Die Rolle von Interferon-γ bei der Tumorabwehr von B16 GP33 -Lungenmetastasen durch CD8 T-Lymphozyten

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1 Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Abteilung Immunologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Die Rolle von Interferon-γ bei der Tumorabwehr von B16 GP33 -Lungenmetastasen durch CD8 T-Lymphozyten INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt im Juli 2001 von Johannes Schwartzkopff geboren in Berlin

2 Dekan: Professor Dr. med. J. Zentner 1. Gutachter: Professor Dr. sc. nat. H. Pircher 2. Gutachter: Professor Dr. med. P. Fisch Jahr der Promotion: 2003

3 Für meine Eltern und Großeltern

4 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis 1. Zusammenfassung... 1 Summary Abkürzungen Einleitung Das Immunsystem Das unspezifische Immunsystem Das spezifische Immunsystem Stimulation von T-Lymphozyten Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) und MHC-Restriktion Antigenpräsentation, Antigenerkennung und Aktivierung von T-Zellen Cross-priming Effektormechanismen von T-Lymphozyten Tumorimmunologie Tumorantigene Immunantwort gegen Tumoren Möglichkeiten der Tumorzellen dem Immunsystem zu entgehen Immuntherapie von Tumorerkrankungen Das B16 GP33 -Melanommodell Fragestellung Material und Methoden Mäuse Zellinien Zellbiologische Methoden Medien zur Zellkultur Kultivierung von Tumorzellen Einfrieren von Zellen Auftauen von Zellen Intravenöser Tumorzelltransfer Herstellen einer Einzelzellsuspension In vitro-stimulation von TCR-tg T-Zellen Adoptiver Transfer in vitro stimulierter TCR-tg T-Zellen Durchflußzytometrie... 24

5 Inhaltsverzeichnis II Verwendete Puffer Analyse von Zellen aus lymphatischen Organen Analyse von Zellen aus dem peripheren Blut Analyse von B16-Tumorzellen CFSE-Markierung von Milzzellen Histologie und Immunhistochemie Präparation des Lungengewebes Einfrieren von Gewebe Beschichtung der Objektträger Präparation histologischer Gefrierschnitte Färbung der Gewebeschnitte mit Antikörpern Verwendete Antikörper Ergebnisse Etablieren der immunhistochemische Färbung von Gefrierschnitten aus Lungengewebe Immunhistochemische Darstellung von B16 GP33 -Tumorzellen Unterschiedliche hämatopoetische Infiltrate in B16 GP33 -Lungenmetastasen von B6- und B6.IFN-γ -Mäusen GP33-spezifische Infiltration von TCR-tg Zellen Infiltration hämatopoetischer Zellen in B16 GP33 -Lungenmetastasen in An- und Abwesenheit von IFN-γ Einfluß des adoptiven Transfers auf die Vaskularisation der Lungenmetastasen Nachweis der transferierten TCR-tg Zellen im Empfängertier IFN-γ-Abhängigkeit der Expansion transferierter TCR-tg T-Zellen Expansion der transferierten TCR-tg Zellen ist unabhängig von der IFN-γ- Synthese des Empfängertieres Proliferation aktivierter TCR-tg T-Zellen nach adoptivem Transfer Nachweis der Histokompatibilität zwischen IFN-γ-defizienten TCR-tg T-Zellen und B6-Mäusen Immunhistologischer Nachweis der proliferierten T-Zellen in Milz und Leber Phänotypische Charakterisierung von in vitro aktivierten TCR-tg T-Zellen... 48

6 Inhaltsverzeichnis III 6. Diskussion Darstellung verschiedener Zellen auf Gefrierschnitten der Lunge Infiltration von B16 GP33 -Lungenmetastasen Unterschiedlich ausgeprägte DC-Infiltrate in Abwesenheit von IFN-γ Minimale Infiltration der transferierten T-Zellen sichert spezifische Tumoreliminierung Bedeutung der infiltrierenden Makrophagen Fragen, die sich aus den histologischen Daten ergeben Ein angiostatischer Effekt der transferierten CD8 T-Zellen? Unterschiedliches Expansionsverhalten der transferierten TCR-tg CTL in vivo Literaturverzeichnis Lebenslauf Dank Publikationen... 81

7 1. Zusammenfassung 1 1. Zusammenfassung In verschieden Tiermodellen wurde gezeigt, daß CD8 T-Lymphozyten bei der Bekämpfung maligner Zellen eine wichtige Rolle spielen. Die Identifizierung von tumorassoziierten Antigenen (TAA) bei Krebspatienten, die von CD8 T-Zellen erkannt werden, unterstreicht diese Beobachtung. CD8 T-Zellen alleine reichen jedoch meist nicht aus, um das unkontrollierte Wachstum der Tumorzellen zu stoppen. Es ist allerdings von besonderem Interesse, diese Zellen gezielt gegen Tumoren aktivieren zu können. Um die Mechanismen, die einer solchen tumorspezifischen CD8 T-Zellantwort zugrunde liegen, zu beeinflussen, ist es notwendig, sie zu verstehen. In der vorliegenden Arbeit wurde das B16 GP33 -Melanommodell verwendet, das es ermöglicht, den Ablauf einer derartigen Immunantwort genauer zu untersuchen. Dieser gering immunogene, in die Lunge metastasierende Tumor exprimiert das CD8 T-Zellrestringierte Epitop GP33 des Glykoproteins des Lymphozytären Choriomenigitis Virus als TAA. Dieses Antigen wird von T-Zellrezeptor transgenen (TCR-tg) CD8 T-Zellen spezifisch erkannt. Durch den adoptiven Transfer aktivierter TCR-tg T-Zellen kann die vollständige Regression von B16 GP33 -Lungenmetastasen erreicht werden, wobei der Erfolg der Behandlung entscheidend von der Interferon-γ (IFN-γ) -Synthese des tumortragenden Tieres abhängt. Um die Rolle von IFN-γ bei der Tumoreliminierung zu verstehen, wurden die Lungen von B16 GP33 -Metastasentragenden IFN-γ defizienten und kompetenten Mäusen nach dem adoptiven Transfer von aktivierten TCR-tg T-Zellen immunhistochemisch untersucht. Dabei stellte sich heraus, daß Metastasen von unbehandelten Tieren von wenigen hämatopoetischen Zellen infiltriert wurden. Zuvor transferierte IFN-γ-kompetente TCR-tg CTL konnten nach vier Tagen in großer Zahl im Tumorgewebe dargestellt werden, wogegen lediglich eine schwache Infiltration von transferierten IFN-γ-defizienten TCR-tg T-Lymphozyten nachweisbar war. Unabhängig von der IFN-γ-Synthese der transferierten T-Zellen und des Empfängertieres stieg die Zahl von Makrophagen (CD11b + ), Dendritische Zellen (CD11c + ) und Granulozyten (Gr-1 + ) in den Metastasen nach einem Transfer um ein Vielfaches an. Anhand dieser Ergebnisse konnte kein direkter Zusammenhang zwischen der IFN-γ Produktion des Empfängertieres und der Infiltration hämatopoetischer Zellen im Tumor nachgewiesen werden. Dagegen stellte sich heraus, daß die transferierten TCR-tg CD8 T-Zellen durch ihre eigene IFN-γ Synthese die Vaskularisation des Tumorgewebes inhibierten. Zudem zeigte die durchflußzytometrische Analyse vom Blut der Empfängertiere, daß die transferierten, in vitro aktivierten IFN-γ kompetenten TCR-tg T-Zellen nach ihrem Transfer in vivo proliferierten, wohingegen TCR-tg IFN-γ defiziente T-Zellen nicht expandierten.

8 Summary 2 Summary CD8 T cells are crucially involved in the immune response against tumors. A number of tumor associated antigens (TAA) and their corresponding TAA-specific CD8 T cell have been described in the past few years in cancer patients. This illustrates the importance of this concept in immune surveillance against tumors. Since CD8 T cells alone are not sufficient to prevent tumor growth it is of interest to examine the involvement of other immune cells in CD8 T cell mediated immunity. The B16 GP33 -melanoma tumor model was chosen to study this question. This low immunogenic tumor expresses the glycoprotein epitope amino acid (GP33) of the lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) as a model antigen, which is recognized by GP33-specific T cell receptor transgenic (TCR-tg) T cells. Adoptive transfer of in vitro activated TCR-tg T cells leads to complete eradication of B16 GP33 -lungmetastases, an effect that depends on the IFN-γ production of the tumor-bearing mouse. To further investigate the role of this cytokine in the CD8 T cell mediated immune response against B16 GP33 -metastases immunohistology of sections from lungs of tumor bearing wild type and IFN-γ-deficient mice was performed. Without adoptive transfer neither T nor B cells were found in the tumors but a slight infiltration of haematopoetic cells was observed. After adoptive transfer large numbers of TCR-tg T cells were found in the metastases. In contrast only few IFN-γ deficient TCR-tg T cells infiltrated the tumors. Independent of their IFN-γ production both types TCR-tg cells led to an increase of tumor infiltrating macrophages (CD11b + ), dendritic cells (CD11c + ) or granulocytes (Gr-1 + ) cells respectively. A correlation between IFN-γ production of the tumor bearing mouse and the infiltrating haematopoetic cells was not observed. However IFN-γ production of the transferred TCR-tg cells appeared to inhibit angiogenesis in the tumor. In addition IFN-γ of the transferred T cells was crucial for their proliferation in vivo after an adoptive transfer.

9 2. Abkürzungen 3 2. Abkürzungen A Alanin Abb Abbildung AFP α-fetoprotein Ag Antigen Ak Antikörper AP Alkalische Phosphatase APC Antigenpräsentierende Zelle APES 3-Aminopropyltriethoxy-Silan AS Aminosäure ATP Adenosin-Tri-Phosphat B6 C57BL/6 Mäuse B6.IFN-γ Interferon-γ defiziente B6-Maus B16.F10 Melanomzellinie B16.F10 GP33 GP33 exprimierende B16.F10 Linie bfgf basischer Fibroblasten Wachstumsfaktor Bio Biotin C Grad Celsius CD cluster of differentiation CEA karzinoembryonales Ag CFSE 5,6-Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidyl-Ester CTL Zytotoxischer T-Lymphozyt DC Dendritische Zelle d.h. das heißt DMEM Dulbecco s Modified Essential Medium DMSO Dimethylsulfoxid EBV Ebstein Barr Virus ELR-Chemokine Gruppe von Chemokinen, die die AS-Folge Glutamin- Leucin-Arginin, das sgn. ELR-motif enthalten ENA-78 epitheliales Neutrophilen aktivierendes Protein-78 F Phenylalanin FcγII/IIIR FcγII/III-Rezeptor FITC Fluoresceinisothiocyanat

10 2. Abkürzungen 4 FKS fötales Kälberserum FSC forward scatter (Zellgröße) G418 Genticinsulfat GMCSF Granulozyten-Makrophagen Kolonie stimulierender Faktor GP Glykoprotein GP33 Peptid KAVYYNFATM des Glykoproteins von LCMV h Stunde H8 Mauslinie die GP33 auf allen kernhaltigen Zellen exprimiert HPV Humanes Papilloma Virus Hsp Hitze-Schock-Protein IFN-γ Interferon gamma IFN-γRβ β-kette des IFN-γ-Rezeptors IgM Immunglobulin M IL Interleukin IMDM Iscove s Modified Essential Medium IP-10 IFN-γ induzierbares Protein-10 i.v. intravenös K Lysin l Liter LAK Lymphokin aktivierte Killerzellen LCMV Lymphocytäres Choriomeningitis Virus L-Gln L-Glutamin M Molar m Milli µ Mikro MCP macrophage chemoatractant protein MHC Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) Mig IFN-γ induziertes Monokin min Minute MIP macrophage inflammatory protein Mφ Makrophagen

11 2. Abkürzungen 5 N Asparagin n Nano NK-Zelle Natürliche Killer-Zelle NO Stickstoffmonoxyd NaCl Natriumchlorid OVA Ovalbumin PBS Phosphat gepufferte Saline PE Phycoerythrin ph negativer dekadischer Logarithmus der Protonenmolarität P/S Penicillin/Streptomycin rpm Umdrehungen pro Minute RT Raumtemperatur s.c. subkutan SSC sideward scatter (Zellgranularität) SV40 Simian Virus 40 T Threonin TAA tumorassoziiertes Antigen TAP Transporter associated with antigen processing Tc1 Typ1 CD8 T-Zelle Tc2 Typ2 CD8 T-Zelle TCR T-Zell Rezeptor TCR-tg T-Zell Rezeptor transgen tg transgen TGF-β transforming growth factor-β T H 1 Typ1 CD4 T-Helferzelle T H 2 Typ2 CD4 T-Helferzelle TNF Tumor-Nekrose-Faktor TRIS 2-Amino-2-Hydroxymethyl-1,3-propandiol U Unit V Valin VEGF vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor Y Thyrosin

12 3. Einleitung 6 3. Einleitung 3.1 Das Immunsystem Der Körper steht ständig einer großen Zahl pathogener Substanzen und Prozesse gegenüber. Diese werden durch bakterielle und virale Infektionen, aber auch von Pilzen und anderen Parasiten verursacht. Außerdem kann es unter verschiedenen Umständen zum unkontrollierten Wachstum körpereigener Zellen kommen. Um diesen Prozessen zu begegnen und vor Krankheiten zu schützen, hat sich im Körper ein System aus verschiedenen zellulären Bestandteilen und sezernierten Molekülen entwickelt, das es ermöglicht, die genannten schädigenden Einflüsse früh und in kurzer Zeit zu kontrollieren Das unspezifische Immunsystem Dieser Teil des Immunsystems stellt die erste Barriere dar, der eingedrungene Substanzen sowie entarteten Zellen begegnen (71). Es besteht einerseits aus anatomischen Grenzflächen wie der Haut: Diese bedeckt den ganzen Körper und gewährleistet durch einen niedrigen Oberflächen-pH-Wert das Absterben vieler Mikroorganismen. Außerdem erschweren die Schleimhäute des Verdauungs-, des Respirations- und des Urogenitaltraktes, sowie die Konjunktiven ein Eindringen fremder Substanzen. Hier werden Partikel in Sekreten eingeschlossen und z.b. mit Hilfe von Zilien zu einer Körperöffnung transportiert. Andererseits haben sich im Organismus verschiedene physiologische Mechanismen entwikkelt, durch die Pathogene unschädlich gemacht werden: Dazu gehören der niedrige ph-wert des gesamten Verdauungstraktes, in Sekreten enthaltene antibakterielle Substanzen, wie Lysozym, sowie die Möglichkeit der reaktiven Temperaturänderung in Form von Fieber. Chemische Mediatoren, wie die Faktoren des Komplementsystems, helfen bei der Phagozytose und lysieren Mikroorganismen, wohingegen verschiedene Zytokine das Immunsystem auf vielfältige Weise beeinflussen. Ist ein Pathogen trotz dieser Barrieren in den Körper eingedrungen, so steht es einer Reihe gewebsständiger und zirkulierender Zellen gegenüber. Dazu zählen die Langerhanszellen der Haut, Granulozyten, γδ-t-zellen, Natürliche Killerzellen (NK-Zellen), Dendritische Zellen (DC) und Makrophagen. Letztere zirkulieren als Monozyten im Blut, liegen in der Lunge als Alveolarmakrophagen und in der Leber als Kupffer sche Sternzellen vor. Sie besitzen die Fähigkeit, Pathogene durch Endo- und Phagozytose aufzunehmen und zu verdauen, und stehen gemeinsam mit DC und B-Zellen als Antigenpräsentierende Zellen (APC) mit der spezifi-

13 3. Einleitung 7 schen Immunabwehr in enger Verbindung. Schließlich wird durch Gewebszerstörung nach Eintritt von Pathogenen oder nach Verletzung eine Entzündungsreaktion initiiert, die eine Ausbreitung einer Infektion schnell verhindert und das rasche Heilen der Läsion gewährleistet. Kann ein pathologischer Prozeß durch diese Mechanismen nicht kontrolliert werden, wird das spezifische Immunsystem hinzugezogen Das spezifische Immunsystem Im Gegensatz zum unspezifischen Immunsystem reagiert dieser Teil der Immunabwehr später, dafür jedoch spezifisch und unter Ausbildung eines immunologischen Gedächtnisses auf in den Körper eingedrungene Pathogene. Er wird aus den Lymphozyten, einer Population der Leukozyten, gebildet. Diese haben die Fähigkeit zwischen körpereigenen und -fremden Substanzen zu unterscheiden. Während ihrer Zirkulation zwischen Blut und Lymphsystem treten sie sowohl in den Lymphknoten als auch in der Milz mit anderen Zellen in Kontakt. Dabei wird das organisierte Zusammentreffen in diesen sekundären lymphatischen Organen und das geregelte Zirkulieren durch den Körper von einer Vielzahl sezernierter Botenstoffe und extrazellulär exprimierter Adhäsionsmoleküle vermittelt. Obwohl sie morphologisch eine einheitliche Zellpopulation darstellen, können sie aufgrund ihres Reifungsortes, ihrer Oberflächenmarker und ihrer Effektormechanismen in B- und T-Lymphozyten unterschieden werden. Beide Zellpopulationen sind darauf spezialisiert, Antigene (Ag) über einen Rezeptor zu erkennen und daraufhin eine spezifische Antwort zu generieren. Nach Abklingen der Immunreaktion verbleiben wenige spezifische Gedächtniszellen mit dem Potential, schneller auf ein erneutes Eindringen des Ag zu reagieren, im Körper (133). Während B-Zellen auf lösliche Ag hin durch die Bildung von Antikörpern (Ak) die humorale Immunantwort initiieren, sind T-Zellen darauf spezialisiert zellgebundene Peptide zu erkennen. Sie lösen dadurch die zelluläre Immunantwort aus. Beide stehen über Zellkontakte aber auch durch lösliche, sezernierte Mediatoren in ständigem Kontakt miteinander und beeinflussen sich gegenseitig. 3.2 Stimulation von T-Lymphozyten Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) und MHC-Restriktion Die aus dem Thymus entlassenen T-Zellen tragen auf ihrer Oberfläche einen T-Zell-Rezeptor (TCR) (30), über den sie prozessiertes Peptid-Ag in Zusammenhang mit körpereigenen MHC- Molekülen spezifisch erkennen. Dieser Mechanismus wird MHC-Restriktion genannt (132). Er besagt, daß T-Zellen prozessiertes Ag nur über MHC-Moleküle des eigenen Haplotypes erkennen. Diese stellen extrazelluläre, membrangebundene Glykoproteine der Immunglobulin-

14 3. Einleitung 8 superfamilie dar, die beim Menschen im HLA- und bei der Maus im H-2-Komplex kodiert sind (60). Sie können aufgrund ihrer molekularen Struktur in MHC Klasse I- und MHC Klasse II-Moleküle unterteilt werden. MHC Klasse-I Moleküle bestehen aus einer polymorphen α-kette, an die nicht kovalent das β 2 -Mikroglobulin gebunden ist. Während die α 3 -Untereinheit den Liganden des Korezeptors CD8 darstellt, bilden α 1 und α 2 die Bindungsstelle für ein 8 bis 11 Aminosäuren (AS) langes Peptid (15). Dieses wird im Proteasom aus zytoplasmatischen Proteinen proteolytisch gespalten und ATP-abhängig über den TAP (transporter associated with antigenprocessing) in das endoplasmatische Retikulum transportiert (116). Nach Assoziation mit dem MHC-Molekül wird es an die Zelloberfläche gebracht. MHC Klasse-I Moleküle werden auf allen kernhaltigen Zellen exprimiert, wobei starke Variationen bezüglich der Expressionsstärke bestehen. MHC Klasse-II Moleküle bestehen aus zwei nicht kovalent verbundenen Polypeptidketten, α und β, die sich jeweils aus zwei Domänen zusammensetzen. Dabei stellt die β 2 -Untereinheit die Bindungsstelle für den Korezeptor CD4 dar, während ein 10 bis 30 Aminosäuren langes Peptid von der α 1 - und β 1 -Kette gebunden wird. Dieses ist ein Teil eines Proteins, das aus dem Extrazellulärraum mittels Endozytose bzw. Phagozytose in Endosomen aufgenommen und dort enzymatisch gespalten wurde (81). Nach Fusion mit MHC Klasse-II Molekülen enthaltenen Vesikeln wird das Peptide MHC-gebunden zur Zellmembran transportiert. MHC Klasse-II Moleküle werden nur auf professionellen APC wie DC, Makrophagen, B-Zellen sowie den Thymusepithelzellen exprimiert. Beiden MHC-Molekülen ist gemeinsam, daß sie polygen angelegt sind und ihre Allele einem ausgeprägten Polymorphismus unterliegen. In einem Individuum werden diese zudem kodominant exprimiert, d.h. sowohl mütterliche als auch väterliche MHC-Molekül werden synthetisiert (124) Antigenpräsentation, Antigenerkennung und Aktivierung der T-Zellen Die Antigenerkennung auf MHC-Molekülen durch T-Zellen wird durch den TCR vermittelt (5, 20). Dieser besteht aus einer α- und β-kette, die über eine Disulfidbrücke kovalent verbunden sind, und ähnelt dem Fab-Teil der Immunglobuline. Je drei hypervariable Regionen pro Kette bilden die Kontaktstelle, durch die eine Verbindung mit dem MHC-Peptid-Komplex eingegangen wird. Durch die Bindung der Korezeptoren CD4 und CD8 an die entsprechenden MHC-Moleküle wird der Kontakt zur APC stabilisiert und die Signaltransduktion initiiert. Wie bei den Immunglobulinen existieren verschiedene Segmente der beiden Ketten, die durch Rearrangement beliebig kombiniert werden, wodurch eine den Ak vergleichbare Vielfalt der

15 3. Einleitung 9 αβ-tcr gesichert ist. Daneben exprimieren ca. 1-5% aller T-Lymphozyten einen aus den Ketten γ und δ aufgebauten TCR. Diese zum unspezifischen Immunsystem zählenden γδ-t- Zellen spielen u.a. auch eine Rolle bei der Immunantwort gegen manche Tumoren (40, 79). Die extrazellulären Signale zur Aktivierung der αβ-t-zellen erfolgen bei CD4 und CD8 T- Lymphozyten in gleicher Weise: Aktivierte APC transportieren aufgenommenes Ag in die sekundären lymphatischen Organe, wie Lymphknoten und Milz, wo sie das prozessierte Peptid präsentieren. Naive T-Zellen zirkulieren durch diese Organe und werden durch die Bindung von L-Selektin (CD62L) an CD34 und GlyCAM-1 auf den Venulen mit hohem Endothel im LN festgehalten. Binden sowohl ihr TCR als auch der Korezeptor an das entsprechende MHC-Molekül, wird ein erstes Signal über die CD3-Ketten, die nicht kovalent mit dem αβ-tcr assoziiert sind, in die Zelle weitergegeben. Dadurch wird die Signalkaskade, die zur Differenzierung in eine Effektorzelle führt, ausgelöst. Die Adhäsion der T-Zellen an die APC wird durch die Bindung aksessorischer Moleküle, deren Liganden auf der APC exprimiert werden, verstärkt. Dazu gehören die Paare CD2 LFA-3 und LFA-1 ICAM-1,-2 und -3. Ein zweites Signal wird über die kostimulatorischen Moleküle B7.1 und B7.2 gewährleistet, welche auf aktivierten APC exprimiert werden und an CD28 auf Seiten der T-Zelle binden. Dadurch erhält der Lymphozyt den Stimulus zur Expression antiapoptotischer Proteine, zur Zytokinproduktion, sowie zur weiteren Differenzierung und Proliferation (18, 63). Fehlt dieses zweite Signal, tritt die T-Zelle in den Zustand der Anergie: Sie reagiert nicht und erkennt auch in Zukunft ihr Ag nicht mehr. Das CD28-homologe Molekül CTLA-4 wird nach Aktivierung auf T-Zellen exprimiert. Es bindet ebenfalls an die B7-Proteine, wodurch ein antiproliferatives Signal gegeben wird, wirkt also als Antagonist des CD28 und terminiert die T-Zell-Antwort (21). Nach Aktivierung über den TCR produziert die T-Zelle Interleukin-2 (IL-2) und exprimiert den IL-2 Rezeptor (IL-2R). Dieser besteht aus den drei Ketten IL-2Rα (CD25), IL-2Rβ (CD122) und IL-2Rγ (CD132), die nur als Trimer die maximale Affinität für ihren Liganden aufweisen (113). IL-2 wirkt autokrin und stimuliert die klonale Expansion der T-Zelle (32). Die Differenzierung zu Effektorzellen folgt der antigeninduzierten Aktivierung und ist durch das Zytokinmilieu am Ort der Antigenerkennung bedingt. Während CD8 T-Zellen zu Zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) differenzieren, können CD4 T-Zellen in zwei verschiedene Richtungen reifen, wobei beide als T-Helferzellen (T H ) bezeichnet werden. CD4 T H 1-Zellen entwickeln sich als Antwort auf IL-12, das von aktivierten Makrophagen- bzw. NK-Zellen sezerniert wird. Die Produktion von Interferon-γ (IFN-γ), IL-2, Lymphotoxin und Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) kennzeichnet diese Zellen. Auf eine repetitive Stimulation durch Ag, wie

16 3. Einleitung 10 bei Allergien, und z.b. auf Helminthen-Infektionen hin, differenzieren CD4 T H 2 Zellen als Antwort auf eine vermehrte IL-4-Produktion. Sie produzieren IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13. Neben dem IL-2R exprimieren die Effektorzellen verschiedene Adhäsionsmoleküle, die eine Bindung an APC stabilisieren und die gerichtete Migration der T-Zelle zum Ort der Entzündung bzw. Infektion gewährleisten. Zu ihnen zählen Integrine, wie VLA-4, das über VCAM-1 an Endothelien als auch an APC bindet, und LFA-1, dessen endothelständige Liganden ICAM-2 und -3 sind. L-Selektin wird vermindert exprimiert, wohingegen E- und P-Selektin hochreguliert werden und die Adhäsion an Endothelzellen im Entzündungsgebiet verbessern. Schließlich exprimieren aktivierte T-Zellen das Molekül CD44, das die Bindung an die extrazelluläre Matrix und Endothelzellen sichert. Mit Hilfe dieser Moleküle und entlang von Chemokingradienten gelangen die Effektorzellen zum Ort der Entzündung. Nachdem das Ag eliminiert worden ist, sterben die meisten Zellen des T-Zell-Klons. Einige differenzieren jedoch zu Gedächtniszellen, die bei wiederholtem Kontakt mit dem gleichen Peptid schneller und effizienter zu Effektorzellen heranreifen können (133) Cross-Priming Wie im oberen Abschnitt beschrieben, ist der klassische Weg, über den es zur Aktivierung von CD8 T-Zellen und zur Differenzierung zu CTL kommt, die Präsentation prozessierter zytosolischer Proteine über das MHC Klasse-I Molekül. Diese Peptide werden nach Infektionen mit intrazellulären Erregern, wie Viren und bestimmten Bakterien in der APC selber synthetisiert. Bestimmte Proteine hingegen werden von APC aufgenommen und intrazellulär über das Proteasom in den MHC Klasse-I-Weg eingeschleust (19). Die Aufnahme kann z.b. durch Bindung von Hitze-Schock-Proteine (Hsp), wie gp96, Hsp70 und Hsp90 an Rezeptoren vermittelt werden (102). Andererseits können Bestandteile apoptotischer oder nekrotischer Zellen internalisiert und präsentiert werden (3). Um eine vollständigen Aktivierung zu CTL zu induzieren, müssen jedoch stimulierte APC vorliegen, die ausreichend kostimulatorische Signale übermitteln. Da dies nach Aufnahme nekrotischer Zellbestandteile nicht gegeben ist, findet die Generation von CTL nicht statt (93). Die T-Zellen werden in den Zustand der Toleranz gegenüber dem Ag versetzt (107). Anders als bei einer ausreichend starken Ag-Präsentation der Zielzelle oder als bei Hsp, die APC durch ihre Bindung aktivieren, wird die Expression der Kostimulatoren nach Aufnahme apoptotischen Zellmaterials durch die Ligation von CD40L auf T H 1 Zellen an CD40 der APC induziert (44, 94). Der Mechanismus der Präsentation exogener Ag über MHC-Moleküle wird Cross-Päsentation genannt (51) ; die dadurch hervorgerufene Aktivierung von CD8 T-Zellen als Cross-Priming bezeichnet (12, 13). Dieser Mechanismus spielt vermutlich eine wichtige Rolle bei der Präsentation von Tumorantigenen entarteter,

17 3. Einleitung 11 nicht professionell antigenpräsentierender Zellen (52). Virale Antigene, die nach Virusinfektion dieser Zellen exprimiert werden, können ebenso auf diesem Weg dargeboten werden (101). Über die physiologische Bedeutung des Cross-Primings wird jedoch weiterhin diskutiert, und eine direkte Aktivierung von CD8 T-Zellen durch Tumoren oder virusinfizierte Zellen kann nicht ausgeschlossen werden. 3.3 Effektormechanismen von T-Lymphozyten Die verschiedenen T-Zell-Populationen nehmen nach ihrer Aktivierung auf verschiedene Weise an einer Immunantwort teil: Zu T H 1 Zellen gereifte Lymphozyten expandieren klonal und migrieren zum Ort der Entzündung. Einerseits stimulieren sie durch IFN-γ Makrophagen und wirken über die beschriebene CD40L-CD40 Interaktion auf APC (11, 90, 98), andererseits tragen IL-2 und IFN-γ zur Proliferation und Differenzierung der CD8 T-Zellen bei. Die Aktivierung Neutrophiler Granulozyten fördern sie durch die Produktion von TNF und Lymphotoxin. Dagegen beruhen die Effektormechanismen der T H 2 Zellen auf der Synthese von IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13, wodurch sie eine IgE- und mastzell- bzw. eosinophilenvermittelte Immunantwort induzieren. Hierbei ist es von Bedeutung, daß IFN-γ und IL-4 bzw. IL-10 antagonistisch wirken; T H 1 und T H 2 hemmen sich also in ihren Effektorfunktionen gegenseitig (16). CD8 T-Zellen wandern nach Differenzierung zu CTL durch das Gewebe und migrieren an den Ort der Ag-Expression (41, 96). Durch die Bindung von TCR und Korezeptor an den MHC Klasse-I Molekül-Peptid-Komplex gelangt der Lymphozyt in die unmittelbarer Nähe der Zielzelle. Zusätzliche Adhäsionsmoleküle verstärken die Bindung und sichern das gerichtete und langdauernde Einwirken der Effektormechanismen (56). Wesentliche Vermittler ihrer Funktion sind die in intrazellulären Granula der CTL gespeicherten Moleküle Perforin und die Granzyme (55). Nach Bindung an die Zielzelle werden sie in den Interzellulärspalt sezerniert. Darauf bildet Perforin unselektive Kanäle in der Zytoplasmamembran der Zielzelle, wodurch ihr osmotisches Gleichgewicht gestört und ihr Absterben hervorgerufen wird. Die mitausgeschütteten Granzyme dringen durch die Kanäle in die Zielzelle, wo sie aktiviert werden und durch die Induktion von Caspasen die Apoptose der Zelle einleiten. Eine ähnliche Kaskade, die die Aktivierung von Caspasen nach sich zieht, wird durch Ligation des extrazellulären Moleküls Fas ausgelöst (57). Fas gehört in die Familie des TNF-Rezeptors (TNF-R) und bindet an Fas Ligand (FasL), dessen Expression auf CTL erhöht ist. Ein dritter Mechanismus ist die Synthese membrangebundenen und löslichen TNF-α, das seinerseits den apoptotischen Tod der Zielzelle durch Binden an die Rezeptoren, TNF-R1 und TNF-R2 auslöst (28). Schließlich syntheti-

18 3. Einleitung 12 sieren zu CTL differenzierte CD8 T-Zellen IFN-γ, dessen Wirkungsspektrum vielfältig in das spezifische und unspezifische Immunsystem eingreift. Seine Hauptfunktion besteht in der Aktivierung und Rekrutierung von Makrophagen, aber auch von NK-Zellen und Neutrophilen Granulozyten. Außerdem beeinflußt es an verschiedenen Stellen den Mechanismus, durch den Ag prozessiert und MHC-Moleküle beladen sowie exprimiert werden, und steigert daneben die Expressionsstärke von kostimulatorischen Molekülen auf APC. Weiterhin fördert es die Differenzierung zu CTL sowie die zu T H 1 Zellen und wirkt den Effektormechanismen der T H 2 Lymphozyten entgegen. Bei der Synthese opsonierender und komplementbindender Ak spielt es eine Rolle und nimmt Einfluß auf den Vaskularisationsstatus von Tumorgewebe, was zeigt, wie unterschiedlich die biologischen Funktionen dieses Zytokins sind (14, 16). 3.4 Tumorimmunologie Aufgrund der Tatsache, daß entartete Zellen vom Immunsystem prinzipiell erkannt werden können, ihm jedoch entgehen und so den Organismus stark schädigen, ist es von besonderem Interesse, seine Reaktionen auf Krebszellen aufzuklären. Ziel ist es, eine Immunantwort gegen Tumoren einzuleiten oder zu verstärken. Nach Transplantationsexperimenten mit durch Methylcholantren induzierten Tumoren konnte eine gewisse Immunität gegen die entarteten Zellen beobachtet werden. Übertragene Tumoren wurden in allogenen Mäusen wie Transplantate abgestoßen, da fremde MHC-Moleküle auf der Zelloberfläche exprimiert wurden. Entsprechend wuchsen sie nach Transfer auf syngene Tiere. Eine Immunisierung gegen einen Tumor X konnte durch vorrangehende Injektion bestrahlter, teilungsunfähiger Zellen desselben Tumors X erreicht werden. Nachdem dieser Schutz durch den adoptiven Transfer von T-Zellen auf andere Mäuse übertragen werden konnte, wurde ihnen der Effekt zugeschrieben (43, 47). In T-Zelldefizienten Mäusen konnte eine derartige Immunität hingegen nicht verzeichnet werden. Dennoch wird diskutiert, ob daneben andere Mechanismen des Immunsystems bei der Tumorbekämpfung eine Rolle spielen Tumorantigene Aufgrund dieser Experimente konnten Peptide auf Tumorzellen angenommen werden, gegen die immunisiert werden könnte, deren immunogenes Potential jedoch nicht ausreichte, eine Immunantwort zu induzieren. Sowohl von menschlichen als auch von murinen Tumoren ist es gelungen, eine Vielzahl verschiedener Ag durch Säurebehandlung zu isolieren. Außerdem ist es möglich, eine cdna-sammlung aller in einem Tumor transkribierten Gene herzustellen,

19 3. Einleitung 13 und nach deren Transfektion in MHC Klasse-I + Zellen Ag-spezifische T-Zell-Klone ausfindig zu machen (26). Diese Peptide werden als Tumorassoziierte Antigen (TAA) bezeichnet (121). Es handelt sich dabei um Fragmente von Proteinen der Tumorzelle, die u.u. an MHC-Moleküle gebunden gegenüber T-Zellen präsentiert werden. Es werden verschiedene Gruppen unterschieden: Sogenannte Stille Gene werden im Gewebe nicht oder nur in immunprivilegierten Regionen wie Testes, Plazenta und Retina translatiert (45, 111, 119). Die Ag MAGE-1 und MAGE-3, GAGE und BAGE, die beim Menschen auf manchen Melanomen und Karzinomen exprimiert werden (31), sowie P1A bei der Maus (119) gehören in diese Gruppe. Andere Ag hingegen werden ubiquitär so schwach exprimiert, daß sie keine Antwort auslösen und ignoriert werden. Durch eine erhöhte Expression auf Tumorzellen kann diese klonale Ignoranz durchbrochen werden. Thyrosinase, MART1, gp75 und gp100 zählen zu den menschlichen, TRP-2 zu den murinen Vertretern dieser auch als Differenzierungsantigene bezeichneten TAA. Sie werden in den Melanozyten der Haut, aber auch auf Melanomen exprimiert. Außerdem können TAA als Folge von Genmutationen neu auftreten. Die daraus resultierenden Proteine können den Entartungsprozeß direkt unterhalten, wie es bei aktivierten Onkogenen (Ras-Mutation) und mutierten Tumorsuppressorgenen (p53-mutation) der Fall ist, müssen jedoch nicht damit in Verbindung stehen. Desweiteren können Proteine durch posttranslationale Modifikation verändert exprimiert werden, wie es im Fall der TAA GM2, GD2 und GD3 auf Melanomen, bzw. MUC-1 auf Pankreas- und Mammatumoren zutrifft. Auch die Tumormarker CA-125 und CA-19-9 zählen zu dieser Gruppe. Bei viral verursachten Tumoren (z.b. durch SV40, EBV und HPV) werden virale Ag präsentiert. Schließlich besteht die Möglichkeit der Expression fetaler Peptide (onkofetale Antigene), wie z.b. dem α-fetoprotein (AFP) und dem Karzinoembryonalen Ag (CEA), die im adulten Organismus nicht synthetisiert werden. Zwar können nicht gegen alle identifizierten TAA reaktive T-Zellen gefunden werden, dennoch stellen sie Kandidaten dar, die bei der immuntherapeutischen Behandlung von Tumoren mit in Betracht gezogen werden können Immunantwort gegen Tumoren Ein beträchtliches Repertoire von TAA, die potentiell in eine Immuntherapie einbezogen werden könnten, bleibt dem Immunsystem jedoch verborgen. Die dennoch nachgewiesene gegen Tumorzellen gerichtete Immunität wird, wie aus den anfangs beschriebenen Experimenten hervorgeht, wesentlich durch T-Lymphozyten vermittelt (43, 47). Dabei ist entscheidend, daß fast alle genannten Ag MHC Klasse-I Molekül assoziiert präsentiert werden und demnach

20 3. Einleitung 14 CD8 T-Zellrestringiert sind. Bei der Aktivierung dieser T-Zellen spielen APC eine entscheidende Rolle, wobei sie die Fähigkeit zur Cross-Präsentation haben und ein ausreichendes kostimulatorisches Potential gewährleisten müssen. Einmal differenzierte tumorspezifische CTL können TAA auch ohne Kostimulation auf den Tumorzellen erkennen und angreifen. Die Rolle von CD4 T-Zellen bei der Elimination von Tumoren hingegen ist unklar. Im Fall des TAA Thyrosinase, dessen Expression im Kontext von MHC Klasse-I und MHC Klasse-II Molekülen nachgewiesen werden konnte, ist eine direkte Beteiligung dieser T-Zellen gezeigt worden. Aus Tierexperimenten geht hervor, daß eine durch CD40-CD40L Interaktion verstärkte Kostimulation durch APC in einigen Systemen erforderlich ist, die durch CD4 T-Lymphozyten gewährleistet werden könnte. Eine Beeinflussung des Tumorwachstums durch die von ihnen sezernierten Zytokine TNF-α und INF-γ ist wahrscheinlich (9, 87, 118). Gegen eine Vielzahl verschiedener Tumoren konnten außerdem spezifische Ak im Serum nachgewiesen werden. Diese scheinen bei der Elimination von Tumoren jedoch gegenüber T-Lymphozyten eine untergeordnete Rolle zu spielen, da sie trotz ihres Vorkommens keine effiziente Abstoßung des entarteten Gewebes hervorrufen. Ein von Ak unabhängiger Einfluß von B-Lymphozyten auf die Tumorimmunität ist hingegen im Tiermodell beschrieben worden. Es stellte sich heraus, daß diese Zellen einen hemmenden Effekt auf T H 1 Zellen ausübten, der in dem untersuchten System für das Absterben der Tumorzellen in vivo verantwortlich war (88). Ihre Relevanz konnte jedoch lediglich bei der CD4 T-Zell-abhängigen Tumorabstoßung im Tiermodell nachgewiesen werden. Trotz ihres ineffektiven Angreifens an den Tumorzellen, bestehen Bestrebungen, Ak bei immuntherapeutischen Behandlungsverfahren einzusetzen (62). Die Rolle des unspezifischen Immunsystems bei der Tumorbekämpfung ist ebenfalls unvollständig geklärt. NK-Zellen spielen eine Rolle bei der Kontrolle verschiedener Tumoren, was im Mausmodell nachgewiesen werden konnte (109). Nach ihrer Stimulation durch IL-12 und IL-2 können sie als Lymphokin aktivierte Killerzellen (LAK) im adoptiven Transfer gegen Tumoren eingesetzt werden (91). Sie können Tumorzellen aufgrund bestimmter Oberflächenmoleküle erkennen und sie durch die Ausschüttung von Perforin und Granzymen lysieren (120). Dabei fördert eine geringe MHC Klasse-I Expression, wie sie häufig auf Tumorzellen beobachtet wird, die Erkennung durch die NK-Zellen. In Anbetracht der Tatsache, daß sie neben T-Zellen die zweite entscheidende IFN-γ-produzierende Zellpopulation darstellen, wird ihre Beteiligung an einer Tumorimmunität auch in diesem Zusammenhang diskutiert. Dennoch ist ihre Funktion bei der Immunantwort gegen Tumoren nicht eindeutig, da aus Tierexperimenten

21 3. Einleitung 15 hervorgeht, daß Tiere ohne Lymphozyten, jedoch mit intakten NK-Zellen eine erhöhte Inzidenz für Tumoren aufweisen (99). Neben NK-Zellen scheinen auch Makrophagen bei der Immunität gegenüber Tumoren eine Rolle zu spielen. Aus in vitro-versuchen ist bekannt, daß aktivierte Makrophagen Tumorzellen direkt abtöten können. Sie wirken über Sauerstoffradikale, Stickstoffmonoxyd (NO) und TNF direkt auf ihre Zielzellen und beeinflussen auf der anderen Seite durch die Sekretion von IL-12 die zelluläre Immunabwehr (38, 68). Schließlich konnte auch für die zum unspezifischen Immunsystem gehörenden γδ-t-zellen eine antitumorale Wirkung beschrieben werden (40, 79) Möglichkeiten der Tumorzellen, dem Immunsystem entgehen Eines der Hauptprobleme bei der Kontrolle von Tumoren besteht in ihrer Fähigkeit, das Immunsystem auf verschiedene Arten zu supprimieren bzw. ihm zu entgehen (103). Als Resultat einer erhöhten Instabilität der Zellen bei der Replikation bilden sich unter dem Druck der endogenen Immunität, der medikamentösen wie der immuntherapeutischen Behandlung häufig Zellvarianten aus, deren Immunogenität stark herabgesetzt ist. Dadurch selektieren diejenigen Zellklone heraus, die eine ausreichende Resistenz entwickelt haben. Viele Tumorzellen exprimieren wenige bis keine MHC Klasse-I Moleküle und sind infolgedessen für T-Lymphozyten nicht zu erkennen. So können z.b. die Untereinheiten des MHC- Moleküls vermindert translatiert oder funktionsuntüchtige TAP oder Proteasomen exprimiert werden. Experimente mit Tumorzellen, deren MHC Klasse-I Molekülexpression durch Transfektion oder unter INF-γ-Behandlung erhöht wurde, bestätigten eine verstärkte Immunogenität in vivo. In vitro konnte eine vermehrte Lyse dieser Zellen durch spezifische CTL im Zytotoxizitätstest nachgewiesen werden. Teilweise wird jedoch ausschließlich die Expression des MHC-molekülassoziierten TAA vermindert. Dazu kommt es z.b. bei in vitro-experimenten nach Kultivierung mit tumorspezifischen Ak oder -CTL. Außerdem ist aus Mausmodellen bekannt, daß die Expression des TAA nach repetitiver Transplantation eines Tumors in verschiedene syngene Inzuchttiere oder nach dem adoptiven Transfer reaktiver CTL herabgesetzt wird (85). Ein weiterer Mechanismus, sich dem Immunsystem zu entziehen, ist die Synthese immunsuppressiver Substanzen, wie TGF-β (Tumor growth factor-β) (89) oder FasL (108). TGF-β hemmt die Proliferation und Differenzierung von Makrophagen und T-Zellen, wohingegen die Bindung von FasL der Tumorzelle an Fas der Leukozyten deren Apoptose induziert. Schließlich sind zu einer effektiven CTL-vermittelten Immunantwort kostimulatorische Signale gegenüber den T-Zellen notwendig. Diese können durch APC gewährleistet werden, müssen bei

22 3. Einleitung 16 unzureichender Aufnahme des TAA jedoch anderweitig gesichert werden. Da Tumorzellen in der Regel keine kostimulatorischen Moleküle exprimieren, kann eine Aktivierung der T-Zellen durch die Tumorzellen nicht erfolgen. Stattdessen wird deren Anergie induziert (106, 117). Zusätzlich fehlt meist die Präsentation MHC Klasse-II Molekülassoziierter Ag, wodurch eine Verstärkung der kostimulatorischen Signale auf den APC durch CD4 T-Zellen verhindert wird Immuntherapie von Tumorerkrankungen Nachdem bekannt ist, daß Tumorzellen prinzipiell vom Immunsystem angreifbar sind, und daß es ein Charakteristikum der malignen Entartung ist, dieser Kontrolle zu entgehen, kann die Forderung nach immunmodulatorischen Therapieverfahren gestellt werden. Diese sollten spezifisch eine gegen den Tumor gerichtete Reaktion einleiten bzw. verstärken, ohne den Organismus durch Nebenwirkungen weiter zu schwächen. Bis heute sind verschiedene Methoden entwickelt worden, die sich im Tiermodell als vielversprechend erwiesen, im Menschen jedoch nur teilweise Erfolge aufgezeigt haben. Prinzipiell läßt sich die aktive Stimulation des Immunsystems von der passiven Immunisierung unterscheiden. Durch den ersten Ansatz soll auf verschiedene Weise eine endogene, tumorspezifische Reaktion eingeleitet werden: Einerseits soll gegen bestimmte TAA geimpft werden, um CTL zu generieren. Die Injektion isolierter TAA, bzw. einer Mischung verschiedener TAA in Adjuvantien erfüllen diese Forderung experimentell. Dabei ist entscheidend, daß TAA von APC aufgenommen und effizient präsentiert werden. Neben der gleichzeitigen Applikation mit Adjuvantien konnte gezeigt werden, daß die Kopplung des Ag an Vektoren diesen Prozeß fördert. Dies wurde für an Latex- bzw. Eisenpartikel, oder auch an bakterielle Toxine gebundene Ag bestätigt (36, 48, 49). Außerdem konnte in verschiedenen Modellen nachgewiesen werden, daß aus Tumorzellen isolierte Hsp-Peptid-Komplexe effektiv eine Cross-Präsentation des TAA hervorrufen können (22). Schließlich besteht die Möglichkeit Vorläuferzellen von DC zu isolieren, in vitro zu reifen und mit dem TAA zu beladen oder mit für TAA-codierender cdna zu transfizieren und zu reinjizieren (66, 78). Ein anderer Ansatz besteht in der Vakzinierung mittels genetisch modifizierter Tumorzellen. Diese können Zytokine z.b. sezernieren (IL-2, IFN-γ, GMCSF [Granulozyten-Makrophagen Kolonie stimulierender Faktor] und IL-12) oder membrangebunden darbieten. Für derart veränderte Tumore konnte ein fehlendes bzw. vorrübergehendes Wachstum gezeigt werden. Die Transfektion kostimulatorischer Moleküle brachte ähnliche Resultate. Daneben besteht die Möglichkeit, Zytokine wie GM-CSF, IL-2, TNF, IL-12 oder

23 3. Einleitung 17 IL-6 systemisch bzw. lokal zu applizieren, um eine Immunantwort zu forcieren. Eine unspezifische Stimulation durch polyklonale anti-cd3 Ak ist ebenfalls möglich. Die zweite Möglichkeit immuntherapeutisch gegen Tumoren vorzugehen, besteht in der passiven Immunisierung durch Injektion spezifischer Zellen oder Ak. Dazu können Lymphozyten aus dem Patientenblut isoliert und in vitro z.b. durch IL-2 zu LAK expandiert und aktiviert werden. Nach Reinjektion dieser Zellen konnten Erfolge bei der Behandlung verzeichnet werden (91, 92). Aus Tumoren isolierte infiltrierende Lymphozyten können ebenso stimuliert und eingesetzt werden (86). Um hingegen tumorspezifische Ak repetitiv applizieren zu können, müssen sie in ihrem Fc-Teil an den Empfängerorganismus adaptiert werden, um eine Abstossung des speziesfremden Immunglobulins zu verhindern. Sie können dann als Vektoren eingesetzt werden und zelltoxische Substanzen direkt an die Zielzelle binden (62). So werden z.b. Substanzen wie Pseudomonastoxin oder Rizin A an Ak gekoppelt als Immuntoxine verabreicht, aber auch Radioisotope zur lokalen, intrakorporalen Bestrahlung eingesetzt. Bei allen genannten Verfahren besteht die Gefahr, eine autoimmunologische Nebenreaktion hervorzurufen, die dann auftreten kann, wenn das TAA auch auf anderen Geweben als dem Tumor exprimiert wird (66). Außerdem können alle beschriebenen Therapien die Selektion behandlungsresistenter Tumorzellvarianten hervorrufen, was den notwendigen Anwendungszeitraum verkürzte und eine Fortsetzung unmöglich machen würde. Es erscheint deshalb sinnvoll zu sein, verschiedene Ansätze untereinander sowie mit herkömmlichen Chemotherapieverfahren und nuklearmedizinischen Methoden zu kombinieren, um diese unerwünschte Nebenwirkung zu vermeiden. 3.5 Das B16 GP33 Melanommodell Vielfach werden Tiermodelle verwendet, um die Mechanismen, durch die eine Immunantwort gegenüber Tumoren aufgebaut werden kann, zu untersuchen. Die Beobachtung der Tumoren bzw. ihrer Metastasen in Inzuchttieren, Gen-Knock-out Varianten und Transgenen Linien ermöglicht es, bestimmte Funktionen des Immunsystems detailliert zu betrachten. Beim B16 GP33 -Melanommodell handelt es sich um eine Transfektante des murinen Melanoms B16. Dieser in C57BL/6 Mäusen (B6, Haplotyp H-2 b ) spontan aus Melanozyten entstandene Tumor konnte isoliert und in vitro kultiviert werden (39). Nach subkutaner (s.c.) Injektion der Zellen in syngene Empfängertiere wurde bei der Linie B16.F1 eine Lungenmetastasierung beobachtet. Die wiederholte Isolierung der Tumorzellen aus dem Lungengewebe und deren Rekultivierung steigerte nach erneuter Applikation das Bestreben des Metastasierungsprozes-

24 3. Einleitung 18 ses in die Lunge drastisch, wodurch sich der Klon B16.F10 (im Folgenden mit B16 bezeichnet) ergab. Nach intravenöser (i.v.) Injektion von B16-Zellen werden ausschließlich Lungenmetastasen induziert. Die genauere phänotypische Charakterisierung der Zellen zeigte eine fehlende Expression von MHC Klasse-II Molekülen ( I-A b ), der kostimulatorischen Moleküle B7.1 und B7.2, von LFA-1, CD40L und ICAM-1. MHC Klasse-I Moleküle (K b D b ) werden in geringem Ausmaß, die Oberflächenmoleküle CD44 und CD40 dagegen deutlich exprimiert. Unter IFN-γ-Einwirkung konnte in vitro eine vermehrte Expression beider MHC-Moleküle beobachtet werden (17, 76). B16 exprimiert das TAA H52 (50), was jedoch keine spezifischen CTL induziert. 250 Anzahl der Lungenmetastasen B6 TCR-tg.IFN-γ TCR-tg B6.IFN-γ TCR-tg.IFN-γ TCR-tg B6 B6 B6.IFN-γ B6.IFN-γ Abb.1: Anzahl von B16 GP33 -Lungenmetastasen in Abhängigkeit von IFN-γ nach Behandlung der Tiere durch den adoptiven Transfer von TCR-tg IFN-γ defizienten und kompetenten CTL. Als Kontrollen dienten unbehandelte B6-und B6.IFN-γ -Mäuse (modifiziert nach Prévost-Blondel A et al. (85) ). Um den Einfluß von CD8 T-Zellen auf den Tumor besser erfassen zu können, wurden B16-Zellen mit einem Konstrukt, das das immundominante Epitop GP33 des Lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV) enthielt, transfiziert. Die daraus entstandenen B16 GP33 -Zellen zeigten eine kontinuierliche Expressionsstärke des GP33-Ag und wurden im Zytotoxizi-

25 3. Einleitung 19 tätstest durch GP33-spezifische, T-Zellrezeptortransgene (TCR-tg) CTL spezifisch lysiert. In seinem Phänotyp unterscheidet sich B16 GP33 nicht von der parentalen B16-Zellinie (86). Bei in vivo-experimenten stellte sich heraus, daß dem Zytokin IFN-γ bei der Elimination der Lungenmetastasen eine Schlüsselfunktion zukommt. So konnte in B6-Tieren gezeigt werden, daß durch transferierte TCR-tg CTL die Eliminierung von B16 GP33 -Lungenmetastasenzahl möglich war. Der adoptive Transfer von IFN-γ kompetenten TCR-tg CTL in IFN-γ -Tiere reduzierte ihre Anzahl lediglich auf ca.100, wohingegen keine Reduktion nach Injektion von aktivierten IFN-γ defizienten TCR-tg T-Zellen in B6.IFN-γ -Mäuse verzeichnet wurde (Abb.1). Der Erfolg des beschriebenen adoptiven Transfers war also von der IFN-γ-Synthese des Empfängertieres und nicht von den transferierten CTL abhängig (85). 3.6 Fragestellung Der im vorrangegangenen Abschnitt beschriebene Einfluß des endogenen IFN-γ auf das Gelingen der Behandlung durch einen adoptiven Transfer von TCR-tg CTL sollte in der folgenden Arbeit genauer untersucht werden. Die in 3.5 genannten Transferexperimente sollten in den Mauslinien B6 und B6.IFN-γ wiederholt werden. Es hatte sich gezeigt, daß der Transfer von in vitro aktivierten TCR-tg T-Zellen nötig war, um die Abstoßung von B16 GP33 -Tumoren spezifisch einzuleiten. Als entscheidendes Effektormolekül hatte sich endogenes IFN-γ des Empfängertieres erwiesen. Ausgehend von der Annahme, daß die transferierten T-Zellen eine gegen den Tumor gerichtete Reaktion lediglich auslösten, diese jedoch vom Immunsystem des Empfängertieres selbst bewerkstelligt wurde, sollten mögliche Unterschiede in An- und Abwesenheit von IFN-γ erarbeitet werden. Dazu sollte die immunhistochemische Färbung von verschiedenen Zellpopulationen in B16 GP33 -Lungenmetastasen etabliert und angewendet werden, um mögliche Effekte von IFN-γ auf tumorinfiltrierende Zellen zu untersuchen.

26 4. Material und Methoden Material und Methoden 4.1 Mäuse C57BL/6 (B6) (Haplotyp H-2 b ) Mäuse wurden von Harlan Winkelmann (Borchen, Deutschland) bezogen. Aus eigener Zucht wurden Interferon-γ defiziente B6-Mäuse (B6.IFN-γ ) verwendet. Diese wurden sechs Mal auf den genetischen Hintergrund von B6-Mäusen zurückgekreuzt und synthetisieren kein IFN-γ. Weiterhin standen aus eigener Zucht P14 T-Zell Rezeptor transgene (TCR-tg) Mäuse der Linien 318 sowie der Linie 327 zur Verfügung. Die CD8 T-Zellen dieser Tiere exprimieren zu 40-60% bzw. 90% den TCR des Klones P14, der das H-2D b -restringierte Epitop GP33 des Glykoproteins des Lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV) spezifisch erkennt. Das GP33-Epitop umfaßt die Aminosäuren des Glykoproteins von LCMV (82). Für die Experimente wurde die TCR-tg Linie auf den Hintergrund von B6.IFN-γ zurückgekreuzt (TCR-tg.IFN-γ ). Alle Versuchstiere wurden in den Ställen des Institutes für Mikrobiologie und Hygiene sowie des Neurozentrums der Universität Freiburg i. Br. unter konventionellen Bedingungen gehalten und im Alter von 4-8 Wochen für die Experimente verwendet. 4.2 Zellinien Die murine Melanomlinie B16.F10 (im Folgenden B16 genannt) wurde von T. Blankenstein (Max-Delbrück-Zentrum für molekulare Medizin, Berlin) zur Verfügung gestellt. Dies ist die gering immunogene Tochtergeneration der Linie B16.F1, die durch zehnmalige Rekultivierung von Zellen aus Lungenmetastasen gewonnen wurde (39). B16 GP33 -Zellen wurde durch Transfektion der parentalen Tumorlinie B16 mit dem GP33-Expressionsvektor hergestellt (Cellgenix, Freiburg i. Br.). Um eine selektive Kultivierung der transfizierten Zellinie zu gewährleisten, wurde ein Gen eingefügt, das für die Resistenz gegen das Antibiotikum Neomycin kodiert (86). Beide Tumorzellinien waren nicht mit Mykoplasmen infiziert.

27 4. Material und Methoden Zellbiologische Methoden Medien zur Zellkultur DMEM-Grundmedium DMEM in H 2 O gelöst Biochrom, Berlin 0,75% NaHCO 3, ph 7,2 DMEM-Kulturmedium DMEM-Grundmedium 10% hitzeinaktiviertes FKS Life Technology, Wiesbaden 2 mm L-Gln Life Technology, Wiesbaden 100 U/ml P/S Life Technology, Wiesbaden IMDM-Grundmedium IMDM in H 2 O gelöst Life Technology, Wiesbaden 0,3% NaHCO 3, ph 7,2 IMDM-Kulturmedium IMDM-Grundmedium 10% hitzeinaktiviertes FKS Life Technology, Wiesbaden 2 mm L-Gln Life Technology, Wiesbaden 100 U/ml P/S Life Technology, Wiesbaden In vitro Stimulation-Medium IMDM-Kulturmedium 5x10-5 M β-mercaptoethanol Fluka, Ulm Kultivierung von Tumorzellinien B16-Zellen wurde in DMEM-Kulturmedium in einem Feuchtinkubator bei 37 C und 5% CO 2 kultiviert. Sie wurden ausverdünnt, sobald sich ein konfluenter Rasen gebildet hatte. Dazu wurde das Medium abgesaugt und 2,5 ml doppeltkonzentrierte Trypsin-EDTA-Lösung (Life Technology, Wiesbaden) in die Kulturflasche gegeben. Nachdem sich die adhärenten Zellen nach etwa 2 min durch zusätzliches leichtes Schlagen gegen den Rand der Kulturflasche vollständig vom Boden gelöst hatten, wurde die Trypsinreaktion durch Zugabe von 2,5 ml DMEM-Kulturmedium abgestoppt. 500 µl dieser Lösung wurde in eine neue Kulturflasche übertragen, die mit 15 ml DMEM-Kulturmedium aufgefüllt wurde. Um das selektive Wachstum der B16 GP33 -Zellen zu gewährleisten, wurden 1mg/ml des Antibiotikums Neomycin (G418-Sulfat, Life Technology, Wiesbaden) in das DMEM-Kulturmedium zugegeben. Die Bedingungen der Kultur unterschieden sich ansonsten nicht von denen der B16-Zellen.

28 4. Material und Methoden Einfrieren von Zellen Zur längeren Lagerung bestand die Möglichkeit, die Zellen in flüssigem Stickstoff (-170 C) aufzubewahren. Sie mußten in einem möglichst schonendem Verfahren gefroren werden. Dazu wurden je 1x10 7 der trypsinierten Zellen in 1ml eiskaltem DMEM-Kulturmedium aufgenommen, dem 20% FKS zugegeben wurden; zusätzlich wurden 10% DMSO in das Medium gemischt. Die Zellen wurden in einer mit Isopropanol gefüllten Einfrierbox bei 70 C eingefroren. Dieses Verfahren gewährleistete ein langsames Einfrieren ohne die Bildung von Kristallen Auftauen von Zellen Um in Stickstoff gelagerte Zellen zu rekultivieren, mußten sie schnell aufgetaut werden. Zur Entfernung des bei RT zytotoxischen DMSO wurden sie in DMEM-Kulturmedium aufgenommen und für 10 min bei 1100 rpm zentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen in DMEM-Kulturmedium unter den genannten Bedingungen gehalten. Nach etwa einer Woche konnte die Kultur der B16 GP33 -Zellen in Selektionsmedium weitergeführt werden Intravenöser Tumorzelltransfer Adhärenten Tumorzellen wurden bei Vorliegen eines konfluenten Zellrasens wie oben beschrieben trypsiniert. Nach zehnminütigem Zentrifugieren bei 1100 rpm und 4 C wurden die Zellen in FKS-freiem DMEM-Medium resuspendiert. Dieser Waschvorgang wurde drei Mal wiederholt. Schließlich wurden die Tumorzellen mehrmals in 2 ml FKS-freiem DMEM-Medium resuspendiert und durch ein steriles Nylonnetz mit einer Maschenweite von 100µm (Cell strainer, FALCON, Becton Dickinson, New Jersey, USA) gefiltert, um die Suspension von verklumpten, abgestorbenen Zellen zu befreien. Mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer wurde die Zellzahl folgendermaßen festgestellt: Ein definiertes Volumen der Tumorzellsuspension wurden mit 2%-iger Trypanblaulösung (Merck, Darmstadt) verdünnt und abgestorbene Zellen auf diese Weise blau angefärbt. Damit wurde die Zählkammer beladen, und die Zahl lebender Zellen in 16 großen Quadraten festgestellt. Die Zellzahl pro ml wurde daraufhin nach folgender Formel berechnet: gezählte Zellzahl x Verdünnungsfaktor x 10 4 =Zellzahl pro ml Nach der genannten Methode wurde eine Zellzahl von 2x10 6 pro ml eingestellt und jeweils 500 µl davon nach Erwärmen der Mäuse unter einer Infrarotlampe in deren laterale Schwanzvene injiziert.

29 4. Material und Methoden Herstellen einer Einzelzellsuspension Die Organe wurden entnommen und direkt im Anschluß in 5 ml IMDM-Kulturmedium aufgenommen. Unter sterilen Bedingungen wurden sie in einer Petrischale mit einem Spritzenstempel durch ein feines Metallnetz gedrückt. Das Netz wurde anschließend mit weiteren 5 ml IMDM-Kulturmedium mehrmals durchgespült, und die Zellsuspension aufgenommen. Nachdem sich nach 2 min größere Zelltrümmer abgesetzt hatten, wurde der Überstand abgenommen und zwei Mal in IMDM-Kulturmedium gewaschen. Die Zellzahl wurde mit Hilfe der Neubauer-Zählkammer eingestellt In vitro-stimultion TCR-tg Milzzellen Aus TCR-tg- bzw. TCR-tg.IFN-γ -Mäusen wurde die Milz entnommen, und eine Einzelzellsuspension des Gewebes hergestellt. Die Zellen wurden einmal gewaschen und in IMDM- Kulturmedium, dem 5x10-5 M β-merkaptoethanol zugefügt worden war, resuspendiert. Nachdem eine Zellzahl von 1x10 6 Milzzellen pro ml eingestellt worden war, wurden je 1ml der Zellsuspension pro Loch einer 24-Lochplatte pipettiert. Weiterhin wurden 100µl 1x10-6 M GP33 pro ml dazugegeben und durch leichtes Klopfen gegen den Plattenrand mit den Zellen vermischt. Dieser Ansatz wurde für drei Tage im Feuchtinkubator bei 37 C und 5% CO 2 inkubiert (85) Adoptiver Transfer in vitro stimulierter TCR-tg Zellen Die proliferierten Zellen wurden aus der Lochplatte aufgenommen und drei Mal in FKS-freiem IMDM-Kulturmedium gewaschen. Danach wurde eine Zellzahl von 2x10 7 pro ml eingestellt. Vor dem adoptiven Transfer wurden ca. 1x10 6 Zellen mit Cycrome (Cy) -markierten CD8-spezifischen, Phycoerythrin (PE) markierten Vα2-spezifischen und Fluoreszeinisothiozyanat (FITC) markierten Vβ8.1-spezifischen Antikörpern (Ak) inkubiert (siehe 5.3.9), um den Anteil transgener CD8 T-Zellen festzustellen. Bei der folgenden durchflußzytometrischen Analyse waren reproduzierbar ca % der CD8 T-Zellen Vα2 + Vβ Nach Erwärmen der Mäuse unter einer Rotlichtlampe wurden je 1x10 7 der stimulierten Milzzellen in die dilatierte laterale Schwanzvene der Tiere injiziert.

30 4. Material und Methoden Durchflußzytometrie Verwendete Puffer Zell-Puffer PBS ohne Ca 2+ und Mg 2+ 0,1% NaN 3 SIGMA-Aldrich GmbH, Steinheim 2% FKS Life Technology, Wiesbaden Blut-Puffer Zell-Puffer 2 U/ml Liquemin Roche, Basel Lyse-Puffer 10% Lysing buffer Becton Dickinson in ddh 2 O Analyse von Zellen aus lymphatischen Organen Aus dem betreffenden Organ wurde eine Einzelzellsuspension erstellt, wovon ca Zellen pro Röhrchen eingesetzt wurden. Abhängig vom jeweiligen Ak wurden 0,15-8 µl des Immunglobulins pro 100µl Zellpuffer angesetzt. Nachdem die Zellen für 8 min bei 1100 rpm und 4 C zentrifugiert worden waren, wurde das Zellpellet mit 100µl der Ak-Lösung vermischt und auf Eis für 15 min inkubiert. Anschließend wurden die Proben in Zellpuffer resuspendiert und erneut zentrifugiert. Wurden zur Färbung biotinylierte Ak verwendet, mußte dieser Waschschritt einmal wiederholt werden. Streptavidin-PE (Biotinbindendes Protein, das mit PE gekoppelt ist) wurde darauf in einer Konzentration von 0,25µl pro 100µl und Pellet zugegeben und erneut für 15 min auf Eis inkubiert. Nach einem letzten Waschschritt wurde der Überstand bis auf ein Restvolumen von 500µl abgesaugt und die Zellen in einem Durchflußzytometer (FACScan, Becton Dickinson, Mountain View, Ca) unter Verwendung der CELLquest Software analysiert Analyse von Zellen aus dem peripheren Blut Vor der Blutentnahme wurden die Mäuse für einige Minuten unter einer Rotlichtlampe erwärmt, um eine Dilatation der Gefäße zu erreichen. Die laterale Schwanzvene wurde mit einer Rasierklinge inzisiert und 3-5 Tropfen Blut pro Röhrchen in Blut-Puffer aufgenommen. Nachdem die Proben für 8 min bei 1100 rpm und 4 C zentrifugiert worden waren, wurde der Überstand abgesaugt, das Pellet wie oben beschrieben mit den Antikörpern inkubiert und darauf mit Blut-Puffer gewaschen. Schließlich wurde das Pellet in 1ml Lyse-Puffer resuspendiert und für 5 min lichtgeschützt bei Raumtemperatur inkubiert. Bei der Messung störende Erythrozyten konnten auf diese Weise lysiert werden. Das Zelllysat wurde mit Blut-Puffer

31 4. Material und Methoden 25 gewaschen und der Überstand bis auf 500 µl abgesaugt, welche wie oben zur Messung eingesetzt wurden Analyse von B16-Tumorzellen Die B16- bzw. B16 GP33 -Zellen wurden durch Trypsinieren aus den Kulturflaschen gelöst und eine Zellzahl von 10 6 pro Röhrchen eingestellt. Nach 15 minütiger Inkubation mit dem H52- spezifischen Ak M562 (murines IgM) wurden die Zellen zwei Mal in Zell-Puffer gewaschen und darauf mit einem biotinylierten Kaninchen-anti-Maus-IgM Ak inkubiert. Die Zellen konnten nach Binden von Streptavidin-PE wie in im Durchflußzytometer analysiert werden CFSE-Markierung von Milzzellen Nachdem aus Milzgewebe eine Einzelzellsuspension erstellt worden war, wurden die Zellen in eiskaltem PBS gewaschen und eine Konzentration von 5x10 6 Zellen pro ml eingestellt. Je 1µl des fluoreszierenden Farbstoffes 5,6-Carboxyfluoreszein-Diacetat-Succinimidyl-Ester (CFSE, Molecular Probes, Eugene, OR) wurden zu der Zellsuspension gegeben, und für 10 min bei 37 C unter leichtem Schütteln inkubiert (125). CFSE bindet an intra- und extrazelluläre Moleküle, wodurch die Aktivität der Zellen unbeeinflußt bleibt, und wird pro Teilung jeweils zur Hälfte an die Tochterzelle abgegeben. Anhand der Intensitätsminderung kann die Zahl der Zellzyklen festgestellt werden. Zum Abstoppen der Markierung wurden die Zellen einmal in IMDM-Grundmedium gewaschen. 4.4 Histologie und Immunhistochemie Präparation des Lungengewebes Die Mäuse wurden mittels einer intraperitonealer Injektion von 200 µl Narkodorm-n (Alvetra GmbH, Neumünster; Wirkstoff: Pentobarbital) für 5 min anästhesiert, woraufhin die Femoralgefäße der Mäuse perforiert wurden, um die Tiere auszubluten. Nach Entfernen des Fells über Abdomen, Thorax und dem Zervikalbereich, wurden die Bauchhöhle eröffnet sowie die Trachea dargestellt. Mittels Punktion des Zwerchfells in der Herzregion wurde der Pleuraspalt belüftet, wodurch eine Entfernung dieses Muskels möglich wurde, ohne das Lungengewebe zu beschädigen. Die Trachea wurde daraufhin längs mit einem Skalpell distal des Kehlkopfes eröffnet. Durch die intratracheale Injektion von Jung Tissue-Freezing Medium (Leica Instruments GmbH, Nußloch, Deutschland), das im Verhältnis 1:1 mit PBS verdünnt worden war,

32 4. Material und Methoden 26 wurden die Lungenflügel aufgebläht. Um ein Auslaufen des Einbettmediums zu verhindern, wurde distal des Schnittes ein Klemmchen angesetzt. Der knöcherne Brustkorb wurde entfernt, und die Lunge herauspräpariert, ohne sie zu verletzten Einfrieren von Gewebe Die Lunge wurde in gerade auftauendem Hexan (ca. -70 C) (Merck, Darmstadt) gefroren. Die harten Lungenflügel konnten daraufhin auseinandergebrochen werden. Diese Fragmente wurden gegebenenfalls weiter zerschnitten und auf einen Streifen Whatman-Filterpapier gelegt. Nach Überschichten mit unverdünntem Jung Tissue-Freezing Medium wurde das Präparat erneut gefroren. Die eingebetteten Organfragmente wurden von diesem Zeitpunkt an bei 70 C aufbewahrt. Im Fall von Milz- und Lebergewebe wurde das herausgelöste Organ mit einer Rasierklinge zerteilt, ohne vorheriges Frieren auf Filterpapier aufgefroren und bei 80 C gelagert Beschichtung der Objektträger Da die Lungenschnitte nicht auf herkömmlichen Objektträgern hafteten, mußten diese beschichtet werden. Dazu wurden gereinigte Objektträger (R.Langenbrinck, Emmendingen, Deutschland) für 5 min bei Raumtemperatur in Azeton (Merck, Darmstadt, Deutschland) gewässert und danach weitere 5 min in eine 2 %-igen Lösung aus 3-Aminopropylriethoxy-Silan (APES, Sigma Chemical Co., St.Louis, USA) und Azeton gestellt. Nachdem sie zwei Mal kurz in ein drittes Azetonbad getaucht worden waren, wurden sie für 15 min bei Raumtemperatur getrocknet. Es folgten zwei je fünfminütige Waschschritte in ddh 2 O. Danach wurden die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur staubfrei getrocknet und weiterhin ebenso gelagert. Da durch die Beschichtung mit APES die Färbungseigenschaften aller verwendeten Antikörper erhalten blieben, wurden die Präparate aller anderen Organe weiterhin auf herkömmlichen gebrauchsfertigen Objektträgern aufgenommen Präparation histologischer Gefrierschnitte Am Kryostat (Typ220, SLEE, Mainz, Deutschland) wurden bei 25 C von den eingefrorenen Geweben 5-7 µm dicke Schnitte angefertigt. Diese wurden auf Objektträger aufgenommen und bei Raumtemperatur über Nacht getrocknet. Danach folgte deren Fixation für 10 min in eiskaltem Azeton bei 20 C. Nachdem sie erneut für 1 h bei RT getrocknet waren, wurden die Schnitte mit einem Fettstift eng umrandet und entweder staubfrei bei 20 C gelagert oder so-

33 4. Material und Methoden 27 fort weiterverarbeitet. Eingefrorene Schnitte mußten zur Färbung vollständig getrocknet sein und wurden deshalb vorher über Nacht bei Raumtemperatur aufbewahrt Färbung der Gewebeschnitte mit Antikörpern Die fixierten und getrockneten Schnitte wurde vor der Färbung für 2 min in Tris-Puffer ph 7,5 (0,1 M Tris/HCl in Aqua dest., ph 7,5; Sigma Chemical Co., St.Louis, USA ) rehydriert. Um endogene Biotinvorkommen zu blockieren, wurde das DAKO Biotin Blocking System (DAKO Corporation, Carpinteria, USA) verwendet. Dazu wurden die Schnitte für 10 min in einer Feuchtkammer mit Avidin bedeckt, worauf zwei je fünf min dauernde Waschschritte in Tris-Puffer PH 7,5 folgten. Nun wurden sie für 10 min mit Biotin inkubiert und weitere 10 min in Tris-Puffer ph 7,5 gewässert. Im ersten Schritt wurde auf diese Weise endogen synthetisiertes Biotin mit Avidin gesättigt, dessen freie Bindungsstellen im zweiten Schritt vollständig durch Biotin besetzt wurden. In einem weiteren Blockierungsschritt wurden die Lungenschnitte mit einem FcγII/III-Rezeptor (FcγII/IIIR)-spezifischen Ak (2.4G2) inkubiert, um die Bindung der detektierenden Ak an diesen auf Alveolarmakrophagen exprimierten Rezeptoren zu verhindern. Nach erneutem Waschen folgte die Inkubation mit dem nachweisenden, biotinylierten Ak für 60 min, woraufhin die Präparate jeweils zwei Mal für 5 min in Tris-Puffer ph 7,5 gewaschen wurden. An die freien Biotinenden der Ak konnte in einem 30 min dauerndem Inkubationsschritt das an Streptavidin gekoppelte Enzym Alkalische Phosphatase (StreptABComplex/AP, DAKO Corporation, Carpinteria, USA) gebunden werden. Nach zwei weiteren Waschschritten setzte es in 20 bis 30 min das Färbesubstrat Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector, Burlingham, CA, USA) um, wodurch sich durch Ak besetzte Stellen rot färbten. Nachdem die Präparate für etwa 10 min in Wasser gewaschen worden waren, wurden sie für 2 min mit Hämalaun-Lösung (Merck, Darmstadt, Deutschland) benetzt. Dadurch wurde der Gewebehintergrund blau gegengefärbt, was die Lokalisation der gefärbten Zellpopulationen erleichterte. Die gefärbten Schnittpräparate wurden mit Kaisers Glyceringelatine (Merck, Darmstadt, Deutschland) und einem Deckgläschen eingedeckt. Die Spezifität aller Färbungen wurde mit isotypischen, biotinylierten Ak kontrolliert.

34 4. Material und Methoden Verwendete Antikörper Bei den durchflußzytometrischen und immunhistologischen Analysen wurden folgende Antikörper eingesetzt. Falls nicht anders beschrieben, wurden Ak aus Ratten verwendet, die sich gegen murine Ag richteten: a) Biotinylierte Ak der Firma Pharmingen, Hamburg, Deutschland: Anti-Thy1.1, anti-cd8, anti-cd4, anti-cd11c, anti-cd11b (Mac-1), anti-ly-6g (Gr-1), anti- CD45 und anti-h-2k b /D b (MHC Klasse-I Molekül), anti-cd25, anti-cd122, anti-cd44, anti- Ratten IgG, anti-cd62l, anti-cd69, anti-ly-6c. Anti-IgG 2A, κ und anti-igg 1, κ (isotypische Kontroll-Ak). b) Weitere Ak der Firma Pharmingen: Anti-CD8-Cy, anti-vα2-pe, anti-vβ8.1-fitc, anti-thy1.1-pe, anti-cd132. c) Antikörper anderer Firmen: Anti-F4/80 (biotinyliert) Biozol Diagnostica Vertrieb GmbH, Serotec, Deutschland Anti-CD31 (biotinyliert) BMA Biomedicals AG, Augst, Schweiz Anti-CD4-FITC Life Technology, Gibco, Karlsruhe, Deutschland Kaninchen-anti-murines IgM (biotinyliert) Dianova, Hamburg, Deutschland Anti-FcγII/III-R Hybridomalinie 2.4G2 Streptavidin-PE Caltag Laboratories, Burlingham, CA, USA Streptavidin-AP DAKO Corporation, Carpinteria, USA

35 5. Ergebnisse Ergebnisse Um möglicherweise nach dem adoptiven Transfer von aktivierten TCR-tg T-Zellen auftretende Zellinfiltrate in B16 GP33 -Lungenmetastasen darstellen zu können, mußte als erstes die Immunhistologie von Lungengewebe im Labor etabliert werden. Als Ausgangspunkt wurde ein Protokoll verwendet, nach dem Milzschnitte von Mäusen gefärbt werden können (84). 5.1 Etablieren der immunhistochemische Färbung von Gefrierschnitten aus Lungengewebe Nach der oben genannten Versuchsanordnung wurden 5-7µm dünne Schnitte von Lungengewebe angefertigt, in eiskaltem Azeton fixiert und mit einem in 5 %-igen Mäuseserum verdünnten, biotinylierten Antikörper inkubiert, an den ein Komplex aus Streptavidin und dem Enzym Alkalische Phosphatase gebunden wurde. Ein Substrat, das eine Farbreaktion induzierte wurde darauf zugegeben. Nach Gegenfärben mit Hämalaun wurden die Präparate mit Glyzerin eingedeckt und konserviert. Positiv gefärbte Zellen sollten sich daraufhin rot vom blauen Hintergrund abheben. Es stellte sich jedoch heraus, daß sich die Lungenschnitte während der Färbung vom Objektträger ablösten. Um dieses Problem zu beseitigen, wurden unterschiedliche Beschichtungsmethoden erprobt. Dabei zeigte sich, daß die Präparate auf kommerziell vorbeschichteten und auf mit 5%-iger Gelatinelösung beschichteten Objektträgern nicht hafteten. Dagegen erwies es sich als sinnvoll, die Objektträger vor ihrer Verwendung mit einer 2 %-ige Lösung aus 3-Aminopropyltriethoxy-Silan (APES) und Azeton zu behandeln. Das Abschwemmen der Schnitte konnte auf diese Weise verhindert werden, wobei die als Positivkontrolle dienende Färbung von Milzschnitten nicht verändert wurde. Im Folgenden zeigte sich, daß sich das gesamte Lungengewebe unspezifisch anfärbte. Ursache dafür konnten einerseits unspezifische Bindungen der Antikörper (Ak) an FcγII/III- Rezeptoren (FcγII/IIIR) von Alveolarmakrophagen sein. Um das auszuschließen, wurden die Präparate zu Beginn für 30 min mit dem Ak 2.4G2 inkubiert, der sich gegen diesen Rezeptor richtet. Die starke Hintergrundfärbung konnte dadurch vermindert, jedoch nicht beseitigt werden. Es verblieben im Alveolarnetz gelegene Zellen, die eine große Zahl sich färbende Vakuolen aufwiesen. Diese Unspezifität konnte darauf zurückgeführt werden, daß im Lungengewebe selbst das später zugegebene, die Farbreaktion katalysierende Enzym Alkalische Phosphatase synthetisiert und gespeichert wurde. Die Schnitte wurden deshalb vor seiner Zugabe mit

36 5. Ergebnisse 30 Levamisole inkubiert, das endogene Alkalische Phosphatase-Vorkommen blockiert, ohne die Wirkung des zugegebenen Enzyms zu beeinträchtigen. Da sich trotz des beschriebenen Zusatzschrittes die Spezifität der Färbung nicht verbesserte, konnte eine endogene Alkalische Phosphatase-Aktivität ausgeschlossen werden. Weiterhin kam die Speicherung von Biotin im Lungengewebe in Betracht. Um die unspezifische Anlagerung des Streptavidin-Enzym-Komplexes daran zu verhindern, wurden die Schnitte zu Beginn mit Avidin inkubiert, das eine vergleichbar starke Avidität für Biotin aufweist wie Streptavidin. Die in den Folgeschritten mögliche Bindung des biotinylierten Ak an das gebundene Avidin wurde durch einen weiteren Inkubationsschritt mit löslichem Biotin verhindert. Dies war möglich, da Biotin nur eine Bindungsstelle für Avidin bzw. Streptavidin aufweist. Es stellte sich darauf heraus, daß die unspezifische Granulation durch diese Vorbehandlung verhindert werden konnte, und die spezifische Färbung einzelner Zellen gewährleistet wurde. Die als Kontrolle stets dienende Färbung von Zellen auf Milzschnitten wurde durch die Abwandlung des Protokolls nicht beeinträchtigt. Während der Etablierung dieser histologischen Färbung stellte sich heraus, daß die sofortige Fixation der nach dem Schneiden getrockneten Schnitte notwendig war. Nach deren Konservierung mit Azeton mußte ihre Weiterverarbeitung bzw. die Lagerung bei -20 C erfolgen. Bei bestimmten Färbungen (CD4, CD8) zeigte sich, daß eine strenge Einhaltung dieser Abfolge beachtet werden mußte, um ein Gelingen der Färbung zu sichern. Zu häufiges Auftauen, eine zu lange Trockenzeit sowie eine lange Lagerung führte auf Milzkontrollschnitten zu Negativergebnissen. 5.2 Immunhistochemische Darstellung von B16 GP33 -Tumorzellen Um die Infiltration von verschieden hämatopoetischen Zellpopulationen in B16 GP33 - Lungenmetastasen besser darstellen zu können, sollten die Tumorzellen selbst mit Hilfe des murinen Ak M562, der gegen das von B16-Melanomzellen exprimierte Antigen (Ag) H52 gerichtet ist (50), gefärbt werden. Dazu mußte geklärt werden, ob das H52-Ag auch auf B16 GP33 -Zellen exprimiert wird. Deshalb wurden B16- und B16 GP33 -Kulturzellen mit dem oben genannten Ak inkubiert und ein zweiter biotinylierter Kaninchen-anti-Maus Ak an den M562-Ak gebunden. Durch die abschließende Inkubation der Zellen mit Streptavidin-PE konnte durchflußzytometrisch gezeigt werden, daß das H52-Ag auf B16 GP33 - genauso wie auf B16-Kulturzellen exprimiert wird (Abb.2).

37 5. Ergebnisse 31 B A M562 Abb.2 : Durchflußzytometrische Darstellung von B16 GP33 -Kulturzellen. Die Zellen wurden mit dem H52-spezifischen Ak M562 (IgM) inkubiert. Nach Binden eines biotinylierten anti-maus-igm, konnten sie mit Streptavidin-PE dargestellt werden (A). Als Kontrolle wurde ein isotypischer Ak verwendet (B). Die Expression des H52-Ag war auf B16 GP33 -Kulturzellen genauso stark ausgeprägt wie auf den parentalen B16 Tumorzellen. Um B16 GP33 -Lungenmetastasenzellen im Gewebe färben zu können, wurde der Ak M562 biotinyliert und auf Lungenschnitten getestet. Zur Kontrolle wurden auf Objektträgern gewachsene B16 GP33 -Kulturzellen verwendet, die wie die histologischen Gefrierschnitte fixiert und gefärbt wurden. Es stellte sich heraus, daß eine immunhistochemische Färbung der Metastasenzellen im Gegensatz zu den in vitro kultivierten Zellen (Abb.3) nicht möglich war. Dieses Resultat zeigt, daß der H52-spezifische Ak M562 zur Identifizierung von B16 GP33 -Tumorzellen auf Gefrierschnitten nicht eingesetzt werden kann. Abb.3: Immunhistochemische Darstellung von auf einem Objektträger gewachsenen B16 GP33 -Kulturzellen mit dem H52-spezifischen Ak M562.

38 5. Ergebnisse Unterschiedliche hämatopoetische Infiltrate in B16 GP33 -Lungen- metastasen von B6- und B6.IFN-γ -Mäusen Um die Rolle von IFN-γ bei der Infiltration von Tumorgewebe zu klären, sollten Lungenmetastasen von B6- und B6.IFN-γ -Mäusen verglichen werden. Dazu wurden, wie beschrieben (85) B16 GP33 -Zellen i.v. injiziert, und die Lungen nach 14 Tagen zur histologischen Verarbeitung präpariert. B6 B6.IFN-γ A D CD11c B E CD11b C F Gr-1 Abb.4 : Histologische Darstellung von infiltrierenden DC (CD11c + ), Makrophagen (CD11b + ) und Granulozyten (Gr-1 + ) in B16 GP33 -Lungenmetastasen von unbehandelten B6- (A,B,C) und B6.IFN-γ - (D,E,F) Mäusen mit biotinylierten CD11c-, CD11b- und Gr-1-spezifischen Ak.

39 5. Ergebnisse 33 Dabei stellte sich heraus, daß die B16 GP33 -Lungenmetastasen von wenigen hämatopoetischen Zellen infiltriert wurden. Sowohl in B6- als auch in B6.IFN-γ - (IFN-γ-defizienten B6) Mäusen konnten Makrophagen (CD11b +) und Granulozyten (Gr-1 + ) gefärbt werden (Abb.4 B,C, E,F). Weiterhin zeigte sich ein Unterschied in der Zahl der die Lungenmetastasen infiltrierenden DC (CD11c + ). Während diese in B6-Mäusen die größte Population darstellten, konnten sie in den IFN-γ-defizienten Tieren nicht gefärbt werden (Abb.4A,D). 5.4 GP33-spezifische Infiltration von TCR-tg Zellen Im Folgenden sollte untersucht werden, ob die nachgewiesene Spezifität der Behandlung von B16 GP33 -Tumoren mit T-Zell-Rezeptor transgenen (TCR-tg) T-Zellen (85), die für das GP33-Ag spezifisch waren, auch histologisch nachweisbar war. Da in anderen Tumormodellen eine Infiltration der transferierten Zellen in Tumore gezeigt werden konnte (59, 74), sollte eine solche auch im B16 GP33 -Melanommodell untersucht werden. Aufgrund der Tatsache daß die parentale B16-Zelle nicht das GP33-Ag exprimierte, konnte nach dem adoptiven Transfer von aktivierten, GP33-spezifischen T-Zellen keine Eliminierung erfolgen, was sich histologisch äußern könnte. Um das untersuchen zu können, wurden Thy1.1 + TCR-tg Mäuse als Spendertiere für die zu transferierenden Zellen verwendet. Aufgrund unterschiedlicher Thy1-Ag zwischen den tumortragenden B6-Mäusen und den TCR-tg Tieren konnten die T-Lymphozyten nach dem adoptiven Transfer auf Gewebeschnitten histologisch nachgewiesen werden (84). Da in B6-Mäuse Thy1.2 + T-Zellen gebildet werden, war es möglich, die transferierten Thy1.1 + Effektorzellen von endogenen T-Lymphozyten zu unterscheiden. Mit Hilfe von Thy1.1-spezifischen, biotinylierten Ak konnten sie auf Lungenschnitten von tumortragenden B6-Tieren dargestellt werden. Es stellte sich heraus, daß sich einen Tag nach dem adoptiven Transfer nur wenige Thy1.1 + Zellen in den B16 GP33 -Metastasen anfärbten und ihre Zahl drei Tage später auf ein Vielfaches angestiegen war (Abb.5 A, B). Um eine mögliche Unspezifität dieser Infiltration auszuschließen, wurden B16-Tumorzellen in B6-Mäuse i.v. injiziert, und nach 14 Tagen aktivierte Thy1.1 + TCR-tg T-Zellen transferiert. Die histologische Färbung von Lungenschnitten dieser Tiere ergab eine sehr leichte Infiltration der Thy1.1 + T-Zellen. Ihre Zahl blieb jedoch sowohl einen als auch vier Tage nach dem adoptiven Transfer konstant und war deutlich kleiner als die in den B16 GP33 -Metastasen beobachtete (Abb.5 C, D). Neben den transferierten Thy1.1 + TCR-tg T-Zellen wurden infiltrierende Makrophagen (CD11b + ) in beiden Tumoren gefärbt. Dabei zeigte sich, daß ihre Zahl in B16 GP33 - und in B16-Lungenmetastasen ohne

40 5. Ergebnisse 34 adoptiven Transfer vergleichbar groß war (Abb.5 E, G). Während in B16 GP33 -Metastasen nach vier Tagen jedoch ein massiver Anstieg erkennbar war, konnte in B16-Tumoren keine derartige Änderung ihrer Anzahl nachgewiesen werden (Abb.5 F, H). B16 GP33 B16 A C Tag 1 Thy1.1 B D Tag 4 E G Tag 0 CD11b F H Tag 4 Abb.5: Darstellung von infiltrierenden Zellen in B16 GP33 - und B16-Lungenmetastasen. Die Thy1.1 + TCR-tg T-Zellen wurden mit Thy1.1-spezifischen Ak einen und vier Tage nach dem adoptiven Transfer gefärbt (A-D). Außerdem wurden sowohl ohne (E,G) als auch vier Tage nach dem Transfer von stimulierten TCR-tg T-Zellen (F,H) Makrophagen (CD11b + ) im Tumorgewebe dargestellt.

41 5. Ergebnisse 35 Da die spezifische Darstellung der B16 GP33 -Lungenmetastasen, wie in 5.2 erläutert, nicht erfolgen konnte, mußten die Lungenmetastasen eine ausreichende Größe haben, um sicher vom umgebenden Lungengewebe abgegrenzt werden zu können. Das in vorrangegangenen Experimenten angewandte Protokoll, nach dem ein adoptiver Transfer bereits drei Tage nach Injektion der Tumorzellen durchgeführt wurde (85), konnte aus diesem Grund bei dieser Fragestellung nicht verwendet werden. Durch die in Abb.6 dargestellte Abwandlung des Transferprotokolls konnte reproduzierbar eine ausreichende Metastasengröße erreicht werden: Vierzehn Tage nach i.v. Injektion von 10 6 Tumorzellen wurden den Tieren 10 7 in vitro aktivierte Milzzellen von TCR-tg Mäusen i.v. gespritzt. Etwa 70-90% aller darin enthaltenen Lymphozyten konnten mittels Durchflußzytometrie als TCR-tg CD8 T-Zellblasten identifiziert werden. Bei den genannten Färbungen wurden einen und vier Tage nach dem adoptiven Transfer die Lungen zur histologischen Verarbeitung präpariert. Transfer von 10 6 B16 GP33 i.v. Transfer von aktivierten TCR-tg T-Zellen 14 Tage 1 Tag 4 Tage Histologie Milz- i.v TCR-tg TCR-tg zellen Dreitägige Stimulation mit dem GP33-Peptid-Ag in vitro Abb.6: Abgewandeltes Transferprotokoll nach dem von Prévost-Blondel et al. (85) Durch diese Experimente wurde deutlich, daß die beobachtete Infiltration von Thy1.1 + TCR-tg T-Zellen spezifisch nur in dem GP33-exprimierenden Tumor erfolgte. Die ausschließlich in B16 GP33 -Lungenmetastasen gezeigte massive Begleitinfiltration von Makrophagen (CD11b + ) deutete ebenfalls auf das spezifische Angreifen der TCR-tg Zellen hin.

42 5. Ergebnisse Infiltration hämatopoetischer Zellen in B16 GP33 -Lungenmetastasen in An- und Abwesenheit von IFN-γ Im Folgenden sollte die Rolle, die IFN-γ nach dem adoptiven Transfer der transgenen T-Zellen zukommt (85), näher untersucht werden. Dazu wurden Transferexperimente in An- und Abwesenheit von IFN-γ verglichen. Einerseits wurden in B6-Mäusen B16 GP33 -Zellen i.v. injiziert und in vitro aktivierte TCR-tg IFN-γ-kompetente T-Zellen transferiert. Die Synthese von IFN-γ war dabei nicht beeinträchtigt. Parallel wurden in IFN-γ-defiziente B6-Mäusen (B6.IFN-γ ) Lungenmetastasen derselben Tumorlinie induziert und aktivierte TCR-tg.IFN-γ Zellen transferiert, wodurch die vollständige Abwesenheit von IFN-γ sichergestellt war. Weder Spender- noch Empfängerzellen besaßen die Fähigkeit, IFN-γ zu synthetisieren. Darauf wurden auf Lungenschnitten zum Einen verschiedene hämatopoetische Zellen gefärbt, aber auch eine mögliche Infiltration der transferierten T-Zellen durch Färbung mit einem CD8-spezifischen Ak untersucht. Wie in Abb.7A und C erkennbar ist, konnten sowohl in unbehandelten B6- als auch unbehandelten B6.IFN-γ -Mäusen kaum CD8 T-Lymphozyten in den Metastasen gefärbt werden. Dagegen stieg ihre Zahl in B6-Tieren vier Tage nach dem adoptiven Transfer von IFN-γ-kompetenten TCR-tg T-Zellen massiv an. TCR-tg B6 TCR-tg.IFN-γ B6.IFN-γ A C Tag 0 CD8 B D Tag 4 Abb.7: Nachweis von CD8 T-Zellen in B16 GP33 -Lungenmetastasen mit biotinylierten, CD8-spezifischen Ak in An- (A,B) und Abwesenheit (C,D) von IFN-γ. Lungenschnitte wurden ohne sowie vier Tage nach dem adoptiven Transfer aktivierter TCR-tg T-Zellen gefärbt.

43 5. Ergebnisse 37 Diese Beobachtung konnte in vollständiger Abwesenheit des Zytokins nicht bestätigt werden: Nach dem adoptiven Transfer aktivierter IFN-γ-defizienter TCR-tg T-Zellen in B6.IFN-γ - Mäuse waren deutlich weniger CD8 T-Zellen in den B16 GP33 -Lungenmetastasen nachweisbar (Abb.7 B,D),<als in Anwesenheit von IFN-γ. Weiterhin wurde die Infiltration verschiedener hämatopoetischer Zellen vor dem adoptiven Transfer mit derjenigen einen und vier Tage danach verglichen. In unbehandelten B6- und B6.IFN-γ -Mäusen konnten nur wenige Makrophagen (CD11b + ), DC (CD11c + ) und Granulozyten (Gr-1 + ) gefärbt werden (Abb.8-10 je A,D). TCR-tg B6 TCR-tg.IFN-γ B6.IFN-γ A D Tag 0 B E Tag 1 C F Tag 4 Abb.8: Nachweis von Makrophagen (CD11b + ) in B16 GP33 -Lungenmetastasen mit biotinylierten Ak in An- (A-C) und Abwesenheit (D-F) von IFN-γ. Die Lungenschnitte wurden ohne, sowie einen und vier Tage nach dem adoptiven Transfer von aktivierten TCR-tg T-Zellen gefärbt.

44 5. Ergebnisse 38 Bei der Färbung der Lungenmetastasen einen Tag nach dem adoptiven Transfer der beiden genannten transgenen T-Zellpopulationen stellte sich heraus, daß die Zahl aller drei genannten Zellen anstieg (Abb je B, E). TCR-tg B6 TCR-tg.IFN-γ B6.IFN-γ A D Tag 0 B E Tag 1 C F Tag 4 Abb.9: Nachweis von DC (CD11c + ) in B16 GP33 -Lungenmetastasen mit biotinylierten Ak in An- (A-C) und Abwesenheit (D-F) von IFN-γ. Die Lungenschnitte wurden ohne, sowie einen und vier Tage nach dem adoptiven Transfer von aktivierten TCR-tg T-Zellen gefärbt. Bis zum vierten Tag wurde eine weitere Zunahme der betrachteten hämatopoetischen Zellinfiltrate beobachtet. Während Makrophagen (CD11b + ) und DC (CD11c + ) gleichermaßen stark in die Metastasen einwanderten, war die Zahl von Granulozyten (Gr-1 + ) etwas geringer.

45 5. Ergebnisse 39 Es zeigte sich weiterhin, daß der starke Anstieg der Zellzahlen dieser drei Populationen im Tumorgewebe unabhängig von der Fähigkeit zur IFN-γ-Synthese war. Sowohl in An- als auch in Abwesenheit von IFN-γ nahm ihre Zahl zu (Abb.8-10 je C, F). TCR-tg B6 TCR-tg.IFN-γ B6.IFN-γ A D Tag 0 B E Tag 1 C F Tag 4 Abb.10: Nachweis von Granulozyten (Gr-1 + ) in B16 GP33 -Lungenmetastasen mit biotinylierten Ak in An- (A-C) und Abwesenheit (D-F) von IFN-γ. Die Lungenschnitte wurden ohne, sowie einen und vier Tage nach dem adoptiven Transfer von aktivierten TCR-tg T-Zellen gefärbt. Trotz einer verminderten Infiltration der transferierten TCR-tg CD8 T-Zellen in Abwesenheit von IFN-γ konnten also keine Unterschiede bezüglich einwandernder hämatopoetischer Zellpopulationen in den B16 GP33 -Lungenmetastasen beobachtet werden.

46 5. Ergebnisse Einfluß des adoptiven Transfers auf die Vaskularisation der Lungen- metastasen In einer kürzlich erschienen Arbeit (87) konnte gezeigt werden, daß aktivierte, tumorspezifische CD4 T-Zellen die Vaskularisation des entarteten Gewebes inhibieren und dadurch das Wachstum der Tumoren verhindern. Es konnte weiterhin nachgewiesen werden, daß dieser Effekt von IFN-γ abhängig ist. Um einen vergleichbaren Einfluß der transferierten TCR-tg CD8 T-Zellen im betrachteten B16 GP33 -Modell zu untersuchen, wurden in den Lungenmetastasen Endothelzellen mit CD31- spezifischen Ak gefärbt (87). Die Vaskularisation der Tumoren konnte auf diese Weise dargestellt werden. Beim Vergleich von B16 GP33 - und B16-Lungenmetastasen aus unbehandelten B6-Mäusen stellte sich heraus, daß die Metastasen der transfizierten Tumorzellen eine deutlich schwächere Gefäßzeichnung aufwiesen, als die B16-Lungenmetasatsen (Abb.11). B16 GP33 B16 CD31 Abb.11: Darstellung von Endothelzellen in B16 GP33 - und B16-Lungenmetastasen mit biotinylierten, CD31-spezifischen Ak ohne adoptiven Transfer von aktivierten TCR-tg T-Zellen. In den folgenden Experimenten wurde die Vaskularisationsstärke von B16 GP33 -Metastasen in unbehandelten B6- und B6.IFN-γ -Mäusen betrachtet. Dabei stellte sich heraus, die Gefäßdichte der Tumoren ohne vorrangehende Behandlung in beiden Mäusetypen gleichermaßen gering war (Abb.12A, D, G). Um einen möglichen Zusammenhang zwischen dem adoptiven Transfer der transgenen, stimulierten T-Zellen und der Stärke der Vaskularisation des Tumorgewebes in Abhängigkeit von der IFN-γ-Synthese zu untersuchen, wurden die beiden genannten transgenen T-Zellen transferiert und die Lungenmetastasen nach einem und vier Tagen ge-

47 5. Ergebnisse 41 färbt. Wie aus Abb.12 A-C und G-I hervorgeht, änderte sich die Stärke der Gefäßzeichnung nach dem adoptiven Transfer von IFN-γ-kompetenten, aktivierten TCR-tg T-Zellen nicht. Weder in B6- noch in den B6.IFN-γ -Mäusen unterschied sich die Zahl CD31-positiver Endothelzellen in den Metastasen vor der Behandlung von der nach Injektion der Effektorzellen. Es war demzufolge kein Zusammenhang zwischen der IFN-γ-Synthese des tumortragenden Tieres und der Gefäßdichte der B16 GP33 -Lungenmetastasen nach dem adoptiven Transfer von aktivierten IFN-γ-kompetenten TCR-tg T-Zellen erkennbar. Im Gegensatz dazu war das Tumorgewebe bereits einen Tag nach der i.v. Injektion von in vitro stimulierten IFN-γ-defizienten TCR-tg T-Zellen in B6.IFN-γ -Mäuse massiv vaskularisiert. Die Stärke der Gefäßzeichnung veränderte sich am vierten Tag nach dem Transfer nicht. Sie war im Vergleich zu unbehandelten B6.IFN-γ -Tieren deutlich erhöht (Abb.12D-F). TCR-tg B6 TCR-tg.IFN-γ B6.IFN-γ TCR-tg B6.IFN-γ A D G Tag 0 B E H Tag 1 C F I Tag 4 Abb.12: Färbung von Endothelzellen mit biotinylierten CD31-spezifischen Ak. TCR-tg CTL wurden in B6 (A-C) und in B6.IFN-γ -Tiere (G-I) sowie TCR-tg.IFN-γ CTL in B6.IFN-γ -Mäuse (D-F) i.v. injiziert. Darauf wurde die Vaskularisation der B16 GP33 -Lungenmetastasen ohne, sowie einen und vier Tage nach dem adoptiven Transfer der TCR-tg T-Zellen untersucht.

48 5. Ergebnisse 42 In vollständiger Abwesenheit von IFN-γ zeigte sich also eine veränderte Vaskularisationsstärke des Metastasengewebes nach dem adoptiven Transfer der aktivierten TCR-tg T-Zellen. Während die Gefäßdichte hier massiv zunahm, war kein direkter Einfluß der transferierten IFN-γ-kompetenten T-Zellen auf die Angiogenese im Tumor erkennbar. Um die Änderung der Gefäßdichte der B16 GP33 -Lungenmetastasen besser interpretieren zu können, wurde sie mit Art und Zahl der infiltrierenden Zellpopulationen verglichen. Dabei fiel auf, daß die Gefäßdichte nur in den Metastasen derjenigen Tiere zunahm, in die eine geringe Tumorinfiltration zeigende, IFN-γ-defiziente TCR-tg T-Zellen transferiert worden waren (Abb.13 A, B, D, E, G, H). TCR-tg B6 TCR-tg.IFN-γ B6.IFN-γ TCR-tg B6.IFN-γ A D G CD31 B E H CD8 C F I CD11b Abb.13: Färbung von Endothelzellen (CD31 + ), CD8 T-Zellen und Makrophagen (CD11b + ) mit biotinylierten CD31-, CD8- und CD11b-spezifischen Ak vier Tage nach dem adoptiven Transfer von TCR-tg CTL in B16 GP33 -metastasentragende Tiere. A-C: Adoptiver Transfer von aktivierten TCR-tg T-Zellen in B6-Mäuse. D-F: Adoptiver Transfer von aktivierten TCR-tg.IFN-γ T-Zellen in B6.IFN-γ -Mäuse. G-I: Adoptiver Transfer von aktivierten TCR-tg T-Zellen in B6.IFN-γ -Mäuse.

49 5. Ergebnisse 43 Der Vaskularisationszustand und die Infiltration der transferierten, transgenen Zellen verliefen also umgekehrt proportional. Im Gegensatz dazu war keine direkte Korrelation zwischen der Gefäßmenge und der Anzahl der infiltrierenden Makrophagen (CD11b + ), DC (CD11c + ) oder Granulozyten (Gr-1 + ) zu erkennen. Unabhängig vom Grad der Vaskularisation bestand also eine gleichermaßen stark ausgeprägte Begleitinfiltration hämatopoetischer Zellen. In Abb.13 A, C, D, F, G ist dies am Beispiel der infiltrierenden Makrophagen (CD11b + ) veranschaulicht. Diese Ergebnisse zeigten, daß eine Zunahme der Metastasenvaskularisation nach dem adoptiven Transfer nur dann beobachtet werden konnten, wenn aktivierte IFN-γ-defiziente T-Zellen in IFN-γ-inkompetente Tiere transferiert wurden. 5.7 Nachweis der transferierten TCR-tg Zellen im Empfängertier IFN-γ-Abhängigkeit der Expansion transferierter TCR-tg T-Zellen Im Folgenden sollte die Ursache für die histologisch beobachtete unterschiedliche Infiltration von CD8 T-Zellen in die Metastasen genauer untersucht werden. Dazu wurde das Blut der Empfängertiere durchflußzytometrisch untersucht. Sowohl im IFN-γ-kompetenten als auch im IFN-γ-defizienten Transfermodell wurde die Zahl der im peripheren Blut befindlichen transferierten TCR-tg T-Zellen analysiert. Die injizierten CD8 T-Zellen wurden vier Tage nach ihrem Transfer anhand der Ketten Vα2 und Vβ8.1 ihres transgenen TCR gefärbt. Als Ausgangswert wurde das Blut von unbehandelten B6- und B6.IFN-γ -Mäusen verwendet. In beiden Linien exprimierten 1,5% bis 3% aller CD8 T-Zellen die Ketten Vα2 und Vβ8.1, was dem endogenen, polyklonalen Repertoire dieses TCR entspricht. Die Zahl Vα2 + Vβ8.1 + CD8 T-Zellen stieg nach dem adoptiven Transfer IFN-γ-kompetenter Effektorzellen auf 40-70% an, wohingegen sie im IFN-γ-defizienten Transfersystem mit 2-8% nur schwach über dem endogenen Hintergrund lag (Abb.14). Die in Abwesenheit von IFN-γ fehlende Infiltration TCR-tg Zellen im Metastasengewebe korelierte also mit einer deutlich geringeren Konzentration dieser Zellen im Blut.

50 5. Ergebnisse 44 Tag 0 Tag 4 1,54 40,94 TCR-tg in B6 1,74 3,02 Vα2 TCR-tg.IFN-γ in B6.IFN-γ Vβ8.1 Abb.14: Durchflußzytometrische Analyse von CD8 T-Zellen aus dem peripheren Blut von B6- und B6.IFN-γ - Mäusen vor und vier Tage nach dem adoptiven Transfer von 1x10 7 in vitro mit GP33-Peptid-Ag stimulierten TCR-tg- bzw. TCR-tg.IFN-γ Milzzellen Expansion der transferierten TCR-tg Zellen ist unabhängig von der IFN-γ Synthese des Empfängertieres Es stellte sich die Frage, ob die hohe Zellzahl der TCR-tg T-Zellen, die nach dem adoptiven Transfer von IFN-γ-kompetenten Zellen im peripheren Blut gefunden werden konnten, in Zusammenhang mit ihrer Kompetenz zur IFN-γ-Synthese stand. Dazu sollte ermittelt werden, ob das IFN-γ des Empfänger- oder des Spendertieres als Quelle in Betracht kam. Um dieser Frage nachzugehen, wurden einerseits aktivierte IFN-γ-kompetente TCR-tg und andererseits stimulierte IFN-γ-defiziente TCR-tg T-Zellen jeweils in B6- und in B6.IFN-γ -Mäuse i.v. injiziert. Dabei stellte sich heraus, daß die Zahl der transferierten TCR-tg CD8 T-Zellen unabhängig von der IFN-γ-Synthesefähigkeit des Empfängertieres anstieg. Die Konzentration der injizierten IFN-γ-defizienten TCR-tg T-Zellen im Blut war ebenfalls unabhängig vom Empfängertier niedrig und entsprach etwa Werten, die nach Transfer einer entsprechenden Zahl naiver TCR-tg T-Zellen ermittelt werden konnten (Abb.15). Der Anstieg der transferierten Zellen im Blut konnte also auf die IFN-γ Synthese der transgenen Zellen zurückgeführt werden.

51 5. Ergebnisse 45 Anzahl TCR-tg T-Zellen an den CD8 T-Zellen [%] TCR-tg in TCR-tg.IFN-γ TCR-tg in TCR-tg.IFN-γ naive TCR-tg B6 in B6 B6.IFN-γ in B6.IFN-γ in B6 Abb.15: Durchflußzytometrische Darstellung von TCR-tg und TCR-tg.IFN-γ T-Zellen im peripheren Blut vier Tage nach ihrem adoptiven Transfer in B6- und B6.IFN-γ -Mäuse. Zum Vergleich wurde eine entsprechende Anzahl naiver TCR-tg T-Zellen in B6-Tiere i.v. injiziert. Die transgenen T-Zellen wurden anhand der TCR-Ketten Vα2 und Vβ8.1 gefärbt und auf die Gesamtzahl aller CD8 T-Lymphozyten des Empfängertieres bezogen Proliferation aktivierter TCR-tg T-Zellen nach dem adoptiven Transfer Die stark erhöhte Zahl von TCR-tg im Gegensatz zu IFN-γ-defizienten TCR-tg T-Zellen im Blut könnte aufgrund einer Expansion der transgenen Lymphozyten in vivo zustande kommen. Um diese Frage zu klären, wurden aktivierte Thy1.1 + TCR-tg T-Zellen mit dem Vitalfarbstoff CFSE markiert (125) und in Thy1.2 + B6-Mäuse transferiert. Den Tieren wurde nach 30 min und in der Folge täglich Blut entnommen und die transferierten TCR-tg T-Zellen mit CD8- und Thy1.1-spezifischen Ak nachgewiesen. Wie in Abb.16 dargestellt ist, waren nach 30 min wenige CFSE + Thy1.1 + T-Zellen im Blut vorhanden. Ihre Konzentration nahm nach einem Tag bis an die Detektionsgrenze ab und stieg nach zwei Tagen wieder leicht an. Bis zum vierten Tag nach dem adoptiven Transfer waren die in beschriebenen Werte erreicht. Die Zahl der Thy1.1 + T-Zellen blieb auch bis zum achten Tag nach dem Transfer konstant. An der Abnahme der CFSE-Intensität während dieses Zeitraumes wurde deutlich, daß die injizierten Zellen seit dem adoptiven Transfer im Empfängertier proliferiert waren (Abb.16).

52 5. Ergebnisse min Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 8 Thy1.1-PE CFSE Abb.16: Nach dem adoptiven Transfer von in vitro stimulierten, CFSE-markierten TCR-tg T-Zellen in B6-Mäuse wurde den Tieren nach 30 min und danach täglich Blut entnommen und mit PE-markierten Thy1.1-spezifischen und Cychrom-markierten CD8-spezifischen Ak gefärbt. Es wurden nur CD8 T-Zellen analysiert Nachweis der Histokompatibilität zwischen IFN-γ-defizienten TCR-tg T-Zellen und B6-Mäusen Es bestand die Möglichkeit, daß die IFN-γ-defizienten T-Zellen aufgrund einer vorliegenden Histoinkompatibilität abgestoßen wurden und deshalb eine Expansion dieser Zellen nach dem Transfer ausblieb. Um eine Abstoßungsreaktion auszuschließen, wurden sowohl naive IFN-γkompetente als auch naive IFN-γ-defiziente TCR-tg Milzzellen mit CFSE markiert und in einer Zahl von 10 8 Zellen i.v. in B6-Mäuse transferiert. Den Tieren wurde in den folgenden Tagen Blut entnommen und daraus die Zahl CFSE + CD8 T-Zellen durchflußzytometrisch bestimmt. Wie in Abb.17 dargestellt ist, wurden die transferierten Zellen über einen Zeitraum von 22 Tagen im Blut der Mäuse verfolgt. Dabei stellte sich heraus, daß sie in den ersten beiden Tagen 20% der CD8 T-Zellen des Empfängertieres ausmachten. In den darauffolgenden Wochen nahm ihre Zahl zwar auf 10% aller CD8 T-Lymphozyten ab, sie konnten jedoch dennoch weiterhin deutlich im peripheren Blut nachgewiesen werden. Da weiterhin kein Unterschied zwischen den beiden Transferexperimenten festgestellt wurde, konnte eine Abstoßung der transferierten IFN-γ-defizienten T-Zellen konnte ausgeschlossen werden.

53 5. Ergebnisse 47 CFSE + CD8 T-Zellen [%] Maus1 TCR-tg Maus2 TCR-tg Maus3 TCR-tg.IFN-γ Maus4 TCR-tg.IFN-γ Tage nach dem adoptiven Transfer Abb.17: Durchflußzytometrische Analyse peripherer Blutlymphozyten nach dem adoptiven Transfer von naiven CFSE-markierten TCR-tg und TCR-tg.IFN-γ CD8 T-Zellen. Es wurden 10 8 transgene T-Zellen transferiert und über 22 Tage verfolgt Immunhistologischer Nachweis der proliferierten T-Zellen in Milz und Leber In den vorangegangenen Experimenten war aufgefallen, daß die transferierten in vitro aktivierten TCR-tg T-Zellen einen Tag nach dem adoptiven Transfer weder in den Lungenmetastasen des B16 GP33 -Tumors noch im Blut nachweisbar waren. Es stellte sich deshalb die Frage, ob sie unspezifisch ins Gewebe übergetreten waren. Durchflußzytometrische Analysen verschiedener Organe hatten ergeben, daß die betrachteten Zellen außer in der Milz und den inguinalen Lymphknoten nur in der Leber gefunden werden konnten. Deshalb wurden in den folgenden Experimenten Milz und Leber näher betrachtet. Aus B6-Mäusen wurden beide Organe einen und vier Tage nach dem adoptiven Transfer der aktivierter IFN-γ-kompetenten Thy1.1 + TCR-tg T-Zellen entnommen. Darauf wurden die transferierten T-Zellen auf histologischen Gefrierschnitten mit einem biotinylierten Thy1.1-spezifischen Ak gefärbt (123). Dabei stellte sich heraus, daß einen Tag nach dem adoptiven Transfer nur wenige Thy1.1 + Zellen in beiden Organen dargestellt werden konnten. Diese waren in der Milz in der weißen Pulpa lokalisiert, verteilten sich in der Leber jedoch diffus über das gesamte Parenchym (Abb.18A, C). Am vierten Tag nach dem Transfer hatte die Zahl Thy1.1 + Zellen in beiden Organen zugenommen. Während sich in der Leber etwa vier Mal mehr positive Zellen im gesamten Gewebe anfärbten, waren es in der Milz etwa vierzig Mal mehr (Abb.18 B, D), die jetzt hauptssächlich in der rote Pulpa verteilt waren.

54 5. Ergebnisse 48 Die am ersten Tag nach dem adoptiven Transfer im peripheren Blut nicht nachweisbaren TCR-tg T-Zellen konnten also in geringer Zahl in Milz und Leber wiedergefunden werden. Ein Konzentrationsanstieg der Zellen, der dem im peripheren Blut am vierten Tag beobachteten entsprach, wurde jedoch nur in der Milz beobachtet, und war in der Leber nur ansatzweise erkennbar. A Milz C Leber Tag 1 B D Tag 4 Abb.18: Immunhistochemische Färbung von transferierten Thy1.1 + TCR-tg T-Zellen in Milz (A,B) und Leber (C,D) einen und vier Tage nach ihrem adoptiven Transfer. Die Zellen wurden mit einem Thy1.1-spezifischen, biotinylierten Ak dargestellt Phänotypische Charakterisierung von in vitro aktivierten TCR-tg T-Zellen Ein möglicher Grund, weshalb ein stark vermindertes Proliferationsverhalten von TCR-tg Effektorzellen aus IFN-γ-defizienten Mäusen in vivo beobachtet werden konnte, war eine möglicherweise unterschiedlich verlaufende Aktivierung während der dreitägigen Stimulation. Um diese Frage zu prüfen, wurden die verschiedenen TCR-tg CD8 T-Zellen vor ihrem Transfer verglichen. Dazu wurden IFN-γ-kompetente und IFN-γ-defiziente TCR-tg Milzzellen parallel in vitro mit dem GP33-Peptid-Ag stimuliert. Vor der Kultur und an jedem weiteren Tag wurden Zellen entnommen und mit einem CD8-spezifischen Ak inkubiert. In der

55 5. Ergebnisse 49 darauffolgenden durchflußzytometrischen Analyse wurden diejenigen Zellen betrachtet, die sich als CD8 T-Zellblasten darstellten. Es zeigte sich, daß ihre Zahl in beiden Ansätzen gleichermaßen zunahm (Abb.19). Tag 0 Tag 1 Tag 2 Tag 3 FSC CD8 Abb.19: Durchflußzytometrische Analyse von TCR-tg Milzzellen vor und während der Stimulation mit dem GP33-Peptid-Ag in vitro. Dazu wurden die Zellen mit einem Cycrome-markierten, CD8-spezifischen Ak markiert, und die Zunahme von CD8 T-Zellblasten untersucht. Die Abbildung ist repräsentativ für IFN-γ-kompetente TCR-tg und IFN-γ defiziente TCR-tg T-Lymphozyten. Um die Lymphozyten während der Aktivierung weiter zu charakterisieren, wurden sie an jedem Tag der Kultur auf die Expression von Aktivierungsmarkern hin untersucht. Als Aktivierunsmarker wurden die Moleküle CD44, CD69 und CD11b sowie die α-, β- und γ-kette des Interleukin-2 Rezeptors (IL-2R) ausgewählt, welche mit biotinylierten CD25- (α), CD122- (β) und CD132- (γ) spezifische Ak dargestellt werden konnten. Die Expressionsstärke der Marker an den einzelnen Tage wurde mit dem Zustand naiver CD8 T-Zellen der jeweiligen Linie verglichen. Um eine spezifischere Darstellung der TCR-tg T-Zellen zu erreichen, wurden sie zusätzlich mit einem Vα2-spezifischen Ak gefärbt. Auf diese Weise war es möglich die Expression der Marker auf Vα2 + CD8 T-Zellen zu analysieren. Wie in Abb.20 für die IFN-γ-kompetenten TCR-tg CD8 T-Zellen dargestellt ist, wurden die α- und γ-kette des IL-2R bereits am ersten Tag der Kultur verstärkt exprimiert. Die β-kette hingegen blieb vorerst in dem bei naiven T-Zellen beobachteten schwach positiven Zustand. Sie wurde am zweiten Tag leicht und bis zum dritten Tag der Kultur vollständig exprimiert. Die Marker CD44 und CD69 waren bereits am ersten Tag der Stimulation deutlich darstellbar. Bei beiden konnte ein leichter Abfall der Expressionsstärke im Verlauf der Stimulation verzeichnet wer-