Identifizierung und Charakterisierung von Genen mit spezieller Funktion in der Skelettentwicklung

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1 Identifizierung und Charakterisierung von Genen mit spezieller Funktion in der Skelettentwicklung Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Melanie Grosch aus Erlangen

2 Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: Vorsitzender der Promotionskommission: Erstberichterstatter: Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Rainer Fink Prof. Dr. Andreas Winterpacht Prof. Dr. Robert Slany

3 Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung Summary Einleitung Skelettentwicklung Enchondrale Ossifikation von Röhrenknochen Desmale Ossifikation Angeborene und erworbene Skelettdefekte Ursachen von Skeletterkrankungen ER-Stress Das Zentrosom Zilien Selenoproteine Zielsetzung Ergebnisse Suche nach der genetischen Ursache der SEMD-JL Typ Hall Patientenbeschreibung und Stammbaum Homozygotie-Kartierung Sanger-Sequenzierung von Kandidatengenen Gruppe A: Gene mit bekannter Funktion bei der Skelettentwicklung Gruppe B: unbekannte Gene Gruppe C: in ATDC5-Zellen differentiell exprimierte Gene Next Generation Sequencing Bioinformatische Analysen Expression der betroffenen NIN- und POLE2-Isoformen Subzelluläre Lokalisation Funktionelle Analysen von Selenoprotein M und dessen Rolle in der Skelettentwicklung Gen- und Proteinstruktur Expressionsanalysen von selm im Huhn Expressionsanalysen von Selm in der Maus Generierung einer Selm-Knockout-Maus Nachweis des Knockouts... 41

4 Inhaltsverzeichnis II X-Gal-Färbung Charakterisierung der Selm-Knockout-Maus Genotypenverteilung Morphologische und Histologische Untersuchungen Regulation der Selm-Expression durch die Unfolded Protein Response Promotoranalyse von Selm Regulation des Selm-Promotors durch XBP Suche nach Interaktionspartnern mittels Yeast-two-Hybrid-System Generierung der Köder-Konstrukte Autotransaktivierungstest der Köder Nachweis der Fusionsproteine mittels Western Blot Screening auf Interaktionspartner Diskussion Suche nach der genetischen Ursache der SEMD-JL Typ Hall Diagnose und Art der Vererbung Funktion der Proteine NIN und POLE POLE NIN Funktionelle Analysen von Selenoprotein M und dessen Rolle in der Skelettentwicklung Expressionsstudien Möglicher Zusammenhang von SELM mit der UPR Die Rolle der UPR bei der Skelettentwicklung Mit der UPR assoziierte Skeletterkrankungen Generierung und phänotypische Analyse von Selm -/- -Mäusen Mögliche Kompensation durch andere Selenoproteine Einfluss des Selenstatus auf die Synthese der Selenoproteine Die Rolle von ER-Stress in der Pathogenese verschiedener Krankheiten Material und Methoden Isolierung von Nukleinsäuren Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien Isolierung von Plasmid-DNA aus Hefen DNA-Isolation aus Gewebe DNA-Isolation aus Mausschwänzen RNA-Isolation aus Geweben RNA-Isolation aus Zellkultur Photometrische Bestimmung der DNA- und RNA-Konzentration...80

5 Inhaltsverzeichnis III 5.2 DNA- und RNA-Standardmethoden Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen Agarose-Gelelektorphorese von DNA- und RNA-Fragmenten PAA-Gelelektrophorese von DNA-Fragmenten Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Aufreinigung von DNA/RNA durch Phenol-Chloroform-Extraktion Fällung von DNA Fällung von RNA Southern Blot-Analysen Klonierung Klonierung von PCR-Produkten Ligation Transformation von Bakterien Selektion positiver Klone Gerichtete Mutagenese Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Semiquantitative PCR Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR) Quantitative Real-Time PCR (qpcr) Prinzip der qpcr Durchführung Analyse der qpcr-daten Sequenzierung von DNA Aufreinigung von PCR-Produkten für die Sequenzierung Sequenzierreaktion und Aufreinigung Sequenzanalyse und Auswertung Protein-Techniken Isolierung von Proteinen aus Zellkultur Isolierung von Proteinen aus Hefen Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford Western Blot Immunzytologie Histologische Färbungen Paraffineinbettung von Gewebe Anfertigen von Gewebeschnitten HE-Färbung Azan-Färbung X-Gal-Färbung Skelettfärbung... 91

6 Inhaltsverzeichnis IV 5.12 RNA in situ Hybridisierung Generierung DIG-markierter RNA Sonden Prähybridisierung Hybridisierung Posthybridisierung Detektion Zellkultur Primäre Osteoblasten Micromass culture Kultur von adhärent wachsenden Zellen Passagieren von Kulturen Einfrieren und Auftauen von Kulturen Transfektion eukaryotischer Zellen Luziferase-Assay Mauszucht Yeast-two-Hybrid-System Transformation der Hefen Mating haploider Hefestämme Ermittlung der Matingeffizienz Verifizierung potentieller Interaktionspartner In silico-analysen Reagenzien und Materialien Puffer und Lösungen Vektoren Antikörper Bakterien und Medien Zellkulturmedien und -zusätze Hefen und Medien Enzyme, Molekulargewichtstandards, Chemikalien Kits Materialien Geräte Synthetische Oligonukleotide Literaturverzeichnis Anhang mrna-sequenz von selm im Huhn Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis

7 Inhaltsverzeichnis V 7.4 Abkürzungsverzeichnis Danksagung Lebenslauf Veröffentlichungen

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9 1 Zusammenfassung Das Skelett besteht aus über 200 unterschiedlichen und einzigartig geformten Knochen, für deren Bildung und Homöostase ein komplexes regulatorisches Netzwerk notwendig ist, dessen einzelne Komponenten bisher nur zum Teil bekannt sind. Genetische Studien von Skeletterkrankungen und Untersuchungen am Tiermodell können dazu beitragen, diese hochkomplexen Prozesse besser zu verstehen, neue Gene zu identifizieren und deren Rolle während der Skelettentwicklung näher zu charakterisieren. Dementsprechend wurden hierzu in der vorliegenden Arbeit zwei unterschiedliche Strategien verfolgt. Zum einen wurde die genetische Ursache der Spondylo-epi-metaphysären Dysplasie (SEMD) mit Gelenkschwäche (joint laxity) und Leptodaktylie (SEMD-JL Typ Hall) in einer konsanguinen Familie untersucht. Dabei wurde mittels Homozygotie-Kartierung eine 8 Mb und 64 annotierte Gene umfassende Kandidatenregion auf Chromosom 14 (14q22.1 bis 14q23.1) identifiziert. Dies ist der erste kartierte Lokus für die SEMD-JL. Nach Priorisierung und Kategorisierung der Kandidatengene konnte durch Sanger- Sequenzierung eine Mutation (c.6345a>g) in Ninein (NIN), die zu einem Austausch einer hoch konservierten Aminosäure (p.n2082d) führt, identifiziert werden. Um diese Mutation zu bestätigen, wurde mittels Next Generation Sequencing das komplette Exom der Indexpatientin sequenziert. Dabei wurde neben der NIN-Mutation noch eine zweite Mutation (c.283c>t) in der Polymerase epsilon Untereinheit 2 (POLE2) innerhalb der Kopplungsregion gefunden, die ebenfalls zu einem Austausch einer hochkonservierten Aminosäure (p.p95s) führt. Beide Mutationen segregieren mit der Erkrankung. Obwohl die funktionellen Analysen keinen direkten Hinweis auf die Ursächlichkeit einer der beiden Mutationen für die Erkrankung ergaben, sprechen die bioinformatischen Analysen zusammen mit Daten aus der Literatur jedoch dafür, dass die Mutation im zentrosomalen Protein NIN die ursächliche Mutation in der vorliegenden Familie mit SEMD-JL Typ Hall darstellt. Darüber hinaus ist dies ein erster Hinweis auf eine Verbindung von Ninein mit der Skelettentwicklung. Zum anderen wurde das Selenoprotein M (SELM) funktionell charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass Selm während der Entwicklung besonders stark in Knochen und Sehnen exprimiert wird. Dabei wurde in den Knochen eine signifikante Co-Expression mit Osteocalcin (Bglap) und Typ I Kollagen (Col1a1) und in Sehnen mit Scleraxis (Scx) und Tenomodulin (Tnmd) nachgewiesen. Dies spricht für eine Expression in Osteoblasten und Tenozyten. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, dass SELM in Osteoblasten in die Unfolded Protein Response (UPR) involviert ist und ein Zielgen von XBP1(s) darstellt. Zusammen mit Daten aus der Literatur und der potentiellen

10 1 Zusammenfassung 2 Interaktion mit der Protein-Disulfid-Isomerase (PDI) sprechen die Ergebnisse dieser Arbeit dafür, dass SELM eine Rolle bei der Faltung und Prozessierung sekretorischer (Matrix-)Proteine während der Skelettentwicklung spielen könnte.

11 1 Summary A complex regulatory network is responsible for the formation and homeostasis of more than 200 different and uniquely shaped bones of the skeleton. However, the underlying genes and mechanisms have only partly been elucidated yet. Genetic studies of skeletal diseases and analyses of animal models may contribute to a better understanding of these highly complex processes and may help to identify and further characterize genes involved in skeletal development. Thus, two different strategies were used in the present dissertation. On the one hand, I analyzed the genetic cause of the spondylo-epi-metaphyseal dysplasia (SEMD) with joint laxity and leptodactyly (SEMD-JL Hall type) in a consanguineous family. Homozygosity mapping revealed an 8 Mb candidate region on chromosome 14 (14q q23.1) comprising 64 annotated genes. This is the first report of a genetic locus for SEMD-JL. After ranking of candidate genes I could identify a mutation (c.6345a>g) in ninein (NIN) leading to the substitution of a highly conserved amino acid (p.n2082d) using Sanger sequencing. To verify this mutation, the whole exome of the index patient was sequenced using Next Generation Sequencing. In addition to the NIN mutation I found a second mutation (c.283c>t) within the linkage region, namely in the polymerase epsilon subunit 2 (POLE2) gene, which also leads to the substitution of a highly conserved amino acid (p.p95s). Both mutations segregate with the disease phenotype. Although the functional analyses could not link any of the mutations directly with the disease, bioinformatics analyses together with data from the literature indicate that the mutation in the centrosomal protein NIN is the causative mutation in the presented family with SEMD-JL Hall type. In addition, this may point to a possible role of ninein in skeletal development. On the other hand, selenoprotein M (SELM) was functionally characterized. I could show that Selm is prominently expressed in bones and tendons during development. A significant coexpression of Selm with osteocalcin (Bglap) and type I collagen (Col1a1) in bones, and with scleraxis (Scx) and tenomodulin (Tnmd) in tendons could be detected revealing expression in osteoblasts and tenocytes, respectively. Moreover, I showed that SELM is involved in the Unfolded Protein Response (UPR) in osteoblasts and a target gene of XBP1(s). Together with data from the literature and a potential interaction with the protein disulfide isomerase (PDI) these results indicate that SELM could play a role in the correct folding and processing of secretory (matrix) proteins during development.

12 1 Summary 4

13 2 Einleitung Die Bildung des Skeletts ist ein komplexer Prozess, der durch eine Vielzahl von Faktoren reguliert wird. Längst nicht alle daran beteiligten Mechanismen und Gene sind bisher aufgeklärt worden. Um Defekte bei Bildung, Wachstum und Homöostase des Skeletts besser diagnostizieren zu können und Strategien zur Prävention und Therapie von Knorpel- und Knochenerkrankungen zu entwickeln, ist es wichtig, neue Gene, die an der Knorpel- und Knochenentwicklung beteiligt sind, zu identifizieren. 2.1 Skelettentwicklung Das Skelett besteht aus über 200 Knochen, die je nach Lage und Funktion viele unterschiedliche und einzigartige Formen haben (Karsenty und Wagner, 2002). Sie erfüllen eine wichtige Stützfunktion, schützen lebenswichtige Organe und sind verantwortlich für das Längenwachstum des Körpers. Darüber hinaus sind sie auch der Ort der Blutbildung und spielen eine wichtige Rolle in der Kalziumhomöostase (Zelzer und Olsen, 2003). Knochen bestehen zu 20% aus Wasser, 45% aus anorganischen Bestandteilen (vor allem Hydroxylapatit) und zu 35% aus organischer Matrix. Die organischen Anteile bestehen zu 90% aus Kollagen Typ I und zu 10% aus Proteoglykanen und einigen anderen nicht-kollagenen Proteinen wie z. B. Osteocalcin (BGLAP), Osteonectin (SP ARC) und Osteopontin (SPP1) (Carter und Beaupré, 2007). Die Skelettentwicklung ist ein komplexer Prozess, der sich aus mehreren Phasen zusammensetzt. Während der ersten Phase der Musterbildung kondensieren mesenchymale Zellen und bilden ein Modell des zukünftigen Knochens. Darauf folgt die Phase der Morphogenese, in der es zur Gestalt- und Formbildung der einzelnen Skelettelemente kommt. Dabei differenzieren die mesenchymalen Vorläuferzellen zu Chondrozyten bzw. Osteoblasten und es kommt zur Einwanderung von Blutgefäßen in die resultierenden Knorpel- bzw. Knochengewebe. Den Abschluss bildet die Phase der Homöostase, in der die Knochensubstanz durch Osteoblasten und -klasten kontinuierlich auf- und abgebaut, ihre Form und Größe im Wesentlichen aber nicht mehr verändert wird (Zelzer und Olsen, 2003). Osteoklasten stammen im Gegensatz zu den Osteoblasten nicht von mesenchymalen Zellen, sondern von hämatopoetischen Stammzellen ab (Murakami et al., 2004). Grundsätzlich kann man zwei Arten der Knochenentwicklung unterscheiden: Das Axial- und Extremitätenskelett wird zuerst als Knorpelmodell angelegt, das nach einer Reihe von Proliferations- und Differenzierungsschritten schließlich durch Knochen ersetzt wird ( Ersatzknochenmodell ). Dieser Prozess wird enchondrale Ossifikation

14 2 Einleitung 6 genannt. Im Gegensatz dazu differenzieren bei der desmalen (intramembranösen) Ossifikation kondensierte mesenchymale Zellen direkt zu Osteoblasten, welche die Knochenmatrix aufbauen. Diese Form der Knochenentwicklung spielt vor allem bei der Bildung kraniofazialer Skelettelemente und der Clavicula eine Rolle (Epstein et al., 2004). An der Regulation der Skelettentwicklung ist eine Vielzahl von Signalwegen beteiligt. Dazu zählt der FGF-, TGFβ-, BMP-, Wnt-, Notch- und Hedgehog-Signalweg (Kobayashi und Kronenberg, 2005). Abb. 2.1 zeigt einen Überblick über wichtige Prozesse und Faktoren, die an der Differenzierung von Chondrozyten, Osteoblasten und Osteoklasten beteiligt sind. Abb. 2.1: Differenzierung von Chondrozyten, Osteoblasten und Osteoklasten. Chondrozyten und Osteoblasten stammen von gemeinsamen mesenchymalen Vorläuferzellen ab. Während der enchondralen Ossifikation kondensieren mesenchymale Zellen und differenzieren zu Chondrozyten. Anschließend proliferieren die Chondrozyten und differenzieren weiter über säulenbildende zu hypertrophen Chondrozyten. Die terminale Differenzierung wird dabei durch Runx2 induziert. Runx2 ist außerdem genau wie Osx essentiell für die Osteoblastendifferenzierung sowohl während der enchondralen als auch der desmalen Ossifikation. Osteoklasten sind hämatopoetischer Abstammung. Ihre Differenzierung wird ebenfalls durch eine Reihe externer Stimuli reguliert. Wichtige Transkriptionsfaktoren sind in schwarz dargestellt, Signalmoleküle in blau (nach (Kobayashi und Kronenberg, 2005)) Enchondrale Ossifikation von Röhrenknochen Eine schematische Übersicht über die enchondrale Ossifikation ist in Abb. 2.2 dargestellt. Den ersten Schritt stellt die SOX9-vermittelte Kondensation mesenchymaler Zellen und deren Differenzierung zu Chondrozyten dar (Lefebvre und Smits, 2005). Diese beginnen zu proliferieren und sezernieren Bestandteile der extrazellulären Matrix,

15 2 Einleitung 7 v.a. Kollagen Typ II, IX und XI und Proteoglykane wie Aggrecan (ACAN) (Epstein et al., 2004). Um die Knorpelanlage herum bildet sich das Perichondrium, das aus undifferenzierten mesenchymalen Zellen besteht (Karsenty und Wagner, 2002; Kronenberg, 2003). Anschließend beginnt die Differenzierung zu hypertrophen Chondrozyten, die durch die Expression von Kollagen Typ X charakterisiert sind (Lefebvre und Smits, 2005). Terminal differenzierte, hypertrophe Chondrozyten werden von einer mineralisierten extrazellulären Matrix umgeben, bevor sie in die Apoptose übergehen. Diese Matrix, die auch VEGF (Vascular endothelial growth factor) enthält, ist dann verantwortlich für die Einwanderung von Blutgefäßen, durch die wiederum Osteoblasten sowie Osteo- bzw. Chondroklasten und hämatopoetische Zellen in die Matrix einwandern (Karsenty und Wagner, 2002). Es kommt zur Resorption der Knorpelmatrix durch Osteo- bzw. Chondroklasten und zum Aufbau der Knochensubstanz durch Osteoblasten. So entsteht in der Diaphyse ein primäres Ossifikationszentrum. In den Epiphysen entstehen postnatal sekundäre Ossifikationszentren. Die Wachstumsfuge, der Bereich zwischen primärem und sekundärem Ossifikationszentrum, in dem der Knorpel bis zum Ende der Pubertät erhalten bleibt, ist für das Längenwachstum der Röhrenknochen verantwortlich. Hier spielen sich die eben beschriebenen Vorgänge nochmals in räumlich und zeitlich geordneter Form ab. Abb. 2.2: Enchondrale Ossifikation von Röhrenknochen. Mesenchymale Zellen kondensieren und differenzieren zu Chondrozyten (A). Diese proliferieren und beginnen zu differenzieren (B). Um die Knorpelanlage herum bildet sich aus undifferenzierten mesenchymalen Zellen das Perichondrium. Chondrozyten im Zentrum der Diaphyse hypertrophieren und mineralisieren die extrazelluläre Matrix bis sie apoptotisch werden (C). In die so entstandenen Lakunen wandern Blutgefäße ein, durch die Osteoblasten, Osteoklasten und Knochenmarkzellen in das Gewebe gelangen. Osteoklasten resorbieren den Knorpel, Osteoblasten ersetzen ihn durch Knochensubstanz. Es bildet sich ein primäres Ossifikationszentrum (D, E). An den Epiphysen entstehen schließlich sekundäre Ossifikationszentren. Das Längenwachstum der Röhrenknochen wird durch die Wachstumsfuge reguliert, die zwischen primären und sekundären Ossifikationszentren liegt (F) (verändert nach (Gilbert und Singer, 2006)).

16 2 Einleitung Desmale Ossifikation Im Gegensatz zur enchondralen Ossifikation differenzieren die mesenchymalen Vorläuferzellen bei der desmalen Ossifikation direkt zu Osteoblasten, ohne dass vorher ein Knorpelmodell des Knochens angelegt wird. Auch hier steht zu Beginn die Kondensation von mesenchymalen Zellen, deren Differenzierung zu Osteoblastenvorläufern hauptsächlich durch RUNX2, einem für die Osteoblastendifferenzierung essentiellen Transkriptionsfaktor (Komori, 2005), reguliert wird. Anschließend differenzieren diese zuerst zu Prä-Osteoblasten, dann zu reifen Osteoblasten und exprimieren Osteoblasten-spezifische Gene wie z.b. BGLAP und SPP1 (Nakashima und de Crombrugghe, 2003). Die Hauptaufgabe von Osteoblasten ist die Bildung von Knochenmatrix (Osteoid), die später mineralisiert wird, um neuen Knochen zu bilden. Dafür haben sie ein gut entwickeltes raues endoplasmatisches Retikulum und einen ausgeprägten Golgi-Apparat (Palumbo, 1986). Zu den von Osteoblasten sezernierten Osteoidbestandteilen gehören z.b. Typ I Kollagen, Osteocalcin und Enzyme wie die Alkalische Phosphatase (Nakashima und de Crombrugghe, 2003). Die knochenaufbauenden Osteoblasten werden schließlich in die mineralisierte Knochenmatrix als Osteozyten integriert (Franz-Odendaal et al., 2006). Alternativ können Osteoblasten auch zu ruhenden Oberflächenzellen, den sogenannten bone lining cells differenzieren, welche die inaktiven Bereiche der Knochenoberfläche bedecken. Es handelt sich dabei um flache, dem Knochen aufsitzende Zellen, die zum Einen die Ernährung der Osteozyten unterstützen, zum Anderen der Trennung von Knochenkompartimenten und der Osteoklastenaktivierung dienen (Miller und Jee, 1987; Sims und Gooi, 2008; Rochefort et al., 2010). 2.2 Angeborene und erworbene Skelettdefekte Knochenentwicklung und -wachstum stellen komplex regulierte Prozesse dar, wobei in jedem Entwicklungsstadium Fehler auftreten können, die zu Skelettanomalien führen. Das Spektrum dieser Fehlbildungen reicht von lokalen Deformationen oder Verlusten einzelner Skelettelemente (Dysostosen) bis hin zu generalisierten Fehlbildungen (Osteochondrodysplasien), die isoliert oder als Teil von komplexen Syndromen auftreten können (Zelzer und Olsen, 2003). Die einzelnen Erkrankungen sind dabei meist sehr selten, insgesamt sind Skeletterkrankungen jedoch weit verbreitet (Ikegawa, 2006). Nach neuester Klassifizierung gibt es 456 verschiedene genetische Skeletterkrankungen, die aufgrund klinischer, radiologischer und molekularer Befunde in 40 Gruppen unterteilt werden können (Warman et al., 2011). Eine dieser Gruppen stellen die Spondylo-epi-(meta)physäre Dysplasien (SE(M)Ds) dar. SE(M)Ds sind Skelettdysplasien, die durch vertebrale, epiphysäre und evtl. metaphysäre Fehlbildungen

17 2 Einleitung 9 gekennzeichnet sind. Gemeinsames Hauptmerkmal ist dabei ein disproportionierter Kleinwuchs (Cormier-Daire, 2008). Neben den angeborenen Skeletterkrankungen gibt es eine Vielzahl erworbener Erkrankungen des Skelettsystems. Dazu zählen Verschleißerkrankungen wie Osteoarthrose, durch Störungen des Kalzium-Phosphat-Stoffwechsels verursachte Erkrankungen wie Osteoporose als auch Defekte, die durch einen Mangel an Spurenelementen verursacht werden, wie z.b. die Kashin-Beck-Krankheit (KBD) (Yang et al., 1988; Bijlsma et al., 2011; Vilela und Nunes, 2011). Bei KBD handelt es sich um eine destruktive Osteoarthropathie mit Kleinwuchs, die endemisch in Nordchina, Sibirien, Tibet und Nordkorea auftritt, und u.a. im Zusammenhang mit Selenmangel diskutiert wird (Moreno-Reyes et al., 1998; Sudre und Mathieu, 2001). 2.3 Ursachen von Skeletterkrankungen Neben den klassischen Entwicklungs-Signalwegen (FGF-, TGFβ-, BMP-, Wnt-, Notchund Hedgehog-Signalweg) (Kobayashi und Kronenberg, 2005) wurden in den letzten Jahren auch Mutationen in zahlreichen Bestandteilen der extrazellulären Matrix, sowie in zentrosomalen und ziliären Komponenten identifiziert. So wurden z.b. Mutationen in den ECM-Genen COMP (cartilage oligomeric matrix protein) und MATN3 (Matrilin 3) bei Pseudoachondroplasie (PSACH) und multipler epiphysärer Dysplasie (MED), im zentrosomalen Protein Pericentrin (PCNT) bei primordialem Kleinwuchs Typ Majewski II (MOPD2) und im Ziliengen IFT80 (intraflagellar transport 80 homolog) bei Jeune- Syndrom identifiziert (Briggs et al., 1995; Hecht et al., 1995; Briggs und Chapman, 2002; Beales et al., 2007; Rauch et al., 2008). Wie oben bereits erwähnt, spielen neben den rein genetisch-bedingten Skeletterkrankungen auch eine Kombination von genetischen und Umwelt- bzw. Ernährungsfaktoren eine Rolle. So gibt es auch für die mit Selenmangel assoziierte KBD Hinweise auf eine genetische Komponente. Zwei Assoziationsstudien konnten Selenoproteine in Zusammenhang mit KBD bringen (Sun et al., 2010; Xiong et al., 2010). Weitere Hinweise darauf, dass Selenoproteine bei der Pathogenese von KBD eine Rolle spielen könnten, ergab eine Studie von Downey et al. im Mausmodell. Mäuse die in Skelettelementen keine Selenoproteine produzieren konnten, zeigten einen KBD-ähnlichen Phänotyp (Downey et al., 2009). Im Folgenden sollen ER-Stress, das Zentrosom, Zilien und Selenoproteine näher dargestellt werden, da es zahlreiche Hinweise darauf gibt, dass diese Komponenten eine besonders bedeutende Rolle bei der Knorpel- und Knochenentwicklung und in der Pathogenese von Skeletterkrankungen spielen.

18 2 Einleitung ER-Stress Die korrekte Faltung von Proteinen ist essentiell für die Funktion des endoplasmatischen Retikulums. Die Akkumulation ungefalteter oder fehlgefalteter Proteine im ER führt zu ER-Stress, der wiederum zu einer verminderten Translation, einer transkriptionellen Aktivierung von Chaperonen und Proteindegradierung führt (Schroder und Kaufman, 2005). Diese Prozesse und damit assoziierte Signalwege werden zusammen die Unfolded Protein Response (UPR) genannt. Abb. 2.3 zeigt eine Übersicht über die wichtigsten Faktoren der UPR. In Vertebraten dienen drei ER-residente Transmembranproteine [inositol-requiring protein-1 (IRE1), activating transcription factor-6 (ATF6) und PKR-like ER kinase (PERK)] als proximale ER-Stress-Sensoren. Im inaktiven Zustand sind deren luminale Domänen mit dem ER-Chaperon immunoglobulin heavy chain binding protein/glucoseregulated protein of (BiP/GRP78) assoziiert, einem wichtigen Transducer der UPR. Zu den frühen ER-Stress-Antworten gehört die schnelle Phosphorylierung von eif2α durch PERK und die damit verbundene Inhibierung der Translation (Harding et al., 2001). Um die Faltung akkumulierter Proteine zu beschleunigen, trägt jeder der drei proximalen ER-Stress-Sensoren zur Hochregulierung von UPR-Genen wie Chaperonen und Oxidoreduktasen bei (Ellgaard und Helenius, 2003). Unter ER-Stress wird ATF6 gespalten und als Transkriptionsfaktor in den Kern transloziert. Eines seiner Zielgene ist das X-box binding protein-1 (Xbp1), aus dessen mrna ein 26 bp langes Intron durch unkonventionelles IRE1-abhängiges Spleißen entfernt wird (Rutkowski und Kaufman, 2007). Die gespleißte Form von XBP1 [XBP1(s)] wiederum aktiviert als potenter Transkriptionsfaktor UPR-Zielgene. Die Phosphorylierung von eif2α durch PERK ist nicht nur verantwortlich für die Inhibierung der Translation, sondern auch für die präferentielle Translation von activating transcription factor 4 (ATF4), einem Transkriptionsfaktor, der nur unter ER-Stress translatiert wird. Wenn falsch gefaltete Proteine nicht mehr repariert werden können, werden sie ins Zytosol retrotransloziert und anschließend in einem Prozess, der ER-assoziierte Proteindegradation (ERAD) genannt wird, degradiert (Lilley und Ploegh, 2004; Ye et al., 2004; Meusser et al., 2005). Wenn all diese Mechanismen zur Reduzierung akkumulierter Proteine im ER fehlschlagen, geht die Zelle schließlich in Apoptose über. Erst kürzlich konnten Mutationen in Genen, die für Bestandteile der ECM codieren, in Zusammenhang mit ER-Stress gebracht werden (Hecht et al., 1995; Briggs und Chapman, 2002; Lisse et al., 2008). ER-Stress scheint auch in einer Reihe weiterer Erkrankungen Bestandteil der Pathogenese zu sein (Boot-Handford und Briggs, 2010) (vgl. auch ).

19 2 Einleitung 11 Abb. 2.3: Wichtige Faktoren der Unfolded Protein Response. Die drei proximalen UPR- Transducer ATF6, IRE1 und PERK sind im inaktiven Zustand mit BiP assoziiert. Wenn ungefaltete oder fehlgefaltete Proteine im ER akkumulieren, kommt es zur Dissoziation von BiP und damit zur Aktivierung der drei Stress-Sensoren. ATF6 gelangt in den Golgi-Apparat, wo es durch S1P/S2P geschnitten wird. Das zytosolische Fragment wandert als Transkriptionsfaktor in den Kern. Zur gleichen Zeit oligomerisieren IRE1 und PERK und werden autophosphoryliert. Phosphoryliertes IRE1 katalysiert das Spleißen der XBP1 mrna, da XBP1 nur in seiner gespleißten Form einen potenten Transkriptionsfaktor darstellt. Aktiviertes PERK phosphoryliert eif2a, das wiederum zu einer generellen Verminderung der Translation führt, während es die Translation ausgewählter mrnas mit spezifischen Elementen in der 5 UTR ermöglicht. Zu den Proteinen, die verstärkt synthetisiert werden gehört ATF4. Die downstream Effektoren dieser drei Signalwege induzieren die Expression von Genen, die für ER- Proteine codieren, die die Faltung akkumulierter Proteine beschleunigen sollen. Terminal fehlgefaltete Proteine werden über einen Prozess, der ERAD genannt wird, degradiert (aus (Wu und Kaufman, 2006)) Das Zentrosom Das Zentrosom wird auch als Mikrotubuli-Organisationszentrum (MTOC) bezeichnet. Es besteht aus zwei aufeinander senkrecht stehenden Zentriolen, die von einer elektronendichten Matrix, dem perizentriolären Material (PCM), umgeben sind (Sankaran und Parvin, 2006). Die beiden zylindrischen Zentriolen sind aus 9 radialsymmetrischen Mikrotubuli (MT)-Tripletts aufgebaut und entlang ihrer proximodistalen Achse polarisiert (Bettencourt-Dias und Glover, 2007). Aufgrund ihrer Ultrastruktur und ihres Alters lassen sich die Zentriolen eindeutig voneinander unterscheiden. Das ältere Zentriol (Mutterzentriol) enthält distale und subdistale Anhänge, die dem jüngeren Zentriol (Tochterzentriol), das im vorhergehenden Zellzyklus gebildet worden ist, fehlen (Abb. 2.4) (Piel et al., 2000; Bettencourt-Dias und Glover, 2007; Bornens, 2008; Nigg und Raff, 2009).

20 2 Einleitung 12 Die zentrosomalen Komponenten, die für die Ausbildung von MT- Polymerisationskeimen verantwortlich sind, sind im PCM lokalisiert (Moudjou et al., 1996; Tassin et al., 1998). Das wichtigste beteiligte Protein ist dabei γ-tubulin, das in einem ringförmigen Komplex mit weiteren Proteinen vorliegt, dem γ-tubulin- Ringkomplex (γ-turc). Dieser dient als Ausgangspunkt für die Bildung der polaren Mikrotubuli aus ihren α- und β-tubulin-untereinheiten (Luders und Stearns, 2007). Nach erfolgter Polymerisation der MTs im PCM, werden die MTs entweder ins Zytoplasma entlassen oder an den subdistalen Anhängen des Mutterzentriols verankert. Für die Verankerung am Zentrosom spielen neben dem γ-turc noch andere Proteine eine Rolle (z.b. Ninein, Centriolin, Dynactin), die an den subdistalen Anhängen des Mutterzentriols lokalisiert sind (Dammermann und Merdes, 2002; Delgehyr et al., 2005; Luders und Stearns, 2007). Darüber hinaus dient das Zentrosom als Basalkörper für Zilien. Die distalen Anhänge des Mutterzentriols dienen dabei der Verankerung an der Plasmamembran (transition fibres) (Hagiwara et al., 1997; Rohatgi und Snell, 2010). Man geht davon aus, dass die transition fibres eine Art selektiven Filter oder Pore darstellen, die den Eintritt zellulärer Proteine in das ziliäre Kompartiment reguliert (Rosenbaum und Witman, 2002). Dabei werden strukturelle und funktionelle Ähnlichkeiten mit dem nukleären Porenkomplex (NPC) diskutiert (Jekely und Arendt, 2006; Christensen et al., 2007). Abb. 2.4: Aufbau des Zentrosoms. Schematische Darstellung (links) und Elektronenmikroskopische Aufnahme (rechts) des Zentrosoms. Das Zentrosom besteht aus zwei Zentriolen, die jeweils aus 9 Mikrotubuli-Tripletts aufgebaut sind und durch Fasern miteinander verbunden sind. Das Mutterzentriol unterscheidet sich durch seine distalen und subdistalen Anhänge vom Tochterzentriol. Die Zentriolen sind von einer elektronendichten Matrix, dem perizentriolären Material (PCM), umgeben (verändert nach (Doxsey, 2001; Azimzadeh und Marshall, 2010)) Zilien Zilien sind 5-10 µm lange Zellfortsätze an der Zelloberfläche, welche einen Durchmesser von 250 nm aufweisen. Grundsätzlich kann zwischen zwei Arten von

21 2 Einleitung 13 Zilien unterschieden werden: beweglichen (Kinozilien) und unbeweglichen (primäre) Zilien (Abb. 2.5). Bewegliche Zilien sind durch eine sogenannte 9+2 Mikrotubuli- Konfiguration gekennzeichnet. Dabei umgeben neun MT-Dubletten zwei einzeln stehende MTs. Dieses zentrale MT-Paar ist wichtig für die Beweglichkeit der Zilien. Im Gegensatz dazu fehlt primären Zilien, die auf fast jeder Körperzelle zu finden sind, das zentrale MT-Paar (9+0 Konfiguration). Sie sind demzufolge unbeweglich. Eine Ausnahme hierzu bilden die nodalen Zilien, die trotz 9+0 Konfiguration (eingeschränkt) beweglich sind und für die Ausbildung der Links-Rechts-Achse in der frühen Embryonalentwicklung verantwortlich sind (Basu und Brueckner, 2008). Abb. 2.5: Schematischer Aufbau eines Ziliums. Zilien bestehen aus einem Mikrotubuli-basierten Axonem, das von der Zilienmembran umgeben ist. Neun radial angeordnete Mikrotubulipaare (9+0- Konfiguration bei primären Zilien, 9+2-Konfiguration bei beweglichen Zilien), deren Ursprung der Basalkörper (Mutterzentriol) ist, werden dabei über die distalen Anhänge an der Plasmamembran verankert. Zilienproteine gelangen gekoppelt an IFT-Partikel mittels Kinesin-II-Motor zur Zilienspitze (anterograder Transport) und mittels retrogradem Dynein-Motor zur Zilienbasis zurück (retrograder Transport) (verändert nach (Temiyasathit und Jacobs, 2010; Hu und Nelson, 2011)). Da für die Skelettentwicklung insbesondere die primären Zilien wichtig sind, soll hier näher auf diese eingegangen werden. Diese Zilien befinden sich auf fast allen nichtproliferierenden Zellen bzw. Zellen während der Interphase, so auch auf Chondrozyten und Osteoblasten (Haycraft und Serra, 2008; Kaushik et al., 2009). Während der Mitose wird das Zentrosom für die Ausbildung der Mitosespindeln gebraucht und steht zu diesem Zeitpunkt nicht als Basalkörper für die Verankerung des primären Ziliums zur Verfügung (Sharma et al., 2008). Da innerhalb des Ziliums keine Ribosomen lokalisiert sind, werden alle Proteine, die für die Bildung und Aufrechterhaltung des primären

22 2 Einleitung 14 Ziliums gebraucht werden, aktiv dorthin transportiert. Dieser Transportmechansimus wird Intraflagellarer Transport (IFT) genannt. IFT ist ein bidirektionales Transportsystem, das zwischen den MT-Dubletten des Axonems und der Zilienmembran lokalisiert ist, durch das große Partikel (IFT-Partikel) von der Zilienbasis zur spitze und umgekehrt transportiert werden. Der anterograde Transport wird hierbei durch Kinesin-II-Motorproteine und der retrograde Transport durch zytoplasmatisches Dynein 2 bewerkstelligt (Pedersen et al., 2008). IFT ist ein hochkonserviertes System und essentiell für die Bildung und Aufrechterhaltung des Ziliums. Man geht davon aus, dass das Zilium von Vertebraten bis zu 1000 unterschiedliche Proteine für seine Funktion braucht (Gherman et al., 2006). Primäre Zilien spielen eine wichtige Rolle während der Entwicklung und sind an der Fortleitung von mechanischen und chemischen Signalen beteiligt (Pazour und Witman, 2003; Marshall und Nonaka, 2006; Singla und Reiter, 2006; Sloboda und Rosenbaum, 2007; Berbari et al., 2009; Lancaster und Gleeson, 2009). Des Weiteren spielen sie eine wichtige Rolle in verschiedenen Signaltransduktionswegen, wie dem Hedgehog (Hh)-, kanonischen und nicht-kanonischen Wnt- und PDGFRα-Signalweg (Bisgrove und Yost, 2006; Eggenschwiler und Anderson, 2007; Gerdes et al., 2009). Defekte in der Bildung, Aufrechterhaltung oder Funktion der primären Zilien gelten als Ursachen unterschiedlichster humaner Erkrankungen, die Ziliopathien genannt werden. Deren klinische Symptome sind sehr variabel (sogar innerhalb einer Familie) und können nahezu jedes Organsystem betreffen. So kann es z.b. zu Nierenzysten, Retinadegeneration, Gehörverlust, Situs inversus, Polydaktylie und anderen Skelettfehlbildungen kommen (vgl ). Oft führen dabei Mutationen in zentrosomalen oder Zilien-Genen zu einem kompletten Zilien-Verlust oder fehlerhaftem Zilienaufbau (Badano et al., 2006; Bergmann, 2011) Selenoproteine Das essentielle Spurenelement Selen ist von großer Bedeutung für verschiedene Stoffwechselwege, Schilddrüsenhormone, den Schutz der Zelle vor oxidativem Stress und die intrazelluläre Redox-Homöostase (Fairweather-Tait et al., 2011). Selen wird in Form der 21. Aminosäure Selenocystein (Sec) co-translational in Proteine eingebaut. Beim Menschen sind bisher 25 (bei Nagetieren 24) solcher Selenoproteine bekannt (Reeves und Hoffmann, 2009). Die 21. Aminosäure Sec wird durch das Codon UGA codiert, das normalerweise als Stop-Codon fungiert. Ob das Nukleotid-Triplett UGA in der mrna zum Stopp der Translation oder zum Einbau von Sec in die wachsende Polypeptidkette genutzt wird, hängt von dem Vorhandensein mehrerer cisund trans-aktiver Faktoren ab (Hatfield und Gladyshev, 2002), die in Abb. 2.6 A

23 2 Einleitung 15 schematisch dargestellt sind. So befindet sich in der Selenoprotein-mRNA ein sogenanntes Sec Insertionssequenz (SECIS)-Element, eine Stammschleifenstruktur in der 3 UTR (Berry et al., 1991; Copeland et al., 2000), die für die Rekrutierung des SECIS-Bindeprotein 2 (SBP2) zuständig ist. Der Sec-spezifische Translationselongationsfaktor EFSec wiederum bindet an SBP2 und rekrutiert die SectRNA. So wird Selenocystein in das aktive Zentrum des Proteins eingebaut. Interessanterweise hängt die Sec-Biosynthese (Abb. 2.6 B) selbst von einem Selenoprotein ab, dem Enzym Selenophosphat-Synthetase 2 (SEPHS2), das für die Bildung des Selendonors Monoselenphosphat verantwortlich ist (Itoh et al., 2009). Die für den Einbau von Sec verantwortliche trna, auch Sec-tRNA [Ser]Sec genannt (Lee et al., 1989), wird zu Beginn durch die Seryl-tRNA-Synthetase mit Serin beladen, welches anschließend durch die Phosphoseryl-tRNA [Ser]Sec -Kinase phosphoryliert wird (Carlson et al., 2004). Der Selendonor wird schließlich durch die Sec-Synthase auf die Phosphoseryl-tRNA [Ser]Sec übertragen, aus der nach Abspaltung des Phosphats die SectRNA [Ser]Sec entsteht, welche die Sec-Insertion vermittelt (Ganichkin et al., 2008). Die Funktion der meisten Selenoproteine ist bislang nur unzureichend erforscht. Es konnte jedoch nachgewiesen werden, dass Selenoproteine essentiell für das Überleben von Organismen mit Selenoproteomen sind. So sind Mäuse, in denen das Gen für die Sec-tRNA [Ser]Sec genetisch deletiert wurde, embryonal letal (Bosl et al., 1997). Auch für die Skelettentwicklung sind Selenoproteine essentiell. So führt der konditionale Knockout der Sec-tRNA [Ser]Sec in Osteochondroprogenitorzellen zu Wachstumsstörungen, Veränderung der Wachstumsfugen, verspätete Ossifikation und Chondronekrosen des artikulären Knorpels (Downey et al., 2009). Abb. 2.6: Einbau von Selenocystein in Selenoproteine. (A) Synthese von Selenoproteinen. Das SECIS-Element in der 3` UTR (Stammschleife in rot) wird von SBP2 (hellblau) erkannt, das wiederum den Elongationsfaktor EFSec (grün) und die Sec-tRNA (gelb und hellgrün) rekrutiert. So wird das Stop- Codon UGA nicht als Translationsstopp, sondern zum Einbau von Selenocystein in das Protein genutzt (verändert nach (Berry, 2005)). (B) Selenocystein-Biosynthese. (verändert nach (Papp et al., 2007)).

24 2 Einleitung Zielsetzung Die an der Bildung und der Homöostase des Skeletts beteiligten Gene und Mechanismen sind bisher nur zum Teil aufgeklärt. Um Skeletterkrankungen besser diagnostizieren zu können und Strategien zur Prävention und Therapie von Knorpelund Knochenerkrankungen zu entwickeln, ist es wichtig, neue Gene/Proteine mit spezieller Funktion in der Skelettentwicklung zu identifizieren und deren Rolle während der Skelettentwicklung näher zu charakterisieren. Dazu wurden in der vorliegenden Arbeit zwei unterschiedliche Strategien verfolgt. Zum einen sollte die genetische Ursache der Spondylo-epi-metaphysären Dysplasie (SEMD) mit Gelenkschwäche (joint laxity) und Leptodaktylie (SEMD-JL Typ Hall) in einer konsanguinen Familie mittels Homozygotie-Kartierung und Sequenzierung von Kandidatengenen identifiziert und mögliche funktionelle Konsequenzen näher charakterisiert werden. Zum anderen sollte das Selenoprotein M (SELM) funktionell charakterisiert werden, das von Tagariello et al. (2005) im Rahmen eines Screenings nach skelettspezifischen Transkripten identifiziert worden war. Um dessen Rolle während der Skelettentwicklung näher zu untersuchen, sollten Expressionsanalysen am Huhn- und Mausmodell durchgeführt, eine Knockout-Maus generiert und charakterisiert, die Regulation der Genexpression analysiert und Interaktionspartner mittel Yeast-two- Hybrid-System gesucht werden.

25 3 Ergebnisse Skelettentwicklung und Homöostase werden durch eine Vielzahl von Genen und Mechanismen reguliert, die längst nicht alle aufgeklärt sind. Neben der Charakterisierung neuer Gene und Genprodukte der Knorpel- und Knochenentwicklung können auch genetische Studien von Erkrankungen, die die Bildung und das Wachstum des Skelettsystems betreffen, neue Einblicke in die Rolle einzelner Gene bei diesen komplexen Prozessen geben. Dementsprechend wurden in der vorliegenden Arbeit zwei unterschiedliche Strategien verfolgt. Zum einen wurde die genetische Ursache der SEMD-JL Typ Hall in einer konsanguinen Familie mittels Homozygotie-Kartierung und Next Generation Sequencing untersucht (vgl. 3.1). Zum anderen wurde das Selenoprotein M (SELM) funktionell charakterisiert, das von Tagariello et al. (2005) im Rahmen eines EST-Projektes als Kandidatengen für die Skelettentwicklung beschrieben worden war (vgl. 3.2). 3.1 Suche nach der genetischen Ursache der SEMD-JL Typ Hall Patientenbeschreibung und Stammbaum Die türkisch-stämmige Indexpatientin (Abb. 3.1 A, IV.1) wurde 1995 im Alter von 35 Jahren bei Frau Dr. Stephanie Spranger (Facharzt für Humangenetik, Bremen) vorstellig. Klinische und radiologische Befunde umfassten auffällige epi- und metaphysäre Veränderungen der Röhrenknochen, Kleinwuchs, Gelenkschwäche mit häufigen Dislokationen, verzögerte Ossifikation der Handknochen, grazile Metakarpalia, feine vertikale Streifen an den Metaphysen, Genu valgum und eine schwere Skoliose (Abb. 3.1 B). Aufgrund dieser Symptome wurde bei der Indexpatientin eine Spondylo-epi-metaphysäre Dysplasie (SEMD) mit Gelenkschwäche (joint laxity) und Leptodaktylie (SEMD-JL Typ Hall) diagnostiziert. Dabei handelt es sich um einen bestimmten Typ einer sehr heterogenen Gruppe von Skeletterkrankungen (SEMD), denen die Kombination von vertebralen, epiphysären und metaphysären Dysplasien gemein ist (Cormier-Daire, 2008). Die Familienanamnese ergab, dass außer der Indexpatientin noch eine Schwester und zwei Cousinen zweiten Grades betroffen sind. Alle vier Elternteile der Betroffenen sowie zwei Brüder und eine Schwester der Indexpatientin sind gesund. Es handelt sich also um eine Familie mit 4 betroffenen Individuen, deren Eltern Cousins und Cousinen ersten Grades sind (Abb. 3.1).

26 3 Ergebnisse 18 Aufgrund der Seltenheit der Erkrankung (25 Fälle weltweit) und der multiplen Konsanguinität innerhalb der Familie muss von einer identischen vererbten Mutation bei den Patienten ausgegangen werden. Da es keinen betroffenen Vorfahren der Patienten gibt, ist eine autosomal rezessive Vererbung anzunehmen. Dies steht im Gegensatz zu den bisher publizierten Fällen von SEMD-JL Typ Hall, bei denen von einer autosomal dominanten Vererbung ausgegangen wird (Megarbane et al., 2003). Die zu Grunde liegende Mutation bzw. das betroffene Gen sind jedoch bisher noch unbekannt. Um die ursächliche Mutation zu finden, wurde die Konsanguinität der Familie genutzt und eine Homozygotie-Kartierung durchgeführt. Abb. 3.1: Stammbaum und Patientenbilder. (A) Stammbaum der betroffenen Familie. Betroffene sind mit einem schwarz ausgefüllten Symbol gekennzeichnet, die Indexpatientin zusätzlich mit einem Pfeil. Arabische Zahlen markieren die Personen, von denen DNA verfügbar war. (B) Röntgenbilder der Indexpatientin im Alter von 35 Jahren.

27 3 Ergebnisse Homozygotie-Kartierung Da es sich wie bereits oben erwähnt im vorliegenden Fall um eine sehr seltene autosomal rezessiv vererbte Erkrankung in einer konsanguinen Familie handelt, kann angenommen werden, dass das mutationstragende Allel von einem gemeinsamen Vorfahren abstammt. Dabei wird nicht nur die Mutation weitergegeben, sondern auch mit dem Krankheitslocus gekoppelte flankierende Marker. Chromosomenabschnitte, die aufgrund der Konsanguinität homozygot vorliegen, werden auch als autozygot oder abstammungsidentisch (identical by descent; IBD) bezeichnet. Die gezielte Suche nach solchen homozygoten Haplotypen stellt den ersten Schritt zur Identifikation des Krankheitslocus dar. In der vorliegenden Arbeit wurde in Kooperation mit Dr. Dominik Seelow und Prof. Peter Nürnberg (Max-Delbrück-Zentrum für Molekulare Medizin, Berlin) eine Homozygotie-Kartierung mittels 10K-SNP-Arrays durchgeführt. Dabei wurde für die multipoint Kopplungsanalyse die ALLEGRO-Software (Gudbjartsson et al., 2000; Gudbjartsson et al., 2005) und für die two-point Kopplungsanalyse der Kandidatenregionen zusätzlich MLINK (FASTLINK Software, Version 5.1) des LINKAGE Pakets verwendet. In jedem Programm wurden ein autosomal rezessiver Vererbungsmodus mit kompletter Penetranz und eine Krankheitsallelfrequenz von 0,001 gewählt. Die genomweite Kopplungsanalyse mit der DNA von vier betroffenen (IV.1, IV.2, IV.6 und IV.7) und drei nicht-betroffenen (III.1, III.2 und III.4) Familienmitgliedern ergab zwei homozygote Intervalle mit einem LOD-Score größer als 3. Ein Bereich lag auf Chromosom 3 mit einem LOD-Score von 3,5 und der zweite Bereich auf Chromosom 14 mit einem LOD-Score von 4,2 (Abb. 3.2). Abb. 3.2: Genomweite parametrische multipoint LOD-Score Analyse. Auf der X-Achse sind die Chromosomen von p-ter nach q-ter und der genetische Abstand in cm dargestellt. Die Y-Achse zeigt den LOD-Score, der bei Chromosom 3 und 14 die Signifikanzschwelle von 3 überschreitet. Zur Eingrenzung des genomischen Bereichs wurde von beiden Regionen mit den SNP- Markern aus dem Array eine Haplotyp-Karte konstruiert. Weiterführende SNP-

28 3 Ergebnisse 20 Analysen zeigten aber, dass die Kopplungsregion auf Chromosom 3 heterozygote SNPs enthielt, woraufhin diese als Kandidatenregion ausgeschlossen und im Folgenden nicht mehr weiter analysiert wurde. Abb. 3.3: Eingrenzung der Kopplungsregion auf Chromosom 14 durch Haplotypenanalyse. Dargestellt sind die Haplotypen des Elternpaares III.1 und III.2 sowie der 4 Betroffenen (IV.1, IV.2, IV.6 und IV.7). Zusätzlich sind auch die rekonstruierten Haplotypen des Elternpaares III.3 und III.4, deren DNAs für die Chip-Analyse nicht verwendet wurden, in schwarz dargestellt. Der chromosomale Bereich, der bei den Betroffenen homozygot vorliegt und mit der Erkrankung segregiert, ist in der Abbildung mit einem schwarzen Rahmen markiert. Die verschiedenen Farben stehen für unterschiedliche Haplotypenblöcke. Abb. 3.3 zeigt die Haplotyp-Karte des kartierten Bereichs auf Chromosom 14. Die flankierenden heterozygoten SNPs sind an Position (rs , SNP_A_ ) und (rs950622, SNP_A_ ) auf Chromosom

29 3 Ergebnisse 21 14q21.3 bis q22.3 lokalisiert. Die Kopplungsregion auf Chromosom 14 ist 8 Mb groß und umfasst 64 annotierte Gene (Abb. 3.4; entsprechend GRCh37/hg19). Abb. 3.4: Physikalische Karte der Kopplungsregion auf Chromosom 14. Schematische Darstellung von Chromosom 14, die Kopplungsregion (14q21.3 q22.3) ist rot umrahmt. Darunter befindet sich eine Vergrößerung des Ausschnitts mit den darin enthaltenen 64 annotierten RefSeq-Genen (UCSC-Browser, hg19) Sanger-Sequenzierung von Kandidatengenen Um die verursachende Mutation zu finden, sollten die 64 Kandidatengene sequenziert werden. Dazu wurden die Gene zunächst nach verschiedenen Kriterien analysiert und einer von vier Gruppen (A-D, siehe unten) zugeordnet. Anschließend wurden alle codierenden Exons (inklusive Exon-Intron-Übergänge) der entsprechenden Gene mit der DNA der Indexpatientin (IV.1) amplifiziert und nach Sanger sequenziert. Da es sich bei der SEMD-JL Typ Hall um eine sehr seltene autosomal rezessiv vererbte Erkrankung handelt, wurden bei der Auswertung nur solche Mutationen in Betracht gezogen, die homozygot vorliegen und in der SNP (single nucleotide polymorphism)- Datenbank dbsnp (Version 131) nicht annotiert sind Gruppe A: Gene mit bekannter Funktion bei der Skelettentwicklung Der Gruppe A wurden alle Gene zugeordnet, die bereits eine bekannte Rolle bei der Knorpel-/Knochenentwicklung spielen, eine Homologie zu solchen Proteinen oder eine bekannte Expression in Knorpel- oder Knochengewebe aufweisen (Tab. 3.1). In diesen zehn Genen wurde keine Mutation gefunden. Tab. 3.1: Kandidatengene der Gruppe A (entsprechend NCBI36/hg18). Rang Gensymbol Genname 1 BMP4 Bone morphogenetic protein 4 2 GNG2 Guanine nucleotide binding protein (G protein), gamma 2 3 LGALS3 Lectin, galactoside-binding soluble 3 4 TXNDC1 Thioredoxin domain containing 1 5 NID2 Nidogen 2 6 STYX Serin/threonin/tyrosine interacting protein 7 CNIH Cornichon homolog, Drosophila 8 OTX2 Orthodenticle homolog 2, Drosophila 9 GNPNAT1 Glucosamine-phosphate N-acetyltransferase 1 10 MAP4K5 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 5

30 3 Ergebnisse Gruppe B: unbekannte Gene Der Gruppe B wurden alle Gene zugeordnet, die bisher noch nicht näher charakterisiert waren oder bei denen es sich nur um vorhergesagte Gene handelte, da eines dieser Gene eine noch nicht bekannte Funktion in der Skelettentwicklung spielen könnte. Auch in diesen acht Genen (C14orf104, C14orf166, C14orf138, C14orf32, C14orf101, C14orf29, KIAA0831 und KIAA1344; entsprechend NCBI36/hg18) wurde keine Mutation gefunden Gruppe C: in ATDC5-Zellen differentiell exprimierte Gene Der Gruppe C wurden alle Gene zugeordnet, die differentiell in der chondrogenen Zelllinie ATDC5 exprimiert sind (Tab. 3.2). Es handelt sich hierbei um eine murine Teratomzelllinie, die unter Zugabe von Insulin zu Chondrozyten differenziert und dabei alle Stadien der enchondralen Ossifikation bis zu hypertrophen Chondrozyten durchläuft (Shukunami et al., 1996). Die Differenzierung erfolgte über einen Zeitraum von 32 Tagen, wobei alle vier Tage RNA aus den Zellen isoliert wurde. Nach Umschreibung der RNA in cdna wurde eine semiquantitative RT-PCR mit allen verbleibenden Kandidatengenen durchgeführt (Daten nicht gezeigt). Die Gene, die in allen Chondrozyten-Differenzierungsstadien gleich stark exprimiert waren, wurden schließlich der Gruppe D zugeordnet. Tab. 3.2: Kandidatengene der Gruppe C (entsprechend NCBI36/hg18). Rang Gensymbol Genname 19 MGAT2 mannosyl (alpha-1,6-)-glycoprotein beta-1,2-nacetylglucosaminyltransferase 20 FRMD6 FERM domain containing 6 21 DDHD1 DDHD domain containing 1 22 SOCS4 suppressor of cytokine signaling 4 23 KLHDC1 kelch domain containing 1 24 SPG3A spastic paraplegia 3A 25 PELI2 pellino homolog 2 (Drosophila) 26 GMFB glia maturation factor, beta 27 ATP5S ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial Fo complex, subunit s (factor B) 28 SOS2 son of sevenless homolog 2 (Drosophila) 29 PPIL5 peptidylprolyl isomerase-like 5 30 PLEKHC1 pleckstrin homology domain-containing family C member 1 31 NIN ninein Nachdem die Gene der Gruppe A und B erfolglos sequenziert wurden, konnte schließlich in Exon 31 des Ninein-Gens (NIN) eine Mutation (c.6244a>g) gefunden werden, die zu einem AS-Austausch von Asparagin zu Aspartat (p.n2082d, NP_06597) führt. Exon 31 kommt ausschließlich in Isoform 2 (NM_020921) vor, einer von 4 bekannten NIN-Isoformen. Die Resequenzierung aller Familienmitglieder ergab erwartungsgemäß, dass die Mutation mit dem Krankheitsphänotyp segregiert. Durch die