Untersuchungen zur Beziehung von Kohlenstoffund Stickstoffmetabolismus in Spinatpflanzen (Spinacia oleracea L.) Dissertation zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fachbereiche der Georg-August-Universität zu Göttingen vorgelegt von Burgi Riens aus Gifhorn Göttingen 1992
INHALTSVERZEICHNIS 1. Einleitung 1 1.1. Der Weg des Kohlenstoffes in der Pflanze 1 1.2. Der Weg des Stickstoffes in der Pflanze 4 1.3. Der Zusammenhang zwischen Kohlenstoff-und Stickstoffrnetabolismus 6 1.4. Der Transport von Metaboliten innerhalb der Pflanze 7 1.5. Zielsetzung der Arbeit 8 2. Material und Methoden 9 2.1. Pflanzenmaterial und Anzucht 9 2.1.1. Zusammensetzung der Nährlösungen 9 2.2. Bestimmung der photosynthetischen Aktivität 10 2.2.1. Blattscheiben-Sauerstoff-Elektrode 10 2.2.2. Gaswechselanlage 10 2.2.3. Meßprinzip des CO2 / H2O - Porometers 11 2.3. Chloroform/Methanol-Extraktion 11 2.3.1. Entfärbung der Extrakte 12 2.4. Optisch-enzymatische Metabolitbestimmungen 13 2.4.1. Nitrat 13 2.4.2. Malat 14 2.4.3. 2-Oxoglutarat 14 2.4.4. Pyruvat und Phosphoenolpyruvat 15 2.4.5. Hydroxypyruvat 15 2.4.6. Saccharose 16 2.4.7. Stärke 17 2.5. Nitritbestimmung 18 2.5.1. Oberprüfung der Zuverlässigkeit der Extraktionsmethode 18 2.6. Chromatographische Bestimmung von Aminosäuren 19
2.6.1. Derivatisierung mit Ninhydrin 20 2.6.2. Derivatisierung mit OPA 21 2.6.2.1. Reversed-Phase HPLC: Entwicklung der Methode 22 2.6.2.2. Im Routineberieb eingesetzte Methode zur Aminosäure-Analyse 26 2.7. Untersuchungen zum Einfluß des Nitratgehaltes der Nährlösung auf diurnale Metabolitänderungen 31 2.8. Nichtwässrige Fraktionierung 31 2.9. Nitratreduktase-Aktivitätsmessung 33 2.10. Anreicherung der Nitratreduktase 34 2.11. Proteinbestimmung 35 2.12. SDS-Gelelektrophorese 36 2.12.1. Bestimmung der Molekulargewichte 37 2.12.2. Proteinfärbung 37 2.13. Western-Blot-Untersuchungen 38 2.13.1. Amido-Schwarz-Färbung 39 3. Ergebnisse 41 3.1. 3.1.1. 3.1.2. 3.1.3. 3.1.3.1. 3.1.3.2. 3.1.4. 3.1.5. 3.1.6. 3.1.7. 3.1.8. 3.1.9. 3.1.10. Änderungen von Metabolitgehalten bei unterschiedlicher Nitrat- Verfügbarkeit im diurnalen Rhythmus Vorbemerkungen Blattentwicklung Photosyntheseleistung Diurnale Änderung der CO2-Assimilationsrate unter Standardbedingungen CO2-Assimilationsraten bei verschiedenen Anzuchtbedingungen Nitratgehalt Malatgehalt Saccharose- und Stärkegehalt 2-Oxoglutarat-, Pyruvat- und Phosphoenolpyruvatgehalte Glutamat- und Glutamingehalte Aspartat- und Asparagingehalte Serin- und Glycingehalte 41 41 42 44 44 46 46 51 53 56 58 61 67
3.1.11. Alaningehalte 67 3.1.12. Valingehalte 71 3.1.13. Threonin-, und Isoleucin- und Tyrosingehalte 71 3.1.14. Fixierung von Kohlenstoff und Stickstoff in Aminosäuren 71 3.1.15. Zusammenfassung der wichtigsten Merkmale 75 3.2. Bestimmung von subzellulären Metabolitgehalten 78 3.2.1. Subzelluläre Verteilung von Aminosäuren 79 3.2.2. Subzellulare Verteilung von Saccharose 83 3.3. Metabolitänderungen während des Licht/Dunkel-Überganges 86 3.4. Aktivitätsänderungen der Nitratreduktase 91 3.4.1. Licht/Dunkel- bzw. Dunkel/Licht-Übergänge 91 3.4.2. Reaktivierung der Dunkel-inaktivierten Nitratreduktase 93 3.4.3. Einfluß von Mg 2+ -Ionen auf die Aktivität der Nitratreduktase 96 3.4.4. Einfluß von ATP auf die Nitratreduktase-Aktivität 101 3.4.5. Einfluß von Phosphatasen, Phosphataseinbibitoren und Metaboliten auf die Nitratreduktase-Aktivität 104 3.4.6. Isolierung und gelelektrophoretische Untersuchungen der Nitratreduktase 107 4. Diskussion 113 4.1. Änderungen von Kohlenstoff- und Stickstoffakkumulation im diurnalen Rhythmus 113 4.2. Zur intra- und interzellulären Verteilung von Aminosäuren und Saccharose 119 4.2.1. Intrazelluläre Verteilung 119 4.2.2. Interzelluläre Verteilung 121 4.3. Zum Einfluß des zellulären Nitratgehaltes auf den pflanzlichen Stoffwechsel 125 4.3.1. Zusammenhang zwischen Nitratassimilation und Energiebedarf 125 4.3.2. Zusammenhang zwischen Nitratassimilation und Kohlenstoffakkumulation 128 4.3.3. Die Rolle von Malat bei der Nitratassimilation 130
4.3.4. Die Rolle von Saccharose und Stärke bei der Nitratassimilation 132 4.3.5. Einfluß der Reduktion des zellulären Nitratgehaltes auf Aminosäuren und Aminosäure-Vorläufer 132 4.4. Zur Regulation der Nitratreduktase 139 4.5. Überlegungen zur Bedeutung der Enzymphosphorylierung im pflanzlichen Stoffwechsel 142 5. Zusammenfassung 144 6. Abkürzungsverzeichnis 147 7. Literaturverzeichnis 149