichtfenster, die eine optische Kontrolle des Bilayers durch ein Stereomikroskop ermöglichen. PTFE-Dichtungsringe und Parafilm dichten die Glasscheiben der Sichtfenster ab. Der gesamte Aufbau wird von einem Edelstahlgehäuse umgeben und fixiert. Als cis-kammer wird diejenige Halbkammer bezeichnet, die dem Experimentator zugewandt ist, die andere analog dazu trans-kammer. 29

36 Abbildung 2.5: Aufbau der Messkammer Ag/AgCl-Elektroden Die Silber-Silberchlorid-Elektrode einer jeden Halbkammer bestand grundsätzlich aus einem Silberdraht mit einem Durchmesser von 0.5 mm (Carl Roth Laborbedarf, Deutschland). Sie wurde in einer 2 M KCl-Lösung für 10 Minuten chloriert, indem sich bei einer angelegten Spannung von 20 V durch Oxidation eine dünne Silberchlorid-Schicht auf der Oberfläche des Drahtes abschied. Um Grenzflächenpotentiale zu vermeiden, waren beide Elektroden in Agarsalzbrücken eingebettet (1.5 % (w/v) Agarose in 2 M KCl 10 mm Mops/Tris ph 7), die ihrerseits von Glasröhrchen (Durchmesser: 1.5 mm) umgeben waren. Die Elektroden erfüllen zwei Aufgaben im Messsystem. Zum einen findet an ihrer Oberfläche die Übersetzung eines Ionenstroms der Messkammer in den elektrischen Strom des Messsystems statt. Durch eine Kette von Reaktionen an der Elektrodenoberfläche stehen beide Arten des Stroms miteinander im Gleichgewicht. Gleichzeitig wirkt sich eine Verschiebung dieses Gleichgewichts, verursacht durch die Spannungsquelle im Verstärker, als Potentialgefälle über der künstlichen Membran aus. An der Elektrode der cis-kammer finden dieselben Reaktionen in entgegengesetzter Richtung statt Aufbau des Messstandes Die Elektroden sind direkt an einen hochohmigen Vorverstärker (CV-5-1GU Headstage; Molecular Devices) angeschlossen, der den gemessenen Strom in eine Spannung transformiert. Der Messverstärker (Gene Clamp 500B; Mol. Dev.) wandelt das Signal wiederum in Stromwerte um und dient gleichzeitig als Amperemeter und Spannungsquelle, so dass an dieser Stelle das Potential (Kommando-Spannung) vorgegeben und der resultierende Strom gemessen wird. Hierbei ist zu beachten, dass das Potential der trans- 30

37 Material und Methoden Kammer relativ zur cis-kammer (geerdet) variiert wird. Die Daten werden über einen Analog/Digital-Wandler (Digidata 1200-Series Interface; Mol. Dev.) an einen Computer übertragen, der mit einer entsprechenden Digitalisierungskarte (Digidata 1200B; Mol. Dev.) ausgestattet ist. Mit der entsprechenden Software (AxoScope 9; Mol. Dev.) ist es möglich, die Spannung vom Computer aus zu steuern und gleichzeitig die Daten auf der Festplatte aufzuzeichnen. Unterhalb der Kammerhalterung befindet sich ein Magnetrührer, mit dessen Hilfe Rührkerne angetrieben werden, um Probe und Elektrolytlösung zu vermischen. Eine Lampe beleuchtet über einen Lichtleiter das Innere der Bilayerkammer. Für den Austausch des Elektrolyten während einer Messreihe sorgt die Perfusionseinrichtung. Diese besteht aus zwei 60 ml Einwegspritzen, die über Schläuche mit kurzen Glasröhrchen verbunden sind. Werden die Röhrchen über einen dreiachsigen Mikromanipulator in die Lösung der Kammer getaucht, kann der Elektrolyt durch gleichzeitiges Einspeisen und Abziehen ausgetauscht werden, ohne dass sich der Pegelstand in der Kammer ändert. Auf diese Weise bleibt der Bilayer bestehen und der Ionenkanal kann unter den veränderten Bedingungen weiter vermessen werden. Um die Messung vor äußeren Störungen abzuschirmen, umgibt ein Faradayscher Käfig den gesamten Aufbau, der wiederum auf einem schwingungsgedämpften Tisch installiert ist. Alle elektrischen Komponenten (Messverstärker, A/D-Wandler, Computer, Lichtquelle, Motor des Magnetrührers) befinden sich außerhalb des Käfigs. Ein sternförmig verbundenes Erdungssystem sorgt dafür, dass keine Potentialdifferenzen zwischen den Komponenten auftreten. Abbildung 2.6: Ansicht des Messaufbaus 31

38 Herstellung des Bilayers Für den Bilayer wurde eine Lipidmischung (L- -Phosphatidylcholin aus Soja Typ IV-S, Sigma) mit folgender Zusammensetzung verwendet: 40 % Phosphatidylcholin, 33 % Phosphatidylethanolamin, 14 % Phosphatidylinositol, 5 % Lysophosphatidylcholin und 4 % Cardiolipin (Angaben nach (Miller, 1976)). Eine Stammlösung (100 mg/ml) wurde in Methanol und Chloroform (2:1 v/v) bei -20 C gelagert und vor der Verwendung für 30 Minuten mit Hilfe einer Vakuumpunpe (MZ 2C, Vacuumbrand) eingedampft. Die endgültige Konzentration von 50 mg/ml wurde durch Zugabe von n-dekan (99 %, Sigma) auf das getrocknete Lipid erreicht. In einem ersten Schritt zur Herstellung einer künstlichen Lipiddoppelschicht wurde ein kleiner Lipidtropfen auf dem Loch im PTFE-Film abgesetzt (painting-technique). Durch mehrmaliges Absenken und Anheben des Flüssigkeitspegels unter das Loch verdünnte sich das Lipid sukzessiv, so dass sich nach einiger Zeit selbstständig ein Bilayer ausbildete (Mueller, 1963). Dieser war bei entsprechender Beleuchtung als glatte Fläche im Zentrum des Loches zu erkennen, umgeben von einem mehrschichtigen Lipidrand (Abbildung 2.7A- D). Für die Stabilität des Bilayers hatte es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn der Lipidtropfen vor der Verdünnung eine Stunde auf dem Loch im PTFE-Film ruhte. Abbildung 2.7: Herstellung des Bilayers A) Flüssigkeitsstrom durch das offene Loch in der PTFE-Folie von trans nach cis. B) Ein Lipidtropfen wurde auf das Loch gegeben und verschließt die Verbindung zwischen den beiden Halbkammern. C) Nach einmaligem Absenken und Anheben des Flüssigkeitsspiegels hat sich bereits ein Bilayer ausgebildet. D) Durch wiederholtes Absenken und Anheben des Elektrolyten nimmt die Breite des Lipidrandes ab. 32

39 Material und Methoden Fusion von Proteoliposomen mit dem Bilayer Bevor ein rekonstituierter Ionenkanal in der Bilayer-Kammer vermessen werden kann, ist es notwendig, dass die Membranen von Proteoliposom und Bilayer miteinander fusionieren (Abbildung 2.8A-D). Für ein solches Fusionsereignis sind zwei Voraussetzungen zu erfüllen (Cohen, 1980; Niles, 1987): Zum einen muss ein osmotischer Gradient zwischen den beiden Halbkammern bestehen. Außerdem sollte der Kanal in der Membran des Proteoliposoms geöffnet sein. Die Probe wird in der cis-kammer, die den höher konzentrierten Elektrolyten enthält, direkt vor dem Bilayer abgesetzt. Sobald ein Proteoliposom Kontakt mit dem Bilayer hat, schwillt es aufgrund des osmotischen Gefälles an. Der Zusammenhalt der Membran wird dadurch geschwächt, so dass nach einer gewissen Zeit die Fusion der Membranen stattfinden kann. Die Volumenzunahme des Proteoliposoms kommt durch einen Wassereinstrom von der trans-kammer zustande, deren Elektrolyt im Fusionsansatz geringer konzentriert ist. Gleichzeitig strömt durch den geöffneten Kanal höher konzentrierter Elektrolyt aus der cis- Kammer nach, so dass der Gradient zwischen Vesikellumen und trans-kammer aufrecht erhalten bleibt. Die Wahrscheinlichkeit des Anheftens von Proteoliposomen an den Bilayer wird durch die Anwesenheit von CaCl 2 (10 mm) erhöht. Die zweifach positive Ladung der Ca 2+ Ionen vermittelt dabei zwischen den partiell negativ geladenen Oberflächen der Membranen. Abbildung 2.8: Fusionsmechanismus A) Die Probe wird auf der höher konzentrierten Seite zugegeben. B) Das Anheften des Proteoliposoms an den Bilayer wird durch Ca 2+ Ionen erleichtert und es kommt durch Flüssigkeitseinstrom zu einem Anschwellen des Vesikels. C) Die Membranen fusionieren in dem Moment, in dem das Proteoliposom platzt. D) Der Ionenkanal befindet sich daraufhin im Bilayer. 33

40 2.3.2 Leitwert-Messung Der Leitwert ergibt sich aus dem Kehrwert des Widerstands im Ohmschen Gesetz. Er wurde zumeist unter symmetrischen Elektrolytbedingungen gemessen, das heißt cis- und trans-kammer enthielten denselben Elektrolyten. Prinzipiell wird bei voltage-clamp Messungen die Spannung vorgegeben, so dass der Strom dem Messergebnis entspricht. Gleichung 2.1 Gleichung 2.2 Das Ohmsches Gesetz R: Widerstand [Ohm, ] U: Spannung [Volt, V] I: Strom [Ampere, A] G: Leitwert [Siemens, S] Im Falle des Leitwertes wird zwischen zwei unterschiedlichen Messwerten unterschieden, die sich wiederum von der Leitfähigkeit abgrenzen Der Leitwert ermittelt aus Schaltereignissen Der Leitwert, ermittelt aus einzelnen Schaltereignissen des Kanals, beschreibt die Differenz zwischen zwei Stromniveaus vor und nach einem Schaltereignis. Es treten häufig unterschiedliche Leitwertklassen auf, die durch partielles oder komplettes Schließen der Pore zu erklären sind. Um einen Überblick über das gesamte Schaltverhalten eines Kanals zu erlangen und die Grenzen zwischen den Leitwertklassen festzulegen, ist es notwendig die Leitwerte sehr vieler Schaltereignisse (Anzahl: >1000) in einem Histogramm aufzutragen. Aus der Verteilung der Daten ist es möglich, den Mittelwert und die Varianz einer Leitwertklasse zu bestimmen. Um das Schaltverhalten des Kanals unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen, wurden die Histogramme normalisiert, indem die Häufigkeit der Schaltereignisse auf das gleiche Messzeit-Intervall bezogen wurde (beispielsweise im Abschnitt 3.1.4). 34

41 Material und Methoden Der Gesamtleitwert Der Gesamtleitwert einer Pore betrachtet hingegen den absolut über die Membran fließenden Strom und beinhaltet außerdem Leckströme, die hauptsächlich durch nicht vollständig schließende Poren zustande kommen. Durch den hohen Abdichtwiderstand der künstlichen Lipiddoppelschicht sind kleinste Ionenströme, die nicht durch die Pore fließen, zu vernachlässigen. Als rektifizierend wird der Leitwert eines Kanals dann bezeichnet, wenn die Größe des Ionenstroms richtungsabhängig ist. Die Daten in einem Strom-Spannungs-Diagramm beschreiben einen bogenförmigen Verlauf und stehen demnach nicht direkt linear mit der Spannung in Beziehung. Der Grad der Rektifizierung wurde durch das Verhältnis der Stromstärke bei positiven und negativen Spannungen ermittelt Die Leitfähigkeit Die Leitfähigkeit der Elektrolytlösung ist eine allgemeine physiko-chemische Eigenschaft des Elektrolyten und unabhängig vom untersuchten Kanal. Der Wert wird auf die Entfernung der Elektroden in einer Messzelle bezogen und liegt um Größenordnungen über dem Leitwert eines Ionenkanals (Einheit: ms/cm). Die Leitfähigkeit wird mit einem Konduktometer gemessen (WTW Microprocessor Conductivity Meter LF 3000, Elektrode: TetraCon 96, Weilheim). Je höher die Ionenkonzentration des Elektrolyten, desto höher ist auch der Wert der Leitfähigkeit. Ein direkter Zusammenhang besteht jedoch nur zwischen Leitfähigkeit und Aktivität des Elektrolyten. Die Aktivität ist ein Maß für die effektive Konzentration und gibt damit die Menge der tatsächlich dissoziierten Ionen in der Lösung an. Tabelle 2.4: Leitfähigkeit verschiedener Elektrolytlösungen KCl [mm] Mops [mm] Leitfähigkeit Konzentration Aktivität /Tris ph 7 [ms/cm] Temp. [ C]

42 Wenn nicht anders vermerkt wurde der Elektrolyt mit 3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure (Mops, 10 mm) gepuffert und mit Tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethan (Tris) auf ph 7 titriert. Die Pufferbedingungen wurden nach Zugabe von Effektoren oder anderen Salzlösungen grundsätzlich für mindestens 2 Minuten durch Rühren äquilibriert Berechnung der Porengröße ausgehend vom Leitwert Auf der Basis von Diffusionsgleichung und Ohmschem Gesetz stellte (Hille, 1968) ein Modell auf, mit dem es möglich ist, den Widerstand eines Kanals abzuschätzen (Gleichung 2.3). Es handelt sich um eine grobe Annäherung, da makroskopischen Formalismen auf der molekularen Ebene angewandt werden. Die Pore wird dabei zu einem Zylinder mit dem Radius (r) und der Länge (l) reduziert. Sie befindet sich in einem Elektrolyten mit einem spezifischen Widerstand (ρ), welches dem reziproken Wert der Leitfähigkeit entspricht. Das linke sowie rechte Ende der Pore wird von sehr viel breiteren Kanalöffnungen (Vestibülen) flankiert, die den Ionenstrom durch die eigentliche Pore nicht beeinflussen. Der Widerstand des gesamten Kanals (R Kanal ) ergibt sich aus der Summe des Porenwiderstandes (R Pore ) und des Zugangswiderstandes der beiden Vestibüle (R Vestibül ). Gleichung 2.3 r: Radius der Pore l: Länge der Pore ρ: spezifischer Widerstand R x : Widerstand x Ist der Leitwert (G) des Kanals und damit der Widerstand bereits bekannt, so kann der Formalismus umgekehrt dafür verwendet werden, um den Radius bzw. Durchmesser (d) der Pore abzuleiten. Nach Umstellen der Gleichung 2.3 ergibt sich: Gleichung 2.4 d: Durchmesser der Pore G: Kanalleitwert 36

43 Material und Methoden Da über die Länge der Pore keine Informationen vorliegen, wird die Rechnung für zwei Grenzwerte durchgeführt. Entweder handelt es sich um eine sehr kurze Verengungszone von 1 nm mit ausgedehnten Vestibülen oder die Pore erstreckt sich über den gesamten Querschnitt der Lipiddoppelschicht von angenommen 5 nm. Außerdem können Wechselwirkungen zwischen Ionen und geladenen Gruppen des Proteins einen Einfluss auf die Konzentration und somit den spezifischen Widerstand des Elektrolyten innerhalb der Pore ausüben. Für mehrere Kanalproteine wurde deshalb ein Korrekturfaktor für den spezifischen Widerstand von 5 vorgeschlagen (Smart, 1997) und in der Rechnung berücksichtigt Offenwahrscheinlichkeit Der Offenzustand eines Kanals kann von mehreren Parametern abhängig sein. Viele Kanäle reagieren z.b. auf das elektrische Potential über der Membran und werden in der Literatur als voltage-gated bezeichnet. Jedoch auch die Interaktion mit Substraten und anderen Stoffen können einen großen Einfluss auf die Offenwahrscheinlichkeit haben. Der Wert wurde aus Stromspuren ermittelt, bei denen die Spannung jeweils für 1 Minute angelegt wurde. Da es eine gewisse Zeit bedurfte, bis sich das Gleichgewicht des Offenzustands bei der jeweils angelegten Spannung einstellte, wurde zur Berechnung der Offenwahrscheinlichkeit der mittlere Strom der letzten 15 Sekunden mit dem maximalen Strom des vollständig geöffneten Kanals ins Verhältnis gesetzt (Gleichung 2.5). Gleichung 2.5 I maximal : maximaler Strom der jeweiligen Spannung I mittel : mittlerer Strom der letzten 15 Sekunden einer Minute 37

44 2.3.5 Umkehrpotential und Selektivität Die meisten porenbildenden Proteine weisen eine gewisse Präferenz gegenüber Anionen oder Kationen auf. Wenn die Vorzugsrichtung des Ionenstroms unter asymmetrischen Elektrolytbedingungen vorgegeben ist, führt die Selektivität des Kanals zu einer ungleichen Verteilung von positiven und negativen Ladungen und wirkt sich als elektrisches Potential über der Membran aus. Die Spannung, die angelegt werden muss, um das Potential zu kompensieren, wird als Umkehrpotential (U rev ) bezeichnet. An diesem Punkt strömen dem chemischen Gradienten folgend Anionen und Kationen im Verhältnis 1:1 durch den Kanal, so dass kein elektrischer Strom beobachtet wird. Das Umkehrpotential ist somit ein direkter Messwert für die Selektivität von Ionenkanälen. Im Experiment wurde das Umkehrpotential durch sogenannte Strom-Spannungsrampen ermittelt. Die angelegte Spannung wurde in einem gewissen Zeitraum kontinuierlich variiert, wobei die Änderungsrate einen Wert von 10 mv/s nicht überstieg, um kapazitive Anteile des Stroms zu vermeiden Liquid Junction Potentiale Die Grenzfläche zwischen dem Elektrolyten der Halbkammer und der Agar-Salzbrücke der Elektrode zeichnet sich durch einen steilen Konzentrationsgradienten an gelösten Ionen aus, so dass tendenziell ein kontinuierlicher Fluss aus der Salzbrücke in den Elektrolyten stattfindet. Da die Mobilität der verschiedenen Ionensorten meist unterschiedlich groß ist, baut sich ein gewisses elektrisches Potential (Liquid Junction Potential) an der Grenzfläche auf. Je nachdem welche Ionen vorliegen, kann das Potential Werte zwischen -5 und +12 mv einnehmen (Neher, 1992). Im Fall von KCl-Lösungen beträgt das Liquid Junction Potential 1-2 mv (Barry, 1991) und es wurde bei der Analyse des Umkehrpotentials berücksichtigt Goldman-Hodgkin-Katz Gleichung Noch bevor die Existenz von Ionenkanälen bekannt war, stellten David E. Goldman, Alan Loyd Hodgkin und Bernard Katz eine Gleichung auf, in der das gemessene Umkehrpotential und die Membran-Permeabilität verschiedener Ionensorten in Verbindung gebracht wurde (Gleichung 2.6; (Goldman D.E., 1943; Hodgkin, 1949)). Der einfache Formalismus der sogenannte Goldman-Hodgkin-Katz Gleichung ist jedoch nur zulässig, 38

45 Material und Methoden wenn zwei grundlegende Annahmen getroffen werden. Als erste Voraussetzung wird die Membran als homogene Phase angesehen, über der das Potential kontinuierlich abfällt und somit ein konstantes elektrisches Feld vorherrscht. Außerdem wird von einer unabhängigen Diffusion der Teilchen ausgegangen, das heißt Interaktionen der Ionen untereinander werden nicht berücksichtigt. Beide Annahmen treffen nach heutiger Kenntnis von Membran- und Kanalstrukturen nicht zu. Trotzdem stellt die Goldman-Hodgkin-Katz Gleichung eine einfache Möglichkeit dar, die Selektivität von Poren grob abzuschätzen. Gleichung 2.6 U rev : Umkehrpotential in [V] R: allgemeine Gaskonstante T: Temperatur in [K] F: Faraday-Konstante P: Permeabilitätskoeffizient c: Konzentration in [M] +/-: Index für Kationen/Anionen Wenn das Umkehrpotential und die Konzentrationen bekannt sind und nur zwei permeierende Ionensorten vorliegen, kann durch Umformen der Gleichung das Verhältnis der beiden Permeabilitätskoeffizienten ausgerechnet und als Maß für die Selektivität angesehen werden. Gleichung Selektivität in Abhängigkeit der Elektrolyt-Konzentration Das Umkehrpotential ist prinzipiell abhängig von der Selektivität des Kanals, nimmt jedoch verschiedene Werte je nach Steilheit des chemischen Gradienten an. Darüberhinaus kann die Selektivität eines Kanals mit der absoluten Konzentration des Elektrolytpaares in Verbindung stehen. In vielen Fällen steigt die Selektivität an, wenn die absoluten Konzentrationen reduziert werden, jedoch der Gradient konstant bleibt. Für eine solche Beobachtung liefert die Goldman-Hodgkin-Katz Gleichung keine Erklärungsmöglichkeit, was die beschränkte Gültigkeit dieses theoretischen Ansatzes bestärkt. 39

46 Um die Ergebnisse des Abschnitts dennoch beschreiben zu können, wurde ein Formalismus von (Alcaraz, 2004) verwendet. Der Ansatz von Goldman, Hodgkin und Katz wird dabei um Donnan-Potentiale auf der cis und trans Seite des Kanals erweitert. Diese Überlegung begründet sich darauf, dass geladene Aminosäuren im Vestibül des Kanals ein elektrisches Feld verursachen, so dass die lokale Konzentration von Gegenionen am Kanaleingang erhöht ist. Je nach Konzentration der Elektrolytlösung werden diese Ladungen mehr oder weniger stark abgeschirmt und wirken sich als Selektivitätsfilter somit unterschiedlich aus. Gleichung 2.8 Gleichung 2.9 Gleichung 2.10 Gleichung 2.11 X: Ladungsdichte im Vestibül [M] c: Aktivität [M] U rev : Umkehrpotential [V] U GHK : Potential nach Goldman-Hodgkin-Katz [V] U Donnan : Donnan-Potential [V] P: Permeabilitätskoeffizient des Ions innerhalb der Pore Da das Umkehrpotential und die eingesetzten Konzentrationen bekannt sind, verbleiben als freie Variablen der Gleichung 2.8 die Ladungsdichte des cis- und trans-vestibüls sowie die Permeabilitätskoeffizienten der betrachteten Ionensorten innerhalb der eigentlichen Pore. 40

47 Material und Methoden Zugabe von Effektoren Die Wirkung von Effektormolekülen auf die Eigenschaften eines Ionenkanals sind im elektrophysiologischen Experiment von besonderem Interesse. In der Regel wird dabei der Unterschied vor und nach Zugabe der jeweiligen Substanz betrachtet und interpretiert. Wenn nicht anders vermerkt wurde die Lösung der Kammer nach Zugabe für 2 Minuten durch Rühren äquilibriert Redox-aktive Substanzen Zur Untersuchung eines potentiellen Regulationsmechanismus basierend auf dem Redox- Zustand des Tic110-Kanals wurden Oxidationsmitteln wie CuCl 2, DTNB (5,5'-Dithiobis- (2-nitrobenzonsäure)) oder die oxidierte Form des Glutathions (GSSG) in die Bilayerkammer gegeben. Außerdem wurden Reduktionsmittel wie TCEP (Tris-(2- carboxyethyl)-phosphan), DTT (Dithiothreitol) und die reduzierte Form von Glutathion (GSH) eingesetzt. Die CuCl 2 -Stammlösung (600 mm) wurde in reinem Wasser angesetzt, da CuCl 2 bei ph 7 nicht in dieser Konzentration löslich ist. Die in der Bilayerkammer eingesetzte Endkonzentration lag im Bereich zwischen 0.3 und 4 mm. Obwohl der Elektrolyt auf ph 7 gepuffert war, wurde unter diesen Bedingungen kein Präzipitat beobachtet. Aufgrund der sauren Eigenschaften von CuCl 2 (Lewis-Säure) musste der Elektrolyt mit 50 statt 10 mm Mops/Tris gepuffert werden, so dass die ph-wertänderung nach Zugabe von beispielsweise 2 mm CuCl 2 innerhalb von 0.2 Einheiten lag. Die Leitfähigkeit des Elektrolyten blieb durch die erhöhte Pufferkonzentration unbeeinflusst. Es stellte sich jedoch heraus, dass der Leitwert verschiedener Kanalproteine unter diesen Umständen bis zu 35 % kleiner war, was auf eine gewisse Wechselwirkung zwischen Puffersubstanz und Protein hindeutet. Die verwendete DTNB-Stammlösung hatte eine Konzentration von 200 mm und wurde in DMSO (Dimethylsulfoxid) gelöst. Es oxidiert spezifisch Sulfhydryl-Gruppen und setzt dabei einen gelben Farbstoff (das TNB - -Anion) frei. Unter Umständen wird in einem zweiten Reaktionsschritt eine Disulfidbrücke im Protein ausgebildet (van Iwaarden, 1992). Die oxidierte (GSSG) bzw. reduzierte (GSH) Form des Glutathions wurde direkt vor der Messung in Wasser und einer Konzentration von 100 bzw. 200 mm angesetzt. Die Stammlösungen von DTT (200 mm) und TCEP (400 mm) wurden mit dem jeweils verwendeten Elektrolyten hergestellt. 41

48 2.3.7 Auswertung der Daten Um aus den gemessenen Daten die jeweiligen Werte für die Stromamplitude eines Schaltereignisses, das Stromniveau oder den zeitlichen Mittelwert einer Spur zu bestimmen, wurden die Programme pclamp 9 (Molecular Devices) und Ephys (von Dr. Thomas Steinkamp) verwendet. Das Erstellen von kontinuierlichen Spannungsrampen ermöglichte das Programm Clampex 9 (Molecular Devices). Die weitere Verarbeitung und Analyse der Daten wurde mit Excel 2003 (Microsoft) und Origin 7.0 (OriginLab Corporation) durchgeführt. 42

49 Material und Methoden 43

50

51 Ergebnisse 3 ERGEBNISSE 3.1 PRAT-C Strukturvorhersage anhand der Primärsequenz Aufgrund der Zugehörigkeit zur Familie der PRAT-Proteine, deren Mitglieder als membranständig klassifiziert wurden, soll eine bioinformatische Vorhersage einen Überblick darüber geben, welche Abschnitte innerhalb der Primärsequenz von PRAT-C2.1 und 2.2 für eine transmembrane Lokalisation in Frage kommen. Es werden 5 verschiedene Programme verwendet, die auf dem Hidden Markov Modell (HMM) beruhen und Algorithmen benutzen, die mit Datensätzen experimentell bestätigter Strukturen trainiert wurden: HMMTOP, PRODIV_TMHMM, S_TMHMM, PRO_TMHMM, top_mod und Poly-phobius (Tusnady, 1998; Tusnady, 2001b; Viklund, 2004; Kall, 2005; Viklund, 2006). Im Allgemeinen sind die Ergebnisse der verschiedenen Algorithmen sehr ähnlich und sagen vier transmembrane Helices vorher, die für die Proteinfamilie typisch sind. In Abbildung 3.1A und B sind die Aminosäuresequenzen von PRAT-C2.1 rek. und 2.2 rek. sowie die zusammengefassten Ergebnisse der Vorhersagen dargestellt. Blau hinterlegte Kästen markieren die membranständigen Bereiche, die von allen 5 Algorithmen vorhergesagt wurden, während grau hinterlegte Kästen den maximalen Bereich angeben, der nur von einigen Algorithmen einer transmembranen Helix zugeordnet wurde. Das Tim17- Konsensusmotiv, welches allen PRAT-Proteinen eigen ist, ist blau unterstrichen. Durch einen multiplen Sequenzvergleich wird nach Abgleich mit der Pfam-Datenbank (protein families) im C-Terminus der beiden PRAT-C2 Proteine eine weiteres Motiv gefunden. Diese SAM-Domäne (sterile alpha motive) wird mit Protein-Protein-Wechselwirkungen in Verbindungen gebracht (rot unterstrichen) (Kim, 2003). Während die native Sequenz an Position 1 beginnt, wurde dem heterolog exprimierten Protein für die nachfolgende Aufreinigung ein poly-histidin-tag am N-Terminus angefügt (grün unterstrichen, Aminosäuren -25 bis 0). Eine Projektion der transmembranen Bereiche von PRAT-C2.2 entlang der Längsachse ist in Abbildung 3.1C dargestellt (helical-wheel-plot erstellt mit EMBOSS-Pepwheel und weiter modifiziert). Durch die α-helikale Konformation mit einem engen Wertebereich für 45

52 die beiden dihedralen Winkel φ und ψ ergibt sich ab der 19. Position die theoretisch deckungsgleiche Ausrichtung zweier Aminosäurereste. Da sich die vorhergesagten Bereiche der Helices in einigen Fällen über 24 Aminosäuren erstrecken, sind die Positionen innerhalb der Projektion teilweise doppelt besetzt. Der Verlauf der Helix beginnt N-terminal an der obersten Position und setzt sich im Uhrzeigersinn fort. Eingefärbt wurden die Aminosäuren entsprechend der Hydrophobizität ihrer Reste nach der Skala von (Kyte, 1982). Auffällig ist, dass ausgesprochen hydrophile Reste (blau) teilweise im zentralen Bereich der Membran lokalisiert sind und in direkter Nachbarschaft zu besonders hydrophoben Resten (rot) stehen. Die Überlegung, dass hydrophile Reste zu einer Seite hin polarisieren, um so in entsprechender Ausrichtung aller Helices einen hydrophilen Poreninnenraum zu bilden, kann nicht bestätigt werden. Es ist außerdem nicht geklärt, ob alle vier Helices direkt an der Porenbildung beteiligt sind und ob ein oder mehrere Monomere des Proteins für die Kanalaktivität verantwortlich sind. In einem Topologiemodell von PRAT-C2.2 wird deutlich, dass die wasserlöslichen Bereiche (interne loops, N- und C-Terminus) auf beiden Seiten der Membran sehr unterschiedliche Ladungsdichten aufweisen (Abbildung 3.1D). Die Farbgebung bezieht sich auf einen neutralen ph-wert, wobei negativ geladene Aminosäurereste blau und positiv geladene rot dargestellt sind. Während eine Seite eine theoretisch ausgeglichene netto-ladung hat und insgesamt nur 4 Ladungen vorweist, befinden sich auf der gegenüberliegenden Seite 56 geladene Aminosäurereste mit einer Summe von 6 positiven Ladungen. Welche Seite dem Intermembranraum bzw. dem Stroma entspricht, hängt vom Insertionsmechanismus des Proteins ab, der bisher unbekannt ist. 46

53 Ergebnisse Abbildung 3.1: Strukturvorhersage der beiden PRAT-C2 Proteine A) und B) Primärsequenz von PRAT-C2.1 rek. und 2.2 rek. aus A. thaliana. Kästen umschließen die Bereiche, für die transmembrane -Helices vorhergesagt werden. Blau hinterlegt: wahrscheinlicher Bereich, Überlappung aller Algorithmen, grau hinterlegt: variabler Bereich, Vorhersage nur einiger Algorithmen. Zahlen am Rand geben die jeweilige Aminosäureposition an, von -25 bis 0: für die biochemische Aufreinigung hinzugefügter Abschnitt; grün unterstrichen: polyhis-tag; blau unterstrichen: Tim17-Domäne basierend auf der Pfam- Datenbank; rot unterstrichen: SAM-Domäne C) Projektion der helikalen Bereiche von PRAT-C2.2 entlang der Längsachse (helical-wheel-plot), erstellt mit EMBOSS: pepwheel. Die Helices sind nummeriert, Aminosäuren wurden entsprechend der Hydropathie ihrer Reste nach der Skala von (Kyte, 1982) angefärbt. Rot: hydrophob; blau: hydrophil, eingekreist: hydrophile Reste im zentralen Transmembranbereich D) Topologiemodell der Transmembranhelices von PRAT-C2.2 in der inneren Hüllmembran. Deutlich ist die Ladungsasymmetrie der hydrophilen bzw. löslichen Abschnitte zu erkennen. links: Anzahl und Summe der geladenen Aminosäuren, rot: positiv (R, K); blau: negativ (E, D), bezogen auf ph 7. Der Beginn der nativen Sequenz ist durch einen schwarzen Querbalken gekennzeichnet; eingekreist: hydrophile Reste im zentralen Transmembranbereich 47

54 3.1.2 Massenspektrometrie und biochemische Untersuchungen Eine Massenspektrometrie der beiden PRAT-C2 Proben sollte nähere Auskunft über die Reinheit und Proteinzusammensetzung geben. Nach einem tryptischen Verdau der Proteine wurden die Proben in einem ESI-Trap Massenspektrometer analysiert. Zu Beginn der Probenvorbereitung betrug die eingesetzte Proteinmenge 50 bzw. 60 µg. Außerdem wurde den Ansätzen ein weiteres Protein mit bekannter Konzentration hinzugefügt (Carboanhydrase 2), um einen ungefähren Anhaltspunkt über das Auflösungsvermögen der Analyse zu liefern. Dieses Testprotein konnte bis zu einer Masse von 0.1 µg nachgewiesen werden. In Tabelle 3.1 werden nur diejenigen Peptide aufgelistet, die mit Proteinfragmenten aus A. thaliana oder E. coli übereinstimmen und einen signifikanten Mowse-Score von 50 erreichen (Perkins, 1999). In beiden Ansätzen wird das erwartete Protein eindeutig nachgewiesen. Die Probe PRAT- C2.1 enthält darüber hinaus signifikante Mengen von PRAT-C2.2. Außerdem können in beiden Proben Proteine aus dem Expressionssystem E. coli nachgewiesen werden. Obwohl keines der Proteine mit Kanalaktivität in Verbindung gebracht wird, kann aufgrund dieses Befundes nicht ausgeschlossen werden, dass porenbildende Proteine in Konzentrationen unterhalb der Auflösungsgrenze vorhanden sind. Die Formyltransferase YfbG ist ein Vertreter einer Gruppe von E. coli Proteinen, die aufgrund ihre Affinität zu Nickel-, Kobalt- oder Kupfer-Ionen meist mit aufgereinigt werden und somit typische Kontaminationen nach einer heterologen Expression und Metall-Affinitäts- Chromatographie darstellen (Bolanos-Garcia, 2006). Tabelle 3.1: Ergebnis der Massenspektrometrie Probe/Protein Genlocus/ Protein Mowse Anzahl Sequenz- Organismus Protein Menge [µg] Score Peptide Abdeckung [%]* PRAT-C PRAT-C2.1 At3g49560 A. thaliana Carboanhydrase 2 CA2 Bos taurus Formyltransferase YfbG E. coli PRAT-C2.2 At5g24650 A. thaliana Tagatose-6-P. Kinase 1 GatZ E. coli Citrat-Synthase GltA E. coli PRAT-C PRAT-C2.2 At5g24650 A. thaliana Oxyglutarat- Dehydrogenase SucA E. coli Carboanhydrase 2 CA2 Bos taurus *nach MS und MS/MS Auswertung; Toleranzparameter: MS 0.5 %; MS/MS 0.5 Da; Ladungszustand: 2+ und 3+; : nach (Perkins, 1999) 48

55 Ergebnisse Die Abbildung 3.2A zeigt das Bandenmuster der PRAT-C2.2 Probe nach Auftrennung im SDS-Gel. Die aufgetragene Probe entspricht der Fraktion eines Dichtegradienten (10 % Nycodenz), mit dessen Hilfe zuvor membranständige Proteine von löslichen Aggregaten getrennt wurden. Die Bande von PRAT-C2.2 ist bei einer erwarteten Höhe von 31 kda deutlich zu erkennen. Aufgrund der sensitiven Silber-Färbung ist zusätzlich eine Reihe weiterer Banden zu erkennen. Diese nicht identifizierten Proteine entsprechen entweder typischen Verunreinigungen aus dem Probenpuffer (Keratin; (Ochs, 1983)) oder den bereits im Massenspektrum nachgewiesenen Kontaminationen aus E. coli. Abbildung 3.2: Ergebnis biochemischer Untersuchungen der PRAT-C2 Proben A) SDS-PAGE von PRAT-C2.2 Proteoliposomen (P) nach Flotation im Dichtegradienten (10 % Nycodenz). Außer der Bande von PRAT-C2.2 lassen sich auch eine Reihe anderer Fraktionen ausmachen. Protein- Standard LMW: low molecular weight, Silberfärbung B) BN-PAGE von Vesikeln der inneren Hüllmembran. Abhängig vom verwendeten Detergens ergibt sich ein unterschiedliches Muster hochmolekularer Banden (*). links: Coomassiefärbung, rechts: Silberfärbung, Protein-Standard HMW: high molecular weight, Digit.: Digitonin, DDM: Dodecylmaltosid C) SDS-PAGE nach Dichtgradienten-Zentrifugation der PRAT-C2.2 Probe. Ein erfolgreiches Inkorporieren in Liposomen ist durch Flotation des rekonstituierten Proteins in geringer Dichte (5-10 % Nycodenz) gekennzeichnet, wohingegen nicht rekonstituiertes Protein im dichteren Medium (20-40 %) verbleibt. 49

56 Die in elektrophysiologischen Experimenten beobachtete dreistufige bzw. trimere Kanalaktivität (siehe Abschnitt 3.1.3) wirft die Frage nach der oligomeren Stöchiometrie von PRAT-C2 in der nativen Membran und rekonstituiert in Proteoliposomen auf. Diesbezüglich werden die Proteinkomplexe sowohl aus Vesikeln der inneren Hüllmembran als auch von rekonstituierten Proteoliposomen mit Hilfe der BN-PAGE aufgetrennt (Abbildung 3.2B). Je nach verwendetem Detergens ergibt sich ein leicht variierendes jedoch vergleichbares Bandenmuster verschiedener hochmolekularer Proteinkomplexe. Gute Ergebnisse der Proteinsolubilisierung wurden mit Digitonin und Dodecylmaltosid (DDM) in einer Konzentration von 1 % erreicht. Eine eindeutige, immunologische Detektion von PRAT-C2 durch western-blotting war nicht möglich und ergab nur ein breit verteiltes Signal über den gesamten Größenbereich (nicht abgebildet). Obwohl für eine detaillierte Analyse eine Optimierung der Reaktionsbedingungen notwendig wäre, verweist das komplexe Bandenmuster darauf, dass die blaue native Gelelektrophorese (BN-PAGE) eine aussichtsreiche Möglichkeit darstellt, um hochmolekulare Strukturen der inneren Hüllmembran zu charakterisieren. Eine Bande auf der Höhe von ca. 500 kda wurde bereits in anderen Arbeiten als der lösliche Rubisco-Proteinkomplex (Ribulose-1,5-Bisphosphat- Carboxylase-Oxygenase) nachgewiesen (Kugler, 1997; Chen, 2007). Bei der nativen Auftrennung von rekonstituierten PRAT-C2-Liposomen kann kein Protein nachgewiesen werden. Da Proteoliposomen im Vergleich zu nativen Membranen ein ungleich höheres Lipid:Protein-Verhältnis aufweisen, ist vermutlich eine zu geringe Detergens- Konzentration (0.5 bis 3 % Digitonin bzw. DDM) dafür verantwortlich, dass die Proteine nicht erfolgreich solubilisiert werden konnten. Der Erfolg des Rekonstitutionsprotokolls von PRAT-C2 kann jedoch durch Flotation im Nycodenz-Dichtegradienten nachgewiesen werden. In Abbildung 3.2C ist deutlich zu erkennen, dass das Protein erst nach Rekonstitution und Bindung an Liposomen in Fraktionen geringerer Dichte flotiert (2-10 % Nycodenz). 50

57 Ergebnisse Leitwert und Schaltverhalten Nach der Fusion von PRAT-C2.1 oder 2.2 enthaltenden Proteoliposomen mit dem planaren Bilayer wird Kanalaktivität beobachtet (Abbildung 3.3A und B). Da die elektrophysiologisch untersuchten Parameter der beiden Proteine identisch sind, werden sie im Folgenden nicht getrennt aufgeführt. Besonders charakteristisch für das Schaltverhalten sind sehr kurze und seltene Schließereignisse unterschiedlicher Größe. In den meisten Fällen liegt die Verweildauer im geschlossenen Zustand unter 100 ms. Auf der Grundlage einer statistischen Auswertung von mehr als 1000 Schaltereignissen zeichnen sich drei unterschiedliche Leitwertklassen ab (Abbildung 3.3D). Die Grenzwerte werden anhand des Leitwertprofils in 250 mm KCl auf 85, 250 und 600 ps festgelegt. Ereignisse der Leitwertklassen I und III treten am häufigsten auf, wobei die Leitwertklasse III eine deutliche Spannungs-Abhängigkeit zeigt. Im untersuchten Bereich zwischen ±160 mv werden große Schaltereignisse viel häufiger bei positiven Spannungen beobachtet. Die Kanalaktivität eines einzelnen Fusionsereignisses besteht grundsätzlich aus einer dreifachen Poreneinheit (Abbildung 3.3C). Wenn hohe Spannungen über einen längeren Zeitraum angelegt werden, findet in einigen Fällen ein komplettes Schließen der Kanäle statt, wobei in drei gleichgroßen Stufen geschaltet wird. Von jedem dieser Offenzustände sind Schaltereignisse aller drei Leitwertklassen möglich und das komplette Schließen einer Einzelpore entspricht einem Ereignis der Klasse III. Beim Auftragen des Gesamtstroms der dreifachen Pore gegen die Spannung (Abbildung 3.3E) wird eine kontinuierlich verlaufende Rektifizierung deutlich. Der Gesamtleitwert beträgt 1.55 ns bei +100 mv und 1.19 ns bei -100 mv, wobei ein Drittel dieser Werte den theoretischen Leitwert der einzelnen Pore ergibt. Anhand der Rektifizierung kann die Einbaurichtung der Kanäle bestimmt werden, welche nach einem Fusionsereignis zufällig verteilt ist. Zur statistischen Auswertung des Leitwertes wird die Orientierung vereinheitlicht, so dass jeweils der größere Stromwert bei positiver Spannung erreicht wird. Dass sich die Rektifizierung konsequent über alle Leitwertklassen vollzieht, wird im Strom-Spannungs-Diagramm, welches aus der Amplitude einzelner Schaltereignisse erstellt wurde, deutlich (Abbildung 3.3F). Der mittlere Leitwert in 250 mm KCl liegt bei 433 ps (Leitwertklasse III), 169 ps (II) und 42 ps (I) für positive Spannungen und bei 354 ps (III), 142 ps (II) und 39 ps (I) für negative Spannungen. 51

58 Abbildung 3.3: Leitwert und Schaltverhalten der PRAT-C2 Aktivität in 250 mm KCl A) Stromspur eines Bilayers nach einem Fusionsereignis der Probe PRAT-C2.2 bei +100 mv in 250 mm KCl. Die Poren sind unter diesen Bedingungen nahezu immer geöffnet mit einem Gesamtleitwert von ca. 1.5 ns. Der Kanal schließt selten und verharrt nur sehr kurz im geschlossenen Zustand (ca ms). Die Vergrößerungen zeigen jeweils Schaltereignisse der drei unterschiedlich großen Leitwertklassen (I, II und III; siehe D). rote Linie: Stromniveau des geöffneten Zustands; graue Linien: Grenzwert zwischen den drei Leitwertklassen. B) Stromspur desselben Bilayers bei -100 mv. Der Gesamtleitwert beträgt ca. 1.2 ns. Auch bei negativen Spannungen werden drei Leitwertklassen unterschieden, das Schaltverhalten ähnelt demjenigen bei positiven Spannungen mit sehr kurzen Schließereignissen und einer hohen Offenwahrscheinlichkeit. C) Stromspur desselben Bilayers bei +160 mv. Erst durch Anlegen sehr hoher Spannungen über einen längeren Zeitraum nimmt die Offenwahrscheinlichkeit ab. Deutlich ist die grundsätzlich trimere Organisation 52

59 Ergebnisse der Poren eines Fusionsereignisses zu erkennen. Für jede Pore sind Schaltereignisse der drei Leitwertklassen möglich; o: Kanäle offen; g: geschlossen D) Leitwerthistogramm aller ausgewerteten Schaltereignisse bei 250 mm KCl. Bei negativen und positiven Spannungen treten Ereignisse der drei Leitwertklassen auf. Die Grenzwerte (gestrichelte Linien) werden auf der Grundlage des Histogramms festgelegt. Unter diesen Bedingungen sind am häufigsten Ereignisse der Klasse I (und III bei pos. U.) zu beobachten. n unabhängige Bilayer : 6; n Schaltereignisse : 1099 E) Strom-Spannungs-Diagramm des Gesamtstroms der dreifachen Poreneinheit (schwarz) ermittelt aus 5 unabhängigen Bilayern. Der theoretische Gesamtleitwert einer Einzelpore ist durch offene Symbole dargestellt. Leitwertangaben beziehen sich auf ±100 mv. Die Rektifizierung ist durch den gebogenen Verlauf der Daten zu erkennen. Die Standardabweichung ist kleiner als die Symbole. F) Strom-Spannungs-Diagramm ermittelt aus den Stromamplituden von Schaltereignissen bei 250 mm KCl. Schwarz, blau und rot: Leitwertklasse I, II und III Porengröße, Offenwahrscheinlichkeit und die Abhängigkeit des Leitwertes von Spannung und Konzentration Neben der Grundcharakterisierung in 250 mm KCl wird die Kanalaktivität der beiden PRAT-C2 Proben auch eingehender auf Spannungs- und Konzentrations-Abhängigkeit geprüft. In Abbildung 3.4A ist die Leitwertverteilung in 20 mm KCl dargestellt. Sie wird getrennt nach positiven und negativen sowie niedrigen und hohen Spannungsbereichen aufgetragen. Zur direkten Quantifizierbarkeit ist die Häufigkeit auf ein einheitliches Zeitintervall von 15 Minuten pro Spannungsbereich normalisiert. Insgesamt beruht die Darstellung auf 1184 Schaltereignissen aus 8 unabhängigen Bilayern. Anhand der Verteilung im Histogramm kann der Leitwert in 20 mm KCl ebenfalls in drei Klassen unterteilt werden (Grenzwerte: 28 ps, 72 ps und 150 ps). Durch die Einteilung der Schaltereignisse nach hohen und niedrigen Spannungen wird die Zunahme der Schaltfrequenz bei hohen Potentialen deutlich. Während im Spannungsbereich zwischen 20 und 100 mv (oberes Diagramm) vornehmlich in der Leitwertklasse II geschaltet wird, nimmt bei positiven Spannungen oberhalb von 100 mv (unteres Diagramm) die Häufigkeit der Leitwertklasse III zu. Wie auch in 250 mm KCl (Abbildung 3.3D) weist diese Leitwertklasse eine breite Verteilung auf und enthält diejenigen Ereignisse, die dem kompletten Schließen einer einzelnen Poreneinheit entsprechen. Außerdem zeichnet sich durch die Verlagerung der Maxima insbesondere der Leitwertklasse II die Rektifizierung des Stroms ab. Der scheinbare Wegfall von Ereignissen der Klasse I ist darauf zurückzuführen, dass die entsprechende Stromamplitude unterhalb der Auflösungsgrenze liegt. Während der kleine Leitwert in 250 mm KCl 40 ps erreicht, läge dieser unter der Annahme einer linearen Abhängigkeit von der Konzentration bei 3-5 ps. 53

60 Der tatsächliche Zusammenhang zwischen Kanalleitwert und Konzentration des Elektrolyten wird in Abbildung 3.4B dargestellt. Der Gesamtleitwert der trimeren Kanaleinheit bei ±100 mv wird gegen die Aktivität (effektive Konzentration) aufgetragen. Da sich der Leitwert im gemessenen Bereich nicht zu sättigen beginnt, ist von einer großen, wassergefüllten Pore auszugehen. Die Berechnung des Porendurchmessers auf der Grundlage des Kanalleitwertes nach (Hille, 1992) und einem Korrekturfaktor für die Leitfähigkeit der Lösung von 5 (Smart, 1997) ergibt für die Einzelpore einen Wert von 1.9 ± 0.5 nm. Bei der Berechnung wurde der Kanalleitwert in verschiedenen Konzentrationen (von 0.1 bis 1.7 M KCl, vgl. Abbildung 3.4) und die Annahme einer unterschiedlich langen Restriktionszone (1-5 nm) berücksichtigt. Die Elektrolytkonzentration übt einen Einfluss auf den Grad der Rektifizierung aus (Abbildung 3.4C). Bei hohen Konzentrationen hat der Strom ein annähernd ausgeglichenes Verhältnis und ist demnach unabhängig von der Richtung (Verhältnis des positiven und negativen Stroms = 1). Bei niedrigeren Konzentrationen wird eine deutliche Rektifizierung beobachtet, welche sich zudem spannungsabhängig auswirkt. In einem Strom-Spannungs- Diagramm schlägt sich dieser Umstand in einem bogenförmigen Verlauf der Daten nieder (vgl. Abbildung 3.3E). Die Konzentrationsabhängigkeit der Rektifizierung ist ein Hinweis darauf, dass elektrostatische Barrieren des Proteins einen maßgeblichen Einfluss auf die Asymmetrie des Stromflusses ausüben. Bei hinreichender Abschirmung dieser Ladungen, wird der Effekt offensichtlich minimiert. Die Offenwahrscheinlichkeit der PRAT-C2 Aktivität ist von der Spannung, jedoch nicht von der Konzentration des Elektrolyten, abhängig (Abbildung 3.4D). Auch wenn die Haltespannung für jeweils 3 Minuten angelegt wird, verbleibt die Offenwahrscheinlichkeit im Bereich zwischen ±100 mv bei knapp 100 %. Außer den seltenen und sehr kurzen Schaltereignissen ist der Kanal meist vollständig geöffnet. Erst jenseits dieser Spannung treten dauerhafte Schließereignisse auf, so dass sich die Offenwahrscheinlichkeit verringert. Dennoch verhält sich der Kanal dann recht unbeständig. Die große Varianz bei hohen Spannungen beruht darauf, dass Kanäle entweder komplett geöffnet oder bereits geschlossen sind. 54

61 Ergebnisse Abbildung 3.4: Spannungs- und Konzentrationsabhängigkeit des Leitwertes der PRAT-C2 Aktivität A) Spannungsabhängigkeit der Leitwertverteilung in 20 mm KCl. Die Schaltereignisse können in drei Leitwertklassen unterteilt werden (I, II, III). Zur Vergleichbarkeit wird die Häufigkeit normalisiert. Die Kanäle sind im hohen Spannungsbereich aktiver. Insbesondere wird eine Zunahme der Leitwertklasse III bei hohen positiven Spannungen beobachtet. B) Konzentrationsabhängigkeit des Leitwertes getrennt nach ±100 mv. Innerhalb des untersuchten Bereichs bis zu einer Aktivität von 1 M (Konz.: 1732 mm) ist keine Sättigung des Leitwertes zu erreichen, was auf einen großen Porendurchmesser hindeutet. Die Standardabweichung ist zumeist kleiner als das Symbol. C) Konzentrationsabhängigkeit der Rektifizierung. Während bei hohen Konzentrationen ein nahezu linearer Zusammenhang des Leitwertes besteht (Stromverhältnis = 1), zeichnet sich bei niedrigen Konzentrationen eine deutliche Rektifizierung ab, die mit zunehmender Spannung ansteigt. D) Offenwahrscheinlichkeit in Abhängigkeit der Spannung und Konzentration. Über einen großen Spannungsbereich bis ±100 mv bleibt der Wert bei knapp 100 %. Erst jenseits von ±120 mv beginnen die Kanäle dauerhaft zu schließen Einfluss des spezifischen Antiköpers auf das Schaltverhalten Um zu überprüfen, ob es sich bei der beobachteten Kanalaktivität tatsächlich um PRAT-C2 handelt, wurde untersucht, wie sich die Zugabe eines spezifischen Antikörpers (α-prat-c2.1) auf die Kanaleigenschaften auswirkt. Als negativ-kontrolle dient das Blutserum, welches dem Tier vor der Immunisierung entnommen wurde (Präimmunserum), so dass die Spezifität einer auftretenden Reaktion eingeschätzt werden kann. Die 55

62 Proteinkonzentration beider Lösungen ist vergleichbar (α-prat-c2.1: 1.9 µg/µl, Präimmunserum: 1.6 µg/µl). Außerdem wird durch Aufreinigung des Serums im Vorfeld sichergestellt, dass alle weiteren Blutbestandteile entfernt werden, so dass die Proteinkonzentration direkt der Menge des Immunglobulins entspricht. Es stellt sich heraus, dass der Antikörper eine deutliche Erhöhung der Schaltfrequenz bewirkt (Abbildung 3.5C). Der Effekt ist seitenspezifisch und kann, bei vereinheitlichter Orientierung der Kanäle (vgl. Abbildung 3.3), nur bei positiven Spannungen beobachtet werden. Durch Perfusion der Kammern ist die Reaktion auf den Antikörper reversibel (D). Die doppelte Menge des entsprechenden Präimmunserums übt keinen vergleichbaren Effekt aus (B). Abbildung 3.5: Effekt des spezifischen Antikörpers auf die Kanalaktivität von PRAT-C2 A) Stromspur eines Bilayers mit zwei trimeren Kanaleinheiten in 20 mm KCl (c/t) bei einer angelegten Spannung von +100 mv. Die Kanäle schalten selten und verharren nur sehr kurz im geschlossenen Zustand. B) Derselbe Bilayer nach Zugabe von 20 µl Präimmunserum zur cis- und trans-kammer. Das Schaltverhalten ist unverändert. C) Nach Zugabe von 10 µl des spezifischen Antikörpers gegen PRAT-C2.1 zur trans-kammer erhöht sich die Schaltfrequenz deutlich. D) Durch zweifaches Perfundieren der trans-kammer kann der Effekt wieder aufgehoben werden. 56

63 Ergebnisse Selektivität der PRAT-C2 Aktivität Die Kanalaktivität der PRAT-C2 Proben ist stark Kationen-selektiv. Das Umkehrpotential (U rev ) unter asymmetrischen Bedingungen (c/t: 250/20 mm KCl) liegt, unter Einbeziehung des Liquid Junction Potentials, bei Werten von ±1.2 mv und ±0.6 mv, was nach dem GHK-Formalismus einem Permeabilitätsverhältnis von 20:1 bzw. 12:1 (P K+ :P Cl- ) entspricht (Tabelle 3.2). Wie in Abbildung 3.6 dargestellt, wird der absolute Wert des Umkehrpotentials von zwei Strom-Spannungsrampen bei entgegengesetztem Gradienten verglichen. Der Wert unterscheidet sich durchschnittlich um 5 mv, was auf eine intrinsische Asymmetrie des Kanals hindeutet. Die Konsistenz der Messwerte wird durch regelmäßiges Kontrollieren des Elektroden-bedingten Spannungs-Offsets, einheitlicher Orientierung der Kanäle und durch ein hinreichend langsames Rampenprotokoll sichergestellt. Abbildung 3.6: Selektivität der PRAT-C2 Aktivität A) Strom-Spannungsrampen eines Bilayers unter asymmetrischen Elektrolytbedingungen. Das Umkehrpotential hat je nach Orientierung des Gradienten ein positives oder negatives Vorzeichen. Der absolute Wert des Umkehrpotentials unterscheidet sich durchschnittlich um 5 mv. blau: cis/trans (Konz.) 250/20 mm KCl; rot: 20/250 mm KCl; grau: zur Veranschaulichung der Differenz wird das Ergebnis unter 20/250 mm KCl um beide Achsen gespiegelt. B) Umkehrpotential in Abhängigkeit der Ionenaktivität bei einem konstant 5-fachen Gradienten. Im Experiment mit c/t (Aktivität) 200/1000 mm KCl liegt das Umkehrpotential bei 17.5 mv, während es bei 10/50 mm KCl einen Wert von 38.5 mv erreicht. Es sind jeweils die absoluten Werte in Volt angegeben. Das Umkehrpotential wird außerdem bei unterschiedlichen Aktivitäten jedoch einem konstant 5-fachem Gradienten bestimmt (Abbildung 3.6B). Dabei stellt sich heraus, dass das Umkehrpotential konzentrationsabhängig ist. Demnach diskriminieren die Kanäle bei geringen Aktivitäten viel stärker zwischen Anion und Kation als bei höheren Aktivitäten 57

64 (Tabelle 3.2). Mit Hilfe der Theorie von Goldman, Hodgkin und Katz lässt sich dieses Ergebnis nur durch ein separates Permeabilitätsverhältnis für jedes Konzentrationspaar beschreiben. Eine alternative Möglichkeit die Daten anzupassen, ergibt sich durch einen erweiterten Formalismus, der das Donnan-Potential, hervorgerufen durch intrinsische Ladungen am linken und rechten Vestibül mit einbezieht (Alcaraz, 2004). Zur genauen Erklärung siehe Abschnitt Bei dieser Art der Analyse erhält man neben dem Permeabilitätsverhältnis der beiden Ionensorten innerhalb der Pore, auch das Verhältnis der Ladungsdichte beider Vestibüle. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.2 zusammengefasst. Demnach diffundieren K + Ionen zweimal schneller durch die Pore als Cl - Ionen. Für die Ladungsdichte der Vestibüle ergeben sich zwei mögliche Ergebnisse der Regressionsanalyse. Im Fall von negativen netto-ladungen ist eine Seite 1.6-mal dichter besetzt als die gegenüberliegende Seite. Für den Fall positiver Ladung stellt sich eine sehr viel deutlichere Asymmetrie heraus (X trans /X cis : 15.6). Unter Berücksichtigung des Topologie-Modells aus Abbildung 3.1D ist anzunehmen, dass beide Seiten des Kanals eindeutig unterschiedliche Ladungsdichten aufweisen. Tabelle 3.2: Ergebnisse der Selektivität von PRAT-C2 nach GHK nach Alcaraz et al., 2004 Gradient (c/t) [mm] Permeabilitäts- U rev Verhältnis der Ladungsdichte P [mv] K+ :P Cl- Verhältnis in der Aktivität Konzentration der Vestibüle Pore 175/17 250/ :1 17/175 20/ : / / :1 5: /250 20/100 10/ :1 23:1 54: GHK: Goldman, Hodgkin, Katz; U rev : absoluter Wert des Umkehrpotentials; P: Permeabilitätskoeffizient; X: Ladungsdichte [M] Einfluss der Peptide TrOE33 und pcoxiv Da die allgemeine Funktion der PRAT-Proteine mit dem Transport von Präproteinen und Aminosäuren in Verbindung steht, wird untersucht, wie sich die Zugabe von zwei unterschiedlichen Signalpeptiden auf die Kanalaktivität der PRAT-C2 Proben auswirkt. TrOE33 ist die chloroplastidäre Transitsequenz der Untereinheit 33 des Oxygen-Evolving- Complex und wurde in zahlreichen Untersuchungen als Importsubstrat des Toc- und Tic- Translokons verwendet. pcoxiv entspricht hingegen der N-terminalen Präsequenz der 58

65 Ergebnisse Cytochromoxidase-Untereinheit IV und stellt ein Substrat für den nah verwandten Tim23 Kanal im mitochondrialen Proteinimport dar. Beide Peptide werden im Abschnitt eingehender vorgestellt. In Anwesenheit von TrOE33 in nanomolaren Mengen wird eine deutliche Veränderung des Schaltverhaltens in 20 mm KCl festgestellt (Abbildung 3.7A). Im Allgemeinen verursacht das Peptid einen Block und führt zu einer erhöhten Schaltfrequenz, wobei die Amplitude der entsprechenden Block-Ereignisse den Leitwert der Einzelpore übertrifft. Der Effekt kann auf beiden Seiten des Kanals beobachtet werden, jedoch ist die Offenwahrscheinlichkeit bei positiven Spannungen stärker beeinträchtigt (C). Die Leitwertverteilung im normierten Histogramm lässt eine Quantifizierung der Schaltereignisse getrennt nach Leitwertklassen zu (B). Jenseits des maximalen Leitwertes der Einzelpore findet sich unter dem Einfluss von TrOE33 eine breite Verteilung von Ereignissen, die als Leitwertklasse IV zusammengefasst wird. Da der Effekt auf den Kanal durch Perfusion reversibel ist und in der Klasse IV keine Häufung bestimmter Leitwerte festgestellt werden kann, wird nicht von einer spezifischen Reaktion des Kanals wie z.b. einem gekoppelten Schalten mehrerer Poren ausgegangen, um derart große Schaltereignisse zu erklären. Es ist hingegen wahrscheinlicher, dass das Peptid elektrophoretisch vor die Pore getrieben wird und auf diese Weise den Zugang mehrerer Kanäle verdeckt. Die Zugabe des mitochondrialen Signalpeptids pcoxiv (28 nm) übt einen anderen Einfluss auf das Schaltverhalten aus. Im Histogramm wird erkennbar, dass die Position der Leitwertmaxima unverändert bleibt (Abbildung 3.7B). Jedoch kommt es zu einer deutlichen Zunahme der Leitwertklasse III, was aus einem vermehrten Auftreten von kompletten Schließereignissen der Einzelpore resultiert. Die Offenwahrscheinlichkeit bleibt weitestgehend unbeeinflusst, da der Kanal nur sehr kurz im geschlossenen Zustand verharrt (C). Die Leitwertverteilung im Histogramm zeigt, dass der Effekt bei positiven und negativen Spannungen auftaucht, jedoch gibt es auch Fälle, bei denen die Zunahme der Schaltfrequenz nur auf einer Seite deutlich wird. Die Daten im Histogramm beruhen auf Messungen im Spannungsbereich zwischen ±100 mv. Da die Leitwertklasse III unter denselben Bedingungen ohne Peptid erst bei Spannungen oberhalb von 100 mv auftritt (vgl. Abbildung 3.4A), ist die Veränderung durch pcoxiv mit einer erhöhten Spannungssensitivität zu erklären. Der Effekt ist durch einfaches Perfundieren nicht aufzuheben und tritt auch in 250 mm KCl auf (D). Unter diesen Bedingungen ist die Wirkung seitenspezifisch, da die Schaltfrequenz nur bei positiven Spannungen deutlich zunimmt. Die erhöhte Ionenstärke hat eine größere Abschirmung von Ladungen am Kanal 59

66 zur Folge, so dass vermutlich unspezifische, schwach elektrostatische Wechselwirkungen nicht stattfinden können. Die Seitenspezifität sowie ein Fortbestehen des Effektes nach Perfusion gelten im Allgemeinen als Eigenschaften einer spezifischen Wechselwirkung. Abbildung 3.7: Einfluss von TrOE33 und pcoxiv A) Stromspur einer trimeren Kanaleinheit vor und nach Zugabe von 20 nm TrOE33 (c/t) in 20 mm KCl bei ±100 mv. Die Anwesenheit von TrOE33 führt zu einer erhöhten Schaltfrequenz und es werden 60

67 Ergebnisse Schaltereignisse beobachtet, deren Amplitude größer als der Leitwert einer einzelnen Pore ist. Der Effekt ist nicht seitenspezifisch. Rote Linien: Stromniveau von 1, 2 oder 3 geöffneten Poren. B) Leitwerthistogramm in 20 mm KCl (schwarz) vor und nach Zugabe von (c/t) 20 nm TrOE33 (blau) oder 28 nm pcoxiv (rot) im Spannungsbereich zwischen ±100 mv. pcoxiv erhöht die Häufigkeit des Schaltens der Leitwertklasse III, während TrOE33 übergroße Blockereignisse erzeugt (Klasse IV). Zur Quantifizierbarkeit wurde die Häufigkeit jeweils auf den gleichen Zeitraum normiert, grau gestrichelte Linien: Grenzwerte der Leitwertklassen I-IV. C) Offenwahrscheinlichkeit in Abhängigkeit der Spannung in Ab- und Anwesenheit von Signalpeptiden in 20 mm KCl. Der durch TrOE33 verursachte Block wirkt sich insbesondere bei positiven Spannungen auf die Offenwahrscheinlichkeit aus. Die erhöhte Schaltfrequenz durch pcoxiv beeinflusst die Offenwahrscheinlichkeit kaum. D) Stromspur einer trimeren Kanaleinheit in 250 mm KCl. Der Einfluss von 100 nm pcoxiv wird unter diesen Bedingungen nur bei positiven Spannungen deutlich. Rot gestrichelte Linien: Stromniveau von 2 bzw. 3 geöffneten Kanälen (o), grau gestrichelte Linien: Grenzwerte der Leitwertklassen (I, II, III) Gegenüberstellung der Kanaleigenschaften unterschiedlicher Proben Vieles aus den vorangegangenen Experimenten spricht dafür, dass die beschriebene Kanalaktivität durch PRAT-C2 hervorgerufen wird. Zum einen ist grundsätzlich nur die dargestellte Aktivität zu beobachten und in keiner der unterschiedlichen Rekonstitutionen werden weitere Kanalaktivitäten gefunden. Parallel angesetzte Kontrollen, bei deren Rekonstitution das Protein durch Pufferlösung ersetzt wurde, zeigen keine Aktivität im Bilayer. Damit kann die Möglichkeit ausgeschlossen werden, dass durch die verwendeten Chemikalien und Lipide eine Kontamination eingebracht wurde. Ein weiteres Argument liefert der seitenspezifische Effekt des gereinigten Antikörpers auf das Schaltverhalten von PRAT-C2, während das Präimmunserum kein vergleichbares Ergebnis hervorruft. Außerdem werden im Massenspektrum keine Proteine aus dem Expressionssystem E. coli nachgewiesen, die als porenbildend deklariert werden können. Im Gegensatz dazu folgen nun einige Ergebnisse, die dennoch Zweifel an der Identität des Kanals aufkommen lassen. Dabei werden die Kanalaktivitäten von drei unterschiedlichen Proben miteinander verglichen. Neben den Vollängenproteinen PRAT-C2.1 und 2.2 wird auch die C-terminal verkürzte Form (PRAT-C2.1-ΔSam) elektrophysiologisch charakterisiert. Dieser Mutante fehlt die sogenannte Sam-Domäne (steril-alpha-motive), die der Vorhersage nach nicht membranständig ist (vgl. Abbildung 3.1A, B) und funktionell mit Protein-Protein Wechselwirkungen in Verbindung gebracht wird (Kim, 2003). Außerdem ist eine wiederkehrende Aktivität aus mehreren, heterolog exprimierten Tic110 Proben (Tic110-ΔN rek. ) mit aufgeführt. Der Gesamtleitwert aller drei Kanalaktivitäten ist identisch und der absolute Strom beschreibt den gleichen, rektifizierenden Verlauf im Strom-Spannungs-Diagramm (Abbildung 3.8A). Die aus einzelnen Schaltereignissen ermittelte Leitwertverteilung zeigt 61

68 eine übereinstimmende Position der Maxima, wobei insbesondere das verschobene Zentrum der Leitwertklasse II die Rektifizierung verdeutlicht (B). Nach detaillierter Analyse des Schaltverhaltens von PRAT-C2.1-ΔSam wird ebenfalls die Zunahme von Ereignissen der Leitwertklasse III oberhalb von +100 mv nachgewiesen (nicht gezeigt). Alle drei Aktivitäten verfügen über das charakteristische Schaltmuster gekennzeichnet durch sehr kurze und seltene Schließereignisse, wie es bereits für PRAT-C2 beschrieben wurde (C). Durch Anlegen hoher Spannungen über einen längeren Zeitraum, schließen die Kanäle in drei gleich großen Stufen. Zudem ergibt sich dieselbe Abhängigkeit des Umkehrpotentials von der Richtung des Gradienten mit einem Unterschied von ebenfalls 5 mv (D; vgl. Abbildung 3.6A). Außerdem wird eine Kreuzreaktion der Aktivität aus Proben von rekombinant exprimiertem Tic110-ΔN mit dem gereinigten Antikörper gegen PRAT-C2.1 festgestellt. Auch wenn die Seitenspezifität des Effektes etwas schwächer ausfällt, reagiert der Kanal ebenso mit einer erhöhten Schaltfrequenz bei positiven Spannungen (E). 62

69 Ergebnisse Abbildung 3.8: Gegenüberstellung der Kanaleigenschaften verschiedener Proben A) Strom-Spannungs-Diagramm des Gesamtstroms der Kanalaktivitäten aus den Proben PRAT-C2.2, PRAT- C2.1-ΔSam und Tic110-ΔN rek. in 250 mm KCl. Der Leitwert der drei Poren ist nicht voneinander zu unterscheiden. B) Leitwertverteilung der drei unterschiedlichen Proben in 20 mm KCl. Die Schaltereignisse lassen sich in drei Leitwertklassen unterteilen, deren Maxima vergleichbar sind. C) Stromspur einer trimeren Kanaleinheit aus Tic110-ΔN rek. in 250 mm KCl. Bei hohen Spannungen gehen die drei Poren sukzessiv in den geschlossenen Zustand über (obere Spur: -150 mv). Schaltereignisse der drei Leitwertklassen (I, II, III) sind selten und meist sehr kurz (untere Spur: +100 mv). o: offen; g: geschlossen; rote Linien: Stromniveau der einzelnen Poren; graue Linien: Grenzwerte der Leitwertklassen D) Asymmetrische Selektivität einer Aktivität aus Tic110-ΔN rek. in Abhängigkeit von der Richtung des Konzentrationsgradienten. Der Betrag des Umkehrpotentials (ΔU rev ) unterscheidet sich durchschnittlich um 5 mv. Blau: cis/trans 250/20; rot: 20/250; grau: 20/250 zur Veranschaulichung um beide Achsen gespiegelt E) Stromspur einer Kanaleinheit aus Tic110-ΔN rek. bei ±100 mv in 20 mm KCl. Nach Zugabe von 10 µl des gereinigten Antikörperserums gegen PRAT-C2.1 reagiert der Kanal mit vermehrtem Schalten insbesondere bei positiven Spannungen. Die leichte Änderung des Gesamtstroms ist nicht der Regelfall. 63

70 64

71 Ergebnisse 3.2 Tic Zusammenfassung der Ergebnisse vorangegangener molekularbiologischer und biochemischer Untersuchungen Im Vorfeld zu den in diesem Kapitel dargestellten elektrophysiologischen Versuchen an Tic110 wurden molekularbiologische und biochemische Experimente in der Arbeitsgruppe von Prof. Soll an der Universität München hauptsächlich von Dr. Mónica Balsera durchgeführt. Insbesondere standen Fragestellungen zur Topologie und zu physiologisch relevanten Regulationsmöglichkeiten im Mittelpunkt. Im Folgenden sollen die Ergebnisse aus diesen Untersuchungen kurz zusammengefasst werden. Nach der heterologen Expression einer N-terminal verkürzten Form von Tic110 (Aminosäuren der Sequenz aus Pisum sativum) in E. coli und einer Aufreinigung über Nickel-Affinitäts-Chromatographie zeigten sich drei unterschiedlich lange Fragmente mit einer molekularen Massen von 99, 60 und 20 kda (Abbildung 3.9A). Die verkürzten Translationsprodukte kamen dadurch zustande, dass sich innerhalb der entsprechenden RNA-Sequenz mehrere ribosomale Bindestellen befinden, die als Startpunkt der Translation in Frage kommen. Die drei Fragmente werden im Folgenden Tic110-ΔN (99 kda), M2- (60 kda) und M3-Tic110 (20 kda) genannt. Mit Hilfe von Größen-Ausschluss-Chromatographie (SEC, size-exclusion-chromatography) sowie nativer und nicht reduzierender Gelelektrophorese wurden Hinweise erbracht, dass Tic110 in wässriger Lösung als Dimer vorliegt und dass das Dimer nicht durch eine intermolekulare Disulfidbrücke stabilisiert wird. Der Erfolg einer Rekonstitution von Tic110-ΔN und M2-Tic110 in Liposomen wurde durch Dichtegradienten-Flotation nachgewiesen (Abbildung 3.9B). Das Fragment M3-Tic110 war nicht in der Lage in die Membran zu inserieren. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass sich außer den beiden N- terminalen Helices weitere transmembrane Segmente im Bereich der Aminosäuren befinden. Die Kombination aus CD-Spektroskopie, limitierter Proteolyse, Massenspektroskopie, einer Kartierung der reduzierten Cysteinreste und bioinformatischer Methoden führte letztendlich zu einem Topologie-Modell für Tic110 mit insgesamt 6 transmembranen -Helices, zwei großen Aminosäure-Schleifen im Intermembranraum und mehreren großen Sequenz-Abschnitten, die sich ins Stroma erstrecken (Abbildung 3.9F). 65

72 Abbildung 3.9: Zusammenfassung biochemischer Untersuchungen an Tic110 A) Rekombinant exprimiertes Tic110 nach Nickel-Affinitäts-Chromatographie und Auftrennung durch SDS-PAGE. Die drei Fragmente weisen ein Molekulargewicht von 99 kda (Tic110-ΔN), 60 kda (M2) und 20 kda (M3) auf. B) Rekonstitution der drei Fragmente in Liposomen, nachgewiesen durch Flotation im Sucrose- Dichtegradienten und Auftrennung durch SDS-PAGE. Die Angaben M beziehen sich auf die Saccharosekonzentration des diskontinuierlichen Gradienten. In Gegenwart von Liposomen nimmt die Dichte der Fragmente Tic110-ΔN und M2 ab, was auf eine Insertion in die Membran hindeutet. Das Fragment M3 konnte nicht in die Membran rekonstituiert werden. C) Der oxidierte Zustand von Tic110 unterscheidet sich vom reduzierten durch weniger fokussierte Banden und eine erhöhte Mobilität während der SDS-Gelelektrophorese. Tic110-ΔN liegt direkt nach der Aufreinigung (-) und durch Zugabe von DTT (10 mm) im reduzierten Zustand vor. Oxidiert wird es durch Inkubation mit CuCl 2 (50 µm). D) Oxidiertes Tic110-ΔN kann durch Thioredoxin aus E. coli und Trx m und f aus dem chloroplastidären Stroma reduziert werden (Spur 3, 5 und 7). Durch DTT (500 µm) wird Thioredoxin im reduzierten Zustand gehalten. 66