Ein progressiver Algorithmus für Multiple Sequence Alignment auf Basis von A*-Suche. Christine Zarges

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1 Ein progressiver Algorithmus für Multiple Sequence Alignment auf Basis von A*-Suche Christine Zarges Algorithm Engineering Report TR November 2007 ISSN Fakultät für Informatik Algorithm Engineering (LS 11) Dortmund / Germany

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3 UNIVERSITÄT FACHBEREICH DORTMUND INFORMATIK Diplomarbeit Ein progressiver Algorithmus für Multiple Sequence Alignment auf Basis von A -Suche Christine Zarges I N T E R N E I N T E R N A L B E R I C H T E R E P O R T S Diplomarbeit am Fachbereich Informatik der Universität Dortmund 14. Mai 2007 Gutachter: Prof. Dr. Petra Mutzel Maria Kandyba GERMANY D DORTMUND

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5 Ein progressiver Algorithmus für Multiple Sequence Alignment auf Basis von A -Suche Christine Zarges

6 Ich danke Melanie Schmidt für zahlreiche Anmerkungen und Diskussionen, Daniel Göhring für viele hilfreiche Tipps, Maria Kandyba, Markus Chimani und Frau Prof. Dr. Petra Mutzel für die Betreuung dieser Arbeit sowie meinen Eltern für die Unterstützung während des gesamten Studiums. Christine Zarges, Fachbereich Informatik, Universität Dortmund

7 Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Symbolverzeichnis V VII IX 1 Einleitung Problembeschreibung und verwandte Arbeiten Ziele der Arbeit Gliederung der Arbeit Mathematische Problemmodellierung Kodierung von Nukleinsäuren und Proteinen durch Strings Verwandtschaftsbegriff für Sequenzen Definition von Sequenzalignments Bewertung von Sequenzalignments Paarweises Alignment Multiple Sequence Alignment Zusammenfassung Alignments und Dynamische Programmierung Paarweises Alignment Lineare Lückenstrafen: Needleman-Wunsch Allgemeine Lückenstrafen: Waterman-Smith-Beyer Affine Lückenstrafen: Gotoh Multiple Sequence Alignment Zusammenfassung I

8 II Inhaltsverzeichnis 4 Alignments und Kürzeste-Wege-Algorithmen Algorithmus von Dijkstra A -Suche Verwendete Schätzfunktionen Paarweise Alignments als untere Schranke Dreifache Alignments als untere Schranke Pruning Bidirektionale Suche Symmetrischer Ansatz Konsistenter Ansatz Erweiterung für quasi-affine Lückenstrafen Zusammenfassung Progressive Algorithmen Progressiver Divide-And-Conquer-Algorithmus Progressive bidirektionale A -Suche Progressiver k-band-algorithmus Grundlegende Modifikationen für n Sequenzen und Kürzeste- Wege-Algorithmen Distanzberechnung im n-dimensionalen Edit-Graphen MAX-Metrik REACH-Metrik Erweiterung des k-bandes Minimierung der Progressivitätskosten Ansatz 1: Snapshot-Methode Ansatz 2: k-band-stack-methode Zusammenfassung Experimentelle Analyse Setup Verwendete Datenstrukturen Implizite Graphdarstellung Listendarstellung Trie Erweiterung für quasi-affine Lückenstrafen

9 Inhaltsverzeichnis III Berechnung der Nachbarknoten und Kantengewichte Resultate Experimente mit BAliBASE Progressivitätskosten Datenstrukturen für markierte Knoten und Kanten Berechnung der unteren Schranke Varianten des k-band-algorithmus Unidirektionale und bidirektionale Suche Art der Lückenstrafe Konvergenzverhalten Vergleich mit OMA Zusammenfassung der Ergebnisse Experimente mit Cytochrome C Zusammenfassung und Ausblick 103 A Molekularbiologische Grundlagen 105 A.1 Nukleinsäuren A.1.1 DNS A.1.2 RNS A.2 Proteine A.3 Der genetische Informationsfluss B Substitutionsmatrizen für Proteine 111 B.1 PAM-Matrizen B.2 BLOSUM-Matrizen B.3 Vergleich von PAM- und BLOSUM-Matrizen Literaturverzeichnis 115

10 IV Inhaltsverzeichnis

11 Abbildungsverzeichnis 2.1 Multiples Alignment für n = Entstehung der Rekursionsgleichung nach Needleman-Wunsch Berechnung eines optimalen Alignments nach Needleman-Wunsch Beispiel für die Konstruktion eines 2-dimensionalen Edit-Graphen Korrektheitsbeweis des Algorithmus von Dijkstra [9] Modifikation der Kantenkosten durch die A -Suche Edit-Graph für Vorwärts- und Rückwärtssuche mit n = Ablauf der bidirektionalen A -Suche bei Verwendung von linearen Lückenstrafen Gegenbeispiel für das Optimalitätsprinzip bei affinen oder quasiaffinen Lückenstrafen Edit-Graph für quasi-affine Lückenstrafen mit n = Beispiel für eine nicht-konsistente Schätzfunktion bei affinen Lückenstrafen Ablauf der bidirektionalen A -Suche bei Verwendung von quasiaffinen Lückenstrafen Schema der Divide-And-Conquer-Methode aus [36] dimensionales k-band Die Gitter-Struktur des Edit-Graphen dimensionales k-band mit MAX-Metrik dimensionales k-band mit REACH-Metrik Multi-k-Band Ablauf des unidirektionalen k-band-algorithmus für lineare Lückenstrafen unter Verwendung der k-band-stack-methode Ablauf des bidirektionalen k-band-algorithmus für lineare Lückenstrafen unter Verwendung der k-band-stack-methode V

12 VI Abbildungsverzeichnis 6.1 Datenstrukturen für die Verwaltung markierter Knoten Einige Beispiele für den Gray-Code Beispiel für die Berechnung des Gray-Codes für n = Progressivitätskosten bei Verwendung von linearen Lückenstrafen Progressivitätskosten bei Verwendung von quasi-affinen Lückenstrafen Laufzeit und Speicherbedarf von Trie und Listendarstellung Laufzeit von Trie und Listendarstellung für verschiedene Breiten des k-bandes Anzahl endgültig markierter Knoten sowie Laufzeit für paarweise und dreifache Alignments bei Verwendung von linearen Lückenstrafen Anzahl endgültig markierter Knoten sowie Laufzeit für paarweise und dreifache Alignments bei Verwendung von quasi-affinen Lückenstrafen Laufzeit verschiedener Varianten des k-bandes (bidirektional) Laufzeit verschiedener Varianten des k-bandes (unidirektional) Laufzeit für BiDir-REACH, aufgesplittet auf einzelne Iterationen Laufzeit von BiDir-A* für verschiedene Alternierungsstrategien Laufzeit für unidirektionale und bidirektionale Suche Optimierzeit für Algorithmen mit und ohne k-band Speicherbedarf bei Verwendung von linearen und quasi-affinen Lückenstrafen Konvergenzverhalten Konvergenzverhalten Laufzeit von UniDir-REACH auf n Cytochrome C Sequenzen Laufzeit von BiDir-A* auf n Cytochrome C Sequenzen Laufzeit auf n Cytochrome C Sequenzen bei Verwendung von Trie und paarweisen Alignments A.1 Aufbau der Desoxyribonukleinsäure (DNS) [4] A.2 Das zentrale Dogma der Molekularbiologie B.1 PAM-250-Matrix in der Distanzvariante

13 Tabellenverzeichnis 3.1 Relevante Vorgänger für zwei Sequenzen aus einem multiplen Alignment gemäß Sum-Of-Pairs-Maß mit affinen Lückenstrafen [3] Anzahl relevanter Vorgänger bei affinen und quasi-affinen Lückenstrafen [3] Anzahl gezählter Lücken für affine und quasi-affine Lückenstrafen [3] Laufzeiten für verschiedene Prioritätswarteschlangen Überblick über die Eigenschaften der verwendeten Testinstanzen Laufzeitübersicht für lineare Lückenstrafen und paarweise Alignments Laufzeitübersicht für lineare Lückenstrafen und dreifache Alignments Laufzeitübersicht für quasi-affine Lückenstrafen Laufzeit (in s) und Speicherbedarf (in MB) für n Cytochrome C Sequenzen A.1 Nukleobasen und ihre Kodierung A.2 Proteinogene Aminosäuren und ihre Kodierung B.1 Vergleich von PAM-Matrizen und BLOSUM-Matrizen VII

14 VIII Tabellenverzeichnis

15 Symbolverzeichnis Folgende Liste gibt einen Überblick über die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Bezeichnungen und Symbole. Sequenzen: Σ Σ + Σ S 1,..., S n Alphabet Σ { } Menge aller möglichen Strings über Σ Sequenzen mit S i = (s i,1... s i,li ) Σ, s i,j Σ S 1 i = (s i,li... s i,1 ) Die zu S i inverse Sequenz αi k σi k S = {S 1,..., S n } n l 1,..., l n l max Präfix von S i, der die ersten k Buchstaben umfasst Suffix von S i, der die letzten l i k Buchstaben umfasst Menge von Sequenzen Anzahl Sequenzen Länge der Sequenzen S 1,..., S n Länge der längsten Eingabesequenz Alignments: s 1,1 s 1,2... s 1,l s 2,1 s 2,2... s 2,l A Ein Alignment mit A == s n,1 s n,2... s n,l A Optimales Alignment A ij Projektion von A auf S i und S j (induziertes paarweises Alignment) IX

16 X Symbolverzeichnis S i = (s i,1... s i,l ) l D = (d ij ) d : (Σ + Σ + ) Q w(a) w(a ij ) w (S i, S j ) Zeile eines Alignments A bzgl. S i Anzahl Spalten eines Alignments A (Σ Σ)-Substitutionsmatrix mit d ij Q Distanzfunktion zu einer Substitutionsmatrix D Bewertung eines Alignments A Bewertung für ein induziertes paarweises Alignment A ij Wert eines optimalen Alignments von S i und S j µ Obere Schranke für den Wert eines optimalen Alignments g : N Q γ g op g ext Lückenstrafe Kosten für eine einzelne Lücke bei Verwendung von linearen Lückenstrafen Lückenöffnungskosten (Gap Opening Penalty) Lückenfortsetzungskosten (Gap Extension Penalty) Graphentheorie: G = (V, E, c) Edit-Graph mit Quelle s = (l 1,..., l n ), Senke t = (0,..., 0) und Kantenkosten c G 1 = (V 1, E 1, c 1 ) Inverser Edit-Graph mit Quelle t = (0,..., 0), Senke s = (l 1,..., l n ) und Kantenkosten c 1 (v, w), v w v w λ(v w), λ(p) Gerichtete Kante von v nach w Weg von v nach w Länge eines Weges von v nach w bzw. eines Weges p Algorithmus von Dijkstra: dist s [v] dist t [v] δ s (v) δ t (v) π s (v) Länge eines kürzesten Weges von s nach v in G Länge eines kürzesten Weges von t nach v in G 1 Distanzlabel für Knoten v in G Distanzlabel für Knoten v in G 1 Vorgänger von v auf einem (kürzesten) Weg in G

17 Symbolverzeichnis XI π t (v) Vorgänger von v auf einem (kürzesten) Weg in G 1 Q, Q 1 Prioritätswarteschlange A -Suche: h s (v) h t (v) c hs c 1 h t P, P 1 Funktion, die die Länge einen kürzesten Weg von s nach v in G abschätzt Funktion, die die Länge einen kürzesten Weg von t nach v in G 1 abschätzt Reduzierte Kantenkosten bzgl. h s in G Reduzierte Kantenkosten bzgl. h t in G 1 Datenstruktur zur Verwaltung endgültig markierter Knoten k-band-algorithmus: q i = (q i,1,..., q i,n ) i-tes Diagonalelement

18 XII Symbolverzeichnis

19 Kapitel 1 Einleitung Die Bioinformatik ist ein aufstrebendes interdisziplinäres Gebiet der heutigen Wissenschaft und verfolgt das Ziel, effiziente algorithmische Methoden für die biologische Forschung zu entwickeln und einzusetzen. Beginnend mit der Entdeckung der Doppelhelix-Struktur der DNS durch Watson und Crick im Jahre 1953 hat sich das Wissen im Bereich der Molekularbiologie rasant vermehrt. Die Bioinformatik arbeitet daher meist auf großen Datenbeständen, um neue Erkenntnisse zu gewinnen und diese für andere Wissenschaften nutzbar zu machen. Viele molekularbiologische Erkenntnisse wären heute ohne den Einsatz informatischer Methoden undenkbar. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit einem fundamentalen Teilgebiet der Bioinformatik der Sequenzanalyse. Hierbei werden molekularbiologische Sequenzen wie z. B. Nukleinsäuren (DNS, RNS) oder Aminosäuresequenzen (Proteine) miteinander verglichen und Ähnlichkeiten zwischen ihnen identifiziert. Grundlage dieser Untersuchungen ist die Annahme, dass eine hohe Ähnlichkeit derartiger Sequenzen funktionelle und strukturelle Ähnlichkeiten sowie eine evolutionäre Verwandtschaft impliziert [19]. Diese Hypothese kann damit begründet werden, dass bewährte Strukturen im Laufe der Evolution wiederverwendet, kopiert und dabei modifiziert werden (Zentrales Paradigma der Evolution von Proteinen [19]). Die ersten Untersuchungen im Bereich der Sequenzanalyse begannen in den 60er Jahren. Zu diesem Zeitpunkt waren nur wenige molekularbiologische Sequenzen verfügbar, wie z. B. die Proteine Cytochrome C 1 und Hämoglobin 2. Da diese Proteine für verschiedene Organismen bekannt waren, wurden aufgrund der Annahme, dass verwandte Organismen auch ähnliche Proteinsequenzen besitzen, Abstammungsbäume konstruiert [47]. Ein erster großer wissenschaftlicher Erfolg auf dem Gebiet der Sequenzanalyse gelang 1983 mit der Feststellung eines Zusammenhangs zwischen einem krebsverursachenden Gen und einem Gen, das am normalen Wachstums- und Entwicklungsprozess von Zellen beteiligt ist. Aufgrund der Ähnlichkeit dieser beiden Gene wurde die Vermutung, dass Krebs durch eine falsche Aktivierung dieses Wachstumsgens entsteht, bestätigt [34]. 1 Cytochrome dienen der Übertragung von Elektronen. 2 Hämoglobin ist zuständig für den Sauerstofftransport im Blut. 1

20 2 Kapitel 1 - Einleitung Den Durchbruch auf dem Gebiet der Bioinformatik stellt schließlich der erfolgreiche Abschluss des Human-Genom-Projektes im Jahre 2003 dar, bei dem mit Hilfe der Informatik die menschliche DNS vollständig entschlüsselt wurde. Hieraus ergaben sich neue Aufgabenfelder und Herausforderungen. Die gewonnenen Erkenntnisse helfen häufig bei der Diagnose und Vorbeugung von genetisch beeinflussten Krankheiten. 1.1 Problembeschreibung und verwandte Arbeiten Wir werden uns im Folgenden insbesondere mit dem Vergleich von Proteinen beschäftigen. Diese Ähnlichkeitsanalyse hat zwei Hauptanwendungsgebiete: Einerseits sollen Zusammenhänge zwischen Aminosäuresequenzen und der Funktion bzw. der Struktur der durch sie kodierten Proteine identifiziert werden. Andererseits dient die Analyse der Bestimmung von Verwandtschaftsbeziehungen und damit der Rekonstruktion von Evolutionsprozessen. Eine wichtige Methode für die Struktur- und Funktionsanalyse von Proteinen sind Alignment-Verfahren. Ziel dieser Verfahren ist die Bestimmung eines Maßes für den Verwandtschaftsgrad der gegebenen Sequenzen. Diese werden dabei durch das Einfügen von Lücken so gegeneinander verschoben, dass ähnliche Bereiche übereinander stehen. Hieraus können wiederum evolutionäre Verwandtschaften (Homologien) abgeleitet werden. Darüber hinaus stellen Alignment-Verfahren die Grundlage für komplexere Aufgaben dar. Zu nennen sind hier z. B. DNS-Sequenzierung, Datenbanksuche und die Erstellung phylogenetischer Bäume. Aufgrund dieser Anwendungen ist die Entwicklung effizienter Alignment-Verfahren sehr wichtig. Ein weit verbreitetes Framework zur Berechnung von Alignments stellt das Sum-of-Pairs-Maß [7] dar. Während sich das paarweise Alignment, bei dem nur zwei Sequenzen gegeben sind, in quadratischer Zeit lösen lässt, ist das Multiple Sequence Alignment mit n Sequenzen gemäß Sum-Of-Pairs-Maß NP-schwer [46]. In der Praxis beschäftigt man sich jedoch meistens mit dem Multiple Sequence Alignment. Da es dort wichtig ist, möglichst schnell ein Ergebnis zu erhalten, werden in der Regel Heuristiken [19, 32] eingesetzt. Trotz der Komplexität des vorliegenden Problems ist die Entwicklung effizienter exakter Algorithmen sinnvoll. Sie kommen z. B. bei der Evaluierung von Heuristiken oder als Unterprogramm für Heuristiken zum Einsatz. Eine klassische exakte Methode zur Berechnung von Alignments ist der auf dem Prinzip der Dynamischen Programmierung basierende Needleman-Wunsch-Algorithmus [33]. Er wurde u. a. von Carillo und Lipman [7] verbessert. Ein anderer Ansatz für das vorliegende Problem basiert auf Kürzeste-Wege- Algorithmen. Gupta et al. präsentierten in [18] einen Branch-and-Bound-Ansatz, der den Algorithmus von Dijkstra [11] verwendet. Horton et al. [24, 29, 38] nutzten stattdessen die A -Suche [20] für die Berechnung des kürzesten Weges und konnten auf diese Weise den Suchraum des Algorithmus deutlich reduzieren.

21 1.2 Ziele der Arbeit 3 Einen Kompromiss aus Heuristiken und exakten Algorithmen stellen progressive Algorithmen 3 dar. Hierbei werden zunächst nur suboptimale Lösungen berechnet, die dann abhängig von den zur Verfügung stehenden Ressourcen (Zeit, Speicher) immer weiter verbessert werden und beweisbar gegen das Optimum konvergieren. Der erste und einzige uns bekannte progressive Algorithmus für das Multiple Sequence Alignment wurde von Reinert et al. [36] vorgestellt. Er basiert auf der Verknüpfung einer heuristischen Divide-and-Conquer-Methode [41] mit der A -Suche. 1.2 Ziele der Arbeit Aufgrund der bisherigen Ergebnisse auf dem Gebiet der Alignment-Verfahren soll ein neuer progressiver Algorithmus auf Basis der A -Suche entwickelt werden. Hierzu soll anstelle der Divide-and-Conquer-Heuristik eine k-band-heuristik [19] verwendet werden, die ursprünglich für das paarweise Alignment entworfen wurde. Die zentrale Idee dieses Algorithmus ist, den Suchraum zunächst auf einen kleinen Bereich (k-band) einzuschränken, der dann sukzessive erweitert wird. Auf dem eingeschränkten Suchraum wird dann z. B. eine A -Suche ausgeführt. Die Größe des aktuell betrachteten k-bandes kann dabei zusätzlich einen Hinweis auf die Ähnlichkeit der betrachteten Sequenzen geben. Des Weiteren gibt es im Bereich Kürzester-Wege-Algorithmen vielversprechende Resultate bei der Verwendung einer bidirektionalen Suche [35]. Hierbei werden im Gegensatz zur unidirektionalen Suche zwei parallele Berechnungen durchgeführt: eine vom Startknoten s und eine vom Zielknoten t aus. Sobald sich die beiden Suchrichtungen treffen, werden die Wege geeignet konkateniert. In dieser Arbeit soll untersucht werden, ob sich die Verwendung einer bidirektionalen Suche für das vorliegende Problem lohnt. Soweit uns bekannt ist, wurde bisher weder die k-band- Heuristik noch die bidirektionale Suche für das Multiple Sequence Alignment eingesetzt. Ziel der vorliegenden Arbeit ist, aus den vorgestellten Ansätzen einen progressiven Algorithmus für das Multiple Sequence Alignment zu entwickeln. Dieser soll außerdem implementiert und experimentell analysiert werden. Abschließend sollen die erzielten Ergebnisse mit dem progressiven Algorithmus von Reinert et al. [36] verglichen werden. 1.3 Gliederung der Arbeit Die vorliegende Arbeit ist wie folgt gegliedert: Zunächst wird in Kapitel 2 eine geeignete Problemmodellierung vorgestellt und es werden notwendige Begriffe eingeführt. Kapitel 3 behandelt Standardmethoden zur Berechnung von Alignments, 3 Im Kontext von Alignment-Verfahren wird der Begriff progressiv häufig mit einer anderen, im Rahmen dieser Arbeit irrelevanten, Bedeutung verwendet und beschreibt eine Klasse von Heuristiken zur Berechnung von Alignments.

22 4 Kapitel 1 - Einleitung die auf dem Prinzip der Dynamischen Programmierung basieren. Danach werden wir in Kapitel 4 zeigen, wie Kürzeste-Wege-Algorithmen auf das vorliegende Problem angewendet werden können. Schließlich werden in Kapitel 5 verschiedene progressive Algorithmen behandelt. Das Kapitel beginnt dabei mit der Beschreibung des progressiven Algorithmus von Reinert et al. [36]. Im Anschluss wird der im Rahmen dieser Arbeit entwickelte progressive k-band-algorithmus präsentiert. Den Hauptteil der Arbeit stellt die experimentelle Analyse in Kapitel 6 dar. Hier werden verschiedene Varianten des entwickelten Algorithmus auf praktisch relevanten Daten getestet und mit dem bestehenden Verfahren aus [36] verglichen. Außerdem werden verwendete Datenstrukturen erläutert. In Kapitel 7 werden die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse zusammengefasst und Ideen für Weiterentwicklungen gegeben.

23 Kapitel 2 Mathematische Problemmodellierung Dieses Kapitel gibt eine Einführung in die Grundlagen und Formalismen, die zur Beantwortung der in Kapitel 1 formulierten Fragestellungen notwendig sind. Die Güte einer berechneten Lösung hängt dabei einerseits entscheidend davon ab, wie realistisch die gewählte Problemmodellierung ist. Andererseits kann ein zu komplexes Modell dazu führen, dass eine effiziente Lösung der Problemstellung nicht mehr möglich ist. Im Rahmen dieser Diplomarbeit werden übliche Vereinfachungen gewählt. Der erste Schritt der Modellierung besteht darin, die Eingabedaten, d. h. Nukleinsäuren und Proteine, in geeigneter Form zu kodieren. Als zweites wird das gewünschte Resultat spezifiziert. Hierzu wird erklärt, wie der Verwandtschaftsbegriff für Sequenzen in der vorliegenden Arbeit aufgefasst wird. 2.1 Kodierung von Nukleinsäuren und Proteinen durch Strings Eine übliche Repräsentation von Nukleinsäuren und Proteinen ist die Beschreibung der linearen Abfolge ihrer einzelnen Bausteine als String über einem Alphabet Σ. Diese einfache Art der Darstellung ist für die Beantwortung der in dieser Arbeit aufgeworfenen Fragen ausreichend, jedoch muss für weitergehende Untersuchungen, wie z. B. die Analyse der räumlichen Struktur der Nukleinsäure DNS, eine komplexere Repräsentation gewählt werden. Für eine detaillierte Beschreibung der gewählten Darstellung sei auf Anhang A verwiesen. Die in dieser Arbeit vorgestellten Algorithmen können sowohl für den Vergleich von Nukleinsäuren als auch von Proteinen eingesetzt werden, da sie stringbasiert arbeiten. Die gegebenen Strings unterscheiden sich dabei abhängig von der betrachteten molekularbiologischen Sequenz im zugrunde liegenden Alphabet Σ. In der Regel gilt für DNS und RNS Σ = 4 und für Proteine Σ = 20 (siehe Anhang A). 5

24 6 Kapitel 2 - Mathematische Problemmodellierung S 1 : G C C T G A T G S 2 : G A C T G G A G S 3 : A C G A G (a) Eingabe-Sequenzen S 1 : G C C T G A T G S 2 : G A C T G G A G S 3 : A C G A G (b) Ein mögliches Alignment Abbildung 2.1: Multiples Alignment für n = 3. Für die Behandlung von Strings führen wir zunächst einige Notationen ein, die im Verlauf der Arbeit verwendet werden: Notation 2.1 Sei Σ die Menge aller möglichen Strings über Σ und Σ + := Σ { }. Dabei stellt mit Σ ein zusätzliches ausgewiesenes Symbol (Lückensymbol, engl.: Gap) dar, mit dem Löschungen bzw. Einfügungen modelliert werden. Mit S = (s 1... s l ) Σ bzw. S i = (s i,1... s i,li ) Σ wird eine einzelne Sequenz bezeichnet. Die zu S i inverse Sequenz (s i,li... s i,1 ) heißt S 1 i. Für S i = αi k σi k ist αi k der Präfix von S i, der die ersten k Zeichen umfasst, und σi k der Suffix, der aus den letzten l i k Zeichen besteht. Dabei stellt die Konkatenation der beiden Sequenzen dar. 2.2 Verwandtschaftsbegriff für Sequenzen Im Folgenden wird die in dieser Arbeit gewählte Modellierung des Verwandtschaftsbegriffs für Sequenzen vorgestellt. Die verwendete Modellierung definiert dabei ein Maß für den Verwandtschaftsgrad der gegebenen Sequenzen. Außerdem gibt sie mögliche Erklärungen, wie die Sequenzen im Laufe der Evolution auseinander hervorgegangen sein können. Dabei werden evolutionäre Vorgänge wie Einfügungen, Löschungen und Substitutionen (Mutationen) betrachtet Definition von Sequenzalignments Eine Standardmethode zum Vergleich verschiedener Sequenzen stellen Alignment- Verfahren dar. Die Idee dieser Verfahren besteht darin, gegebene Sequenzen durch das Einfügen von Lücken so gegeneinander zu verschieben, dass an einer Position möglichst ähnliche Zeichen untereinander stehen. Man sagt, die Sequenzen werden aligniert. Das Resultat wird als Alignment bezeichnet. Der Ähnlichkeitsbegriff für verschiedene Zeichen wird in Abschnitt näher erläutert. Abbildung 2.1 zeigt ein Beispiel für ein Alignment von drei Sequenzen. Übereinstimmende Zeichen in einer Spalte werden als Match, unterschiedliche als Mismatch bezeichnet. In der Biologie entspricht ein Mismatch einer Mutation. Falls in einer Spalte eine Lücke mit einem Zeichen aligniert wird, kann dies biologisch als Löschung bzw. Einfügung eines Bausteins interpretiert werden. Auf diese Weise können anhand eines Alignments Aussagen über evolutionäre Verwandtschaften oder funktionelle Zusammenhänge der Sequenzen gemacht werden. Anhand

25 2.2 Verwandtschaftsbegriff für Sequenzen 7 eines Alignments kann mit Hilfe einer geeigneten Bewertungsfunktion eine Ähnlichkeitsmessung durchgeführt werden. Wir werden derartige Bewertungsfunktionen in Abschnitt vorstellen und zunächst eine formale Definition für ein Alignment angeben [41]: Definition 2.2 (Alignment) Sei S = {S 1,..., S n } eine Menge von n 2 Sequenzen über Σ und l i die Länge der Sequenz S i Σ, 1 i n. Bezeichne s i,j den j-ten Buchstaben der i-ten Sequenz. Ein Alignment von S ist gegeben durch eine (n l)-matrix s 1,1 s 1,2... s 1,l s 2,1 s 2,2... s 2,l A = s n,1 s n,2... s n,l mit s i,j Σ +. Dabei gilt: Die Anzahl der Spalten von A ist mindestens so groß wie die Länge der längsten Sequenz und höchstens so groß wie die Summe der Längen aller gegebenen Sequenzen, d. h. es muss gelten: max{l 1,..., l n } l n i=1 l i Für jede Zeile S i = (s i,1s i,2... s i,l ) erhält man durch Streichung der Lückensymbole die Sequenz S i. Keine Spalte von A enthält ausschließlich das Zeichen. Für n = 2 spricht man von einem paarweisen Alignment, für n > 2 heißt A multiples Alignment. Für letzteres wird außerdem noch der Begriff der Projektion benötigt, den wir wie folgt definieren [41]: Definition 2.3 (Projektion) Sei S = {S 1,..., S n } eine Menge von Sequenzen und A ein zugehöriges multiples Alignment. Weiter sei Ŝ S eine Teilmenge der gegebenen Sequenzen und S i die zu S i gehörende Zeile in A. Die Projektion von A auf Ŝ ist dann das Alignment Â, für das gilt:  enthält nur Zeilen S i aus A mit S i Ŝ. Sämtliche Spalten, die durch die Modifikation nur das Zeichen enthalten, werden aus  entfernt. Von besonderer Bedeutung für die weiteren Betrachtungen sind paarweise und dreifache Projektionen, d. h. Ŝ = 2 und Ŝ = 3. Häufig ist in der Literatur anstelle von Projektionen auch von induzierten Alignments die Rede.

26 8 Kapitel 2 - Mathematische Problemmodellierung Bewertung von Sequenzalignments Die in der vorliegenden Arbeit betrachtete Fragestellung lässt sich wie folgt als Optimierungsproblem formulieren [41]: Definition 2.4 (Multiple Sequence Alignment) Sei S = {S 1,..., S n } eine Menge von Sequenzen und w : A(S) Q eine beliebige Bewertungsfunktion auf der Menge der möglichen Alignments zu S. Gesucht ist ein Alignment A A(S), das w(a) optimiert. Je nach Art der Anwendung kann die Berechnung eines Alignments als Minimierungs- oder Maximierungsproblem formuliert werden. Bei der Maximierungsvariante spricht man von Ähnlichkeit. Dabei werden Matches honoriert und Mismatches sowie Lücken bestraft. Alternativ beschreibt die Minimierungsvariante die sog. Edit- Distanz zwischen den gegebenen Sequenzen. Unter der Edit-Distanz versteht man die (minimale) Anzahl an Einfüge-, Lösch- und Ersetzungsoperationen, um einen String S i in einen String S j zu überführen. Um die Qualität eines Alignments, d. h. seine biologische Relevanz, bewerten zu können, muss ein geeignetes Bewertungsmodell aufgestellt werden. Die Wahl dieses Modells ist dabei entscheidend für den praktischen Nutzen des berechneten Alignments. Wir werden zunächst Bewertungsfunktionen für paarweise Alignments vorstellen und diese anschließend auf multiple Alignments erweitern Paarweises Alignment Es wird häufig vereinfacht angenommen, dass Mutationen, Löschungen und Einfügungen an verschiedenen Stellen der Sequenzen unabhängig voneinander geschehen. Daher basieren übliche Bewertungsmodelle auf dem Vergleich von jeweils zwei einzelnen Zeichen und sind häufig durch eine Ähnlichkeits- oder Distanzfunktion d : (Σ + Σ + ) Q gegeben. Das folgende Beispiel gibt zwei einfache Funktionen für die beiden Optimierungsvarianten an: Beispiel 2.5 (Einfache Ähnlichkeits- und Distanzfunktionen) Sei s, t Σ + und d : (Σ + Σ + ) Q. Dann stellt (2.1) eine Ähnlichkeitsfunktion und (2.2) eine Distanzfunktion dar. (2.2) wird auch Levenshtein-Distanz [30] genannt. d(s, t) := d(s, t) := 1 falls s = t 1 falls s t 2 falls s = oder t = 0 falls s = t 1 falls s t 1 falls s = oder t = (2.1) (2.2)

27 2.2 Verwandtschaftsbegriff für Sequenzen 9 Die Bewertungen für Substitutionen werden meistens durch eine (symmetrische) (Σ Σ)-Substitutionsmatrix D = (d ij ) mit d ij Q repräsentiert. Abhängig von der Art der Problemformulierung wird dabei zwischen Ähnlichkeits- und Distanzmatrizen unterschieden. Die beiden Varianten lassen sich einfach ineinander umformen [40, 51]. Außerdem wurde von Smith et al. gezeigt, dass beide Varianten unter bestimmten Umständen äquivalent sind [39]. Wir werden uns daher im Folgenden auf das Minimierungsproblem und damit auf Distanzmatrizen beschränken. Für den Vergleich von DNS-Sequenzen reichen meist einfache Substitutionsmatrizen (vgl. (2.1) und (2.2)) aus. Da miteinander verwandte Proteine aber häufig nur wenige identische Aminosäuren besitzen, sind derartige Matrizen nicht in der Lage, existierende Verwandtschaften zwischen diesen zu erkennen. Daher werden für Proteinvergleiche meist spezielle Substitutionsmatrizen verwendet. Diese berücksichtigen Ähnlichkeiten bzgl. der chemischen Eigenschaften sowie Mutationswahrscheinlichkeiten unterschiedlicher Aminosäuren. Die beiden gängigsten Substitutionsmatrizen für Proteine sind PAM- [10] und BLOSUM-Matrizen [21]. Wir werden für unsere experimentelle Analyse in Kapitel 6 eine Distanzvariante der PAM-250-Matrix verwenden (siehe Abbildung B.1 in Anhang 6). Für Details zu den genannten Substitutionsmatrizen sei auf Anhang B verwiesen. Es kann nun wie folgt eine Bewertungsfunktion w : A(S) R 0 auf der Menge der möglichen Alignments definiert werden [41]: Definition 2.6 (Bewertungsfunktion für paarweise Alignments) Sei A ein Alignment der Sequenzen S 1 und S 2 und l die Anzahl der Spalten von A. Die Bewertung von A entspricht dann der Summe aller Spaltenbewertungen von A gemäß d : (Σ + Σ + ) Q: l w(a) := d(s 1,k, s 2,k) (2.3) k=1 Diese Bewertungsfunktion weist jedoch eine Schwachstelle auf: Biologisch gesehen ist das Auftreten einer großen zusammenhängenden Lücke der Länge k wahrscheinlicher als viele kleine Lücken, die zusammen ebenfalls die Länge k haben. Dies liegt daran, dass meistens ganze Sequenzteile gelöscht bzw. eingefügt werden. (2.3) bewertet diese beiden Fälle jedoch identisch. Abhängig von den zur Verfügung stehenden Ressourcen und der Art der Anwendung können verschiedenen Arten von Lückenstrafen (engl.: Gap Costs) definiert werden [22]. Lückenstrafen werden dabei durch eine Funktion g : N 0 Q definiert, wobei g(k) die Kosten für eine fortlaufende Lücke der Länge k angibt. Es gelte g(0) = 0. Da kürzere Lücken wahrscheinlicher sind als lange, sollte g monoton in der Länge der Lücke sein. Wir unterscheiden im Rahmen dieser Arbeit folgende Funktionstypen von g: Lineare Lückenstrafen: Lineare Lückenstrafen werden durch eine lineare Funktion g(k) = k γ beschrieben. Dabei sind γ die Kosten für eine einzelne Lücke. Diese Art der Lückenstrafe wird in (2.3) verwendet.

28 10 Kapitel 2 - Mathematische Problemmodellierung Affine Lückenstrafen: Affine Lückenstrafen werden durch eine affine Funktion definiert: g : N 0 Q k g ext k + g op Der Parameter g op gibt die zusätzlichen Kosten zum Öffnen einer neuen Lücke (Lückenöffnungskosten, engl.: Gap Opening Penalty) an und stellt sicher, dass eine fortlaufende Lücke der Länge (k 1 + k 2 ) günstiger ist als zwei Lücken der Längen k 1 und k 2. Der Wert g ext beschreibt die proportionalen Kosten für die Länge der Lücke (Lückenfortsetzungskosten, engl.: Gap Extension Penalty). Allgemeine Lückenstrafen: Bei allgemeinen Lückenstrafen kann eine beliebige Funktion g definiert werden. Hier kann z. B. berücksichtigt werden, dass das Löschen oder Einfügen bestimmter Bausteine wahrscheinlicher ist. Es wird nur gefordert, dass g sublinear ist, d. h. dass g(k 1 + k 2 ) g(k 1 ) + g(k 2 ) für alle k 1, k 2 N 0 gilt. Optimal für den praktischen Nutzen des berechneten Alignments ist sicherlich die Verwendung von allgemeinen Lückenstrafen. Diese erfordern jedoch einen sehr hohen Rechenzeit- und Speicherplatzbedarf [22]. Lineare Lückenstrafen sind zwar am schnellsten zu berechnen, liefern jedoch Alignments von geringer biologischer Relevanz. Daher werden in der Praxis meistens Varianten von affinen Lückenstrafen verwendet. Um affine und allgemeine Lückenstrafen bei der Bewertung eines Alignments berücksichtigen zu können, muss die Bewertungsfunktion (2.3) erweitert werden. Dabei werden Spalten, in denen Lücken vorkommen, separat betrachtet. Definition 2.7 (Erweiterte Bewertungsfunktion für paarweise Alignments) Sei A ein Alignment der Sequenzen S 1 und S 2 und l die Anzahl der Spalten von A. Die Bewertungsfunktion w : A(S) Q ergibt sich dann für allgemeine Lückenstrafen durch [41]: w(a) := d(s 1 i l, s 1,i, s 2,i 1,i, s 2,i) + g(k) # Lücken der Länge k in A (2.4) k>0 Wir werden die vorgestellten Lückenstrafen in Kapitel 3 näher betrachten und Algorithmen für die verschiedenen Funktionen vorstellen Multiple Sequence Alignment Für multiple Alignments gibt es verschiedene Bewertungsmöglichkeiten. Im Rahmen dieser Arbeit wird das weit verbreitete Sum-Of-Pairs-Maß (SP-Maß, [7]) verwendet, da dieses auch im betrachteten Referenzalgorithmus OMA [36] zum Einsatz kommt. Für weitere Maße siehe z. B. [19, 22].

29 2.3 Zusammenfassung 11 Das Sum-Of-Pairs-Maß basiert auf den Bewertungen der paarweisen Projektionen eines gegebenen Alignments und lässt sich wie folgt definieren: Definition 2.8 (Sum-Of-Pairs-Maß) Sei A ein Alignment und A i,j die paarweise Projektion von A auf S i und S j. Der Zielfunktionswert w(a) ergibt sich dann gemäß des Sum-Of-Pairs-Maßes durch: w(a) := n n w(a i,j ) i=1 j=i+1 Es gibt insgesamt ( n 2) verschiedene paarweise Projektionen eines multiplen Alignments. Daher lässt sich das Sum-Of-Pairs-Maß zu einem gegebenen Alignment in Zeit O(n 2 ) berechnen. Bemerkung 2.9 Die Kosten w(a i,j ) für die paarweise Projektion A i,j eines gemäß Sum-Of-Pairs-Maß optimalen multiplen Alignments A auf S i und S j entsprechen im Allgemeinen nicht den optimalen Kosten w (S i, S j ), um S i und S j zu alignieren. Es gilt: w (S i, S j ) w(a i,j ) 2.3 Zusammenfassung Wir haben in diesem Kapitel eine Modellierung für die vorliegende Fragestellung vorgestellt. Hierzu wurde zunächst eine übliche Kodierung für molekularbiologische Sequenzen angegeben. Anschließend haben wir den Begriff eines Alignments eingeführt und verschiedene Möglichkeiten zur Bewertung von Alignments präsentiert, sowie deren Vor- und Nachteile aufgezeigt. Auf Basis der vorgestellten Problemmodellierung können wir im Folgenden verschiedene Algorithmen für die Lösung der betrachteten Fragestellung beschreiben.

30 12 Kapitel 2 - Mathematische Problemmodellierung

31 Kapitel 3 Alignments und Dynamische Programmierung Das folgende Kapitel beschäftigt sich mit Standardverfahren zur Berechnung optimaler Alignments. Diese Verfahren basieren auf dem Prinzip der Dynamischen Programmierung und gehören zu den ältesten Methoden zur Berechnung optimaler Alignments. Dynamische Programmierung beruht auf der Idee, die optimale Lösung des Gesamtproblems aus den optimalen Lösungen geeigneter Teilprobleme zusammenzusetzen (Bellmansches Optimalitätsprinzip, [9]). Ein derartiger Algorithmus kann in zwei Phasen gegliedert werden: 1. Berechnung des Wertes einer optimalen Lösung. (a) Charakterisierung der Struktur einer optimalen Lösung. (b) Konstruktion einer rekursiven Vorschrift für den optimalen Wert einer Lösung. (c) Bottom-up-Berechnung des optimalen Wertes, d. h. zunächst werden die Werte für die kleinsten Teilprobleme direkt berechnet und daraus dann die Lösungen für die jeweils nächstgrößeren Teilprobleme bestimmt. Um bereits berechnete Zwischenlösungen wieder verwenden zu können, werden diese in einer Tabelle gespeichert. Wir nennen diese Tabelle im Folgenden Rekursionstabelle, da sie auf einer rekursiven Vorschrift basiert. 2. Rekonstruktion einer zugehörigen optimalen Lösung. Dynamische Programmierung bietet insbesondere dann Vorteile, wenn die Teilprobleme abhängig voneinander sind, d. h. wenn unterschiedliche Teilprobleme gleiche Unterprobleme haben. Bei der Berechnung optimaler Alignments wird die Alignierung beliebiger Präfixe der gegebenen Sequenzen als Teilproblem aufgefasst. Diese Definition erfüllt die genannte Abhängigkeitsbedingung. 13

32 14 Kapitel 3 - Alignments und Dynamische Programmierung Im Folgenden werden zunächst verschiedene Algorithmen für paarweise Alignments vorgestellt. Dabei wird zwischen linearen, affinen und allgemeinen Lückenstrafen (siehe Abschnitt ) unterschieden. Zum Schluss des Kapitels werden Erweiterungsmöglichkeiten für multiple Alignments aufgezeigt. 3.1 Paarweises Alignment Beim paarweisen Alignment sind zwei Sequenzen S 1 = (s 1,1... s 1,l1 ) und S 2 = (s 2,1... s 2,l2 ) gegeben. Historisch gesehen gibt es verschiedene unabhängige Quellen, die Dynamische Programmierung zur Berechnung optimaler paarweiser Alignments verwenden. Nach Stoye [41] sind hier neben Needleman und Wunsch [33] noch Wagner und Fischer [45] zu nennen. Auch wenn sich die Algorithmen geringfügig unterscheiden, basieren sie auf derselben Grundidee. Kruskal gibt in [26] einen Überblick über den Entwicklungsprozess. Wir beginnen mit der Beschreibung des einfachsten Algorithmus dem Needleman-Wunsch-Algorithmus [33]. Dieser berücksichtigt nur lineare Lückenstrafen. Daher werden danach Erweiterungen für allgemeine (Waterman-Smith-Beyer, [48]) und affine Lückenstrafen vorgestellt (Gotoh [15]) Lineare Lückenstrafen: Needleman-Wunsch Der Needleman-Wunsch-Algorithmus wurde bereits 1970 für den Vergleich von zwei Proteinsequenzen vorgestellt [33]. Er arbeitet gemäß des Prinzips der Dynamischen Programmierung in zwei Phasen: 1. Berechnung des Wertes eines optimalen Alignments. 2. Rekonstruktion eines zugehörigen optimalen Alignments. Phase 1: Berechnung des Wertes eines optimalen Alignments Die Idee des Needleman-Wunsch-Algorithmus besteht darin, optimale Alignments von beliebigen Präfixen zu bestimmen und aus diesen das optimale Alignment der gesamten Sequenzen zu berechnen. Um Lücken am Anfang der Sequenzen zu ermöglichen, wird eine Rekursionstabelle OPT der Größe (l 1 +1) (l 2 +1) verwendet. Ein Tabelleneintrag OPT(i, j) wird als Wert eines optimalen Alignments der Präfixe α i 1 und α j 2 interpretiert. Für i = 0 ist α i 1 leer, so dass α j 2 nur mit Lücken aligniert wird. Entsprechendes gilt für j = 0. Der Eintrag OPT(l 1, l 2 ) entspricht der Bewertung eines optimalen Alignments der gegebenen Sequenzen. Die Rekursionstabelle kann zeilenweise ausgefüllt werden. Dabei wird bei der Berechnung von OPT(i, j) angenommen, dass der Wert der optimalen Lösung für alle kürzeren Präfixe bekannt ist. Es kann dann entschieden werden, wie die nächsten beiden Zeichen aligniert werden sollen. Seien s 1,i und s 2,j die nächsten beiden Zeichen

33 3.1 Paarweises Alignment 15 s 1,1... s 1,i 1 s 1,i s 2,1... s 2,j (a) Löschung s 1,1... s 1,i s 2,1... s 2,j 1 s 2,j (b) Einfügung s 1,1... s 1,i 1 s 1,i s 2,1... s 2,j 1 s 2,j (c) Match / Mismatch Abbildung 3.1: Entstehung der Rekursionsgleichung nach Needleman-Wunsch. und d : (Σ + Σ + ) Q eine Distanzfunktion. Dann gibt es für die Alignierung drei verschiedene Möglichkeiten (siehe Abbildung 3.1): 1. Löschung: s 1,i wird mit einer Lücke aligniert. Dies entspricht einem Schritt nach unten in der Tabelle. Die Bewertung setzt sich aus dem Tabelleneintrag OPT(i 1, j) und d(s 1,i, ) zusammen. 2. Einfügung: s 2,j wird mit einer Lücke aligniert. Dies entspricht einem Schritt nach rechts. Die Kosten berechnen sich symmetrisch zum ersten Fall. 3. Match / Mismatch: s 1,i und s 2,j werden aligniert. Dies entspricht in der Tabelle einem Diagonalschritt nach rechts unten. Der Wert dieser Alternative ergibt sich als Summe von OPT(i 1, j 1) und d(s 1,i, s 2,j ). Der Wert eines optimalen Alignments der Präfixe α i 1 und α j 2 ergibt sich dann als Minimum über diese drei Möglichkeiten. Die erste Zeile bzw. Spalte der Tabelle wird mit der Bewertung eines Alignments des entsprechenden Präfixes nur mit Lücken initialisiert. Abbildung 3.2 visualisiert den Ablauf der ersten Phase des Needleman-Wunsch-Algorithmus. Formal lässt sich diese durch folgende rekursive Berechnungsvorschrift darstellen: OPT(i, 0) = i d(s 1,i, ) i {1, l 1 } (3.1) OPT(0, j) = j d(, s 2,j ) j {1, l 2 } (3.2) OPT(i 1, j) + d(s 1,i, ) OPT(i, j) = min OPT(i, j 1) + d(, s 2,j ) (3.3) OPT(i 1, j 1) + d(s 1,i, s 2,j ) Phase 2: Rekonstruktion eines zugehörigen optimalen Alignments Falls das optimale Alignment selbst ausgegeben werden soll, ist es sinnvoll, während der Berechnung der Rekursionstabelle Zeiger auf die jeweils relevanten Vorgängerzellen zu speichern. Dann erhält man ein optimales Alignment, wenn man nach der Durchführung von Phase 1 von OPT(l 1, l 2 ) aus entlang der Zeiger zu OPT(0, 0) läuft. Eine Rekonstruktion des optimalen Alignments ist mit zusätzlichem Zeitaufwand aber auch ohne diese Zeiger möglich [4].

34 16 Kapitel 3 - Alignments und Dynamische Programmierung S 2 S M i 1 i M L j 1 j L l 2 OPT ( i 1, j 1) OPT( i 1, j) ( i, j ) OPT( i, j) (, s ) OPT 1 ( s s ) d 1, i 1, 2, j 1 d 2, j 1 d ( ) s 1, i 1, l 1 Abbildung 3.2: Berechnung eines optimalen Alignments nach Needleman-Wunsch. Satz 3.1 (Laufzeit und Speicherbedarf) Der Needleman-Wunsch-Algorithmus berechnet für zwei Sequenzen unter Verwendung von linearen Lückenstrafen in Zeit O(l 1 l 2 ) und Platz O(l 1 l 2 ) ein optimales paarweises Alignment. Beweis: Die Rekursionstabelle OPT hat die Größe (l 1 + 1) (l 2 + 1) = O(l 1 l 2 ). Die Laufzeit setzt sich aus der Berechnung der Tabelleneinträge und der Rekonstruktion des optimalen Alignments zusammen. Die Berechnung eines jeden Tabelleneintrags benötigt konstante Zeit. Die Rekonstruktion des optimalen Alignments ist in Zeit O(l 1 + l 2 ) und mit einem Speicheraufwand von O(l 1 l 2 ) möglich. Damit folgt direkt die Behauptung. Optimale Alignments sind im Allgemeinen nicht eindeutig. Der Algorithmus kann so erweitert werden, dass er sämtliche optimale Alignments ausgibt. Die Anzahl optimaler Alignments kann jedoch exponentiell in der Sequenzlänge sein. So gibt es z. B. insgesamt ( ) 2z z viele optimale Alignments der Sequenzen S1 = X z und S 2 = X 2z, da es ( ) 2z z verschiedene Möglichkeiten gibt, die z notwendigen Lücken einzufügen, und die Bewertung nicht von dieser Positionierung abhängt. Ein solcher Algorithmus hat demnach im schlechtesten Fall eine Laufzeit, die exponentiell in der Größe der Eingabe ist. Bemerkung 3.2 Es gibt diverse Varianten des Needleman-Wunsch-Algorithmus, die der Senkung des Speicherbedarfs dienen: Falls nur der Wert des optimalen Alignments berechnet werden soll, genügt es, jeweils die direkte Vorgängerzeile der Rekursionstabelle im Speicher zu halten, da nur diese für die Berechnung der darauf folgenden Zeile benötigt wird. Der Algorithmus benötigt dann einen Platz von O(max{l 1, l 2 }). Wird auch das Alignment selbst benötigt, kommen fortgeschrittenere Algorithmen zum Einsatz. Ein solches Verfahren ist z. B. der Hirschberg-Algorithmus [23].

35 3.1 Paarweises Alignment 17 Er benötigt nur linearen Speicherplatz, dies jedoch bei einem doppelt so hohen Berechnungsaufwand Allgemeine Lückenstrafen: Waterman-Smith-Beyer Mit der einfachen Rekursionsgleichung des Needleman-Wunsch-Algorithmus können keine allgemeinen Lückenstrafen berücksichtigt werden, da es dabei nicht ausreicht, nur die direkten Vorgängerzellen zu betrachten. Vielmehr muss bei der Berechnung von OPT(i, j) auf alle vorhergehenden Werte der i-ten Zeile und j-ten Spalte zurückgegriffen werden, da die Kosten der Lücken nicht mehr linear sind und von sämtlichen vorhergehenden Zeichen abhängen können. Waterman et. al [48] haben die folgende Rekursionsgleichung vorgestellt. Dabei beschreibt die Funktion g(k) die allgemeine Lückenstrafe für eine Lücke der Länge k: OPT(0, 0) = 0 OPT(i, 0) = g(i) i {1, l 1 } OPT(0, j) = g(j) j {1, l 2 } min {OPT(i k, j) + g(k)} 1 k i OPT(i, j) = min min {OPT(i, j k) + g(k)} 1 k j OPT(i 1, j 1) + d(s 1,i, s 2,j ) Bei dieser Berechnungsvorschrift werden auch zwei direkt aufeinander folgende Lücken berücksichtigt, d. h. eine Lücke der Länge (k 1 + k 2 ) wird als zwei Lücken der Längen k 1 und k 2 aufgefasst. Da wir jedoch angenommen haben, dass g sublinear ist, gilt g(k 1 + k 2 ) g(k 1 ) + g(k 2 ) für alle k 1, k 2 N 0. Damit werden zwei aufeinander folgende Lücken der Längen k 1 und k 2 schlechter bewertet als eine Lücke der Länge (k 1 + k 2 ) und es wird auf jeden Fall der Wert für die längste fortlaufende Lücke in die Berechnung des OPT(i, j)-wertes einbezogen. Dieser Ansatz hat eine Laufzeit von O(l 1 l 2 (l 1 + l 2 )), da die Berechnung eines einzelnen Tabelleneintrags nun Zeit O(l 1 + l 2 ) benötigt. Außerdem lassen sich die in Bemerkung 3.2 erwähnten Verbesserungen nicht auf allgemeine Lückenstrafen übertragen. Aus diesen Gründen werden allgemeine Lückenstrafen in der Praxis meist nicht eingesetzt Affine Lückenstrafen: Gotoh Affine Lückenstrafen stellen einen Kompromiss aus linearen und allgemeinen Lückenstrafen dar. Sie modellieren biologische Eigenschaften und Zusammenhänge besser als lineare Funktionen, können aber effizienter berechnet werden als allgemeine Lückenstrafen [22]. Affine Lückenstrafen unterscheiden dabei zwischen Lückenöffnungskosten und Lückenfortsetzungskosten (siehe Abschnitt ).

36 18 Kapitel 3 - Alignments und Dynamische Programmierung Der Algorithmus von Gotoh [15] stellt eine Erweiterung des Needleman-Wunsch- Algorithmus für affine Lückenstrafen dar. Die zentrale Idee dieses Verfahrens ist, zusätzlich zum Wert eines optimalen Alignment für zwei gegebene Präfixe, den Wert eines besten Alignments dieser Präfixe abhängig vom Aussehen der letzten Spalte zu speichern. Neben der bisherigen Rekursionstabelle OPT existieren also drei Hilfstabellen A, B und C [22]: A(i, j): Distanz eines optimalen Alignments der Präfixe σ i 1 und σ j 2, das mit einem Match oder Mismatch endet, d. h. s 1,i ist mit s 2,j aligniert. B(i, j): Distanz eines optimalen Alignments der Präfixe σ i 1 und σ j 2, das mit einer Löschung endet, d. h. s 1,i ist mit einer Lücke aligniert. C(i, j): Distanz eines optimalen Alignments der Präfixe σ i 1 und σ j 2, das mit einer Einfügung endet, d. h. s 2,j ist mit einer Lücke aligniert. Der Eintrag OPT(l 1, l 2 ) entspricht wie beim Needleman-Wunsch-Algorithmus der Bewertung eines optimalen Alignments der gegebenen Sequenzen. Es ergeben sich folgende Rekursionsgleichungen, wobei g op die Lückenöffnungskosten und g ext die Lückenfortsetzungskosten bezeichnet: A(0, 0) = 0 B(0, 0) = C(0, 0) = OPT(0, 0) = 0 A(i, 0) = B(i, 0) = i g ext + g op C(i, 0) = OPT(i, j) = B(i, 0) A(0, j) = B(0, j) = C(0, j) = j g ext + g op OPT(i, j) = C(0, j) A(i, j) = OPT(i 1, j 1) + d(s 1,i, s 2,j ) B(i 1, j) + g ext B(i, j) = min A(i 1, j) + g op + g ext C(i 1, j) + g op + g ext B(i, j 1) + g op + g ext C(i, j) = min A(i, j 1) + g op + g ext C(i, j 1) + g ext OPT(i, j) = min{a(i, j), B(i, j), C(i, j)} Laufzeit und Speicherbedarf des Algorithmus von Gotoh ergeben sich analog zum Needleman-Wunsch-Algorithmus wie folgt: Satz 3.3 (Laufzeit und Speicherbedarf) Der Algorithmus von Gotoh berechnet für zwei Sequenzen in Zeit O(l 1 l 2 ) und Platz O(l 1 l 2 ) den Wert eines optimalen paarweisen Alignments bzgl. affiner Lückenstrafen. Beweis: Es werden vier Rekursionstabellen der Größe (l 1 + 1) (l 2 + 1) = O(l 1 l 2 ) verwendet. Die Berechnung eines jeden Tabelleneintrags benötigt konstante Laufzeit. Damit folgt direkt die Behauptung.

37 3.2 Multiple Sequence Alignment 19 Die Rekonstruktion des zugehörigen optimalen Alignments kann wie beim Needleman-Wunsch-Algorithmus durch zusätzliche Zeiger realisiert werden. Die Methoden zur Speicherplatzreduktion können auch hier angewendet werden, so dass eine Berechnung mit einem Platzbedarf von O(min{l 1, l 2 }) möglich ist. 3.2 Multiple Sequence Alignment Zum Abschluss dieses Kapitels sollen Möglichkeiten zur Erweiterung der vorgestellten Algorithmen auf n Sequenzen aufgezeigt werden. Der Needleman-Wunsch- Algorithmus lässt sich einfach modifizieren, indem statt einer 2-dimensionalen eine n-dimensionale Rekursionstabelle (Gitter) verwendet wird. Der Platzbedarf steigt damit auf O(l n max), wobei l max die Länge der längsten Sequenz ist. In der Rekursionsformel müssen nun 2 n 1 mögliche Vorgänger betrachtet werden. Außerdem wird eine Bewertungsfunktion für multiple Alignments benötigt, wie z. B. das Sum-of-Pairs- Maß. Die Auswertung dieser Funktion erfordert Zeit O(n 2 ) (siehe Abschnitt ). Man erhält also einen Algorithmus, der in Zeit O(n 2 2 n l n max) und Platz O(l n max) ein optimales multiples Alignment berechnet [22]. Die Erweiterung des Algorithmus von Gotoh auf den allgemeinen Fall ist leider nicht ganz so einfach. Gotoh hat einen kubischen Algorithmus für drei Sequenzen vorgestellt [16]. Wir verzichten jedoch auf dessen Beschreibung, da er im Rahmen dieser Arbeit nicht verwendet wird. Das Hauptproblem bei affinen Lückenstrafen besteht darin, dass die Anzahl der relevanten Vorgänger, die gespeichert werden müssen, in der Größenordnung O ([ n n ) e ln 2] n wächst [3]. Wir betrachten an dieser Stelle erneut das Sum-Of- Pairs-Maß (siehe Definition 2.8): w(a) := n n w(a i,j ) i=1 j=i+1 Bei der Bestimmung von w(a) werden für jedes Sequenzenpaar die Lücken bewertet, die in der entsprechenden Projektion vorkommen. Dabei fallen übereinander stehende Lücken weg (siehe Definition 2.3). Bei der Übertragung auf affine Lückenstrafen können daher folgende Fälle auftreten: 1. In einer Spalte werden entweder zwei Lücken oder zwei Zeichen aligniert. In diesem Fall wird in der zugehörigen paarweisen Projektion keine neue Lücke geöffnet. 2. Es wird eine Lücke mit einem Zeichen aligniert, d. h. die Entscheidung, ob eine neue Lücke aufgemacht wird oder nicht, hängt von den vorhergehenden Spalten des Alignments ab. Sind in der direkten Vorgängerspalte zwei Lücken aligniert, muss solange zurückgegangen werden, bis eine Spalte mit mindestens einem richtigen Zeichen erreicht wird.