IMMUNOLOGIE BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN SCHWANGERSCHAFTSTEST DURCH IMMUNOLOGISCHEN NACHWEIS DES HUMANEN CHORIONGONADOTROPINS (HCG) IM URIN

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1 21 IMMUNOLOGIE BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN Immunologische Nachweisverfahren werden zum Nachweis von vielen verschiedenen Substanzen genutzt. Ist ein Stoff immunogen, so führt die Injektion dieses Stoffes in einem fremden Organismus zur Antikörperbildung. Nach der Isolierung solcher Antikörper können diese nicht nur zur Detektion von Proteinen, Antikörpern, Hormonen oder Viren eingesetzt werden, sondern u.a. auch einen Nachweis von Toxinen und Pestiziden in Blut oder Urin von Patienten ermöglichen. Hieraus ergibt sich eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten in der Medizin und den Naturwissenschaften. SCHWANGERSCHAFTSTEST DURCH IMMUNOLOGISCHEN NACHWEIS DES HUMANEN CHORIONGONADOTROPINS (HCG) IM URIN Eine der häufigsten Anwendungen ist der immunologische Schwangerschaftsschnelltest, welcher im Jahr 1980 patentiert wurde und auch bei ungeübter Anwendung eine hohe Zuverlässigkeit bietet. Hierbei wird durch eine einfache Immunreaktion ein Peptidhormon im Urin der zu untersuchenden Person nachgewiesen, welches während der Schwangerschaft von der Plazenta gebildet wird und für die Erhaltung der Schwangerschaft verantwortlich ist. Anders als beim beschriebenen Stäbchenschnelltest ist im Labor eine weitaus genauere Diagnostik möglich. Vor allem innerhalb der ersten fünf Schwangerschaftswochen kann die Hormonkonzentration im Urin unter der Nachweisgrenze des Schnelltests liegen, sodass hierbei ein falsch negatives Testergebnis auftreten kann. Aber auch rechtsmedizinische Fragestellungen können eine quantitative Bestimmung der hcg-konzentration erforderlich machen, wenn es z.b. darum geht, ob eine Schwangerschaft unrechtmäßig, also zu spät, abgebrochen wurde. QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON ANTIGENKONZENTRATIONEN Mittels EIA (Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest) bzw. ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) lässt sich schnell die genaue Konzentration eines Antigens in wässriger Lösung bestimmen.

2 22 Die in den 60er Jahren entwickelte Methode, bei der Enzyme zur Markierung von Antikörpern oder Antigenen verwendet werden, wird in der Immunologie sehr verbreitet für den Nachweis einer Antikörper-Antigen-Wechselwirkung benutzt. Gleichzeitig eignet sich diese Methode für die quantitative Bestimmung von Antigen- bzw. Antikörperkonzentrationen. Das Prinzip der Methode ist in Abb. 1 dargestellt: Antigen Enzym- Markierter Anti- farbloses farbiges () gekoppelter körper gebunden Substrat Produkt Antikörper an Antigen Die Anwesenheit eines Antigens wird mit Hilfe des Enzym-gekoppelten Antikörpers nachgewiesen. Das Enzym reagiert anschließend mit dem farblosen Substrat und ein farbiges, leicht detektierbares Produkt entsteht. Die Menge des farbigen Produktes ist der Enzymkonzentration und gleichzeitig der Antigenkonzentration proportional. Der in Abb.1 beschriebene Ablauf stellt einen sogenannten direkten ELISA-Test dar, weil der spezifische Antikörper direkt markiert ist. Oft ist es nicht möglich, den spezifischen Antikörper mit einem Enzym zu koppeln. In diesem Fall kann der an das Antigen gebundene Antikörper mit Hilfe eines Enzym-gekoppelten Zweitantikörpers aus einer anderen Spezies (z. B. Ziegeanti Maus IgG) nachgewiesen werden. Die Methode ist der sogenannte indirekte ELISA- Test. Das Prinzip ist in Abb. 2 schematisch dargestellt: Enzym-gekoppelter Anti- Immunoglobulin Antikörper Antikörper gegen Antigen Immobilisiertes Antigen Diese Methode ist im Vergleich zum direkten ELISA-Test wesentlich empfindlicher, weil mehr als ein Enzym-gekoppeltes zweites Antikörpermolekül an den primären Antigen-spezifischen Antikörpern gebunden sein kann.

3 23 IMMUNGLOBULINE Beim Menschen sind fünf verschiedene Immunglobulin (Ig) -Klassen zu finden, welche sich in der Struktur ihrer konstanten Regionen unterscheiden und in verschiedenen Geweben in unterschiedlichen Konzentrationen zu finden sind. IgA ist in allen Schleimhäuten des Körpers zu finden. Es wird insbesondere von Drüsen rund um die Brustwarze von Müttern sezerniert und schützt den Säugling vor Pathogenen. Im Serum bildet es 15 % aller Immunglobuline. IgD ist als membranständiger Antigenrezeptor auf der Oberfläche von B-Zellen zu finden, allerdings ist die genaue Funktion noch unbekannt. Der IgD-Anteil im Serum liegt deutlich unter 1 %. IgE vermittelt nach Antigenbindung auf der Oberfläche von Mastzellen die Ausschüttung von Histamin und spielt somit eine wichtige Rolle bei allergischen Reaktionen. Weniger als 1 % der Immunglobuline des Körpers gehört zu dieser Klasse. IgG ist die am häufigsten vorkommende Klasse von Immunglobulinen im Plasma und während der Immunantwort wird es mit einiger Verzögerung gebildet, bleibt dann jedoch lange erhalten. Von Bedeutung ist das Vorkommen von IgG im Zusammenhang mit Impfungen, Autoimmunerkrankungen und dem Vorkommen des Rhesusfaktors während Schwangerschaft. IgM ist das erste Immunglobulin, welches im Verlauf einer Immunantwort an der Oberfläche von B-Lymphozyten erscheint und zu einer Aktivierung des Komplementsystems beiträgt. Ein erhöhter IgM-Anteil im Blut kann also auf eine momentane Infektion hinweisen. GEWINNUNG VON ANTIKÖRPERN Um in der Diagnostik immunologische Nachweisverfahren durchzuführen, wurden anfänglich Antisera verwendet. Man immunisierte zunächst ein Versuchstier, z. B. ein Kaninchen, mit dem nachzuweisenden Molekül und verwendete dann das Serum dieses Versuchstiers, welches nun Antikörper gegen das nachzuweisende Molekül enthält, als Werkzeug in immunologischen Tests. Ein Antiserum stellt somit ein Gemisch aus Antikörpern gegen alle Antigene dar, mit denen das Versuchstier in Berührung gekommen ist. Dies birgt das Risiko möglicher Kreuzreaktionen und einer verminderten Spezifität der Immunreaktion. Ein monoklonaler Antikörper vermeidet diese Probleme, da er das Produkt einer einzigen B-Zelle darstellt. Seine Herstellung ist allerdings sehr aufwendig. Zunächst wird eine Maus mehrfach mit dem nachzuweisenden Molekül immunisiert. Dann wird ihr die Milz

4 24 entnommen, die nun zahlreiche B-Zellen enthalten sollte, die Antikörper gegen das nachzuweisende Molekül produzieren. Um diese Zellen zu immortalisieren, werden sie mit einer Mäusetumorzellinie fusioniert. Durch die Fusion der beiden Zellarten entstehen unter anderem B-Zell-Tumorzell-Fusionen, welche selektiert und weiter kultiviert werden. So können Zellkulturen angelegt werden, die ausschließlich Antikörper gegen ein einzelnes Epitop sezernieren. Da die Zellen den gewünschten Antikörper kontinuierlich ins Medium abgeben, kann man nun beliebige Mengen dieses monoklonalen Antikörpers herstellen. Damit ist es theoretisch nur einmal nötig den aufwendigen Herstellungsprozess zu durchlaufen. Für die meisten diagnostisch wichtigen Makromoleküle sind heute monoklonale Antikörper kommerziell erhältlich. Diese werden aber auch therapeutisch eingesetzt. Da sie jedoch meist aus der Maus stammen, würden sie eine Immunreaktion im Menschen auslösen. Aus diesem Grund müssen die für die Antigen-Bindung nicht benötigten Regionen eines solchen Antikörpers mit gentechnischen Methoden durch die entsprechenden menschlichen Sequenzen ersetzt werden. Man spricht in diesem Fall von einem humanisierten monoklonalen Antikörper. REINIGUNG VON ANTIKÖRPERN Um die gewonnen Antikörper für diagnostische Zwecke einsetzen zu können, bedarf es häufig einer Reinigung aus Serum oder Zellkulturmedium. Meistens wird eine Affinitätschromatografie für diese Reinigung eingesetzt. Dabei können zum einen Antikörper gereinigt werden, die spezifisch gegen ein bestimmtes Antigen gerichtet sind oder es können unspezifisch alle Antikörper aus der Lösung isoliert werden. Bei der spezifischen Reinigung wird das Antigen, gegen das der gewünschte Antikörper gerichtet ist, an eine Matrix kovalent gebunden. Diese Matrix wird mit der Antikörper-haltigen Lösung inkubiert, wobei die gewünschten Antikörper an die Matrix binden. Nach mehreren Waschschritten können die gebundenen Antikörper durch Zugabe eines sauren Puffers wieder eluiert werden. Für die unspezifische Reinigung werden die Antikörper-bindenden Eigenschaften von Protein A bzw. Protein G ausgenutzt. Protein A und Protein G sind Oberflächenproteine von Staphylococcus aureus bzw. Streptokokken. Beide Proteine besitzen die Eigenschaft Immunglobuline, vor allem IgG, zu binden. Dabei erfolgt die Bindung nicht über die Antigenbindestellen, sondern über den Fc-Teil des Immunglobulins. Für die Bakterien fungieren diese Proteine als ein Schutzmechanismus, da durch die Bindung wirtseigener Antikörper eine Erkennung durch das Immunsystem des Wirts erschwert wird.

5 25 Die Reinigung von Antikörpern über Protein A/G erfolgt wie zuvor durch kovalente Bindung der Proteine an eine Matrix. Bei Inkubation mit Antikörperhaltigen Lösungen binden diese an Protein A/G und können nach mehrmaligem Waschen durch Zugabe eines sauren Puffers eluiert werden. AUFTRENNUNG VON PROTEINGEMISCHEN MITTELS SDS-POLYACRYLAMID- GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) Die Gelektrophorese bezeichnet im Allgemeinen die Wanderung von geladenen Teilchen durch ein Trägermaterial in einem elektrischen Feld. Dabei wandern verschiedenartige Moleküle und Partikel je nach Ladung und Größe mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten und können so voneinander getrennt werden. Bei der SDS-Gelelektrophorese (SDS = Sodium Dodecyl Sulfate = Natriumdodecylsulfat) werden Proteine nach einem einzigen physiko-chemischen Parameter aufgetrennt, ihrem Molekulargewicht. Sie dient der Analyse von Proteingemischen und ermöglicht schnelle Molekulargewichtsbestimmungen. SDS ist ein stark anionisches Detergenz, welches die Proteine denaturiert, sich an diese anlagert und proportional zu ihrer Größe mit einer negativen Ladung versieht. Die Eigenladungen der Proteine werden überdeckt. Sekundär- und Tertiärstrukturen der Proteine werden durch Aufspaltung der Wasserstoffbrücken und Streckung der Moleküle aufgelöst. Lediglich Disulfidbrücken (Schwefelbrücken zwischen Cysteinen) kann das SDS nicht spalten, diese können optional durch Zugabe reduzierender Thiole wie z.b. 2-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol (DTT) aufgebrochen werden. Durch das identische Ladungs- zu Masse-Verhältnis sowie die Auffaltung und Streckung der Aminosäureketten unterscheiden sich die SDS-Komplexe verschiedener Proteine für viele Messmethoden nur noch in ihrer Größe. Die Auftrennung der SDS-Protein-Mizellen erfolgt in der Regel in einem Polyacrylamidgel, weshalb diese Methode auch als SDS-PAGE (SDS-Poly-Acrylamid-Gel-Elektrophorese) bezeichnet wird. Die Gelmatrix besteht aus Ketten von polymerisiertem Acrylamid, die durch einen Anteil von bifunktionalem Bisacrylamid quervernetzt sind. Im angelegten elektrischen Feld wandern die negativ geladenen SDS-Protein-Komplexe zur Anode (Pluspol). Dabei trennt der Molekularsiebeffekt der porösen Gelmatrix die einzelnen SDS-Protein-Komplexe nach ihrem Molekulargewicht auf: Kleinere Proteine wandern schneller durch die Poren des Gels als größere. Am Ende des Vorganges sind die Proteine nach Größe fraktioniert und können durch weitere Verfahren, wie z.b. Coomassie- oder Silberfärbung oder

6 26 immunologische Nachweismethoden, wie Immunoblotting, sichtbar gemacht werden. Mit Hilfe von Markerproteinen, deren Molekulargewichte bekannt sind und die man ebenfalls auf das Gel aufträgt, lassen sich die Molekulargewichte der zu analysierenden Proteine abschätzen. Die Porengröße des Gels muss an den jeweiligen Molekulargewichtsbereich, in welchem eine lineare Auftrennung der Proteine erzielt werden soll, angepasst werden. Meistens wird die SDS-PAGE mit einem diskontinuierlichen Puffersystem durchgeführt, bei welchem das Trenngel mit einem großporigen Sammelgel überschichtet ist. Die Probe und das Sammelgel enthalten Tris-Cl (ph 6,8), der Puffer in der oberen und unteren Pufferkammer Tris-Glycin (ph 8,3) und das Trenngel Tris-Cl (ph 8,8). Alle Komponenten des Systems enthalten 0,1% SDS. Sobald das elektrische Feld anliegt, bilden die Chloridionen die Spitze der sich in Richtung Anode bewegenden Molekülfront und die Glycin-Moleküle den Schluss. Dazwischen befinden sich die SDS-Protein-Komplexe, die an der Grenzschicht zum Trenngel durch den hohen Reibungswiderstand in einer sehr schmalen Zone aufkonzentriert ( gesammelt ) werden. Diese Verdichtung vor dem Eintritt ins Trenngel bewirkt eine wesentliche Erhöhung der Bandenschärfe und Auflösung des Gels.

7 27 ZIELSETZUNG DER EXPERIMENTE I. Aufreinigung von IgG-Antikörpern aus Schafserum Im Rahmen des Versuchstages sollen Immunglobuline der Klasse IgG aus Serum des Schafes affinitätschromatographisch mittels ProteinA-Sepharose isoliert werden. Sowohl Reinigungserfolg als auch IgG-Gehalt im Serum sind anschließend mit Hilfe von SDS-PAGE und Coomassie-Färbung zu bestimmen. II. ELISA-Test zum Nachweis des hcg-hormons im Urin Anhand eines ELISA sollen verschiedene vorgelegte Urinproben qualitativ auf das Vorhandensein von hcg untersucht und die hcg-konzentrationen, der positiven Proben, jeweils einer Schwangerschaft im dritten bzw. siebten Monat zugeordnet werden. Das qualitative Ergebnis ist am Ende des Versuches mit einem kommerziell erhältlichen Schnelltest zu überprüfen. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG UND VERSUCHSPROTOKOLL Mitbringliste: Kittel, Lineal, Taschenrechner VERSUCHSDURCHFÜHRUNG DES ELISA-TESTS Puffer für ELISA (stehen am Arbeitsplatz): Verdünnungslösung für das Antigen: in 10 ml 0.01M Natrium-Phosphatpuffer 25mg Mannitol ph 7,2 und Waschpuffer (PBS-T) (blauer Deckel): NaCl 137 mm, KCl 2,7 mm, Na2HPO4 8,1 mm, KH2PO4 1,76 mm, 0,1 % Tween20, ph 7,2 (einstellen mit NaOH) Blocklösung (orangener Deckel): 2,5 % Magermilchpulver in PBS-T hcg-antikörperlösung (gelber Deckel): ß-hCG-Antikörper (Calbiochem ) 1:4000 in PBS-T Zweitantikörperlösung (gelb/blauer Deckel): Anti-Maus-AK POD-Konjugat (Invitrogen ) 1:4000 in PBS-T

8 28 Substrat-Lösung (braunes Gefäß): 1,2mg Tetramethylbenzidin in 1 ml Ethanol abs. lösen; 9 ml Na-Acetatpuffer 0,1M ph 5,0 und 10µl H2O2 (37%) hinzufügen Lösung jeden Tag frisch ansetzen Stopplösung (roter Deckel): 1M Schwefelsäure (ätzend) Versuchsdurchführung Die Proben sind bereits in die Platte pipettiert und über Nacht inkubiert worden. Für die Verteilung der Proben siehe Plattenschema. Zunächst die in der Platte befindliche Flüssigkeit auskippen und den Rest durch Ausklopfen der Platte auf Handtuchpapier entfernen. Im Anschluss in jedes belegte Well 300 µl Waschpuffer Elisa pipettieren und direkt danach ausschütten und ausklopfen. Diesen Vorgang insgesamt dreimal durchführen. Als nächstes erfolgt ein Blockieren von Bindestellen um unspezifische Bindung des folgenden Antikörpers zu unterbinden. Hierfür in jedes Well 300 µl Blocklösung pipettieren und für 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Nach erfolgter Inkubation wird erneut dreimal mit 300 µl Waschpuffer gewaschen. Im nächsten Schritt erfolgt die Bindung des für hcg spezifischen Antikörpers. Hierfür in jedes Well 200 µl hcg-antikörperlösung pipettieren und die Platte für 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Nach erfolgter Inkubation wird erneut dreimal mit 300 µl Waschpuffer gewaschen Zum Nachweis des gebundenen spezifischen hcg-antikörpers wird mit einem, gegen diesen ersten Antikörper gerichteten, Zweitantikörper inkubiert. Dafür je 200 µl der 2. Antikörperlösung. in jedes Well pipettieren und für weitere 60 min inkubieren. Nach erfolgter Inkubation wird erneut zweimal mit 300 µl Waschpuffer und zweimal mit 200 µl H2O gewaschen. Der Nachweis des gebundenen Zweitantikörpers erfolgt enzymatisch. Hierfür ist der Zweitantikörper mit Peroxidase konjugiert. Zum Starten der Reaktion je 100 µl Substrat- Lösung (Tetramethybenzidin-Lösung) in jedes Well pipettieren und 2 min stehen lassen. Nun fügt man 100 µl Stopplösung (Schwefelsäure) hinzu. Es kommt zu einem Farbumschlag von blau nach gelb. Im Anschluss wird die Absorption der Wells bei 450nm im Plattenlesegerät gemessen.

9 29 Die ermittelten Messwerte sind zu notieren und das Ergebnis zu interpretieren A Urin A Unverd. Urin A 1: 2 verd. Urin A 1: 4 verd. Urin A 1: 8 verd. Urin A 1: 16 verd. B Urin B Unverd. Urin B 1: 2 verd. Urin B 1: 4 verd. Urin B 1: 8 verd. Urin B 1: 16 verd. C Urin C Unverd. Urin C 1: 2 verd. Urin C 1: 4 verd. Urin C 1: 8 verd. Urin C 1: 16 verd. Ergebnistabelle: gemessen am Plattenlesegerät bei 450 nm: A B C AFFINITÄTSCHROMATOGRAFISCHE REINIGUNG VON ANTIKÖRPERN Puffer für die affinitätschromatografische Reinigung von Antikörpern (stehen am Arbeitsplatz): 10 x Waschpuffer (10 x PBS-T 500) NaCl 5 M, KCl 27 mm, Na2HPO4 81 mm, KH2PO4 17,6 mm, 1 % Tween20, ph 7,4 Waschpuffer (PBS-T 500) (Glasflasche mit blauem Deckel): : NaCl 500 mm, KCl 2,7 mm, Na2HPO4 8,1 mm, KH2PO4 1,76 mm, 0,1 % Tween20, ph 7,4 Elutionspuffer (blau/roter Deckel): 0,2 M Glycin, ph 2,8 Neutralisationspuffer (weißer Deckel): 1,5 M Tris/HCl, ph 8,8 Probenpuffer (gelbes, kleines Eppi): 250mM Tris/HCl, ph 6,8, 40% Glycerin, 20% β - Mercaptoethanol, 0,4% Orange G Coomassie-Färbelösung: 0,2% Coomassie Brilliant Blau R250, 7,5% Essigsäure, 20 % Ethanol

10 30 VORBEREITEN DER SÄULE Die Protein-A-Agarose ist bereits in der Säule vorgelegt. Zunächst die in der Säule befindliche Flüssigkeit (20 % Ethanol) auslaufen lassen. Im Anschluss wird die Säule 2-mal mit je 10 ml Waschpuffer (mit der Plastikpipette pipettieren) äquilibriert. Beim zweiten Durchlauf die Säule am Ende mit einem gelben Stopfen verschließen, so dass ein kleiner Rest Puffer über dem Säulenmaterial verbleibt. VORBEREITEN DES SERUMS: (WIRD TEILWEISE VOM ASSISTENTEN DURCHGEFÜHRT!!) Bevor das Serum auf das Säulenmaterial gegeben wird, wurde es zunächst den Pufferbedingungen angepasst. Dazu hat der Assistent zu 2 ml Serum 200 µl 10-fach Waschpuffer gegeben und danach gemischt. Die Probe steht mit S beschriftet auf dem Platz Von dem Serum werden 10 µl in ein frisches Eppi gegeben und mit 90 µl Waschpuffer Säule, (nicht der Waschpuffer Elisa!!) versetzt (T= Totalprotein). Dieses Eppi wird zur Seite gestellt. Das restliche Serum wird auf die Säule gegeben. AFFINITÄTSCHROMATOGRAFIE: Das Rest-Serum wird in die äquilibrierte und verschlossene Säule gegeben und für 15 min. inkubiert. Während der Inkubation wird das am Boden der Säule befindliche Säulenmaterial durch vorsichtiges Schütteln mehrmals aufgeschwemmt. Nach der Inkubation den Stopfen der Säule entfernen und das Serum auslaufen lassen. Dabei den Durchlauf (DL) in einem 2,2ml Eppi auffangen. Im Anschluss erfolgen 5 Waschschritte. Hierfür jeweils 10 ml Waschpuffer (mit der Plastikpipette pipettieren) in die Säule geben und auslaufen lassen. Auch hier die Durchläufe (W1-W5) je in einem Reagenzglas auffangen. Nach dem letzten Waschschritt die Säule erneut verschließen. Für die Elution der gebundenen Antikörper wird zunächst ein Eppi mit 50 µl Neutralisationspuffer versetzt. Im Anschluss wird auf die noch verschlossene Säule 250 µl Elutionspuffer gegeben und für 5 min inkubiert. Danach den Stopfen der Säule entfernen und das Eluat in das vorbereitete Eppi tropfen lassen. Direkt im Anschluss wird ein zweiter Elutionsschritt wie zuvor durchgeführt und im selben Eppi aufgefangen (Probe E).

11 31 SDS-PAGE ODER PROTEINELEKTROPHORESE: Pipettierplan (Angaben in µl) (wird direkt in das Eppi pipettiert!!!) Name der Probe Probenmenge Waschpuffer Säule Probenpuffer T (Totalserum) 10 µl 90 µl 25µl Schon fertig!!! Siehe Vorbereitung des Serums DL (Durchlauf) 10µl 90µl 25µl W1 (Waschschritt 1) 100µl 25µl W5 (Waschschritt 5) 100µl 25µl E (Eluat) 100µl 25µl Alle mit Probenpuffer versetzten Proben (T, verdünnter DL, W1, W5, E) werden für 5 min bei 95 C erhitzen. STARTEN DES SDS-GELS: Von jeder Probe werden 5 µl auf das Gel aufgetragen. Dabei sollte folgende Reihenfolge verwendet werden: Marker, Total, DL, W1, W5, E Wenn alle Proben auf das Gel aufgetragen sind, wird der Deckel auf die Gel-Kammer gesetzt und ein konstanter Strom von 40 ma pro Gel angelegt. Sobald die farbige Bande aus dem Gel ausgelaufen ist, wird der Strom ausgestellt (ca min).

12 32 FÄRBEN DES GELS: Nach erfolgter Elektrophorese wird das Gel aus der Kammer entnommen (Handschuhe tragen, da Acrylamid krebserregend ist). Um das Gel aus den Glasplatten zu bekommen mit einem Spatel vorsichtig die kleinere Glasplatte nach oben hebeln und entfernen. Danach kann das Sammelgel vorsichtig entfernt werden. Im Anschluss das Gel mit Hilfe eines Spatels vorsichtig von der Großen Platte lösen, in eine Plastikschale legen und mit Coomassie-Färbelösung überschichten. Kurz in der Mikrowelle aufkochen (ca. 30 sec.) und für 5 min auf einem Schüttler inkubieren. Nach erfolgter Inkubation die Färbelösung zurück gießen und das Gel mit Wasser abspülen. Danach das Gel mit Wasser überschichten und erneut in der Mikrowelle aufkochen (30 sec). Nach dem Aufkochen einige Spritzer Ethanol hinzugeben und auf dem Schüttler inkubieren bis das Gel entfärbt ist, diesen Schritt mehrfach wiederholen. PROTEINMARKER: Ein wichtiges Verfahren in der Protein-Biochemie ist die Analyse von Proteinen anhand ihrer unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld. Dazu werden Eichproteine mitgeführt, mit deren Hilfe die Molekulargewichte der zu analysierenden Proteine bestimmt werden können.

13 33 LERNZIELE Inhaltlich: Definition von Antigenen Prinzip der zellulären und humoralen Immunantwort Antikörper: A. Struktur von IgG-Molekülen B. Aufbau der Moleküle der einzelnen Immunglobulinklassen C. Funktion der einzelnen Antikörperklassen D. Wechselwirkungen zwischen Antigen und Antikörper E. Polyklonale und monoklonale Antikörper F. Prinzip der Gewinnung von polyklonalen Antikörpern Physiologie des humanen Choriongonadotropins (hcg) Methodisch: Enzymgekoppelte Immunadsorptionstests Affinitätschromatographie, Protein-A-Agarose SDS-PAGE, Färbemethoden