Magnet. Probenkopf. Computer

Transkript

1 Praktikum Modul 417 Strukturbiochemie SS 2010 im Rahmen des Bachelorstudiengangs Molecular Life Sciences Aufbau eines NMR-Spektrometers Empfänger Lock - Empfänger Feld- Regulierung Magnet Shim- Spulen Probenkopf Sender Entkoppler Lock- Sender Computer ADC Das Herz des Spektrometers ist der Computer. Er steuert und überwacht die Funktion aller elektronischen Komponenten. Von hier aus werden NMR Experimente aufgesetzt und gestartet. Der akquirierte FID wird auf dem Bildschirm angezeigt, kann Fourier-transformiert und bearbeitet werden. Der Sender wird von dem Computer entsprechend einem vordefinierten Pulsprogramm angesteuert. Er generiert Radiofrequenzpulse (RF-Pulse), die zur Anregung der Probe im Probenkopf dienen.

2 Der Empfänger bekommt die von der Probe emitierten Signale, die anschließend im Analog- Digital-Konverter (ADC) digitalisiert werden. Erst danach gelangen die Informationen zum Computer zur weiteren Verarbeitung und Speicherung. Zur Beobachtung von NMR Übergängen ist ein homogenes magnetisches Feld erforderlich. Es wird von einer supraleitenden Magnetspule erzeugt (Solenoid, typische Materialien sind Nb-Legierungen wie NbTi oder Nb3Sn). Die Supraleitfähigkeit ist bei einer Temperatur unter 6K gewährleistet, wofür der supraleitende Draht ständig in einem Behälter mit flüssigem Helium (Sdp. 4K) eingetaucht sein muss. Um den Heliumverbrauch zu minimieren wird der Helium-Tank von einem Tank mit flüssigem Stickstoff umgeben (77.4 K). Der Magnet Helium Einfüllport Stickstoff Einfüllport Probenlift Supraisolierung und Hochvakuum Stickstoff-Tank Helium-Tank Probe Probenspinner Supraleitende Magnetspule Shim-Einheit Probenkopf Die Stärke des Magnetfeldes muss während der gesamten Zeit der Messung konstant bleiben, da eine Veränderung der Feldstärke eine Veränderung der emittierten Frequenzen zur Folge hat. Es ist die Aufgabe des so genannten Locksystems das magnetische Feld bei einer bestimmten Feldstärke zu sperren. Dabei macht man sich die Frequenz des Deuteriumsignals des Lösungsmittels zunutze. Das Locksystem ist im Wesentlichen ein separates Spektrometer mit extra Lock-Sender und -Empfänger zur Beobachtung von Deuterium. Wenn die Feldstärke variiert (drift) so verändert sich die Frequenz des empfangenen Deuteriumsignals. Sie wird einige tausend Mal pro Sekunde gemessen. Das einzulockende Signal wird in Dispersionsphase beobachtet und ermöglicht so die Richtung der Feldstärkeänderung zu

3 bestimmen. Die magnetische Feldstärke wird darauf hin geeignet nachjustiert, bis die Frequenz des Deuteriumsignals wieder den Soll-Wert erreicht hat. Abstimmen des Probenkopfes (tuning und matching) Der Probenkopf ist der Teil des Spektrometers, der die Probe aufnimmt. Er übermittelt RF- Pulse an die Probe und detektiert die Signale von der Probe. Er enthält ein System zur Probenrotation sowie zur Temperaturkontrolle. Zur optimalen Übertragung der RF-Signale vom Sender zur Probe und von der Probe zum Empfänger muss der Probenkopf abgestimmt werden, das sogenannte tuning und matching. Über das tuning wird der Probenkopf so eingestellt, dass seine höchste Empfindlichkeit genau bei der erwünschten Sender- bzw. Empfängerfrequenz liegt (Resonanz). Über das matching wird sichergestellt, dass die maximale Leistung, welche an den Anschlüssen des Probenkopfes ankommt, übertragen wird (Impedanzanpassung). Shimmen Zur Maximierung der Homogenität des Magnetfeldes und damit der Signalschärfe werden Stromtragende Shim-Spulen verwendet. Durch das Einstellen einer geeigneten Stromstärke werden Zusatzfelder erzeugt, die die Homogenität des Magnetfeldes wesentlich verbessern. Das Einstellen der Ströme in den Shim-Spulen wird als shimmen bezeichnet. Aufnahmetechnik Die Puls-Fourier-Methode ermöglicht eine wesentlich höhere Akquisitionsgeschwindigkeit als die klassische cw-methode (continous wave: spektraler Bereich wird durch Frequenzsweep oder Feldsweep durchfahren). Bei einem Fourier- 1 H-Spektrum lässt man einen Hochfrequenzpuls von etwa 10 µs Länge senkrecht zur z-achse auf die Probe

4 einwirken. Dieser Puls stellt keine monochromatische Welle dar, sondern überdeckt einen Frequenzbereich von ca. ±500 khz, d.h. alle Spins mit einer Resonanzfrequenz innerhalb dieses Bereiches werden gleichzeitig angeregt. Um die Wirkung des Pulses zu verstehen ist es sinnvoll den Vorgang im rotierenden Koordinatensystem zu betrachten. Dadurch wird der Einfluss des äußeren Magnetfeldes mathematisch (!) aufgehoben und das magnetische Gesamtmoment dreht sich um das eingestrahlte Feld B 1 und zwar aus der z-richtung in die x,y-ebene. Hier Induziert es in den Empfänger-Spulen eine Spannung deren Amplitude als Funktion der Zeit registriert wird (FID: free induction decay). Außerdem ermöglicht die Puls- Fourier-Methode die Akkumulation von nacheinander gemessenen FIDs, wodurch die Empfindlichkeit der NMR-Spektroskopie erheblich gesteigert werden konnte. Im Computer werden die Daten in Form von diskreten Punkten gespeichert. Der zeitliche Abstand der Punkte durch den der spektrale Bereich gegeben ist, heißt dwell time (DW). Die dwell time ist abhängig von der spektralen Breite des Spektrums (spectral width, SW = 1/2DW). Die digitale Auflösung, die bei der Interpretation der Spektren eine große Rolle spielt, ergibt sich aus der spektralen Breite des Spektrums dividiert durch die Zahl der Digitalisierungspunkte (TD). Sie ist in der Einheit Hz angegeben. Durch Multiplikation der dwell time mit der Zahl der Digitalisierungspunkte ergibt sich weiterhin die Akquisitionszeit (AQ). Zwischen Anregungspuls und Beginn der Akquisition verwendet man einen pre scan delay (DE), der verhindert, dass Seitenbanden des Anregungspulses den FID überlagern. Nach der Anregung kehrt das magnetische Gesamtmoment wieder in die Richtung der z-achse zurück (Relaxation). Man unterscheidet zwei Zeitkonstanten der Relaxation, die longitudinale Relaxationszeit T 1 und die transversale Relaxatioszeit T 2. T 1 beschreibt die Wiederherstellung der Besetzungsverhältnisse der Spinzustände im thermischen Gleichgewicht, also den Aufbau der z-magnetisierung. T 2 dagegen beschreibt den Verlust der Phasenkohärenz und somit die Rückkehr zur Gleichverteilung der magnetischen Momente in

5 der x,y-ebene. Da sich die Messpule in der x,y-ebene befindet, kann T 1 nicht direkt gemessen werden. T 2 manifestiert sich dagegen in dem decay des FID, also in der Abnahme der x,y- Magnetisierung über die Zeit. Die Prozessierung von NMR-Daten Fourier-Transformation Aufgrund der gleichzeitigen Anregung aller Spins eines Moleküls mit der Puls-Fourier- Methode besteht der vom Computer aufgezeichnete FID aus einer Überlagerung von harmonischen Funktionen. Der FID als Funktion der Zeit kann als solches nicht interpretiert werden und muss erst durch eine mathematische Umwandlung, bekannt als Fourier- Transformation, in die Frequenzdomäne überführt werden. Die Transformation übernimmt der Computer. Bei der Umwandlung werden genaugenommen zwei Spektren erzeugt. Die Fourier- Transformation ist eine komplexe Funktion und enthält einen Real- und Imaginärteil. Jeder Anteil für sich stellt ein eigenständiges Spektrum dar und enthält genau die gleiche Information. Es ist somit auch egal welches Spektrum man sich anschaut. Eine Konsequenz folgt trotzdem aus der Transformation. Die eine Hälfte der Digitalisierungspunkte des FID steckt in dem Realanteil, die zweite Hälfte in dem Imaginäranteil. Die Fourier-Transformation halbiert somit die digitale Auflösung. Zero Filling Die Messspule zeichnet die x,y-magnetisierung in Abhängigkeit von der Zeit auf. Diese nimmt aber mit der Zeitkonstante T 2 ab, d.h. die meiste Information steckt in dem vordersten Teil des FID, der kurz nach Öffnung des Empfängers aufgezeichnet wird. Während mit fortschreitender Zeit der Gehalt an Information im FID abnimmt, bleibt das thermische Rauschen in der Messelektronik gleich. Das Signal-Rausch-Verhältnis nimmt somit ab. Es gibt einen Trick mathematisch das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, das sogenannte zero filling. Verdoppelt man die Anzahl der Datenpunkte bei der Fourier- Transformation, dann werden diese an das Ende des FID angehängt. Jeder Datenpunkt besitzt die Amplitude Null. Da bei dem zero filling dem Spektrum keine zusätzliche Information zugefügt wird, bleibt der Informationsgehalt identisch. Das Rauschen nimmt dagegen um den

6 Faktor 2 ab. Ein zweiter Effekt ist eine Erhöhung der digitalen Auflösung. Ein zero filling über den Faktor zwei hinaus bringt keine zusätzliche Verbesserung des Signal-Rausch- Verhältnises. Phasenkorrektur Phasenverschiebungen sowohl vom gesendeten als auch vom empfangenen Signal sind innerhalb der Spektrometerhardware unvermeidbar und müssen deshalb korrigiert werden. Frequenz Phase Frequenz Die Phasenkorrektur nullter Ordnung wendet dieselbe Phasenkorrektur auf das gesamte Spektrum an. Hierbei wird allen Phasenverschiebungen, die unabhängig von der Signalfrequenz auftreten können, Rechnung getragen.

7 Die Phasenkorrektur erster Ordnung wendet eine Phasenkorrektur proportional zur Signalfrequenz an. Dies ist notwendig, da Phasenverschiebungen gewöhnlich eine frequenzabhängige Komponente besitzen. Verwendung von Gewichtungsfunktionen (window functions) Gewichtungsfunktionen sind Funktionen, mit denen der FID multipliziert werden kann. Sie können bestimmte Bereiche des FID unterschiedlich gewichten. Auch die Gewichtungsfunktionen erzeugen keine neuen Informationen im Spektrum. Durch Anwendung einer Exponentialfunktion lässt sich z.b. das Rauschen im hinteren Bereich des FID, und somit auch im Spektrum, künstlich reduzieren. Ein Nebeneffekt ist ein schnellerer Abfall des FID auf Null, was dann wiederum zu einer künstlichen Linienverbreiterung führt. Als Faustregel kann man sich merken, dass eine Verbesserung des Signal-Rausch- Verhältnisses eine Verschlechterung der Auflösung nach sich zieht. Eine Verbesserung der Auflösung führt zu einer Verschlechterung des Signal-Rausch-Verhältnisses. originaler FID Gewichtungsfunktion Gewichtungsfunktion gewichteter FID gewichteter FID

8 Zum Ablauf des Praktikums Das Ziel dieses Praktikums ist es, einen Einblick über die Methode der hochauflösenden magnetischen Kernresonanzspektroskopie in Lösung zu erhalten. Es beinhaltet eine Demonstration am Spektrometer, sowie die Auswertung verschiedener ein- und zweidimensionaler NMR-Experimente. Am ersten Praktikumstag erfolgt zunächst die Demonstration eines PFT-Spektrometers. An einer Beispielprobe (Saccharose) wird der Einfluss verschiedener Messparameter auf die Spektren, die erhalten werden, vorgestellt (Digitale Auflösung, Akquisitionszeit, Homogenität des Magnetfeldes). Anschließend gibt es eine Einführung in die Interpretation von NMR- Spektren. Die Spektren von zwei Monosacchariden werden ausgewertet. Am zweiten Praktikumstag erhalten Sie einen Spektrensatz für ein Disaccharid. Die Struktur der Verbindung soll mittels 1 H-NMR sowie über homo- und heteronukleare Korrelationsspektren (H,H-COSY, TOCSY, HSQC und NOESY) ermittelt werden. Am dritten Praktikumstag folgt die Analyse eines Hexapeptids anhand eines 1 H-, TOCSYund ROESY-Spektrums. Zur Auswertung Für die Anfertigung des Protokolls ist es wichtig die Zuordnung schon während der Auswertung vernünftig mitzuschreiben. Dabei eignet es sich einerseits das 1 H-NNR-Spektrum auszudrucken und dort die Zuordnungen einzutragen. Zusätzlich kann man sich eine Tabelle anfertigen, in der die zugeordneten Signale mit den chemischen Verschiebungen und Kopplungskonstanten eingetragen werden. Weiterhin ist es sinnvoll sich die Korrelationen aus dem COSY bzw. NOESY Spektrum aufzuschreiben. Protokoll Erstellen Sie im Anschluss an das Praktikum ein Protokoll. Gehen Sie auf die folgenden Punkte ein: - Beschreiben Sie die verwendeten Experimente (kurz!). Was ist zu sehen? - Vergleichen Sie das TOCSY und das COSY-Experiment. - Diskussion der anomeren Protonen in den Glycosid-Spektren.

9 - Diskussion der Verknüpfung des Disaccharids und des Peptids. - Interpretation der Spektren nach einem der beiden vorgeschlagenen Auswerteschemata. Auswertung der NMR-Daten 1 H-NMR (500 MHz, CDCl 3, TMS): [ppm] = 5.41 (1H, d, 3 J H,H = 3.8 Hz, H-1), 4.22 (1H, d, 3 J H,H = 8.8 Hz, H-3 ), 4.05 (1H, dd, 3 J H,H = 8.6, 8.7 Hz, H-4 ), (1H, m, H-5 ), (5H, m, H-5, H-6, H-6 ), 3.76 (1H, dd, 3 J H,H = 9.6, 9.6 Hz, H-3), 3.68 (2H, s, H-1 ), 3.56 (1H, dd, 3 J H,H = 3.8, 10.0 Hz, H-2), 3.47 (1H, dd, 3 J H,H = 9.5, 9.5 Hz, H-4). s: Singulett, d: Dublett, dd: Dublett vom Dublett, m: Multiplett

10 NOESY: Alternativ kann die Auswertung in tabellarischer Form aufgeschrieben werden. Die Struktur, welche die Korrelationen aufzeigt, braucht in diesem Fall nicht gezeichnet werden: Signal 1 H Integral Mult. J H,H COSY NOESY [ppm] [Hz] H d , H dd 3.8, , 3 1, H dd 9.6, 9.6 2, H dd 9.5, 9.5 3, H m H m H s 1, H d , H dd 8.6, 8.7 3, H m 4, H m 5 4