Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene der Universität zu Köln Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. M.

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1 Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene der Universität zu Köln Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. M. Krönke Aktivierung, Proliferation und in vivo Induktion von CD8 + CD28 - regulatorischen T-Zellen durch das kapsuläre Polysaccharid von Streptococcus pneumoniae Serotyp 1 Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Janina Mertens aus Köln promoviert am 16. März 2011

2 Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln 2011

3 II Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. J. Klosterkötter 1. Berichterstatterin: Privatdozentin Dr. med. W. M. Kalka-Moll 2. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Dr. h. c. H. Pfister Erklärung Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials, sowie bei der Herstellung des Manuskriptes habe ich Unterstützungsleistungen von Privatdozentin Dr. med. Wiltrud Kalka-Moll erhalten. Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Die Arbeit wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt und ist auch noch nicht veröffentlicht. Köln, den

4 III Die in dieser Arbeit angegebenen Experimente sind nach entsprechender Anleitung durch Frau Privatdozentin Dr. med. Wiltrud Kalka-Moll von mir selbst ausgeführt worden. Die Aufreinigung von Sp1 wurde von Martina Bessler und das Sortieren der Zellen von Christoph Göttlinger, Institut für Genetik, durchgeführt. Der Influxversuch des ersten Abschnitts des Ergebniskapitels wurde von Alessandra Zingarella und Helena Hafke durchgeführt und mir freundlicherweise überlassen. Die Immunhistochemie der Abszesse wurde von Sonja Meemboor durchgeführt.

5 IV Danksagungen Mein besonderer Dank gilt Frau Privatdozentin Dr. med. Wiltrud Kalka-Moll für die ausgezeichnete Betreuung. Bei Herrn Professor Dr. med. M. Krönke bedanke ich mich für die Möglichkeit der Promotion an seinem Institut und für die freundliche Überlassung des Themas. Großer Dank gilt der Köln Fortune Stiftung für die Finanzierung dieser Arbeit und Herrn Göttlinger, Institut für Genetik, für das Sortieren der Zellen. Vielen Dank an Jens Seeger zur Anleitung des Western Blottings. Meiner Schwester Anja und meiner Mutter, danke für die Korrekturen! Ich möchte mich vor allem bei meiner Arbeitsgruppe für die wunderbare Zeit im Labor und den Spaß an der Arbeit bedanken, bei Sonja Meemboor für so manche wissenschaftliche Anregung und Hilfe und besonders bei Martina Bessler für die Anleitung zum Arbeiten im Labor und die Unterstützung beim Sorting und allen anderen Dingen. Danke, dass ihr da wart! Ich danke meiner unverbesserlichen Lerngruppe für die schönste Studienzeit, die man sich vorstellen kann. Am meisten danke ich Roman für seine unendliche Geduld. Zum Schluss möchte ich meinen Eltern dafür danken, dass sie mir immer ein sorgenfreies Studium und Leben ermöglicht haben!

6 Meinen Eltern V

7 VI Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Immunantworten von gewöhnlichen kapsulären Polysacchariden Streptococcus pneumoniae Aktueller Forschungsstand Immunantwort des kapsulären Polysaccharids Sp1 von Streptococcus pneumoniae Serotyp CD8 + T-Zellen und CD8 + CD28 - T-Zellen T-Zellrezeptoraktivierung Arbeitsprogramm 7 2. Materialien 2.1 Antigene Kapsulärer Polysaccharidkomplex von S. pneumoniae Kontrollantigen Depletionsantikörper Geräte/ Materialien Puffer/ Lösungen Versuchstiere Zelllinien Adjuvanzien Zellkulturmedien Kultivierung von CD8 + T-Zellen Kultivierung von dendritischen Zellen Magnetische Separation FACS-Analyse Immunhistochemie NFκB-Analyse Nuklear-Extraktion Bicinchoninsäure Test ELISA 13

8 VII 2.12 Western Blot SDS-Gelektrophorese Western Blotting Methoden 3.1 Aufreinigung des kapsulären Polysaccharids (Sp1) von Streptococcus pneumoniae Serotyp Modifizierung von Sp In vitro Versuche Zellgewinnung aus der Milz Zellkultur Zellseparationen CD8 + T-Zellanreicherung mittels magnetischer Separation CD4 + T-Zellanreicherung mittels magnetischer Separation CD8 + CD28 - und CD8 + CD28 + T-Zellanreicherung mittels magnetischer Separation CD8 + CD28 - und CD8 + CD28 + T-Zellanreicherung mittels durchflusszytometrischer Separation Gemischte Leukozytenreaktion Gewinnung dendritischer Zellen aus Balb/c Mäusen Gemischte Leukozytenreaktion Proliferation der CD8 + CD28 + und CD8 + CD28 - T-Zellpopulation NFκB-Analyse Nukleare Extraktion BCA-Test ELISA Kinetik zur Detektion der Zellviabilität Kinetik zur Detektion der Apoptose Apoptoseinduktion Western Blot Gelelektrophorese Transfer und Blockierung Immunreaktion 23

9 VIII 3.11 Tierversuche In vivo Versuche Depletion von CD4 + T-Zellen / CD8 + T-Zellen Zellgewinnung aus der peritonealen Lavage Abszessmodell Immunhistochemie Durchflusszytometrische Analyse Statistische Analyse Ergebnisse Aufreinigung von Sp Modifizierung von Sp Induktion von CD8 + CD28 - T-Zellen durch Sp1 in vitro CD8 + T-Zellen modulieren die Abszessformation nach intraperitonealer Sp1-Applikation Lokalisation von CD8 + T Zellen in der Abszesswand Influx von CD8 + CD28 - T-Zellen in die peritoneale Höhle nach Sp1-Stimulation Induktion von CD8 + CD28 - und CD8 + CD28 + T-Zellen durch Sp1 in vivo Phänotypisierung der CD8 + CD28 + und CD28 + CD28 - T-Zellpopulationen CD122, CD44, CD25, CD62L, CTLA-4 und CD39 Expression TGF-ß-Expression Immunsuppression der Sp1-induzierten Abszessformation durch CD8 + CD28 - T-Zellen Immunsuppression der gemischten Leukozytenreaktion durch Sp ZAP-70 Aktivierung durch Sp1 in CD8 + CD28 - T-Zellen Induktion von NFκB Aktivierung in CD8 + CD28 - T-Zellen durch Sp Kinetik der Sp1-vermittelten Viabilität der CD8 + CD28 - T-Zellen Kinetik der Sp1-induzierten Inhibition der CD8 + CD28 - T-Zellapoptose Apoptoseinhibition durch Sp1 in CD8 + CD28 - T-Zellen Inhibition der Caspase-3-Aktivität durch Sp1 in CD8 + CD28 - T-Zellen Proliferation der CD8 + CD28 - T-Zellpopulation durch Sp1 47

10 IX 5. Diskussion Sp1 induziert CD8 + CD28 - T-Zellen in vivo Phänotypisierung der Sp1-induzierten CD8 + CD28 - T-Zellen als CD8 + CD28 - regulatorische T-Zellen (Treg) Sp1-induzierte CD8 + CD28 - Treg supprimieren die CD4 + T-Zellproliferation und die Abszessbildung Sp1 aktiviert CD8 + CD28 - T-Zellen über einen ZAP-70- und NFκBvermittelten Weg, der in Apoptose-Inhibition mündet Spezifische T-Zellrezeptorbindung durch Sp Zusammenfassung Literaturverzeichnis Abbildungsverzeichnis Vorabveröffentlichungen Lebenslauf 65

11 X Abkürzungsverzeichnis Abb. APC APZ ATCC BCA BD BSA CD CFSE CO 2 CTLA DC dest. DTT ECL EDTA EGTA ELISA FACS FCS FITC FSC G GM-CSF h HCL HRP Ig IL i.p. KCl kda LAP Abbildung Allophycocyanin Antigenpräsentierende Zellen engl., American Type Culture Collection engl., bicinchoninic acid (Bicinchoninsäure) Becton Dickinson Bovines Serum Albumin engl., cluster of differentiation (Unterscheidungsgruppen) engl., carboxy-fluorescein diacetate succinimidyl ester Kohlendioxid Cytotoxisches T-Lymphozyten-Antigen engl., dendritic cell (dendritische Zelle) destilliert 1,4 Dithio-DL-threitol engl., enhanced chemiluminescent Ethylendiamintetraacetat Ethylenglycoltetraacetat engl., enzyme-linked immunosorbent assay engl., fluorescence-activated cell sorter engl., fetal calve serum engl., fluorescein-5-isothiocyanate engl., forward scatter Gauge engl., granulocyte macrophage colony stimulating factor engl., hour (Stunde) Hydrogenchlorid, Salzsäure engl., horseradish-peroxidase Immunglobulin Interleukin intraperitoneal Kaliumchlorid kilodalton engl., latency-associated-peptide

12 XI MACS engl., magnetic activated cell sorting MHC engl., major histocompatibility complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) min. Minute MLR engl., mixed leucocyte reaction (gemischte Leukozytenreaktion) ml Milliliter mm Millimolar msp1 modifiziertes Streptococcus pneumoniae Serotyp1 Polysaccharid µg Mikrogramm µl Mikroliter LPS Lipopolysaccharid NaCl Natriumchlorid NfκB engl., nuklear factor kappa light chain enhancer of activated B cells nm Nanomolar PBS engl., phosphate buffered saline pg Picogramm ph potentia Hydrogenii PE Phycoerythrin PerCP Peridiniumchlorophyll-Protein PI Propidiumiodid PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid rpm engl., rounds per minute (Umdrehungen pro Minute) SCC engl., steril coecal content (steriler Zökalinhalt) SDS Sodiumdodecylsulfat Sp1 Streptococcus pneumoniae Serotyp1 Kapselpolysaccharid SSC Sideward Scatter Tab. Tabelle TCR T-Zell-Rezeptor TEMED Tetramethylethylendiamin TGF-ß engl., Tumor Growth Factor ß Treg regulatorische T-Zelle U engl., unit ZAP engl., ζ-associated peptide ZPS Zwitterionisches Polysaccharid

13 Einleitung 1 1. Einleitung Der menschliche Körper besitzt ein komplexes System, um sich gegen Schädlinge und Krankheitserreger zu schützen. Die Aufgabe des Immunsystems wird schon historisch als Schutz gegen Infektionen definiert [31]. Dem vorangestellt muss das Immunsystem vor allem zwischen körpereigenen und körperfremden Substanzen unterscheiden können. Denn pathogene Keime sollen erkannt und bekämpft werden, die Integrität des Körpers jedoch erhalten bleiben. Diese lebensnotwendige Aufgabe ist die zentrale Rolle der angeborenen und der adaptiven Immunabwehr. Der angeborenen Immunität stehen hierfür mehrere unspezifische Komponenten zur Verfügung. Haut, Schleimhaut, ph-wert der Magensäure oder Flimmerepithelien zählen zu den physiologischen Barrieren, die Keime überwinden müssen, um in den Organismus zu gelangen. Dann folgen die löslichen Bestandteile des Blutes (Komplementsystem, Lysozym etc.) und die zellulären Elemente, wie neutrophile Granulozyten, Makrophagen und Monozyten, die durch ihre Phagozytoseeigenschaften Erreger unschädlich machen. Zusammen stellen sie eine schnelle, aber unspezifische Verteidigung für gewöhnliche und häufige Mikroorganismen dar. Im Gegensatz zur adaptiven Immunabwehr fehlt der angeborenen Immunabwehr ein immunologisches Gedächtnis. Daher greifen bei neuen oder veränderten Antigenen die erworbenen Immunabwehrmechanismen ein. Die Reaktion der spezifischen Immunität basiert neben dem immunologischen Gedächtnis vor allem auf der Aktivierung von B-Zellen als Effektorzellen und auf der T-Zellaktivierung. Antigen-präsentierende Zellen (dendritische Zellen, Makrophagen und B- Lymphozyten) internalisieren und prozessieren verschiedene Antigene [84]. Es erfolgt deren Transport zu den sekundären Immunorganen. Lymphatische Organe sind im Körper so platziert, dass sie den Eintritt und die Ausbreitung von Krankheitserregern verhindern. In den Lymphknoten erkennt ein T-Lymphozyt mittels T-Zellrezeptor (TCR) das für ihn durch Präsentation aufbereitete spezifische Antigen. Die T-Zellen werden mittels ihrer Oberflächenmoleküle CD4 + (T-Helferzellen) und CD8 + (zytotoxische T-Zellen) voneinander unterschieden. CD4 + T-Zellen erkennen bestimmte Antigene in Verbindung mit dem Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II (MHC II) und CD8 + T-Zellen über den Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse I (MHC I) abhängigen Weg.

14 Einleitung Immunantworten von gewöhnlichen kommensalen Polysacchariden Der gesunde menschliche Körper ist von einer großen Anzahl Keime besiedelt, die die sogenannte kommensale Flora bilden. Die kommensale Flora der Haut oder des Darmtrakts besteht aus nicht-pathogenen Keimen, die den Körper vor anderen schädigenden Einflüssen und pathogenen Mikroorganismen schützen. Diese physiologische Besiedelung ist zudem für die Entwicklung und Reifung des Immunsystems mitverantwortlich. Viele dieser Bakterien sind von einer Kapsel umgeben, um sich vor Austrocknung zu schützen und um an Oberflächen haften zu können. Um die Bakterienkapsel unschädlich zu machen, bedarf es spezifischer Mechanismen der adaptiven Immunität. Die Kapsel der meisten pathogenen extrazellulären Bakterien besteht aus hochpolymeren Polysacchariden [41]. Polysaccharide werden auch als T-Zellunabhängige Antigene (TI-2 Antigen, engl. thymus-independent 2 antigen) beschrieben [30] [33], da die TI-2 Antigene ohne T-Zellrekrutierung oder immunologisches Gedächtnis an polysaccharidspezifische B-Zellen binden können. Die Klassifikation der Polysaccharide als TI-2 Antigene basiert allerdings auf der fehlenden T-Zellantwort durch deren ungeladene oder negativ-geladene Struktur [30]. Das Kapselpolysaccharid von Streptococcus pneumoniae besitzt jedoch ein zwitterionisches Ladungsmotiv [37]. 1.2 Streptococcus pneumoniae Pneumokokken, Streptococcus pneumoniae, sind runde bis ovale, gram-positive Bakterien, die meist als Diplokokken oder in kurzen Ketten vorkommen [36]. Es gibt mehr als 80 verschiedene Serotypen. Sie sind keine Sporenbildner und unbeweglich. Die häufigsten Krankheiten, die durch Pneumokokken hervorgerufen werden, sind Pneumonien und Meningitiden [26] [2]. Da Pneumokokken den Nasopharynx kommensal besiedeln, erfolgt eine Infektion häufig endogen bei Immunschwäche. Prädisponierende Faktoren für diese Infektionen sind Alter (>60 Jahre oder Säuglinge), kardiologische Grunderkrankungen, Asplenie oder andere chronische Erkrankungen. Für diese Risikogruppen werden Immunisierungen laut der Ständigen Impfkommission des Robert-Koch-Institutes empfohlen. Die Impfstoffe (Pneumovax 23 ) enthalten Kapselpolysaccharide der 23 häufigsten Serotypen, zu denen auch

15 Einleitung 3 das in dieser Arbeit verwendete zwitterionische Polysaccharid von Streptococcus pneumoniae Serotyp1 gehört. Für Kinder gibt es seit 2001 den Impfstoff Prevenar, der die Polysaccharide der sieben häufigsten Erregern konjugiert an ein Trägerprotein beinhaltet. Die Kapsel schützt das Bakterium vor Phagozytose, indem sie die Opsonierung durch den Komplementfaktor C3b verhindert. Kapsellose Varianten sind nicht pathogen [43]. Das Kapselpolysaccharid ist der hauptsächliche Virulenzfaktor der Pneumokokken [6]. Das Polysaccharid ist an die aus Peptidoglykan-bestehende Zellwand gekoppelt und besteht im Fall von S. pneumoniae Serotyp 1 aus sich wiederholenden Trisaccharideinheiten. Diese Trisaccharide enthalten eine positiv geladene Aminogruppe und zwei negativ geladene Karboxylgruppen. Sie haben damit ein zwitterionisches Ladungsmotiv. +H 3 N O H 3 C O NHAc O - COO COO- O HO HO O O OH OH n -3)-α-D-AAT-(1-4)-α-D-GalpA-(1-3)-α-D-GalpA-(1- Abb. 1) Struktur von S. pneumoniae Serotyp 1. Trisaccharid-Struktur mit zwei negativ-geladenen Karboxylgruppen und einer positiv geladenen Aminogruppe. Molekulargewicht eines Wiederholungsanteils ist 537 Da [73]. Ein aktives aufgereinigtes Molekül ist im Durchschnitt 70 kda groß. Diese zwitterionische Eigenschaft des kapsulären Polysaccharids von S. pneumoniae Serotyp 1 (Sp1) ist vergleichbar mit den kapsulären Polysacchariden von Bacteroides fragilis (PS A1, A2) [82] oder auch Staphylococcus aureus (Serotyp 5 und 8) [77] [78]. Normalerweise besitzen bakterielle Polysaccharide eine negative oder ausgeglichene Ladung [30]. Das zwitterionische Ladungsmotiv von Sp1 ist einzigartig, ebenso wie seine biologische Aktivität die auf diesem Ladungsmotiv basiert [79].

16 Einleitung Aktueller Forschungsstand Immunantwort des kapsulären Polysaccharids von Streptococcus pneumoniae Serotyp 1 (Sp1) Polysaccharide wurden lange Zeit als T-Zell-unabhängige Antigene angesehen. Kapsuläre Polysaccharide mit einem zwitterionischen Ladungsmotiv (ZPS) von B. fragilis, die in der menschlichen Darmflora zu finden sind, und S. aureus, als transienten Besiedler der Haut und Schleimhäute, wurden als Virulenzfaktoren für die intraperitoneale Abszessbildung identifiziert. Das gleiche Potenzial besitzt Sp1 als Besiedler des oberen Atemtraktes. Die intraperitoneale Injektion von ZPS mit sterilem Adjuvans führt zu steriler Abszessbildung [9] [13]. Die Abszessformation durch ZPS ist von CD4 + T-Zellen abhängig, denn ZPS können im Gegensatz zu gewöhnlichen Polysacchariden in vitro und in vivo eine CD4 + T-Zellantwort hervorrufen [38] [39] [77] [78] [79] [80]. Die Elimination der geladenen Gruppe bei zwitterionischen Polysacchariden hebt die T- Zellabhängige Antwort auf [28]. Konvertiert man allerdings ein gewöhnliches kommensales Polysaccharid in ein zwitterionisches, so kann eine CD4 + T-Zellabhängige Antwort ausgelöst werden [28] [78]. Die CD4 + T-Zellen werden über einen MHC II-abhängigen Mechanismus aktiviert [10]. Durch Messung der Zytokinproduktion von IL-2, IL-10 und IFN-γ kann die Aktivierung der CD4 + T-Zellen durch ZPS nachvollzogen werden [78]. Zusätzlich konnte bewiesen werden, dass eine prophylaktische Gabe dieser Polysaccharide den Wirt vor der Bildung von Abszessen schützt [28]. Die Präsentation des zwitterionischen Polysaccharids Sp1 durch MHC II Moleküle erfolgt durch den retrograden Transport vom Lysosom zur Zelloberfläche mit DMabhängigem Protein und MHC II Komplex-positiven Mikrotubuli [21] [38] [71]. Studien zur Antigenbindung von Sp1 weisen darauf hin, dass ZPS an die Antigenbindungsspalte der MHC II Moleküle bindet [11]. Die intraperitoneale Applikation der ZPS mit Adjuvans fördert die CD4 + abhängige Abszessformation [77] [70], wohingegen die subkutane ZPS-Applikation regulatorische IL-10-produzierende CD4 + T-Zellen induziert, welche vor Abszessbildungen schützen [64]. Erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass die orale Gabe von zwitterionischen Polysacchariden vor entzündlichen Darmerkrankungen schützen kann [52].

17 Einleitung 5 Bisherige Untersuchungen sind allerdings ausschließlich auf die Immunantwort von CD4 + T-Zellen fokussiert CD8 + T-Zellen und CD8 + CD28 - T-Zellen Eine signifikante Zahl von potenziellen autoimmunen Lymphozyten verlassen die primären lymphatischen Organe und werden dann nur noch von peripheren Toleranzmechanismen unter Kontrolle gehalten [72]. Die vielleicht wichtigsten Agonisten dieser Mechanismen sind die regulatorischen CD4 + und CD8 + T-Zellen, die fähig sind, die adaptiven und sogar die angeborenen Immunantworten zu unterdrücken [66] [58]. Regulatorische T-Lymphozyten können Immunantworten auf infektiöse Antigene und Autoantigene kontrollieren [54] [1] und auch auf unschädliche Antigene, wie z.b. in der intestinalen Mukosa, einwirken [12]. Natürlich vorkommende suppressive CD8 + T-Lymphozyten (Treg) stellen eine endogene langlebige Population dar, die sich im Thymus entwickeln [59] [23]. Bis zum jetzigen Zeitpunkt wurde den regulatorischen CD8 + CD122 + T-Zellen besondere Beachtung geschenkt. Doch auch die supprimierende Wirkung von CD8 + CD28 - T-Zellen konnte bereits beschrieben werden [53]. Bisherige Daten von in vitro induzierten CD8 + CD28 - T-Zellen durch Antigenstimulation bestätigen, dass die Induktion von CD8 + CD28 - T-Zellen keine Reaktion auf ein spezifisches Antigen sind [34]. Des Weiteren wurde bis jetzt weder ein natürliches Antigen, noch ein Tumor oder ein bakterielles Antigen beschrieben, das CD8 + CD28 - T-Zellen in vitro oder in vivo induziert T-Zellrezeptoraktivierung Der T-Zellrezeptor (TCR) ist der primäre Trigger der antigenvermittelten T- Zellstimulation. Es sind verschiedene Mechanismen der Antigenerkennung durch den TCR bekannt [33]. Konventionelle Peptidantigene werden auf den MHC I oder MHC II Komplex aufgeladen und somit vom T-Zellrezeptor erkannt. Im Gegensatz dazu sind bakterielle Superantigene Proteine, die in anderer typischer Weise mit Zellen des Immunsystems interagieren. Sie können T-Zellen unabhängig von ihrer Antigenspezifität durch Bindung an MHC Klasse II Moleküle Antigen-präsentierender Zellen einerseits und T-Zellrezeptoren andererseits polyklonal stimulieren [44]. Das

18 Einleitung 6 bedeutet, dass Superantigene T-Zellen aktivieren, indem sie zwischen dem MHC II Komplex und dem TCR eine Überbrückung bilden. Mitogene induzieren eine T- Zellaktivierung durch Crosslinking der T-Zelloberflächenmoleküle, wie zwischen dem TCR und dem CD3-Komplex [5]. Es gilt also herauszufinden, ob und auf welche Art und Weise zwitterionische Polysaccharide an den T-Zellrezeptor von CD8 + T-Zellen binden und es zu einer T- Zellstimulation kommen kann. Wenn es zu einer T-Zellaktivierung kommt, können im Inneren der Zelle verschiedene hochregulierte Komponenten nachgewiesen werden (Abb.2). Das ζ- assoziierte Peptid 70 (ZAP-70) kann nur an die ζ-kette des T-Zellrezeptors binden, wenn eine Phosphorylierung durch vorherige Aktivierung stattgefunden hat. Der Transkriptionsfaktor NFκB ist ebenfalls bei Aktivierung der Zelle erhöht nachweisbar und stellt einen Endpunkt von vielen zusammenlaufenden Signalkaskaden dar. Antigen Ag TCR CD3 γδ α β CD3 γδ Lck ζ ζ P ZAP 70 P NfκB Abb. 2) Schematische und vereinfachte Darstellung der T-Zellaktivierung durch Antigenbindung an den T-Zellrezeptor (modifiziert nach Abbildungen von

19 Einleitung Arbeitsprogramm Nachdem bereits bewiesen wurde, dass ZPS zu der Klasse der T-Zellabhängigen Antigenen zählen, standen bis jetzt Untersuchungen an CD4 + T-Zellen im Vordergrund. Aktuellere Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe ergaben aber auch deutliche Hinweise auf die Beteiligung der CD8 + T-Lymphozyten bei Immunantworten auf zwitterionische Polysaccharide. In dieser Arbeit sollen die Immunreaktion und Aktivierung der CD8 + T-Zellen und deren Subpopulationen, CD8 + CD28 + T-Zellen und CD8 + CD28 - T-Zellen, und deren Rolle in der Modulation der Immunantwort der CD4 + T-Zellen durch ZPS untersucht werden. Die Testungen erfolgen in vivo anhand eines murinen Abszessmodells und in vitro durch eine allogene Lymphozytenreaktion. Die Untersuchungen befassen sich mit der Rolle der CD8 + T-Zellen und ihren Subpopulationen bei der Induktion und Prophylaxe von Abszessen und der Antigenspezifität dieser Zellen. Eine Phänotypisierung der durch ZPS-induzierten CD8 + T-Zellen ist hierbei nötig. Es soll außerdem der Frage nachgegangen werden, auf welche Weise ZPS CD8 + T- Lymphozyten aktiviert. Daher soll hier auch die T-Zellrezeptoraktivierung und die intrazelluläre Signalkaskade der CD8 + T-Zellaktivierung nachvollzogen werden. Dies wird mit Messungen der ZAP-70 und NFκB Expression geschehen und des Weiteren durch Apoptoseuntersuchungen genauer beleuchtet werden.

20 Materialien 8 2. Materialien 2.1 Antigene Kapsulärer Polysaccharidkomplex von S. pneumoniae Der kapsuläre Polysaccharidkomplex von Streptococcus pneumoniae Serotyp 1 wird von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, ML, USA) bezogen (Cat. No lot # ). Herstellung durch die Firma Merck & Co., USA Kontrollantigen Modifiziertes Sp1 (eigene Herstellung, Beschreibung siehe 3.2) Depletionsantikörper anti-cd4-antikörper, Becton Dickinson (Klon YTS 169, 500 µg pro Maus) anti-cd8-antikörper, Becton Dickinson (Klon YTS 191, 500 µg pro Maus) 2.2 Geräte/Materialien Durchflusszytometer FACSCalibur, Becton Dickinson ELISA-Reader MRX-TC Revelation, Dynex Variofuge 3.0 R, Heraeus Centrifuge 5417 R, Eppendorf AG Vortex Genie 2, Scientific Industries CO 2 Inkubator Thermo Forma, Thermo MACS Multi Stand, Miltenyi Biotech Falcon Gefäße (15 ml und 50 ml), Falcon Becton Dickinson Sterile Scheren und Pinzetten Organsiebe 40 µm, 70 µm, 100 µm, Falcon Becton Dickinson Neubauer-Zählkammer, Hecht Assistent Pipettierhilfe Accu-Jet, Brand

21 Materialien Puffer/Lösungen Phosphate Buffered Solution (PBS) 0,15 M PBS Dulbecco, Biochrom AG FACS-Puffer: PBS mit 10% FCS (engl., fetal calve serum), Biochrom AG MACS Puffer: PBS mit 0,5% FCS und 2 mm EDTA Annexin Binding Buffer (Cat. No E) bestehend aus 0,1 M Hepes/NaOH ph 7,4, 1,4 M NaCl, 25 mm CaCl (Apoptosis Detection Kit, Becton Dickinson) Aqua ad injectabilia/wasser zu Injektionszwecken, Delta Pharma GmbH Histopaque 1083, Sigma Aldrich, anti-cd3 Antikörper (Klon 1F4), Becton Dickinson EDTA, Sigma Aldrich EGTA, Sigma Aldrich Trypanblau, Sigma Aldrich Staurosporin, Streptomyces spp., Calbiochem-Novabiochem 2.4 Versuchstiere C57/BL6 Wildtyp Mäuse, Charles River, Frankfurt am Main Balb/c Mäuse, Universitätsklinik Köln 2.5 Zelllinien Humane Jurkat Zellen (Klon E6-1) werden bezogen von ATCC. Diese werden in Medium (RPMI-1640 mit 10% FCS) in Kultur gehalten.

22 Materialien Adjuvanzien SCC (engl. sterile coecal content) Adjuvans aus sterilem Darminhalt zur intraabdominellen Abszessinduktion 2.7 Zellkulturmedien Kultivierung der CD8 + T-Zellen RPMI-1640 mit anti-cd3 Antikörper (5 ng/ml), Life-Technologies 50 µm Mercaptoethanol, Biochrom AG 1% Penicillin/Streptomycin, Biochrom AG 1% L-Glutamin, Biochrom AG 1% nicht-essentielle Aminosäuren, Biochrom AG 10% FCS, Biochrom AG Kultivierung der dendritischen Zellen RPMI-1640 mit anti-cd3 Antikörper (5 ng/ml), Life-Technologies 50 µm Mercaptoethanol, Biochrom AG 1% Penicillin/Streptomycin, Biochrom AG 5% FCS, Biochrom AG 500 U Granulocyte/macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF), 20 µg/ml Gentamicin, Biochrom AG 2.8 Immunmagnetische Anreicherung von Zellen CD8 + T-Zell Isolationskit, Miltenyi Biotech CD4 + T-Zell Isolationskit, Miltenyi Biotech Anti-CD34, Miltenyi Biotech Anti-Biotin-Microbeads, Miltenyi Biotech Anti-PE-Microbeads, Miltenyi Biotech Anti-Streptavidin-APC-Microbeads, Miltenyi Biotech MACS LS Separation Columns, Miltenyi Biotech EasySep Biotin Selection Kit, Stem Cell Technologies

23 Materialien FACS-Analyse CFSE Cell Proliferation Kit Cell Trace, Cell Signaling Technology Anti-LAP-PE (27232), R&D Technologies Anti-CD122-FITC (TM-BETA 1), Serotec Anti-CTLA-4-PE (UC10-4B9), ebioscience Die folgenden Antikörper werden von Becton Dickinson bezogen: Spezifität Klon Isotyp Anti-CD8a-FITC GK 4.5 Rat IgG2b Anti-CD8a-APC Rat IgG2a Anti-CD4-APC RM4-5 Rat IgG2a Anti-CD28-PE Rat IgG2b Anti-biotin-Streptavidin-APC Streptavidin Rat IgG2a Anti-CD28-biotin Rat IgG2a Annexin V-FITC X Rat IgG2b Propidiumiodid 1E8 Rat IgG2a Thiazolorange E Rat IgG2b Anti-CD62L-FITC MEL-14 Rat IgG2b Anti-CD39-FITC TU66 Rat IgG2b Anti-CD25-FITC 7D4 Rat IgG2b Anti-CD44-PE IM7 Rat IgG2b Reagenzien, die für das Durchlusszytometer zu gebrauchen sind (FACSFlow, FACSClean, FACSRinse), werden von Becton Dickinson bezogen.

24 Materialien Immunhistochemie 0,3 % H 2 O 2 in Methanol Avidin-Biotin-Kit, Vector Laboratories Goat-Serum, Vector Laboratories anti-cd8 Antikörper (1:50; rat antimouse CD8, clone Ly-2), Becton Dickinson goat biotin-konjugierter anti-rat Antikörper (1:100), Becton Dickinson alkalinische Phosphatase-konjugiertem Streptavidin Antikörperkomplex, Dako Fast Red, Dako Hemalaun, Sigma 2.11 NFκB-Analyse Nuklear-Extraktion Puffer A 10 mm Hepes ph 7,9, 10 mm KCl, 0,1 mm EDTA, 0,1 mm EGTA, 1 mm DTT, 1 mm PMSF Puffer C 20 mm Hepes ph 7,9, 0,4 M Na Cl, 1 mm EDTA, 1 mm EGTA, 1 mm DTT 10% NP 40 Lösung Bicinchoninsäure (BCA) Test BCA Protein-Assay-Kit, Pierce, enthält: Reagenz A: Na 2 CO 3, BCA Natriumtartrat in 0,2 M NaOH Reagenz B: 4% Kupfersulfat Standard: 0,9% NaCl, 0,05% Sodium-Azid, 2 mg/ml BSA Nunc Platte, 96 Vertiefungen (LPS-frei), Nunc

25 Materialien ELISA TransAM NFκB p65 Transcription Factor Assay Kit, Active motif Erstantikörper NFκB p65 Antikörper, Active motif Zweitantikörper HRP-gekoppelter Antikörper, Active motif Standard Recombinant NfκB p65 protein, Active Motif Alle Puffer sind aus den Reagenzien des TransAM Kits herzustellen: Lyse-Puffer 5,4 µl DTT, 10,8 µl Protease Inhibitor Cocktail, 1,064 ml Lysis buffer AM2 Bindungspuffer 3,2 µl DTT, 16,2 µl Herring sperm DNA, 1,6 ml Binding buffer AM3 Bindungspuffer (für Antikörper) 9,72 ml Aqua dest., 1,08 ml (10x) Antibody Binding Buffer AM Western Blot SDS-Gelektrophorese Lämmli-Probenpuffer (6x) Tris/HCl (0,5 M; ph 6,8) 280 mm Glycerol, 30% SDS, 1% DTT, 500 mm Bromphenol Blau 0,0012%, Aqua dest ad 100% Sammelgel (5%) 5,7 ml Aqua dest., 2,5 ml 0,5 M Tris ph 6,8, 100 µl SDS 10%, 1,7 ml Acrylamid/ Bis, 50 µl APS (10%), 10 µl TEMED, Trenngel (14%) 4 ml Aqua dest., 2,5 ml 1,5 M Tris ph 8,8, 100 µl 10% SDS, 3,5 ml Acrylamid/ Bis, 100 µl APS (10%), 10 µl TEMED, Laufpuffer Tris 25 mm, Glycin 192 mm, SDS 0,1%, ph 8,3

26 Materialien Western Blotting Nitrocellulosemembran Optitran BA-583, Schleicher & Schuell GmbH Chromatographiepapier, Whatman Int. Elektrophoresekammer Mini-Protean-II, Bio-Rad GmbH Pierce ECL Western Blotting Substrate, Thermo Fisher Scientific Röntgenfilme 100NIF, Fuji Photo Film Co. Röntgenfilmentwickler Curix capacity Typ8350, Agfa-Gevaert Transferpuffer Tris 25 mm, Glycin 200 mm, Methanol 20%, ph 8,3 Erstantikörper Caspase-3 (8G10) Rabbit mab, Cell Signaling Technology Phospho-Zap-70 (Tyr319)/Syk (Tyr352) Antibody, Cell Signaling Technology Purified Mouse Zap 70, Becton Dickinson Zweitantikörper Anti-rabbit IgG, HRP-linked, Cell Signaling Technology Anti-mouse IgG, HRP-linked, Cell Signaling Technology

27 Methoden Methoden 3.1 Aufreinigung des kapsulären Polysaccharids (Sp1) von Streptococcus pneumoniae Serotyp 1 Das Lyophilisat, das von ATCC bezogen wird, ist ein Zwischenprodukt, das bei der Herstellung von Polysaccharid-Vakzinen gegen Pneumokokken in der Firma Merck & Co. entsteht. Es beinhaltet die kapsulären Bestandteile von Streptococcus pneumoniae Serotyp 1. Für die in dieser Arbeit genannten Versuche werden allein die zwitterionischen Polysaccharide der kapsulären Anteile als Antigen benötigt. Das bedeutet, dass aus dem vorliegenden Lyophilisat alle anderen vorhandenen Substanzen (Proteine und Lipide) entfernt werden müssen und darauf zu achten ist, dass während der Aufreinigung keine Kontaminantien eingeführt werden. In der vorliegenden Arbeit wird die Sp1-Charge 1.22 verwendet. Die Chargen durchlaufen die gleichen Tests bezüglich Reinheit und biologischer Aktivität. 3.2 Modifizierung von Sp1 Die chemische Modifikation des aufgereinigten Sp1 erfolgt über die Neutralisation der freien Aminogruppe am 2-acetamido-4-amino-2,4,6-Trideoxygalactose-Ende durch N-Azetylierung. Azetisches Anhydrid wird in vorher berechneten Mengen über eine Stunde im 10 min-takt unter rührender Bewegung hinzugegeben [77]. Das modifizierte Sp1 wird nachfolgend mit msp1 bezeichnet. 3.3 In vitro-versuche Zellgewinnung aus der Milz Für die in vitro-versuche wird nach Tötung des Versuchstiers mittels CO 2 -Narkose und zervikaler Dislokation nun steril das Abdomen linksseitig eröffnet und die Milz entnommen. Diese wird in ein Falcon Gefäß mit ca. 2 ml PBS gegeben und auf Eis gelagert. Durch ein Organsieb von 100 µm Porengröße wird die Milz mit dem Stempel einer 2 ml-spritze zerdrückt und mehrmals mit PBS nachgespült. Nach

28 Methoden 16 Zentrifugation der Einzelzellsuspension bei 1500 rpm für 5 min. werden mindestens 3 Waschschritte vorgenommen (Auffüllung mit 20 ml PBS, vortexen, wieder abzentrifugieren und Verwerfung des Überstands). Zur Durchführung der Erythrozytenlyse gibt man 0,2% NaCl-Lösung zum Zellpellet und stoppt diese Reaktion nach exakt 30 sec. mit 1,6% NaCl-Lösung ab. Die Erythrozyten halten dem osmotischen Druck nicht stand und zerplatzen. Nun erfolgt nach dreimaligem Waschen der Zellen mit PBS die Zellzählung unter dem Mikroskop mit der Neubauer- Zählkammer in Trypanblau Zellkultur Die Milzzellen werden in c-rpmi Medium mit den oben genannten Zusätzen (1x10 6 Zellen in 1 ml) aufgenommen und im Brutschrank in Platten mit 12 Vertiefungen bei 37 C in wasserdampfgesättigter Atmosphäre mit 5% CO 2 inkubiert. Zusätzlich werden (außer dem Kontrollansatz) 100 µg Sp1 oder 100 µg msp1 hinzugegeben. Die Inkubationszeit der in vitro Versuche beträgt je nach Versuch bei 4-24 h. 3.4 Zellseparationen CD8 + T-Zellanreicherung mittels magnetischer Separation Die gewonnenen Milzzellen werden bei 300 g für 10 min. zentrifugiert. Nach Verwerfung des Überstandes in 30 µl MACS-Puffer aufgenommen. Die CD8 + T- Zellen werden mittels eines CD8 + T-Zell-Isolationskit angereichert. Für 10 min. wird die Zellsuspension mit 10 µl eines Biotin-konjugierten Antikörpercocktails bei 37 inkubiert. Da es sich hierbei um eine negative Anreicherung handelt, bindet Biotin an alle Nicht-CD8 + Zellen. Man gibt für weitere 15 min. 20 µl Anti-Biotin Microbeads und 40 µl MACS Puffer hinzu und inkubiert bei 4 C. Die Microbeads sind kleine magnetische Partikel, die nun das Biotin markieren. Nach Hinzugabe von 1-1,5 ml MACS Puffer und Zentrifugation (300 g für 10 min.) wird der Überstand verworfen und die Zellen in 500 µl MACS-Puffer aufgenommen. Diese Suspension wird nun über die magnetische Säule durch ein Organsieb von 70 µm Porengröße gegeben. In

29 Methoden 17 der Säule binden alle Nicht-CD8 + T-Zellen. Die CD8 + T-Zellen laufen hindurch und werden in einem 15 ml Falcon Gefäß aufgefangen. Die Säule wird mehrmals mit 500 µl MACS-Puffer gespült. Das Protokoll bezieht sich auf eine Zellzahl von 1x10 7 und wird bei höheren Zellzahlen entsprechend der Dosisangaben angepasst. Die aufgefangene Lösung wird abzentrifugiert und die Zellen mit der Neubauerzählkammer gezählt. Die CD8 + T-Zellpopulation beträgt ungefähr 8-10% der Ausgangszellzahl. Die Reinheit wird durchflusszytometrisch überprüft und liegt bei allen Versuchen zwischen 94-98% (Abb. 3). vor Selektion nach Selektion CD8+ T-Zellzahl 32% CD8+ T-Zellzahl 97% CD8+APC CD8+APC Abb. 3) Immunmagnetische Selektion der CD8 + T-Zellen. (A) zeigt die Milzpopulation vor der magnetischen Selektion. Es befinden sich 32% CD8 + T-Zellen in der nativen Milzpopulation. (B) zeigt die aufgereinigten CD8 + T-Zellen. Es sind 97% CD8 + T-Zellen in dieser verwendeten Probe CD4 + T-Zellanreicherung mittels magnetischer Separation Die T-Zellanreicherung der CD4 + Populationen erfolgt analog zur CD8 + Selektion CD8 + CD28 - und CD8 + CD28 + T-Zellanreicherung mittels magnetischer Separation Die selektionierten CD8 + T-Zellen werden zur weiteren magnetischen Verarbeitung entweder mit einem anti-28-pe Antikörper konjugiert (1 µg/1x10 6 Zellen für 20 min. auf Eis) und anschließend mit anti-pe-microbeads (10 min. 4 C) behandelt oder mit anti-28-biotin Antikörper (1 µg/1x10 6 Zellen für 20 min. auf Eis) konjugiert und anschließend mit Streptavidin-APC (1 µg/1x10 6 Zellen für 15 min. auf Eis) und darauffolgend mit anti-apc-microbeads behandelt.

30 Methoden 18 Die CD8 + CD28 + T-Zellen sind dann mit dem jeweiligen Farbstoff versehen und werden in 500 µl MACS-Puffer aufgenommen. Diese Suspension wird nun wieder über eine magnetische Säule durch ein Organsieb mit 70 µm Porengröße gegeben. Die CD8 + CD28 - T-Zellen binden nicht und werden in einem 15 ml Falcon Gefäß aufgefangen. Um die CD8 + CD28 + T-Zellen zu erhalten, werden die positiv selektionierten (Farbstoff- und Microbeads-gebundenen) Zellen mit einem Stempel aus der Säule herausgeschoben und ebenfalls aufgefangen CD8 + CD28 - und CD8 + CD28 + T-Zellanreicherung mittels durchflusszytometrischer Separation Um die aufgereinigten CD8 + T-Zellen je nach CD28 + Expression trennen zu lassen, werden Milzzellen (wie in beschrieben) aus ca. 3-4 Versuchstieren gewonnen und mittels magnetischer Separationstechnik CD8 + T-Zellen angereichert (3.4.1). Danach wird das CD8 + Signal mit FITC und das CD28 + Signal mit PE markiert (je 1 µg Farbstoff/1x10 6 Zellen). Diese angefärbten Zellen werden im Institut für Genetik, Universität zu Köln, von Herrn Christoph Göttlinger mit FACSVantage sortiert. Man benötigt mindestens 1x10 7 CD8 + T-Zellen. Die CD8 + CD28 + T-Zellen und die CD8 + CD28 - T-Zellen werden getrennt und in zwei 15 ml Falcon Gefäßen sortiert (Abb. 4). Die CD8 + T-Zellen enthalten ungefähr zu 30% CD28 - und zu ca. 70% CD28 + Zellen [53]. CD28 PE CD28 PE CD8 FITC CD8 FITC CD28 PE CD8 FITC Abb. 4) Durchflusszytometrische Isolierung der CD8 + CD28 - und CD8 + CD28 + T-Zellpopulation. Die magnetisch angereicherten CD8 + T-Zellen werden durchflusszytometrisch nach CD28 PE-Signal durch Gates sortiert. Die Reinheit liegt hierbei jeweils bei 93-97%

31 Methoden Gemischte Leukozytenreaktion Gewinnung dendritischer Zellen aus Balb/c Mäusen Zur Gewinnung muriner dendritischer Zellen werden Balb/c Mäuse durch zervikale Dislokation unter CO 2 Narkose getötet. Die Knochen der Hinterbeine werden steril freigelegt und von Muskeln und Gelenken befreit. Mit einer Kanüle werden die Knochen mit 4 ml Puffer (PBS plus 1 mm EDTA plus 1% FCS) durchspült und die Zellsuspension auf Eis gelagert. Die Zellsuspension wird durch ein Organsieb mit 100 µm Porengröße gegeben und abzentrifugiert. Das Zellpellet wird in 8 ml raumtemperiertem Puffer (PBS plus 1 mm EDTA) resuspendiert und auf 5 ml Histopaque 1083 gegeben. Anschließend erfolgt eine Zentrifugation bei Raumtemperatur für 30 min. und 450 g ohne Bremse. Danach wird die sichtbare trübe Zwischenschicht abpipettiert und in 20 ml Puffer (PBS plus 1 mm EDTA) für 10 min. zentrifugiert. Nach Zellzählung in der Neubauer-Zählkammer werden 1x10 8 Zellen des Zellpellets in 1 ml Puffer (PBS plus 1 mm EDTA plus 1% FCS) resuspendiert. Die folgenden Protokollangaben werden bei erhöhter Zellzahl entsprechend angepasst. Für 1x10 8 Zellen werden 10 µl FCR-Block und 15 µl anti- CD34 Antikörper für 15 min. hinzugegeben. Die Reaktion wird mit 10 ml Puffer (PBS plus 1 mm EDTA plus 2% FCS) abgestoppt. Nach Zentrifugation wird das Pellet in 1 ml Puffer 3 aufgenommen und erneut durch ein Organsieb gegeben (Porengröße 100 µm). 100 µl anti-biotin-cocktail werden für 15 min. und danach 50 µl anti-biotin- Microbeads für weitere 10 min. hinzugegeben. Die Reaktion wird durch Auffüllung mit Puffer auf 2,5 ml abgestoppt und die Probe wird am Magneten eingestellt. Nach 5 min. wird der Überstand verworfen und die Probe mit den CD34 + Zellen aus dem Magneten entfernt. Nach Zentrifugation werden die CD34 + Zellen in 1 ml Zellkulturmedium aufgenommen, welches jeden zweiten Tag zu 500 µl vorsichtig abpipettiert und mit frischem DC-Medium erneuert wird Gemischte Leukozytenreaktion Bei der gemischten allogenen Leukozytenreaktion [49] werden aus Splenozyten von naiven C57/BL6-Mäusen (Haplotyp-2b) CD4 + T-Zellen magnetisch separiert (Verfahren analog zur Separationstechnik der CD8 + T-Zellen). Diese werden mit 0,25

32 Methoden 20 µm CFSE für 3 min. inkubiert. 1,5 x 10 5 der CFSE-markierten CD4 + T-Zellen gibt man nun zu den 5 x 10 5 dendritischen Zellen der Balb/c-Mäuse (Haplotyp-2d) pro Vertiefung in einem totalen Volumen von 1 ml. Nach 5 Tagen Inkubationszeit bei 37 C und 5% CO 2 in Medium, welches anti-cd3 enthält (5 ng/ml), wird die Proliferation der CD4 + T-Zellen mit FACSCalibur gemessen. In verschiedenen Ansätzen werden magnetisch angereicherte CD8 + CD28 + T-Zellen und CD8 + CD28 - T-Zellen beigefügt, die aus C57/BL6 Mäusen stammen, denen vor Zellentnahme Sp1+SCC+PBS, msp1+scc+pbs oder SCC+PBS allein intraperitoneal injiziert wurde. 3.6 Proliferation der CD8 + CD28 - und CD8 + CD28 + T-Zellpopulation Um die Proliferation der CD8 + Subpopulationen durchflusszytometrisch messen zu können, werden CD8 + T-Zellen angereichert und magnetisch mittels Biotin- Streptavidin-APC nach CD28 + und CD28 - separiert. Dann werden 1x10 6 Zellen pro 1 ml PBS aufgenommen und mit 0,25 µm CFSE für 3 min. inkubiert. Durchflusszytometrisch wird nun kontrolliert, ob die Zellen CFSE aufgenommen haben. Die Zellen werden in den verschiedenen Versuchsansetzen mit 100 µg Sp1, 100 µg msp1 oder mit Medium allein für 24 h im Brutschrank bei 37 C und 5% CO 2 und anti-cd3 inkubiert. Mittels FACS-Analyse werden die Populationen auf ihre CFSE-Positivität untersucht. 3.7 NFκB-Analyse Nukleare Extraktion Die Proben (CD8 +, CD8 + CD28 +, CD8 + CD28 - T-Zellen) werden zur Detektion von NFκb 4 h mit Sp1, msp1 oder mit Medium allein inkubiert und anschließend dreimalig mit PBS gewaschen und einer Nuklearextraktion unterzogen. Dazu werden 1 x 10 7 Zellen bei rpm zentrifugiert und das Zellpellet in 400 µl Puffer A für 15 min. auf Eis inkubiert. Danach werden 50 µl 10% NP40 Lösung für 2 min bei Raumtemperatur hinzugegeben. Man zentrifugiert bei maximaler Geschwindigkeit für 5 min., um die Nuklei zu sedimentieren. Das Pellet wird in 70 µl Puffer C unter milder

33 Methoden 21 Bewegung bei 4 C für 30 min. inkubiert. Der salzhaltige Puffer lysiert die Nuklei und befreit sie von Chromatin-assoziierten Proteinen. Nach Abzentrifugation der Proteine wird der Überstand (Nuklearextrakt) zur weiteren Verwendung entnommen BCA-Test Um den identischen Proteingehalt der Proben nach dieser Behandlung sicherzustellen, wird ein BCA-Test durchgeführt [69]. Es wird eine Platte mit 96 Vertiefungen mit dem BSA-Proteinstandard von 1 mg/ml bis 0,025 mg/ml befüllt. Reagenzien A und B werden im Verhältnis 100:2 gemischt und in den Vertiefungen auf 200 µl aufgefüllt. 10 µl jeder Probe werden gleichsam aufgetragen und die Reaktion verläuft innerhalb einer Stunde bei Zimmertemperatur. Das Ergebnis wird mit einem ELISA-Reader bei 550 nm gemessen. Anhand der Standardgeradengleichung kann nun die Proteinmenge jeder Probe bestimmt werden und entsprechende Mengen weiterverwendet werden ELISA In alle Vertiefungen der ELISA-Platte werden 30 µl Bindungspuffer vorgelegt. Das rekombinante Protein NFκB p65 wird als Standard verwendet und von der Stammlösung (100 ng/µl) eine 2er-Verdünnungsreihe von 0,5 ng/µl bis 0,008 ng/µl angefertigt. Von jedem Verdünnungsschritt werden 20 µl in die Vertiefungen gegeben. Als Positivkontrolle wird 1 µl Jurkatzellextrakt in 19 µl Lysepuffer aufgetragen. Um ein optimales Ergebnis zu erhalten, entspricht die Proteinmenge der Proben ca. 12 µg bis 20 µg. Diese werden auf 20 µl mit Lysepuffer aufgefüllt und in die Vertiefungen der ELISA-Platte gegeben. Die Platte wird nun für eine Stunde bei langsamer Bewegung und Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen der Vertiefungen mit 200 µl Waschpuffer werden jeweils 100 µl NFκB- Antikörper (1:1000 verdünnt in Antikörper-Bindungspuffer) hinzugegeben und erneut eine Stunde bei Raumtemperatur ohne Bewegung inkubiert. Danach wird mit dem Zweitantikörper (HRP-Antikörper) in gleicher Weise verfahren. Schließlich werden 100 µl Entwicklerlösung hineinpipettiert und die Reaktion nach 4 min. mit der Stopplösung (100 µl) beendet. Die Blaufärbung schlägt in eine Gelbfärbung der Vertiefungen um und die kolorimetrische Reaktion sollte innerhalb von 5 min. mit

34 Methoden 22 einem ELISA-Reader detektiert werden. Gemessen wird bei 450 nm zum Referenzfilter 630 nm. Man erstellt daraufhin eine Geradengleichung der Standardkonzentrationen und kann anhand der Absorptionswerte die Konzentration in pg/µl berechnen. 3.8 Kinetik zur Detektion der Zellviabilität Isolierte CD8 + T-Zellen werden in Kultur gebracht und bei den Interventionsansätzen werden 100 µg Sp1, 100 µg msp1 oder Medium allein als Kontrolle hinzugegeben. Nach 0 h, 4 h, 8 h und 12 h entnimmt man die Zellen und färbt jeweils mit Thiazolorange (5 µl/1x10 6 Zellen) für 20 min. und nach einem Waschschritt mit PBS wiederum mit Propidiumiodid (5 µl/1x10 6 Zellen) für 5 min. Die Zellen werden mit anti-28-biotin Antikörper (1 µg/1x10 6 Zellen für 20 min auf Eis) und anschließend mit Streptavidin-APC (1 µg/1x10 6 Zellen für 15 min auf Eis) behandelt. Nach Zentrifugation und Verwerfung des Überstandes resuspendiert man das Zellpellet in FACS-Puffer. 3.9 Kinetik zur Detektion der Apoptose Die gewonnenen CD8 + T-Zellen werden für bestimmte Zeitspannen mit Antigen behandelt (siehe 3.8). Zur Analyse gibt man 200 µl Annexin V Binding Buffer (1:10 verdünnt) zu den Splenozyten hinzu und färbt mit 5 µl/1x10 6 Zellen Annexin V FITC- Konjugat für 20 min. Nach Waschen mit PBS wird durchflusszytometrisch in FACS- Puffer gemessen Apoptoseinduktion Für 4 h wird den isolierten CD8 + T-Zellen 1 µm Staurosporin zum Medium gegeben. Staurosporin ist ein potenter Initiator der Apoptose [35] [40]. Nach insgesamt 12 h Inkubation mit den Antigenen werden die Zellen gewaschen und abzentrifugiert. Man nimmt sie in Annexin V Bindungspuffer auf und fügt 5 µl/1x10 6 Zellen Annexin V FITC-Konjugat für 20 min. und 5 µl/1x10 6 Zellen Propidiumiodid für 2 min. hinzu. Die Reaktion wird mit 5 ml PBS abgestoppt und es wird erneut gewaschen.

35 Methoden Western Blot Gelelektrophorese Die Proteinproben wurden mit zweifach destilliertem Wasser auf gleiche Volumina aufgefüllt und anschließend mit reduzierendem Probenpuffer versetzt. Es erfolgt eine 5 minütige Erhitzung auf 95 C zur Denaturierung der Proteine. Zusätzlich wird ein gefärbter Molekulargewichtsstandard verwendet. Die Gelelektrophorese wird bei 120 V für ca. 75 min. in Laufpuffer durchgeführt, sodass die Proben den unteren Rand des Gels erreichen. Die Proben werden erst im Sammelgel (5% Acrylamid) fokussiert und dann im Trenngel nach Molekulargewicht aufgetrennt Transfer und Blockierung Die aufgetrennten Proteine wurden nun in Transferpuffer auf eine Nitrocellulosemembran transferiert. Dies geschieht im Naß-Verfahren durch die negative Ladung der Proteine von Kathode zu Anode. Das Blotten des Gels auf die Membran erfolgt bei 250 ma für ca. 90 min. Mit einer Ponceau-Färbung werden zur Kontrolle alle Banden, die auf die Membran übertragen wurden, kurz angefärbt. Man erkennt, ob die Proben zu gleichen Mengen aufgetragen wurden. Die Ponceau- Färbung wird durch Waschen mit SPBS wieder entfernt. Danach wird die Membran in ein 50 ml Falcon Gefäß gegeben und in 20 ml 5% Milchpulver für ca. 30 min. unter milder Bewegung für unspezifische Bindungen geblockt Immunreaktion Nun wird über Nacht mit dem jeweiligen Erstantikörper (in der Verdünnung 1:1000 für Caspase-3 und 1:5000 für PhosphoZAP-70/Syk) inkubiert. Am nächsten Tag wird nach dreimaligem Waschen für 15 min. der Zweitantikörper 1:1000 (HRP-linked Antibody) für 60 min. hinzugegeben. Nun wird die Reaktion mittels eines ECL-Kits messbar gemacht. Die Entwicklung erfolgt auf einem Röntgenfilm in einer Dunkelkammer.

36 Methoden Tierversuche Die in dieser Arbeit durchgeführten Tierversuche mit den Registriernummern K07/05 und K16.5/06 sind von der Bezirksregierung Köln genehmigt. Es werden sechs bis acht Wochen alte weibliche C57/BL6 oder Balb/c Mäuse verwendet, soweit nicht anders beschrieben In vivo Versuche Bei den in vivo Versuchen werden 100 µg Sp1 (gelöst in 100 µl PBS)+SCC+PBS in einer Dosierung von 0,68 µl/g Körpergewicht der Maus in einem Gesamtvolumen von 200 µl intraperitoneal injiziert. Analog wird jeweils eine Kontrolle mit 100 µg msp1+scc+pbs und eine Kontrolle mit SCC+PBS durchgeführt. Nach 18 h -24 h werden die Versuchstiere dann durch zervikale Dislokation in CO 2 -Narkose getötet und die Milz entnommen oder eine peritoneale Lavage durchgeführt Depletion von CD4 + T-Zellen / CD8 + T-Zellen Zur Depletion der CD4 + T-Zellen werden 24 h vor Sp1-Behandlung 500 µg eines spezifischen anti-cd4 Antikörper intravenös appliziert. Um die Depletion zu überprüfen, werden Proben des Blutes und der Milz 24 h und 48 h nach Injektion der FACS-Analyse unterzogen. Die Analyse zeigt eine 95%ige Depletion der T- Zellpopulation an. Das Verfahren wird analog zur CD8 + Depletion angewendet Zellgewinnung aus der peritonealen Lavage Nach Tötung des Versuchstiers mittels CO 2 -Narkose und zervikaler Dislokation wird das Bauchfell mit sterilem Werkzeug eröffnet. Ca. 3 ml eisgekühltes PBS wird mit einer 20 G Kanüle intraperitoneal injiziert. Unter Sicht der Kanüle im Peritoneum wird der Bauch nun eine Minute massiert und die Flüssigkeit samt Zellen mit der Spritze wieder herausgesogen. Die Zellen werden in ein Falcon Gefäß gegeben und auf Eis gelagert. Nach dreimaligem Waschen der Zellen mit PBS erfolgt das Zählen der Zellen mittels Neubauerzählkammer.

37 Methoden Abszessmodell Beim intraabdominellen Abszessmodell werden 100 µg Sp1 (gelöst in 100 µl PBS) mit SCC in einer Dosierung von 0,68 µl/g Körpergewicht der Maus aufgefüllt auf 300 µl PBS intraperitoneal injiziert. Dazu wird der Maus die Versuchslösung mit einer 27 G-Kanüle in den rechten Unterbauch injiziert. In der Kontrollgruppe wird msp1+scc+pbs oder SCC+PBS gespritzt. SCC dient hierbei als Adjuvans und imitiert die bei einer Sepsis gestörte Darmflora der Maus. Bei diesem Modell werden die Versuchstiere nach sechs Tagen durch zervikale Dislokation unter CO 2 -Narkose getötet und das Bauchfell eröffnet. Nun werden das komplette Abdomen und Peritoneum von zwei unabhängigen Personen nach Abszessen durchsucht und die Anzahl und die Größe (in mm) der Abszesse notiert Immunhistochemie Eingefrorene Abszesse werden kryosektioniert (5-6 mm) und 1 min. in 4% Formalin fixiert. Nach Blockierung der endogenen Peroxidase mit 0,3 % H 2 O 2 in Methanol und Blockierung des endogenen Biotin mit einem Avidin-Biotin-Kit für 30 min. werden die Gefrierschnitte mit Goat-Serum behandelt und über Nacht mit einem anti-cd8 Antikörper inkubiert. Hiernach inkubiert man 1 h mit einem goat biotin-konjugiertem anti-rat Antikörper (1:100) bei Raumtemperatur und nachfolgend mit einem alkalinischen Phosphatase-konjugiertem Streptavidin Antikörperkomplex für 30 min. Das Immunostaining wurde mit Fast Red als Substrat für alkalinische Phosphatase durchgeführt. Die Schnitte werden abschließend mit Hemalaun behandelt Durchflusszytometrische Analyse Um den Phänotyp von Zellen zu charakterisieren, werden diese mittels Durchflusszytometrie vereinzelt durch einen Laser registriert. Die Zellen werden einerseits durch ihre Größe und Granularität unterschieden, da sie Streulicht aussenden (Forward-, Sideward-Scatter) und andererseits durch die Eigenschaften, die vorher durch Farbstoff-konjugierte Antikörper markiert werden. Zur Analyse und statistischer Auswertung werden mindestens 1x10 4 bis 3x10 4 Zellen gezählt.