4. Diskussion Das Thema dieser Arbeit war die Gewinnung eines rekombinanten Fusionsproteins von PEX14. Dafür sollte es in einer möglichst großen Menge und sauber isoliert werden. Durch die Transformation in Escherichia coli-stämme mit einem geeigneten Konstrukt, konnte das Fusionsprotein GST-Pex14p rekombinant exprimiert werden. Nach der Isolierung des Proteins wurde diese zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. Anschließend konnte von diesen Kaninchen Antiseren gewonnen werden. 4.1. Überexpression von Proteinen in E. coli Bei der heterologen Expression von Genen in E. coli nehmen verschiedene Faktoren Einfluß auf die Menge und Eigenschaften des gebildeten Proteins. Über die Induktionszeit, Anzuchttemperatur, IPTG-Konzentration und die Wahl des Bakterienstammes lassen sich unter anderem die Expressionsrate des Gens sowie die Löslichkeit und die Stabilität des Translationsproduktes beeinflussen. Auf die Bedeutung dieser Faktoren soll nachfolgend näher eingegangen werden. 4.1.1 Expressionsrate Die Expressionsrate rekombinanter Gene läßt sich über die Promotoren der Vektoren regeln. Die Induktionszeit hat Einfluß auf die synthetisierte Proteinmenge und sollte optimiert werden, um die größtmögliche Menge eines Proteins gewinnen zu können. Es wird zunächst angenommen, daß mit längerer Induktionszeit auch die gebildete Menge des Genprodukts steigt. Dies gilt jedoch nur, wenn dieses Protein nicht toxisch für das Wachstum des Bakteriums ist und nicht proteolytisch vom Wirtsorganismus abgebaut werden. Wird das Protein nicht vertragen, muß die Induktion frühzeitig abgebrochen werden. Mithilfe einer Expressionskinetik kann die Induktionszeit optimiert werden (siehe Kap. 3.2.1, Abb. 3.11). 46
Bei dem verwendeten GST-Expressionssystem der FA. Pharmacia, Freiburg (BRD) wird eine Induktionszeit von 3-5 Stunden nach Erreichen einer Zelldichte mit einer OD von 0.6-1 (bei einer Wellenlänge von 600 nm) empfohlen. 4.1.2 Löslichkeit Es gibt verschiedene Methoden, um bakteriell überexprimierte Proteine zu reinigen. Hierbei spielt das Löslichkeitsverhalten der zu reinigenden Proteine eine entscheidende Rolle. Heterolog in Bakterien exprimierte Proteine werden häufig in Form von unlöslichen, amorphen Aggregaten, sog. `inclusions bodies, abgelagert (Marston et al., 1986; Hartley und Kane, 1988; Mitraki et al., 1991). Innerhalb der Zelle stellen diese `inclusion bodies Proteindepots dar, in denen anomale, d.h. beschädigte z.b. Proteine vor ihrem Abbau (Prouty und Goldberg, 1972), aber auch normale Proteine des Bakteriums bei gesteigerter Expression abgelagert werden (Bottermann und Zabeau, 1985). `Inclusion bodies erscheinen als amorphe Proteinaggregate, die ohne umgebende Membran aufgrund ihrer Unlöslichkeit vom übrigen Cytoplasma getrennt sind (Schoemaker et al., 1985). Es wird vermutet, daß bei einer hohen Proteinbildungsrate wegen des überlasteten Chaperonsystems die wachsende Polypeptidkette nicht exakt gefaltet werden kann und die wasserabweisenden (hydrophoben) Zwischenprodukte im Cytoplasma Präzipitate erzeugen. Solche Chaperone-Systeme sind DnaK/DnaJ und GroEL/GroES. (Gragerov et al., 1992). Es erscheint daher sinnvoll, die Synthesegeschwindigkeit des zu exprimierenden Proteins zu verringern, damit das entstehende Protein Zeit zum korrekten Falten hat. Experimentelle Möglichkeiten zur Verlangsamung der Genexpression gibt es mehrere: Durch die Anzuchttemperatur werden die beschriebenen Proteinaggregate zum Teil beeinflußt. Bei einigen Proteinen, die bei 37 C sich in `inclusion bodies ansammeln, konnte gezeigt werden, daß bei Herabsetzung der Temperatur auf zwischen 20 und 30 C, diese Proteine zu einem großen Teil löslich im Cytoplasma vorliegen (Schein und Noteborn, 1988). Bei niedriger Temperatur werden alle Schritte der Genexpression langsamer verrichtet. Dadurch haben die Proteine länger Zeit sich zu entfalten. 47
Auch die Verringerung der IPTG-Konzentration zur Induktion der Proteinexpression hat Einfluß auf die Löslichkeit der gebildeten Proteine. Denn dadurch erfolgt eine langsamere Proteinbiosynthese und dies bedeutet eine bessere Löslichkeit (Tagaki et al., 1988). Dies konnte in dieser Arbeit auch bestätigt werden (siehe Kap.3.1.2, Abb. 3.2a/3.2b). Die in der Literatur vorliegenden und die Ergebnisse dieser Arbeit lassen vermuten, daß die Bildung von `inclusion bodies vor allem durch eine geringere Expressionsrate verhindert werden kann. 4.1.3 Wahl des E. coli-stammes Die Wahl des E. coli-stammes, der für die Expression der Konstrukte verwendet wird, kann einen Einfluß auf die Stabilität des Translationsproduktes haben. Für das Fusionsprotein konnte mit einem GST-Expressionssystem gezeigt werden, daß im Vergleich zu den E. coli-stämmen TG1 und BL21, bei dem proteasefreien Stamm BL21 (DE3) der Abbau des gebildeten Fusionsproteins deutlich verringert ist. Die Bedeutung der verwendeten E. coli-stämme für die Stabilität der Genprodukte ist im Kapitel 4.3.1 beschrieben. 4.2 Genprodukt Pex14p 4.2.1 Heterologe Expression Wie schon in Kapitel 3.1 dargelegt, konnte in Lysaten IPTG-induzierter Bakterienzellen im Coomassie-gefärbten Gel außer der erwarteten Bande mit einem Molekulargewicht von 64 kda eine zusätzliche verstärkte Polypeptidbande mit einer relativen molaren Masse von 26 kda identifiziert werden. Dies ließ vermuten, daß es sich bei der 64 kda- Bande um das Fusionsprotein GST-Pex14p und bei der 26 kda-bande um das GST alleine handelt. Eine mögliche Schlußfolgerung ist, daß die 26 kda-bande durch Proteolyse aus dem Fusionsprotein entstanden ist. 48
Die Überprüfung der Löslichkeit des GST-PEX14 ergab, daß sowohl die 64 kda- als auch die 26 kda-bande überwiegend in löslicher Form im Überstand und zu einem kleinen Anteil im Sediment (`inclusion bodies ) identifiziert werden konnte (Kap. 3.1.3; Abb. 3.4). Es wurden 2 Möglichkeiten zur Gewinnung von Protein für die Antikörperproduktion im Kaninchen verwendet: 1. Trennung des Fusionsproteins in denaturierter Form von seinen Abbauprodukten durch präparative SDS-Gelelektrophorese Da die heterologe Expression des GST-Pex14-Fusionsproteins nicht ohne Proteolyse ablief und trotz Gabe von Protease-Inhibitoren das Ergebnis unzureichend blieb, galt es, das Fusionsprotein von seinen Abbauprodukten durch präparative SDS- Gelelektrophorese unter denaturierter Bedingung zu trennen. Hierdurch wurde sichergestellt, daß das als Antigen verwendete Fusionsprotein mit einer molaren Masse von 64kDa frei von anderen Polypeptidbanden war. Das Protein wurde aus dem Acrylamid elektroeluiert und zur Immunisierung eines Kaninchens eingesetzt 2. Gewinnung des Fusionsproteins in nativer Form aus einem proteasearmen E. coli-stamm BL21 (DE) Das zu Beginn dieser Arbeit bereits vorgelegene Konstrukt ScPEX14 (M.Albertini, 1997) wurde sowohl in Zellen des E. coli-stammes TG1 als auch des Stammes BL21 (DE3) transformiert. Beide Transformanten wurden für Expressionsstudien eingesetzt (3.1 und 3.2). Dabei stellte sich heraus, daß bei beiden Stämmen das gebildete rekombinante Fusionsprotein zum überwiegenden Teil löslich in der Zelle vorlag (3.1.3). Die Expressionskinetik des Fusionsproteins im E. coli-stamm BL21 zeigte, daß die Expressionsrate, unter gleichen Anzuchtbedingungen, bei dem Stamm BL21 (DE3) höher war als beim TG1 (3.2.1, Abb. 3.11). 49
Das Fusionsprotein wurde chromatographisch aufgetrennt und mittels einer Glutathionsäule aufgereinigt. Anschließend wurde die Elutationsfraktionen der Säule zusammengegeben und mit Centriprep-Membranen eingeengt. So wurden zusätzlich auch Degradationsprodukte zwischen 30 und 50 kda abgetrennt. Mit dem so isolierten nativen Fusionsprotein, das nun in ausreichender Menge vorlag, wurden Antikörper im Kaninchen produziert. 4.3 Entwicklung eines Antiserums gegen Pex14p Dieses Kapitel beschäftigt sich mit der Expression des GST-Pex14-Fusionsproteins und der Qualität des erzeugten Antikörpers. Das gegen das Fusionsprotein GST-Pex14p gewonnene Antiserum erkennt schon im Wildtyp eindeutig das endogene Pex14p. Dies zeigt, daß das Antiserum auch ohne Aufreinigung sowohl einen ausreichenden Titer, als auch die erhoffte eindeutige Spezifität besitzt. Bei den im Zellextrakt des Überproduzenten pex14 (YEpPEX14) unerwartet gefundenen höheren Banden könnte es sich um das Dimer von Pex14p mit zwei Abbaubanden handeln. Eine Dimerisierung von Pex14p aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae wurde aufgrund von Ergebnissen mit der Two-Hybrid- Technik postuliert. Warum das Dimer jedoch durch SDS nicht völlig dissoziiert werden konnte, ist zur Zeit ungeklärt. Vergleichbare Fälle sind jedoch in der Literatur bekannt. Unerwartet war auch die Tatsache, daß das Fusionsprotein Pex14p- ProteinA eine intensivere Bande ergab, als das Wildtyp Pex14p selbst. Beide Proteine wurden von Genen exprimiert, die unter der Kontrolle des identischen Pex14p-Promotors im genomischen Kontext stand. 50