Untersuchung der Interaktion. humaner IgG Antikörper mit humanen FcγR. in vitro und in vivo

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1 Untersuchung der Interaktion humaner IgG Antikörper mit humanen FcγR in vitro und in vivo Der naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Anja Lux aus Altenburg

2 Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 22. Dezember 2010 Vorsitzender der Promotionskomission: Erstberichterstatter: Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Rainer Fink Prof. Dr. Falk Nimmerjahn Prof. Dr. Hans-Martin Jäck

3 Zwei Dinge sind zu unserer Arbeit nötig: Unermüdliche Ausdauer und die Bereitschaft, etwas, in das man viel Zeit und Arbeit gesteckt hat, wieder wegzuwerfen. Albert Einstein

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5 Inhalt Inhalt A. Zusammenfassung...1 I. Zusammenfassung...1 II. Summary...2 B. Einleitung...3 I. Fcγ Rezeptoren Murine und humane Fcγ Rezeptoren Induktion von Antikörpereffektorfunktionen Einfluss der IgG Glykosylierung auf die FcγR Interaktion Polymorphismen von humanen FcγR...7 II. Untersuchungen in humanisierten Mausmodellen Generierung humanisierter Mausmodelle Humanisierte Mausmodelle in der biomedizinischen Forschung...11 C. Fragestellung...13 D. Ergebnisse...15 I. Bindung von Immunkomplexen an FcγR in vitro Herstellung von anti-tnp IgG Subtypen (Klon 7B4) Stabile Expression von humanen FcγR in CHO Zellen Bindung von Immunkomplexen an FcγR Einfluss der N297 Glykosylierung auf die FcγR-Bindung...20 II. Untersuchung von Antikörpereffektorfunktionen im humanisierten Mausmodell Herstellung von anti-cd20 IgG Subtypen (Klon 1F5) Eigenschaften von Rag2/γ c /Fcγ -/- Mäusen Aufreinigung und Analyse von humanen hämatopoetischen Stammzellen Genotypisierung der FcγR Polymorphismen Rekonstitution von Rag2/γ c /Fcγ -/- Mäusen mit humanen HSC Charakterisierung der humanisierten Rag2/γ c /F c γ -/- Mäuse ) Leukozytenpopulationen im humanen Immunsystem ) Leukozytenpopulationen in der humanisierten Maus ) Expression humaner FcγR in humanisierten Rag2/γ c /Fcγ -/- Mäusen ) CD20 Expression in humanisierten Rag2/γ c /Fcγ -/- Mäusen IgG-vermittelte B-Zell-Depletion in humanisierten Mäusen ) F c -Abhängigkeit der 1F5 IgG induzierten B-Zell-Depletion ) B-Zell-Depletion in Blut, Milz und Knochenmark ) Depletion reifer B-Zell-Populationen Milz und Knochenmark ) 1F5 IgG vermittelte B-Zell-Depletion im Blut ) Einfluss der FcγRIIA 131H/R und FcγRIIIA 158F/V Polymorphismen anti-cd20 IgG vermittelte Regulation von FcγR...48 E. Diskussion...51 I. In vitro Bindung von Immunkomlexen an humane FcγR...51 II. Etablierung eines humanisierten Mausmodells...53 III. Anti-CD20 IgG vermittelte B-Zell-Depletion im humanisierten Mausmodell...56 IV. Einfluss der FcγR Polymorphismen in vivo...59

6 Inhalt F. Material und Methoden...63 I. Material Chemikalien, Plastik- und Verbrauchsmaterialen Puffer und Lösungen Kommerzielle Kits Antikörper und Konjugate Oligonukleotide Software...65 II. Methoden Klonierung der 7B4 und 1F5 IgG Antikörper ) Klonierung der variablen Regionen ) Klonierung der schweren und leichten Ketten ) Herstellung von chemisch kompetenten E.coli TOP10 Bakterien ) Transformation von E.coli TOP10 Bakterien ) Isolation von Plasmid DNA aus Bakterien ) Sequenzierung Produktion der 7B4 und 1F5 IgG Antikörper ) Transiente Transfektion von HEK293T Zellen ) Aufreinigung der Antikörper ) Entfernung von LPS-Kontaminationen Proteinmodifikationen ) Biotinylierung ) Konjugation von FITC-Fluorochromen ) Konjugation von Alexa647-Fluorochromen ) Herstellung von F(ab) 2 Fragmenten In vitro Analyse der 7B4 IgG Bindung an FcγR ) Affinität der 7B4 IgG für TNP ) FcγR Expression in stabil transfizierten CHO Zellen ) Anreicherung FcγR exprimierender CHO Zellen ) Immunkomplexbindung an FcγR exprimierende CHO Zellen ) Einfluss der Glykosyslierung auf die Immunkomplexbindung In vitro Analyse der Bindung von 1F5 IgG an LCL1.11 Zellen In vitro Analyse der C1q Bindung durch 1F5 IgG Humane hämatopoetische Stammzellen ) Aufreinigung humaner hämatopoetischer Stammzellen ) Durchflusszytometrische Analyse von Nabelschnurblut und HSC Genotypisierung der FcγR Allele ) Isolation von genomischer DNA aus humanem Nabelschnurblut ) Genotypisierung mittels allelspezifischer PCR Rekonstitution von humanisierten Rag2/γ c /Fcγ -/- Mäusen Probengewinnung und durchflusszytometrische Analysen ) Präparation von Maus-Leukozyten aus dem Blut ) Präparation von humanen Leukozyten aus dem Blut ) Präparation von Leukozyten aus Milz und Knochenmark ) Durchflusszytometrische Färbung und Analyse Immunfluoreszenz-Analyse der humanisierten Mäuse F5 IgG vermittelte B-Zell-Depletion...78

7 Inhalt 13. Zellkultur Versuchstierhaltung Statistik...79 G. Literaturverzeichnis...81 H. Anhang...89 I. Sequenzen und Vektorkarten Sequenzen der klonierten Antikörper: Schwere Ketten Sequenzen der klonierten Antikörper: Leichte Ketten Vektorkarten...92 II. Abkürzungsverzeichnis...93 III. Eigene Publikationen Zeitschriftenartikel Posterpräsentation und Vorträge...96 IV. Lebenslauf...97 I. Danksagung...98

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9 Zusammenfassung A. Zusammenfassung I. Zusammenfassung Immunglobulin G (IgG) Antikörper sind ein essentieller Bestandteil des adaptiven Immunsystems. Genetische Defekte, die zu einer verminderten Bildung bzw. dem vollständigen Fehlen dieses Antikörper-Isotyps führen, gehen mit einer erhöhten Infektionsanfälligkeit einher. Eine Vielzahl von Studien in der Maus deuten darauf hin, dass insbesondere Fcγ Rezeptoren (FcγR), die auf fast allen Zellen des angeborenen Immunsystems exprimiert werden, eine wichtige Rolle für die Aktivität von IgG Antikörpern spielen. In der vorliegenden Arbeit sollte daher untersucht werden, ob die Aktivität von humanen IgG Antikörpern von ähnlichen Faktoren in vitro und in vivo beeinflusst wird. Durch in vitro Bindungsstudien von humanen Immunkomplexen an humane FcγR konnte im ersten Teil dieser Arbeit ein Zusammenhang zwischen der Größe von Immunkomplexen und der Bindung an FcγRIIA, FcγRIIB und FcγRIIIA, nicht aber an FcγRIA, gezeigt werden. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass Immunkomplexe ohne die Glykosylierung am Asparagin 297 eine verminderte Bindung an die niedrigaffinen FcγR aufweisen. Große Immunkomplexe konnten die durch Deglykosylierung bedingte reduzierte Affinität teilweise kompensieren. Einen weiteren möglichen Einflussfaktor auf die IgG-FcγR Interaktion stellen Polymorphismen in den humanen FcγR dar. In dieser Arbeit wurden genetische Varianten der aktivierenden FcγR, FcγRIIA 131H/R und FcγRIIIA 158F/V, untersucht. In in vitro Analysen wies FcγRIIA 131H für alle humanen IgG Isotypen eine erhöhte Affinität auf. Für die in vivo Analyse IgG-vermittelter Effektorfunktionen wurde ein humanisiertes Mausmodell etabliert, in dem die genetische Komplexität des humanen Immunsystems abgebildet wird. Hierfür wurden immundefiziente Rag2/γ c /F c γ -/- Mäuse verwendet, die nach Transplantation mit humanen hämatopoetischen Stammzellen ein humanes Immunsystem mit B- und T-Lymphozyten sowie NK-Zellen, Monozyten und dendritischen Zellen entwickelten. Weiterhin zeigten die humanen Effektorzellen, wie etwa Monozyten und NK- Zellen, ein dem Menschen vergleichbares Expressionsmuster der humanen FcγR. In diesem neuen humanisierten Mausmodell wurde der Zusammenhang zwischen den FcγRIIA 131H/R und FcγRIIIA 158F/V Polymorphismen und der biologischen Wirksamkeit von IgG beispielhaft durch die Induktion der Antikörper-induzierten Zell-vermittelten Zytotoxizität (ADCC) analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass die durch Injektion von anti-cd20 IgG verursachte Depletion von humanen B-Zellen vom konstanten Teil des IgG Antikörpers abhängt. Zudem zeigten die verschiedenen IgG Subklassen eine unterschiedliche Aktivität und es konnten erste Hinweise gewonnen werden, die vermuten lassen, dass die IgG2- vermittelte Depletion in Gegenwart der hochaffinen Varianten der aktivierenden F c Rezeptoren FcγRIIA 131H bzw. FcγRIIIA 158V verstärkt war. 1

10 Zusammenfassung II. Summary Immunoglobulin G (IgG) antibodies are an essential part of the adaptive immune system. Genetic defects leading to a reduced production or a complete lack of this antibody isotype are associated with an increased susceptibility to infectious diseases. Studies of the murine immune system suggest that the biological activity of IgG is mainly mediated by their binding to Fcγ receptors (FcγR) expressed on almost all cells of the innate immune system. The aim of the thesis was to analyse which factors influence the biological activity of IgG in vitro and in vivo. We performed in vitro interaction studies of human immune complexes and human FcγR which suggested a correlation of immune complex size and binding to FcγRIIA, FcγRIIB and FcγRIIIA, but not FcγRIA. In addition, we could show that a lack of glycosylation on asparagine 297 impairs binding to low affinity FcγR. However, this reduced binding could be overcome by increasing the size of the immune complexes. Polymorphisms of the human FcγR pose another factor influencing the interaction with IgG antibodies. To study this, we analysed genetic variants of the activating FcγR, FcγRIIA 131H/R and FcγRIIIA 158F/V. In vitro binding studies showed an enhanced affinity of FcγRIIA 131H for all human IgG subclasses. To study IgG induced effector functions in vivo we developed a humanized mouse model which mirrors the genetic complexity of the human immune system. Immunodeficient Rag2/γ c /Fcγ -/- mice transplanted with human hematopoetic stem cells developed a human immune system as shown by the appearance of B and T lymphocytes, NK cells, myeloid cells and dendritic cells. Effector cells such as monocytes and NK cells displayed expression levels of human FcγRs comparable to their human counterparts. This new humanized mouse model was used to study the influence of FcγRIIA 131H/R and FcγRIIIA 158F/V polymorphisms on the biological activity of IgG antibodies such as the induction of antibody induced cell mediated cytotoxicity (ADCC). B cell depletion induced by the injection of anti-cd20 IgG antibodies greatly depended on the constant region of the antibody. Furthermore, IgG subclasses showed a distinct in vivo activity. Preliminary data also suggest an enhanced IgG2 mediated B cell depletion in the presence of FcγRIIA 131H and FcγRIIIA 158 2

11 Einleitung B. Einleitung I. Fcγ Rezeptoren Antikörper, oder Immunglobuline (Ig), sind ein essentieller Bestandteil des adaptiven Immunsystems zur Abwehr von Viren und Bakterien. Zunehmend werden sie auch zu therapeutischen Zwecken bei der Behandlung von Entzündungserkrankungen und bei der Tumortherapie eingesetzt. Die biologische Wirksamkeit von Antikörpern beruht, neben durch die Antigenbindung ausgelösten Effekten, vor allem auf dem F c Fragment. Aufgrund dieser konstanten Domänen können die Immunglobuline in fünf verschiedene Klassen unterteilt werden: IgM, IgG, IgD, IgE und IgA. Für IgA und IgG existieren jeweils noch weitere Subtypen. In Abb. 1 sind die vier Varianten von IgG (IgG1-4) dargestellt, die sich durch eine starke Konservierung ihrer Sequenzen und eine vergleichbare Proteinstruktur auszeichnen. Dennoch unterscheiden sie sich in Bezug auf die Induktion von F c -abhängigen Antikörpereffektorfunktionen. So können IgG1, IgG3 und in vermindertem Maße auch IgG2 beispielsweise an das Protein C1q binden und damit den klassischen Weg der Komplementkaskade aktivieren. Der Großteil der F c -abhängigen Effekte wird jedoch über die Interaktion mit F c Rezeptoren induziert. Besonders IgG1, IgG2 und IgG3, weniger aber IgG4, sind in der Lage mit den F c Rezeptoren für IgG zu interagieren den FcγR [2]. Abb. 1: Im Menschen existieren 4 Subtypen von Immunglobulin G (IgG) Antikörpern. Diese unterscheiden sich in der Induktion von Effektorfunktionen. IgG1, IgG2 und IgG3 binden an C1q und aktivieren so den klassischen Weg der Komplementkaskade. Vor allem IgG1, IgG2 und IgG3 binden auch an FcγR. 1. Murine und humane Fcγ Rezeptoren Als Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie sind FcγR durch extrazelluläre IgG-bindende Domänen charakterisiert [3]. Die murinen FcγR werden auf vielen Zellen des adaptiven und angeborenen Immunsystems wie z.b. Monozyten/Makrophagen [4-6], NK-Zellen [7], B- Lymphozyten [8] und Granulozyten exprimiert [9]. Wie in Abb. 2A dargestellt, werden in der Maus 4 Klassen von FcγR unterschieden, deren Gene auf Chromosom 1 kodiert sind [10]: die aktivierenden FcγRI (CD64) [4], FcγRIII (CD16) [3] und FcγRIV [11] und der inhibitorische FcγRIIB (CD32) [3]. Der auf Makrophagen exprimierte FcγRI bindet aufgrund von drei 3

12 Einleitung extrazellulären Domänen mit hoher Affinität an monomere IgG. Dagegen besitzen die niedrigaffinen FcγRIIB, FcγRIII und FcγRIV zwei extrazelluläre Domänen und interagieren mit IgG nur in aggregierter Form oder in Form von Immunkomplexen bestehend aus Antigen und Antikörpern [12, 13]. Ein weiteres wichtiges Merkmal der murinen FcγR ist ihre unterschiedliche Affinität für die verschiedenen IgG Subklassen in vitro [11] und in vivo [14-16]. Abb. 2: Murine und humane FcγR. A) Darstellung der 4 Klassen muriner FcγR. Die aktivierenden FcγR sind mit der akzessorischen F c γ Kette assoziiert, die intrazellulär über eine ITAM Domäne verfügt. Der inhibitorische FcγRIIB ist durch eine intrazelluläre ITIM Sequenz charakterisiert. B) Darstellung der humanen FcγR. Analog zu den murinen FcγR, sind die aktivierenden FcγRIA und FcγRIIIA mit der ITAM-tragenden F c γ Kette assoziiert. Beim aktivierenden FcγRIIA wird die ITAM- und beim inhibitorischen FcγRIIB die ITIM-Sequenz direkt durch die α Kette kodiert. Die in dieser Arbeit näher untersuchten Polymorphismen der aktivierenden FcγRIIA und FcγRIIIA sind markiert. Während die Interaktion von FcγR und IgG durch die extrazellulären IgG-bindenden Domänen der α Kette vermittelt wird, erfolgt die Signaltransduktion der Rezeptoren durch intrazelluläre Signalmotive. Das immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif (ITIM) des FcγRIIB befindet sich in der intrazellulären Domäne der α Kette [17]. Anstelle eigener Signalmotive sind die aktivierenden FcγR der Maus durch ihre Transmembranregionen mit 4

13 Einleitung der Fcγ Kette assoziiert [11, 18, 19]. Das intrazelluläre immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) der Fcγ Kette ist für die Signaltransduktion der aktivierenden FcγR nach IgG-Bindung verantwortlich [20]. Die Assoziation mit der Fcγ Kette erhöht nicht nur die Affinität der Rezeptoren für IgG [21] sondern ist notwendig für die Expression der Rezeptoren auf der Zelloberfläche. Fehlt die Fcγ Kette in Immunzellen, so kommt es zum proteolytischen Abbau der α Ketten [22]. In Fcγ -/- Mäusen kommt es daher zu einer Reduktion FcγR-induzierter Effektorfunktionen wie der Phagozytose von Immunkomplexen durch Makrophagen und der Antikörper-induzierten Zell-vermittelten Zytotoxizität (ADCC). Die Expression von FcγRIIB auf B-Zellen ist dagegen nicht beeinträchtigt [18]. Rezeptoren für IgG finden sich auch auf den Zelloberflächen von humanen Monozyten/Makrophagen [23], B-Zellen [24], Granulozyten [25], NK-Zellen [26] und Thrombozyten [27]. Im Vergleich zur Maus, bei der 4 FcγR bekannt sind, existieren im humanen Immunsystem 3 Klassen von FcγR, die sich weiter in verschiedene Subtypen aufteilen lassen. Diese Vielfalt kommt durch Duplikation und Rekombination der Gene [28] auf Chromosom 1 zustande [29-31]. Die FcγRI-Familie (CD64) besteht aus 3 Genen [32]. Es wird jedoch nur der hochaffine FcγRIA als funktionelles Produkt exprimiert [33]. Mehrere Isoformen existieren auch für den niedrigaffinen FcγRII (CD32) [34, 35]: Bei FcγRIIA handelt es sich um einen aktivierenden FcγR, der in der intrazellulären Domäne über ein ITAM für die Signaltransduktion verfügt. Analog zur Maus ist der inhibitorische FcγRIIB durch ein intrazelluläres ITIM charakterisiert [36]. Die beiden Isoformen des niedrigaffinen FcγRIII (CD16) unterscheiden sich vor allem in ihrer Verankerung in der Zellmembran. Beim aktivierenden FcγRIIIA handelt es sich um ein Transmembranprotein [37], wogegen FcγRIIIB über Glykosylphosphatidylinositol (GPI) an die Zellmembran assoziiert ist [37]. Analog zu den murinen FcγR, sind die humanen aktivierenden FcγRIA und FcγRIIIA mit der Fcγ Signalkette assoziiert. Diese Interaktion ist sowohl für die Oberflächenexpression als auch für die Funktionalität der Rezeptoren essentiell [38-40] (Abb. 2B). 2. Induktion von Antikörpereffektorfunktionen Antikörpereffektorfunktionen werden durch die Bindung von IgG-Immunkomplexen an FcγR induziert. Diese Interaktion führt zu einer Kreuzvernetzung der FcγR, gefolgt von der Rekrutierung in lipid rafts. Bei der Bindung an aktivierende FcγR folgt die Phosphorylierung des intrazellulären ITAM [41]. Die dadurch ausgelöste Signaltransduktionskaskade führt letztlich zur Freisetzung von Kalzium [42-44]. Je nach betroffener Effektorzelle kommt es zur Phagozytose des Immunkomplexes, der Präsentation des aufgenommenen Antigens durch MHCII-Komplexe, zur Freisetzung von Zytokinen, zur Proliferation oder Reifung der betroffenen Zelle oder zur Antikörper-induzierten Zell-vermittelten Zytotoxizität (ADCC) [6, 5

14 Einleitung 45, 46]. Bei Kreuzvernetzung des inhibitorischen FcγRIIB kommt es dagegen zur Phosphorylierung des ITIM. Dies induziert eine Signalkaskade, die die Signale der aktivierenden FcγR hemmt [47] (Abb. 3). Die meisten Immunzellen, wie z.b. Makrophagen, exprimieren sowohl aktivierende wie auch inhibitorische FcγR, wohingegen B-Zellen nur den inhibitorischen FcγRIIB und NK-Zellen nur den aktivierenden FcγRIII besitzen. Die Koexpression aktivierender und inhibitorischer Rezeptoren beeinflusst maßgeblich Antikörper-induzierte Effekte wie z.b. die Zerstörung von Tumorzellen durch ADCC in vivo [48] oder die Hemmung der Antikörperproduktion durch negative Rückkoppelung [49]. Ein Fehlen von inhibitorischen Signalen führt weiterhin zur Entstehung von Autoimmunerkrankungen [50]. Daher ist eine Balance zwischen aktivierenden und hemmenden FcγR-Signalen essentiell für die Regulation der Immunantwort und die Erhaltung immunologischer Toleranz. Abb. 3: Die Kreuzvernetzung von FcγR durch IgG-Immunkomplexe induziert Antikörpereffektorfunktionen in Abhängigkeit von der Effektorzelle. Die Koexpression und Kreuzvernetzung des inhibitorischen FcγRIIB dämpft die aktivierende ITAM- Signaltransduktion und bestimmt damit die Schwelle für die Immunzellaktivierung. 3. Einfluss der IgG Glykosylierung auf die FcγR Interaktion Einen wesentlichen Einfluss auf die Interaktion von IgG mit FcγR hat die N-Glykosylierung am Asparagin 297 (N297) in der CH 2 Domäne der schweren Ketten. Änderungen an ihrer Zusammensetzung wirken sich auf die Konformation des F c Fragments und damit auf seine Funktionalität aus [51]. Dies bestätigen Analysen bei denen durch Behandlung von IgG Molekülen mit verschiedenen Glykosidasen die Zuckerketten entfernt werden. Beispielsweise hydrolysiert die Peptid:N Glykosidase F (PNGaseF) aus Flavobacterium meningosepticum die Verknüpfung der Zuckerkette mit Asparagin-Resten wie dem N297 [52]. Alternativ schneidet die Endoglykosidase S (EndoS) aus Streptococcus pyogenes nach N-Acetyl-Glucosamin-Resten innerhalb der Zuckerketten [53] (Abb. 4). In mehreren Studien wurde gezeigt, dass die N297-Glykosylierung die Affinität für die FcγR in vitro und die Wirkung von IgG Molekülen in vivo bestimmt. So führt die Deglykosyslierung 6

15 Einleitung von IgG Antikörpern mit EndoS zu einer reduzierten Bindung an murine und humane FcγR in vitro [54, 55]. Die EndoS-Behandlung verursacht außerdem eine Dissoziation der IgG-FcγR Interaktion [1, 55]. In verschiedenen experimentellen Modellen IgG-vermittelter Autoimmunität wurde durch die Deglykosylierung der IgG mit EndoS eine Besserung der klinischen Parameter in vivo erreicht [1, 54]. Eine verminderte Interaktion des humanen IgG1 mit humanen FcγR wurde auch erzielt, indem das N297 durch ein Alanin ersetzt wurde [56]. Abb. 4: Variante der IgG Glykosylierung an Aminosäure Asparagin 297 der schweren Ketten. (adaptiert nach [1]). Eine Behandlung der IgG mit den Enzymen EndoS bzw. PNGaseF trunkiert die Glykosylierung an den markierten Positionen. (NANA, N-Acetyl-Neuraminsäure; Gal, Galaktose; GlcNAc, N-Acetyl-Glucosamin; Man, Mannose; Fuc, Fucose) 4. Polymorphismen von humanen FcγR Die in vivo Wirkung von Antikörpern wird nicht nur durch unterschiedliche Affinitäten der FcγR für die IgG Subtypen oder durch das Expressionsniveau der aktivierenden und inhibitorischen FcγR bestimmt. Polymorphismen in den kodierenden Genen beeinflussen ebenfalls die Funktionalität der FcγR. So sind für das FcγRIIB-Gen zwei Polymorphismen bekannt. Ein Polymorphismus im Promotor verursacht die verminderte Transkription des Rezeptors [57]. Die Rekrutierung des kreuzvernetzten FcγRIIB in lipid rafts wird dagegen durch eine Mutation in der Transmembranregion verhindert [58]. Beide Polymorphismen führen zu einer verminderten FcγRIIB-Signaltransduktion. In den Genen der aktivierenden FcγRIIA und FcγRIIIA sind ebenfalls Polymorphismen publiziert. Für den humanen aktivierenden FcγRIIA ist eine Punktmutation von Guanin zu Alanin in der zweiten IgG-bindenden extrazellulären Domäne beschrieben. Diese Mutation führt zu einem Aminosäureaustausch von Arginin zu Histidin an Position 131 [59]. Aufgrund ihrer unterschiedlichen Affinität für IgG1 Antikörper der Maus werden die beiden Varianten als low responder (LR, FcγRIIA 131H ), die nur schwach mit den Maus-IgG interagieren, bzw. high responder (HR, FcγRIIA 131R ), die dagegen eine hohe Affinität für die Maus-IgG aufweisen, bezeichnet [60]. Die so beschriebenen polymorphen FcγRIIA unterscheiden sich aber zusätzlich in einem weiteren Aminosäureaustausch von Glutamin zu Tryptophan an Position 27 [61]. Um die Bindung der humanen IgG in Abhängigkeit des FcγRIIA 131H/R 7

16 Einleitung Polymorphismus zu untersuchen wurden surface plasmon resonance (SPR) Affinitätsstudien durchgeführt. Der FcγRIIA 131H/R Polymorphismus scheint keinen Einfluss auf die Affinität für humanes IgG3 und IgG4 zu haben. Allerdings binden humane IgG1 und IgG2 Antikörper stärker an die FcγRIIA 131H -Variante. Zudem interagiert dieser hochaffine FcγRIIA 131H verstärkt mit therapeutischen anti-cd20 Antikörpern [62]. In der Sequenz des humanen aktivierenden FcγRIIIA verursacht die Punktmutation von Thymin zu Guanin in der zweiten extrazellulären Domäne einen Aminosäureaustausch von Phenylalanin zu Valin an Position 158. In vitro Experimente zeigen eine verbesserte Interaktion von FcγRIIIA 158V mit IgG1 und IgG3. Dies führt zur Freisetzung von intrazellulärem Kalzium, einer verstärkten Aktivierung von NK-Zellen und einer Induktion der ADCC. Im Gegensatz zu FcγRIIIA 158F, ist FcγRIIIA 158V in der Lage mit IgG4 zu interagieren [63-65]. Die Bestimmung der Bindungskonstanten zeigt eine erhöhte Affinität von FcγRIIIA 158V für alle humanen IgG Isotypen [62]. Im Gegensatz dazu ist die Beseitigung IgG3-gebundener Erythrozyten durch FcγRIIIA 158V exprimierende Monozyten in vivo vermindert [66]. Die beschriebenen funktionellen Polymorphismen der aktivierenden FcγRIIA und FcγRIIIA wirken sich auf die in vitro Bindung von IgG aus. Um ihren Einfluss auf Antikörper-vermittelte Effekte wie z.b. die IgG-induzierte Immunabwehr von Infektionen, der therapeutischen Anwendung von IgG oder der Entstehung IgG-induzierter Autoimmunerkrankungen in vivo zu ermitteln, wurden epidemiologische Studien durchgeführt. In einer Studie ist die niedrigaffine Variante des FcγRIIA 131R mit einer größeren Empfindlichkeit gegen bakterielle Atemwegsinfektionen assoziiert, da IgG2-opsonisierte Bakterien schlechter phagozytiert werden können [67]. Die Wirkung monoklonaler Antikörper z.b. des anti-cd20 IgG1 Rituximab zur Therapie des follikulären Non-Hodgkin Lymphoms wird positiv durch FcγRIIIA 158V beeinflusst [68]. Eine mögliche Erklärung hierfür liefern in vitro Analysen, bei denen Rituximab mit höherer Affinität an FcγRIIIA 158V bindet. Die Zahl FcγRIIIA exprimierender Effektorzellen in vivo wird nicht durch den Polymorphismus beeinflusst [69]. Weiterhin scheint ein erhöhtes FcγRIII-Expressionsniveau bei FcγRIIIA 158V in vivo die verbesserte Bindung von Rituximab und als Folge dessen eine verstärkte ADCC zu verursachen [70]. Auch die biologische Wirksamkeit anderer therapeutischer Antikörper wie z.b. des anti-epidermal growth factor receptor IgG1 Cetuximab wird von Polymorphismen der aktivierenden FcγR beeinflusst. Während sich die hochaffine Variante von FcγRIIA 131H positiv auf den Therapieerfolg auswirkt, hat der hochaffine FcγRIIIA 158V einen negativen Einfluss [71]. Auch die Anwendung des anti-tnfα IgG1 Infliximab führt bei Expression von FcγRIIIA 158F zu einem besseren therapeutischen Verlauf [72]. Bei anderen Erkrankungen oder therapeutischen Antikörpern scheinen die FcγR Polymorphismen dagegen keinen Einfluss zu haben [73, 74]. 8

17 Einleitung Neben ihren Effekten auf die Immunabwehr und auf monoklonale Antikörpertherapien sind die beiden Polymorphismen in unterschiedlichen epidemiologischen Studien außerdem mit der Entstehung und dem Schweregrad von Autoimmun- und anderen Entzündungserkrankungen assoziiert. Ein Beispiel hierfür ist die Rheumatoide Arthritis (RA), eine systemische Autoimmunerkrankung, die durch die entzündliche Schwellung von Gelenken gekennzeichnet ist. In starker Abhängigkeit von der untersuchten Bevölkerungsgruppe ist entweder das niedrigaffine [75] oder das hochaffine Allel [76, 77] des FcγIIIA mit dem Erkrankungsrisiko für RA assoziiert. Der FcγRIIA 131H/R Polymorphismus scheint dagegen nicht für das Auftreten [78] sondern eher für den Krankheitsverlauf der RA bestimmend zu sein [79] auch wenn das gemeinsame Auftreten von FcγRIIA 131H und FcγRIIIA 158V das Risiko an RA zu erkranken erhöht [80]. Sowohl FcγRIIA 131R [79] als auch FcγRIIIA 158V [81] exprimierende Patienten zeigen einen deutlich schwereren Verlauf der Erkrankung. Eine weitere IgG-vermittelte Autoimmunerkrankung ist der Systemische Lupus Erythematodes (SLE). Eine mögliche Ursache von SLE scheinen Defekte bei der Makrophagen-vermittelten Phagozytose zu sein. Dadurch kommt es zur Ablagerung von Immunkomplexen im Gewebe, die die Einwanderung von Immunzellen und die Freisetzung von Entzündungsmediatoren verursachen [82]. In der europäischen Bevölkerung besteht ein Zusammenhang zwischen dem Auftreten von SLE und der FcγRIIIA 158F -Variante [83]. FcγRIIA 131R scheint dagegen ein Risikofaktor für die Entstehung einer Lupus-Nephritis oder der Produktion von Autoantikörpern zu sein [84, 85]. Auch der niedrigaffine FcγRIIIA 158F wird mit einem schlechteren klinischen Phenotyp der SLE in Verbindung gebracht [86]. Bei der Untersuchung anderer IgG-vermittelter Erkrankungen zeigt die niedrigaffine FcγRIIA Variante einen negativen Einfluss bei der Heparin-induzierten Thrombozytopenie [87], bei der Entwicklung von Myasthenia gravis [88] und Riesenzell-Arterititis [78]. Außerdem verstärken FcγRIIA 131R und FcγRIIIA 158V den Schweregrad der IgA Nephropathie [89]. Auch wenn die Daten auf eine verstärkte Bindung von monomeren IgG und Immunkomplexen an die hochaffinen Rezeptorvarianten hindeuten, lassen die zum Teil widersprüchlichen Ergebnisse epidemiologischer Studien keinen Schluss auf die tatsächliche Bedeutung der FcγR Polymorphismen für Antikörper-vermittelte Effekte in vivo zu. 9

18 Einleitung II. Untersuchungen in humanisierten Mausmodellen Humanisierte Mausmodelle dienen der Untersuchung von komplexen Fragestellungen, die in vitro oder in klassischen Mausmodellen nur unzureichend beantwortet werden können. Beispiele hierfür sind die Untersuchungen zur Entwicklung und Funktionsweise des menschlichen Immunsystems oder die Pathogenese von Infektions- und anderen humanen Erkrankungen. Eine Humanisierung wird durch die Ausstattung der Mäuse mit humanen Zellen oder Genen erreicht, wobei in dieser Arbeit der Fokus auf zellulär humanisierten Mausmodellen liegen soll. In den letzten Jahren konnten verschiedene für entsprechende Fragestellungen optimierte Modelle entwickelt werden. 1. Generierung humanisierter Mausmodelle Die Grundlage für die Etablierung humanisierter Mausmodelle war die Entdeckung der severe combined immunodeficiency (scid) Mutation in Mäusen [90]. Diese Mutation der DNA-abhängigen Proteinkinase p350 führt zu einer Blockade der Lymphozyten- Differenzierung und somit zu einer ausgeprägten Immundefizienz. Die Ursache hierfür liegt in der essentiellen Rolle von p350 bei der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen wie sie z.b. bei der Rekombination der B- und T-Zell-Rezeptoren vorkommen [90-92]. Nach Übertragung von isolierten hämatopoetischen Zellen in scid Mäuse kommt es zunächst zur Proliferation und Differenzierung humaner Immunzellen in vivo [93, 94]. Eine länger anhaltende Repopulierung des murinen Knochenmarks wird dagegen durch den Transfer von Zellen aus Nabelschnurblut erreicht [95]. Die Weiterentwicklung des scid Mausmodells erfolgte durch die Übertragung der Mutation auf diabetis-susceptible nonobese diabetic (NOD) Mäuse. Der resultierende Stamm zeichnet sich durch eine reduzierte Aktivität von NK-Zellen, Makrophagen und des Komplementsystems aus [96]. Rekonstituierte NOD/scid Mäuse zeigen einen 5-10fachen Anstieg des Anteils humaner Zellen in der Milz [97]. Allerdings weisen diese Mäuse auch eine erhöhte Inzidenz von Lymphomen auf [98]. Zusätzlich ist ihre Verwendung in der biomedizinischen Forschung vor allem durch die sporadische und verzögerte Entwicklung von funktionellen Lymphozyten und der vorhandenen Restaktivität des angeborenen Immunsystems limitiert [96]. Der negative Einfluss von NK-Zellen auf den adoptiven Transfer humaner Zellen führte zur zusätzlichen Deletion des β2 Mikroglobulin Gens [99] bzw. der gemeinsamen Signalkette der Rezeptoren für Interleukin (IL)-2, IL-4, IL-7, IL-9 und IL-15. Diese sog. γ c Kette ist für die NK-Zell- Entwicklung essentiell [70, 100]. Die so erzeugten Mausstämme zeigen nicht nur eine verbesserte Lebenserwartung. Die transferierten humanen Zellen differenzieren auch in alle hämatopoetischen Linien [101]. Als Alternative zu NOD/scid/γ -/- c Mäusen wurde ein weiterer immundefizienter Mausstamm generiert, der sich durch das vollständige Fehlen aller 10

19 Einleitung Lymphozyten - B-, T- und NK-Zellen - auszeichnet. Verursacht wird dieser Phänotyp durch das Fehlen des recombinase activating gene 2 (RAG2) und die zusätzliche Deletion der IL2R γ c Kette. Durch Verwendung von Rag2/γ c -/- Vergleich zu NOD/scid Mäusen ebenfalls gesteigert werden [102]. Mäusen konnte die Humanisierungseffizienz im Neben dem verwendeten Mausstamm gibt es weitere Faktoren, die das Anwachsen der humanen Immunzellen beeinflussen. Die Effizienz wird z.b. durch die Art der transplantierten Zellen bestimmt. Humanisierte Mäuse lassen sich mit hämatopoetischen Zellen aus dem Knochenmark [103], aus der fötalen Leber, Thymus bzw. Lymphknoten [93] oder aus dem peripheren Blut [94] rekonstituieren. Die besten Ergebnisse werden jedoch durch Injektion von CD34 + hämatopoetischen Stammzellen (HSC) aus Nabelschnurblut erzielt [104]. Die CD34 + Zellen nisten sich dauerhaft im murinen Knochenmark ein [95], das daraufhin zum primären Ort der humanen Hämatopoese wird. Reife Zellen wandern schließlich in die Peripherie aus [105]. Der Transfer von CD34 + Zellen führt zu einer dem menschlichen Immunsystem entsprechenden Entwicklung funktioneller Lymphozyten, dendritischer Zellen, Monozyten, Erythrozyten und Thrombozyten [101, 104, 106]. Weiterhin kann die Humanisierungseffizienz durch Transplantation neugeborener, anstelle adulter Mäuse [104, 107] und die Bestrahlung der Mäuse [95, 105] vor der Zellinjektion gesteigert werden. Auch die Art der Injektion beeinflusst die Humanisierung. Die Zellen können intravenös [96, 102], intrafemural [108] oder intraperitoneal [109] in adulte Mäuse transferiert werden. Zur Differenzierung humaner Immunzellen kommt es auch nach der in uteri Applikation der humanen Zellen [110]. Die Rekonstitution neugeborener Mäuse kann durch intrahepatische [107] oder intravenöse Injektion in die Gesichtsvene [104] erreicht werden. Letzteres führt zu einem besonders effizienten Anwachsen des humanen Immunsystems. 2. Humanisierte Mausmodelle in der biomedizinischen Forschung Humanisierte Mausmodelle in ihren verschiedenen Formen werden in vielen Gebieten der biomedizinischen Forschung angewendet. Mit ihrer Hilfe können die Entwicklung des Immunsystems, die Pathogenese von Infektions- und anderen Erkrankungen oder auch die Wirkung von potentiellen Therapeutika in vivo untersucht werden. Besonders bei der Untersuchung der Pathogenese humanspezifischer Krankheitserreger wie beispielsweise dem Dengue-Virus [111] oder Humanen Immundefizienz Virus (HIV) [112] haben Mausmodelle, die mit einem humanen Immunsystem ausgestattet sind, eine große Bedeutung. Auch die Entwicklung von Therapeutika z.b. gegen Mycobacterium tuberculosis [113] und HIV [114] wird durch humanisierte Mausmodelle vereinfacht. Humanisierte Mäuse eignen sich auch für die Analyse der Wirkmechanismen und potentieller Nebenwirkungen neuer Medikamente wie z.b. therapeutischer Antikörper vor der Anwendung im Menschen 11

20 Einleitung [115, 116]. Ein weiteres Forschungsfeld ist die Entwicklung von zellbasierten Therapien für Typ-1-Diabetis [117] oder Lebererkrankungen [118] und die Weiterentwicklung der Gentherapie z.b. bei der Fanconi-Anämie [119]. Natürlich können humanisierte Mausmodelle auch genutzt werden um die Pathogenese von humanen Erkrankungen wie der Spinalen Muskelatrophie [120], der Rheumatoiden Arthritis [121] oder Typ-1-Diabetis [122] zu untersuchen. Weiterhin können Abstoßungsreaktionen nach Organtransplantationen, die sog. graft versus host disease (GVHD), in ihnen gut abgebildet werden [123]. Auch für die Tumorforschung haben humanisierte Mausmodelle eine große Bedeutung erlangt. So werden in xenotransplantierten Mäusen der Einfluss von Onkogenen [124] oder anderen kanzerogenen Faktoren wie ultraviolettem Licht [125] untersucht oder Medikamente auf ihre Wirksamkeit überprüft [126]. Zusammenfassend werden humanisierte Mausmodelle heute vielseitig angewendet, nicht nur um die humane Hämatopoese, sondern v.a. auch um human-spezifische Krankheitsprozesse in vivo zu untersuchen. Hierbei sind sie in vitro Studien und herkömmlichen Mausmodellen überlegen. Das variable Anwachsen der humanen Zellen schränkt ihre Anwendung allerdings weiterhin ein. Auch das Fehlen der humanen Umgebung in Form von Zytokinprofilen und Stromazellen für die Differenzierung in ein vollständiges, funktionelles Immunsystem und die verbleibende Aktivität der Maus-Immunzellen ist problematisch. Die Zielstellung dieser Arbeit besteht in der Analyse von Einflussfaktoren auf die Interaktion von humanen IgG und FcγR in vivo. Diese Untersuchungen werden zusätzlich durch die Anwesenheit der murinen FcγR-exprimierenden Immunzellen, die ebenfalls mit humanem IgG interagieren, kompromittiert. Daher ist es essentiell neue humanisierbare Mausstämme herzustellen, die eine Untersuchung der Mechanismen der Aktivität humaner IgG Antikörper in vivo erlauben. 12

21 Fragestellung C. Fragestellung In Form von Immunkomplexen binden Antikörper vom Immunglobulin G Isotyp an Fcγ- Rezeptoren (FcγR) auf den Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems. Diese Interaktion löst Antikörpereffektorfunktionen wie z.b. die Antikörper-induzierte Zell-vermittelte Zytotoxizität (ADCC), die Phagozytose von Immunkomplexen oder die Freisetzung von Sauerstoffradikalen und Zytokinen aus. Aufgrund von Versuchsdaten in Mausmodellsystemen wird angenommen, dass die Intensität dieser Effektorantworten von der Stärke der Bindung der IgG Subklassen an verschiedene FcγR abhängig sein könnte. Im Rahmen dieser Dissertation sollte untersucht werden, ob ähnliche Einflussfaktoren die Interaktion von humanen IgG Subklassen mit humanen FcγR in vitro und in vivo beeinflussen. Einen indirekten Hinweis für einen solchen Zusammenhang geben epidemiologische Studien, die vermuten lassen, dass Polymorphismen der humanen FcγR, die zu einer veränderten Affinität zu bestimmten IgG Subklassen führen, mit der Aktivität bestimmter therapeutischer Antikörper korrelieren. Um diese Fragestellung zu beantworten, sollte im ersten Teil der Arbeit untersucht werden, ob die Größe und die Glykosylierung von humanen Immunkomplexen einen Einfluss auf die Interaktion mit humanen FcγR in vitro haben. Darauf aufbauend sollte im zweiten Teil der Arbeit ein neues Maus-Modellsystem etabliert werden, in dem der Einfluss der Polymorphismen in den aktivierenden FcγRIIA 131H/R und FcγRIIIA 158F/V auf Antikörpervermittelte Effektorfunktionen in vivo untersucht werden kann. 13

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23 Ergebnisse D. Ergebnisse I. Bindung von Immunkomplexen an FcγR in vitro Im ersten Teil der Arbeit wurde die Bindung von humanem Immunglobin G (IgG) an die humanen Fcγ-Rezeptoren (FcγR) untersucht. Insbesondere wurde analysiert, inwiefern die Größe und die Glykosylierung von Immunkomplexen die FcγR Bindung beeinflussen. 1. Herstellung von anti-tnp IgG Subtypen (Klon 7B4) Um die Bindung von humanen IgG an FcγR zu untersuchen, erfolgte zunächst die Klonierung des gegen das Hapten 2,4,6-Trinitrophenyl (TNP) gerichteten Antikörpers 7B4. Hierzu wurde aus der Hybridomzelllinie 7B4 die Gesamt-RNA isoliert, in cdna umgeschrieben und einer 5 -RACE unterzogen. Mit dieser Methode konnten die variablen Regionen der schweren und leichten Kette, trotz ihrer unbekannten Sequenz, bestimmt werden (Sequenz siehe Anhang). Die so erhaltenen V H und V L Domänen wurden dann mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) an die konstanten Domänen (C H bzw. C L ) der humanen IgG Subklassen IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4 fusioniert und in Expressionsvektoren kloniert. Durch transiente Transfektion der erhaltenen Konstrukte in HEK293T Zellen und die anschließende Aufreinigung aus dem Zellkulturüberstand mithilfe von Protein G erhielt man die entsprechenden Antikörper. Die Integrität und Reinheit der produzierten Antikörper wurde mittels reduzierender Polyacrylamid (PAA)-gelelektrophorese nachgewiesen. Durch Reduktion der Disulfidbrücken wurden die zwei schweren Ketten mit einer Größe von ca. 55kDa von den zwei leichten Ketten mit einer Größe von etwa 30kDa getrennt. Eine Ausnahme bildete hier IgG3 dessen schwere Kette aufgrund einer verlängerten hinge Region eine Größe von ca. 60kDa aufweist. Wie in Abb. 5A zu sehen ist, zeigten sich nach Auftrennung von je 2µg Protein und Färbung mit Coomassie Blau die Fragmente der schweren bzw. leichten Ketten in den erwarteten Größen. Bei IgG2 war die Bandenintensität merklich vermindert, obwohl die gleiche Menge Protein aufgetrennt wurde. Bei allen vier Proben war keine Degradation der Antikörper oder eine Verunreinigung durch andere Proteine sichtbar. Die Erkennung der hergestellten Antikörper durch einen Sekundärantikörper, der gegen humanes IgG gerichtet ist, wurde in enzyme-linked immunosorbant assays (ELISA) überprüft. Die Vertiefungen einer ELISA-Platte wurden mit je 50ng IgG beschichtet und anschließend mit einem Merretichperoxidase (HRP)-gekoppelten, F c -spezifischen Antikörper detektiert. Die gemessene optische Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 450nm betrug, nach Abzug des Hintergrundes bei einer Wellenlänge von 650nm, im Mittel von 3 unabhängigen Experimenten 0,75±0,08 für IgG1, 0,69±0,08 für IgG2, für IgG3 0,68±0,12 und 15

24 Ergebnisse für IgG4 0,58±0,9. Im ELISA konnte demnach keine unterschiedliche Erkennung der verschiedenen IgG Subklassen durch den Sekundärantikörper festgestellt werden (Abb. 5B). Abb. 5: Humane anti-tnp IgG Varianten (Klon 7B4). Die variablen Regionen des Hybridom- Antikörpers 7B4 wurden kloniert und an die humanen konstanten IgG Regionen fusioniert. A) Gelektrophoretische Auftrennung der produzierten 7B4 IgG1-4 unter reduzierenden Bedingungen. Die Proteine wurden durch Anfärbung mit Coomassie Blau sichtbar gemacht. B) ELISA zur Kontrolle vergleichbarer Erkennung der IgG Subklassen durch den Sekundärantikörper (anti-human IgG-HRP). C) Analyse der Bindung von 7B4 IgG1-4 an TNP-4-BSA bzw. TNP-26-BSA mittels ELISA. Nicht nur die Integrität der produzierten Antikörper ist für die Herstellung von Immunkomplexen relevant sondern auch eine vergleichbare Bindung des entsprechenden Antigens - in diesem Fall TNP. Diese Bindung wurde für die produzierten 7B4 IgG in einem ELISA bestimmt. Hierfür wurden jeweils 100ng TNP-4-BSA bzw. TNP-26-BSA pro Vertiefung einer ELISA-Platte beschichtet und anschließend mit 1ng IgG1-4 inkubiert. Der Nachweis des gebundenen IgG erfolgte mittels einem HRP-konjugiertem, F c -spezifischen Antikörpers und Bestimmung der OD bei 450nm. Im ELISA konnte eine signifikant verstärkte TNP-4- BSA-Bindung von IgG1 (0,65±0,07) im Vergleich zu IgG2 (0,18±0,09) und IgG4 (0,29±0,04) gemessen werden. Auch IgG3 (0,55±0,07) interagierte signifikant besser mit TNP-4-BSA als IgG2 und IgG4. Die Bestimmung der Bindung an TNP-26-BSA zeigte ebenfalls eine signifikant verbesserte Interaktion von IgG1 (0,64±0,15) im Vergleich zu IgG2 (0,14±0,01) und IgG4 (0,25±0,05). Die Bindung von IgG3 war an TNP-26-BSA (0,37±0,07) in Bezug auf TNP-4-BSA signifikant vermindert. Die anderen IgG Subtypen interagierten vergleichbar mit TNP-4-BSA und TNP-26-BSA (Abb. 5C). 2. Stabile Expression von humanen FcγR in CHO Zellen Die humanen F c Rezeptoren, FcγRIA, die beiden Varianten des FcγRIIA (131H bzw. 131R) und der inhibitorische FcγRIIB wurden von Frau Anne Bärenwaldt kloniert, stabil in CHO Zellen exprimiert und für diese Experimente zur Verfügung gestellt. Ein Fusionsprotein aus den extrazellulären Domänen von FcγRIIIA und den Membran-eingelagerten und 16

25 Ergebnisse intrazellulären Bereichen von FcγRIIB (in dieser Arbeit kurz efcγriiia), welches ebenfalls stabil auf der Oberfläche von CHO Zellen exprimiert wird, wurde von Herrn Jeffrey Ravetch (New York, USA) bereit gestellt. Abb. 6: Stabile Expression der humanen FcγR in CHO Zellen. A) Histogrammdarstellung der durchflusszytometrischen Analyse der FcγR-Expression. B) Quantifizierung des Anteils FcγRexprimierender Zellen aus 3 unabhängigen Experimenten. Die Kontrolle der Oberflächenexpression der einzelnen stabilen Klone erfolgte per Durchflusszytometrie mithilfe von FcγR-spezifischen Antikörpern. Abb. 6A zeigt exemplarisch die Fluoreszenzintensität der Expression, während in Abb. 6B der Anteil FcγR positiver Zellen an der Gesamtpopulation in 3 unabhängigen Experimenten dargestellt ist. In den entsprechenden Zelllinien exprimierten 85,6%±6,5 (FcγRIA), 75,8%±1,2 (FcγRIIA 131H ), 94,3%±1,6 (FcγRIIA 131R ), 96,1%±1,6 (FcγRIIB) und 96,1%±2,0 (efcγriiia) der Zellen den jeweiligen FcγR. Eine Verunreinigung der Zelllinien mit den anderen stabilen Klonen war nicht zu beobachten. 3. Bindung von Immunkomplexen an FcγR Mithilfe der FcγR exprimierenden CHO Zellen wurde die Bindung der verschiedenen humanen IgG Subtypen an FcγR in vitro untersucht. Durch Herstellung der Immunkomplexe mit TNP-4-BSA bzw. TNP-26-BSA konnte außerdem der Einfluss der Größe dieser Immunkomplexe auf die Bindung analysiert werden. Nach der Inkubation der Immunkomplexe mit den FcγR exprimierenden CHO-Zellen erfolgte die Detektion der gebundenen Immunkomplexe per Durchflusszytometrie mittels gegen den F c Teil der 7B4 IgG Varianten gerichteter Phycoerythrin (PE)-konjugierter Antikörper. Abb. 7 zeigt die arithmetischen Mittelwerte der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) aus 3 unabhängig durchgeführten Experimenten. 17

26 Ergebnisse Abb. 7: In vitro Bindungsanalyse humaner IgG Immunkomplexe an stabil exprimierte FcγR. Immunkomplexe wurden aus 7B4 IgG und TNP-4-BSA bzw. TNP-26-BSA generiert und ihre Bindung an untransfizierte (A) und mit FcγRIA (B), FcγRIIA 131H (C), FcγRIIA 131R (D), FcγRIIB (E) und efcγriiia (F) stabil transfizierte CHO Zellen durchflusszytometrisch bestimmt. Gezeigt sind die arithmetischen Mittelwerte aus 3 unabhängigen Experimenten. Der Hintergrund der Bindung von TNP-4-BSA Immunkomplexen an untransfizierte CHO- Zellen lag bei Fluoreszenzintensitäten von 4,2±0,6 (IgG1), 7,8±1,9 (IgG2), 4,4±0,9 und 14,1±18,2. Bei Untersuchung von TNP-26-BSA Immunkomplexen erhöhte sich der Hintergrund auf 16,6±6,1 (IgG1), 21,3±14,6 (IgG2), 16,4±7,7 (IgG3) bzw. 19,0±7,1 (IgG4). Für IgG1 war dieser Anstieg signifikant. Allerdings blieben die gemessenen Werte deutlich unter den Werten einer spezifischen Interaktion (Vgl. Abb. 7A mit 7B-F). An FcγRIA exprimierende Zellen banden die getesteten IgG Subtypen vergleichbar stark. Es gab keine signifikante Veränderung der Fluoreszenzintensitäten bei Verwendung von TNP-4- BSA oder TNP-26-BSA. Mit MFI-Werten für IgG1 von 87,9±27,4 im Komplex mit TNP-4-BSA bzw. 139,3±54,7 im Komplex mit TNP-26-BSA, für IgG2 von 103,4±58,5 (TNP-4-BSA) bzw. 100,4±50,8 (TNP-26-BSA), für IgG3 von 109,0±54,0 (TNP-4-BSA) bzw. 144,7±60,0 (TNP-26- BSA) und IgG4 97,2±57,2 (TNP-4-BSA) bzw. 142,6±54,7 (TNP-26-BSA) war eine deutlich verstärkte Bindung im Vergleich zu untransfizierten Zellen zu erkennen (Abb. 7B). 18

27 Ergebnisse Bei der Bindung an die hochaffine Variante des FcγRIIA (FcγRIIA 131H ) für IgG2 wurden signifikante Unterschiede sowohl für die unterschiedlichen IgG Subtypen als auch für die Verstärkung der Interaktion in Abhängigkeit von der Immunkomplexgröße deutlich. Sowohl IgG1-TNP-4-BSA (147,3±19,9) als auch IgG1-TNP-26-BSA (325,3±62,0) Immunkomplexe banden signifikant besser an FcγRIIA 131H als IgG2-TNP-4-BSA (41,3±1,7) bzw. IgG2-TNP- 26-BSA (78,3±8,1) Immunkomplexe. Ebenfalls signifikant im Vergleich zu IgG2 war die stärkere Bindung von IgG3. Komplexe von IgG3 mit TNP-4-BSA banden mit einer Fluoreszenzintensität von 122,7±29,9, die durch Verwendung von TNP-26-BSA noch auf 479,0±35,4 gesteigert wurde. Im Vergleich zu IgG1 und IgG3 TNP-4-BSA Immunkomplexen zeigten IgG4 Immunkomplexe eine signifikant schwächere FcγR-Bindung. Mit TNP-4-BSA wurden MFI-Werte von 43,5±6,4, mit TNP-26-BSA von 252,7±68,4, erzielt. Ein ähnliches Ergebnis wurde für TNP-26-BSA Immunkomplexe erhalten. Alle mit TNP-26-BSA komplexierten IgG interagierten signifikant besser mit FcγRIIA 131H als die jeweiligen TNP-4- BSA Immunkomplexe (Abb. 7C). Die Fluoreszenzintensitäten für die Immunkomplexbindung an die niedrigaffine Variante des FcγRIIA (FcγRIIA 131R ) waren allgemein niedriger als bei den anderen untersuchten FcγR. Besonders schwach war die Bindung von TNP-4-BSA Immunkomplexen. Sie bewegte sich für IgG2 (13,3±4,9) und IgG4 (9,3±2,8) im Bereich der Hintergrundbindung an untransfizierte CHO Zellen. Die mittlere Bindung von IgG1 betrug 37,1±12,9 und war damit signifikant höher als die Bindung von IgG2 und IgG4. Zu IgG3 (61,6±33,8) gab es keine signifikanten Differenzen. Mit TNP-26-BSA erzeugte Komplexe banden bei allen Isotypen besser an FcγRIIA 131R aber nur für IgG1 war der Unterschied signifikant. IgG1- (153,3±66,5) und IgG3- TNP-26-BSA (203,0±107,1) Immunkomplexe banden signifikant besser als IgG2-TNP-26- BSA (20,2±7,9) Immunkomplexe. IgG4 (43,8±23,8) band im Komplex mit TNP-26-BSA zwar besser als IgG2 aber immer noch sehr schwach. An den niedrigaffinen inhibitorischen FcγRIIB, der an Aminosäureposition 131 ebenfalls ein Arginin trägt, banden die Immunkomplexe in einem ähnlichen Muster wie an FcγRIIA 131R. TNP-4-BSA Immunkomplexe mit IgG1 (14,2±5,5), IgG2 (4,8±1,3), IgG3 (31,6±19,4) oder IgG4 (9,6±4,3) interagierten kaum stärker mit der stabil exprimierenden Zelllinie als mit den untransfizierten Kontrollzellen. Im Unterschied dazu kam es zu einer signifikant verbesserten FcγR-Interaktion bei Verwendung von TNP-26-BSA auf 86,3±38,7 (IgG1), 10,4±0,9 (IgG2) und 44,2±16,6 (IgG4). Die Fluoreszenzintensität von IgG3 (125,5±89,8) Immunkomplexen war dagegen nur leicht erhöht. Betrachtet man die einzelnen Isotypen, so zeigte sich eine signifikante Steigerung der Immunkomplexbindung für IgG1 und IgG4 im Vergleich zu IgG2. Das aus den extrazellulären Domänen von FcγRIIIA und den Transmembran- und intrazellulären Sequenzen von FcγRIIB bestehende Fusionsprotein (efcγriiia) band nach 19

28 Ergebnisse Expression in CHO Zellen, im Vergleich zu den anderen getesteten FcγR, am stärksten an TNP-4-BSA Immunkomplexe. Nur bei IgG3 und IgG4 war eine weitere signifikante Verbesserung der Bindung durch Verwendung von TNP-26-BSA zu erreichen. TNP-4-BSA (IgG1: 262,7±21,1, IgG3: 237,7±22,6) wie auch TNP-26-BSA (IgG1: 287,3±30,9, IgG3: 364,7±53,5) enthaltende Immunkomplexe zeigten erneut eine höhere Fluoreszenzintensität als die jeweiligen IgG2 (87,4±18,4 für TNP-4-BSA, 91,0±17,4 bei TNP-26-BSA) Komplexe. IgG4-TNP-4-BSA Immunkomplexe (67,4±8,7) banden signifikant schwächer als die entsprechenden Immunkomplexe für IgG1 und IgG3. Mit TNP-26-BSA komplexiertes IgG4 (255,0±35,8) zeigte zwar eine signifikant verminderte Bindung bezogen auf IgG3, interagierte aber signifikant besser mit efcγriiia als IgG2. Diese Experimente weisen auf eine bessere Interaktion von IgG1 und IgG3 Immunkomplexen mit den niedrigaffinen humanen FcγR hin. Die Verwendung von TNP-26- BSA im Gegensatz zu TNP-4-BSA führt zu Immunkomplexen die i.a. verstärkt an FcγR binden können. Der hochaffine FcγRIA scheint dagegen keine veränderte Affinität für die einzelnen IgG Subtypen oder Immunkomplexvarianten zu besitzen. 4. Einfluss der N297 Glykosylierung auf die FcγR-Bindung Um den Einfluss der IgG Glykosylierung der schweren Ketten auf die Interaktion mit FcγR zu untersuchen, wurden die Antikörper zunächst mit dem Enzym PNGaseF behandelt, dass die Zuckerketten direkt am Asparagin 297 (N297) hydrolysiert. Die Vollständigkeit dieser Deglykosylierung wurde mittels PAA-Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen und anschließendem Lektin Blot unter Verwendung von lens culinaris agglutinin (LCA) kontrolliert. Nach Färbung des PAA-Gels mit Coomassie Blau zeigten sich die schweren Ketten der unbehandelten IgG1, IgG2 und IgG4 bei etwa 55kDa und die schwere Kette von IgG3 bei etwa 60kDa. Die Proteinbanden der PNGaseF behandelten IgG erschienen dagegen bei einem leicht erhöhten Molekulargewicht. Es waren keine Banden auf Höhe der unverdauten schweren Ketten zu sehen. LCA bindet an die Mannose-haltige Zuckerketten, wie sie bei der N297 Glykosylierung der schweren und leichten Ketten auftreten können. Da der 7B4 Antikörper jedoch keine Asparagin gekoppelten Zuckerketten in der leichten Kette enthält, wurden im Lektin Blot nur die schweren Ketten der unbehandelten IgG, nicht aber die leichten Ketten, angefärbt. Nach PNGaseF-Verdau konnten durch LCA keine Zuckerreste detektiert werden. Dies weist auf eine vollständige Hydrolyse hin. Wie am unveränderten Laufverhalten bei der Gelelektrophorese zu sehen war, wurden die leichten Ketten mit einer Größe von etwa 30kDa nicht durch PNGaseF beeinflusst (Abb. 8A). 20