Licht als regulatorischer Umweltfaktor

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1 Gärtner, Wolfgang Licht als regulatorischer Umweltfaktor Tätigkeitsbericht 2009/2010 C he m ie, P flanzenforschung Licht als regulatorischer Umweltfaktor Gärtner, Wolfgang Max-Planck-Institut für bioanorganische Chemie, Mülheim an der Ruhr Abteilung Biophysikalische Chemie Korrespondierender Autor gaertner@mpi-muelheim.mpg.de Zusammenfassung Licht wirkt als bedeutender regulativer Umweltfaktor; allerdings stellt insbesondere der hochenergetische blaue Spektralbereich eine Bedrohung dar, die Organismen zuverlässig detektieren und mit unterschiedlichen physiologischen Antworten verhindern müssen. Ausgehend von In-vitro -Untersuchungen, die die molekularen Reaktionen von Blaulicht (BL)-Photorezeptoren beschreiben, wird deren regulatorische Funktion für mikrobielle Communities dargestellt. Interessanterweise korreliert die Anwesenheit von BL-Photorezeptoren sowohl mit BL-induzierbaren DNA-Reparatur-Enzymen (Photolyasen) als auch mit Proteinen des Eisen-Metabolismus. Abstract Sunlight regulates many environmental processes, but in particular the high-energy blue light region represents a threat that has to be detected with high confi dence and to which organisms have to respond in an appropriate physiological manner. Based on in vitro investigations that reveal the molecular processes of blue light (BL)-sensitive photoreceptors, their regulatory function for microbial communities is outlined. Interestingly, the presence of BL photoreceptors coincides with blue light-induced photolyases that repair DNA lesions, and also with proteins involved in the iron metabolism pathway. Praktisch alles Leben auf der Erde basiert direkt oder indirekt auf dem Sonnenlicht. Neben seiner Rolle als Energiespender dient Licht auch als wichtige Informationsquelle. Entsprechend findet sich eine breite Vielfalt an Photorezeptoren [1]. Neben den Photorezeptoren der Menschen ( Tiere ), die zu den Rhodopsinen gehören, finden sich in Pflanzen die rot/dunkelrot-sensitiven Phytochrome. Zur Detektion des höherenergetischen blauen Spektralbereichs verwenden Pflanzen darüber hinaus Flavin-bindende Rezeptoren. Diese Arten von Photorezeptoren, Rhodopsine, Phytochrome und Blaulichtrezeptoren sind allerdings nicht auf höhere Lebewesen beschränkt, sondern finden sich in vielfältigen Variationen auch in Mikroorganismen. Die Funktion der Rhodopsine (und auch der Phytochrome) basiert auf einer Photoisomerisierung ihres eingelagerten Chromophors (Farbträger). Die Blaulicht(BL)-sensitiven Rezeptoren dagegen verwenden Flavin-Chromophore, die keine Photoisomerisierung, sondern eine erstaunliche Vielfalt von photochemischen Eigenschaften aufweisen. Man kennt drei Arten von BL-Photorezeptoren: die Cryptochrome, die LOV-Domänen-Proteine (LOV light, oxygen, voltage) und die BLUF-Proteine (BLUF blue light photoreceptors using FAD) [2]. In den Cryptochromen und den BLUF-Proteinen dient FAD (Flavin-Adenin-Dinukleotid) als Chromophor, während die LOV-Proteine FMN (Flavin-Mononukleotid) als Chromophor aufweisen ( Abb. 1 ). 2009/2010 Max-Planck-Gesellschaft

2 Tätigkeitsbericht 2009/2010 Gärtner, Wolfgang Licht als regulatorischer Umweltfaktor Abb. 1: (A) Chemische Strukturen biologisch wichtiger Flavinderivate und des Porphyrins. Gezeigt ist (links) die Flavingrundstruktur, die je nach Substitution des Ribitylrests als Ribofl avin (R = H), FMN (R = Phosphat) oder FAD (R = Adenosylphosphat) bezeichnet wird. Die rechte Seite gibt eine Porphyrinstruktur mit Eisen als Zentralatom wieder. (B) Dreidimensionale Struktur einer FMN-bindenden LOV-Domäne (FMN = Flavin- Mononukleotid; LOV = light, oxygen, voltage). Urheber: MPI für bioanorganische Chemie Die LOV-Domänen-Proteine bilden die häufigste Gruppe dieser Photorezeptoren; in den in Datenbanken abgelegten genomischen Sequenzen findet sich dieses Motiv in ca. 15 % aller Einträge. LOV-Proteine tragen im Dunkel(= Ruhe-)zustand ein FMN-Molekül in nicht-kovalenter Weise und weisen damit eine breite Absorption mit einem Maximum von ca. 445 nm auf. Belichtung führt in einem noch nicht vollständig verstandenen Prozess zur Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen Chromophor und Protein, wobei sich die Absorption zu kürzeren Wellenlängen verschiebt (ca. 390 nm). Dieser Zustand wird als signalgebend angesehen. Längere Inkubation im Dunklen führt dann dazu, dass sich der Ruhezustand thermisch zurückbildet, sodass eine neue Lichtabsorption eintreten kann. Die Vielfalt der BL-sensitiven Photorezeptoren gerade in den Genomen von Mikroorganismen ist auffällig. Licht dieses Wellenlängenbereichs, etwa von 400 bis 480 nm, spielt offensichtlich eine wichtige Rolle für die Physiologie von Lebewesen. Hier treffen zwei Aspekte zusammen, die beide von herausragender Bedeutung sind: Zum einen benötigen Photolyasen Enzyme, die durch UV-Licht verursachte DNA-Schäden reparieren für diese Reparaturfunktion blaues Licht, wodurch diese Lichtqualität einen attraktiven Charakter erhält. Und zum anderen aktivieren Organismen Schutzmechanismen unter Blaulicht. Interessanterweise finden sich die Gene, die für BL-Photorezeptoren kodieren, in Genomen von Mikroorganismen häufig in der Nähe von Genen, die für den Eisenstoffwechsel von Bedeutung sind und in der Tat stellt die Konzentration an verfügbarem Eisen ein wichtiges Regulativ für das Wachstum von Mikroorganismen dar ( Abb. 2 ) /2010 Max-Planck-Gesellschaft

3 Gärtner, Wolfgang Licht als regulatorischer Umweltfaktor Tätigkeitsbericht 2009/2010 Abb. 2: Algal blooming im Nordatlantik (Satellitenaufnahme). Die starke Zunahme an Mikroorganismen ließ sich beobachten, nachdem Ostwind Sand (und damit Eisen) aus der Sahara in den Atlantik transportiert hatte. (Man beachte auch die Versuche, durch Eisendüngung die Fixierung von Kohlendioxid durch Erzeugung von Biomasse zu erhöhen!). Urheber: NASA, siehe geology.com/nasa/marine-phytoplankton.shtml Diese Korrelation zwischen BL-Photorezeptoren und dem Eisenstoffwechsel erklärte die Bedrohung für Mikroorganismen durch blaues Licht und brachte, daraus folgend, eine mögliche physiologische Erklärung für die Häufigkeit der BL-Photorezeptoren: im Bereich um 450 nm absorbieren auch Porphyrine, eine chemische Verbindungsklasse, die quasi allgegenwärtig ist. Porphyrine sind in vielen essentiell wichtigen Proteinen als Kofaktoren eingebunden (Abb. 1), stellen die funktionelle Komponente in Hämoglobin und Myoglobin, sind aber auch an Prozessen des biologischen Energiestoffwechsels beteiligt, z.b. als Kofaktoren in Cytochromen. Für diese Funktionen benötigen Porphyrine ein Eisen-Zentralatom. Von besonderer Bedeutung ist, dass bei Abwesenheit dieses Eisen-Zentralatoms (bei Eisenmangel ) diese Metall-freien Porphyrine bei photochemischer Anregung in hoher Ausbeute die sogenannte Triplett-Form bilden, die bei Anwesenheit von Sauerstoff in einer chemischen Reaktion dessen hochreaktive Singulett-Sauerstoff -Form erzeugt. Singulett-Sauerstoff ist aufgrund seiner hohen Reaktivität, die zu extremen Zellschäden führen kann, lebensbedrohend, sodass die Detektion dieses Szenarios (blaues Licht + Eisenmangel) sofortige Abwehrmaßnahmen erfordert. Hierzu stehen mehrere Mechanismen zur Verfügung, da Photorezeptoren aus einer photosensitiven Domäne und einer signalgebenden Domäne mit variabler Funktionalität modular aufgebaut sind. Somit ist ein beträchtliches Repertoire an physiologischen Antworten adressierbar. So ist BL-induzierte Bewegung ( Phototaxis ) nachgewiesen, darüber hinaus BL-induzierte Bindung an DNA wie auch direkte und indirekte Regulation der Genexpression sowie die Biosynthese von Schutzpigmenten und von Substanzen, die die Ausbildung eines Biofilms induzieren. Die erste Erwähnung und funktionelle Charakterisierung eines BL-Photorezeptors vom LOV-Typ in Mikroorganismen gelang uns 2002 [3]. Entsprechend wurden erst in den letzten Jahren BL-abhängige physiologische Reaktionen in Mikroorganismen eindeutig nachgewiesen. Dies geschieht in einem zweiteiligen Ansatz, wobei sowohl das Protein selbst (in rekombinanter Form erzeugt) funktionell charakterisiert und unabhängig davon eine Deletion des Gens im Genom des Organismus durchgeführt wird, die u.u. eine physiologische oder Verhaltensänderung hervorrufen kann. Für den BL- Rezeptor YtvA aus Bacillus subtilis konnte die Entstehung und intramolekulare Weiterleitung des biologischen Signals gezeigt werden. Außerdem wurde demonstriert, dass dieses Protein, lokalisiert zusammen mit anderen Rezeptoren in einem sog. stressosome, eine Stress-Antwort auslöst, die schlussendlich zu einer Sporulierung, also zur Ausbildung einer langdauernden Überlebensform führen kann [4]. Weitere BL-Abhängigkeiten wurden für das Pathogenitätsverhalten von Brucella 2009/2010 Max-Planck-Gesellschaft

4 Tätigkeitsbericht 2009/2010 Gärtner, Wolfgang Licht als regulatorischer Umweltfaktor abortus [5] und für die Aggregierung von Zellen des Bakteriums Caulobacter crescentus gezeigt. Eine BL-induzierbare Erhöhung der Konzentration von Eisen-komplexierenden Molekülen, die von Bakterien in das umgebende Medium ausgeschüttet und nach Eisen- Einfang wieder aufgenommen werden, konnte für Pseudomonas putida gezeigt werden ( Abb. 3 ) [U. Krauss, FZ Jülich/Univ. Düsseldorf, Dissertation 2008]. Abb. 3: Konzentrationserhöhung von Eisen-komplexierenden Siderophoren in Pseudomonas putida selektiv durch blaues Licht. Siderophore zeigen eine Fluoreszenz, die hier auch zu ihrem Nachweis dient. Die bereits vorhandene Menge an Siderophoren ( Dunkel -Spektrum) wird biosynthetisch gegenüber dem Dunkelwert bei Bestrahlung mit blauem Licht mehr als verdoppelt. Bestrahlung mit rotem oder grünem Licht zeigt keinen Effekt (Dissertation U. Krauss, 2008, FZ Jülich/Univ. Düsseldorf). Urheber: MPI für bioanorganische Chemie Aufbauend auf den positiven Ergebnissen, die mit exprimierten Proteinen und mit im Labor gezogenen Bakterienkulturen erhalten wurden, führten wir Versuche durch, um auch in uncharakterisiertem Umweltmaterial BL-Photorezeptoren nachzuweisen. Eine derartige Metagenom -Analyse verwendet Nukleinsäuren oder nichtkultivierte Mikroorganismen aus beliebigen Proben aquatischen oder terrestrischen Ursprungs, um Sequenzen oder Proteinaktivitäten nachzuweisen. Diesen Versuchen liegt die Überlegung zugrunde, dass die überwältigende Mehrheit aller Organismen (>99,5 %!) auf der Erde nicht bekannt, nicht charakterisiert und wahrscheinlich auch nicht kultivierbar ist. Entsprechend wählt man einen indirekten Ansatz, die Vielfalt dieser Materialien (wenn möglich) ohne Kultivierung zu charakterisieren und so z.b. Proteine mit neuartigen Eigenschaften zu finden und zu isolieren. Hierzu führten wir eine Sequenzanalyse aller in Datenbanken abgelegten BL-Photorezeptorgene durch und selektierten daraus 149 charakteristische Sequenzen von 54 Nukleotiden Länge [6]. Die zugehörigen, chemisch synthetisierten Oligonukleotide wurden dann kovalent auf einem Glasträger fixiert. Dieser DNA-microarray wird anschließend mit Fluoreszenz-markierter Fremd-DNA inkubiert, die in unserem Fall aus einer uncharakterisierten Bodenprobe des Hamburger Botanischen Gartens extrahiert worden war. Entsprechend der Eigenschaft von DNA, komplementäre Stränge zu einem Doppelstrang zusammenzulagern, zeigt sich an den Positionen auf dem belegten Glasträger, an denen eine komplementäre DNA an ein fixiertes Oligonukleotid gebunden hat, eine Fluoreszenz, die dann aufgrund der bekannten Position auf dem Glasträger einem bekannten Gen zugeordnet werden kann. Im Experiment führte ein positiver Treffer zu einem neuartigen Blaulichtphotorezeptor mit einer typischen Domänenstruktur, in der die Licht-detektierende Domäne mit einer Enzymaktivität (Histidinkinase) gekoppelt ist ( Abb. 4 ; [6]) /2010 Max-Planck-Gesellschaft

5 Gärtner, Wolfgang Licht als regulatorischer Umweltfaktor Tätigkeitsbericht 2009/2010 Abb. 4: Flussschema zur Erzeugung und zum Nachweis von BL-Photorezeptorgenen aus Bodenproben: Aus Umweltproben wird DNA-Material isoliert und mit einem Fluoreszenz-Marker versehen. Die so modifi zierte DNA wird mit Oligonukleotiden, die kovalent auf einem Glasträger fi xiert sind ( microarray ) zur Hybridisierung gebracht. An Positionen auf dem Glasträger, an denen es zu einer Doppelstrangbildung kommt, verbleibt die Fluoreszenz auf dem Träger. Anhand des erhaltenen Signals kann mittels der Sequenz des Oligonukleotids an dieser Position die Gesamt-Gensequenz aus dem Umweltmaterial bestimmt werden. Dieses Gen wird dann in Escherichia coli heterolog exprimiert und das erhaltene rekombinante Protein funktionell charakterisiert (nach Pathak et al., 2009 [6]). Urheber: MPI für bioanorganische Chemie Es konnte ebenfalls der nächste Nachbar aus der Datenbank mit einer fast gleichartigen Domänenstruktur identifiziert werden (A2SIR0 Methylibium petroleiphilum PM1). In einem weitergehenden Schritt wurde dieses per microarray identifizierte Gen in Escherichia coli heterolog exprimiert und ergab einen funktionellen Blaulichtphotorezeptor. Weitere positive Nachweise gelangen mit Proben aus dem Ufergebiet der Elbe, aber auch mit Material aus so exotischen Habitaten wie Gebirgsseen der Argentinischen Anden (PICT-Programm und zentrale Mittel der MPG). Ein derartiger Ansatz ist für unterschiedlichste Zielsequenzen durchführbar. Wir setzen diese Methodik gegenwärtig u.a. auch für die Suche nach Hydrogenasen aus Meeresboden-Proben durch. Diese Proben entstammen Bereichen vulkanischen Ursprungs und weisen eine große Anzahl exotischer DNA (= Organismen) auf, sodass im Verlauf dieser Untersuchungen Proteine und Enzyme mit neuartigen Funktionsweisen zu erwarten sind. Die Genomanalyse eröffnet einen Arbeitsbereich, dessen Gehalt an unbekannten Eigenschaften und Funktionen gegenwärtig nicht im Geringsten abschätzbar ist, für den aber auf der Basis bisher erbrachter Ergebnisse umfangreiche neuartige Proteine und Proteinfunktionen erwartet werden können. 2009/2010 Max-Planck-Gesellschaft

6 Tätigkeitsbericht 2009/2010 Gärtner, Wolfgang Licht als regulatorischer Umweltfaktor Literaturhinweise [1] W. R. Briggs, J. L. Spudich (Eds.): Handbook of Photosensory Receptors. Wiley-VCH, Weinheim 2005, 473 p. [2] A. Losi: Flavin-based blue-light photosensors: a photobiophysics update. Photochemistry and Photobiology 83, (2007). [3] A. Losi, E. Polverini, B. Quest, W. Gärtner: First evidence for phototropin-like blue-light receptors in prokaryotes. Biophysical Journal 82, (2002). [4] T. A. Gaidenko, T. J. Kim, A. L. Weigel, M. S. Brody, C. W. Price: The blue-light receptor YtvA acts in the environmental stress signaling pathway of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology 188, (2006). [5] T. E. Swartz, T.-S. Tseng, M. A. Frederickson, G. Paris, D. J. Comerci, G. Rajashekara, J.-G. Kim, M. B. Mudgett, G. A. Splitter, R. A. Ugalde, F. A. Goldbaum, W. R. Briggs, R. A. Bogomolni: Blue light-activated histidine kinases: two-component sensors in bacteria. Science 317, (2007). [6] G. Pathak, A. Ehrenreich, A. Losi, W. R. Streit, W. Gärtner: Novel blue light-sensitive proteins from a metagenomic approach. Environmental Microbiology 11, (2009). Drittmittelfinanzierung DFG Forschergruppe /2010 Max-Planck-Gesellschaft