Sequenzanalyse des Humangenoms. Stand & Perspektiven
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- Eugen Linden
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1 Sequenzanalyse des Humangenoms Stand & Perspektiven
2 Genetische Eukaryonten-Autobahn Zahl & Zustand der Fahrstreifen Yeast Human S. cerevisiae H. sapiens Worm C. elegans Fly Fish D. melanogaster F. rubripes Mouse M. musculus
3 Human-Genom-Projekt Ziele Hochauflösende Kartierung des Genoms Vollständige Sequenzierung aller Chromosomen Identifikation aller Gene Technologie-Entwicklung Analyse von Modellorganismen Untersuchung der ethisch & sozialen Konsequenzen
4 Sequenzierung des Human-Genoms Herausforderungen Größe 25x größer als bisher größtes sequenziertes Genom 8x größer als alles bisher Sequenzierte Gehalt an sich wiederholenden Sequenzen erstes wiederholungsreiches Genom, ca.40% erwartet Ackerschmalwand 11%, Fadenwurm 7%, Fruchtfliege 3% Medizinische Relevanz gesellschaftliche und persönliche Konsequenzen, ethische Brisanz Internationales Konsortium 20 Zentren aus 6 Ländern privatwirtschaftliche Konkurrenz von 15% auf 90% in 15 Monaten (Februar 99 - Juni 2000)
5 Sequenzierung des Human-Genoms Meilensteine Oktober 1990 April Jahresplan NIH/DOE NIH/Welcome: Rohfassung bis Frühjahr 2000 Februar 1995 Sulston/Waterson Plan bis Zentren á 85,000 Sequenzen/Woche; 5 Jahre; 99,9% Genauigkeit Februar 1996 Selbstverpflichtung zur unverzüglichen Datenfreigabe G5-Initiative Dezember 1999/ Mai 2000 Veröffentlichungen der ersten Chromosomen Chr 22: GB/Japan/USA; Chr 21: Japan/ Deutschland Juni 2000 IHGSC/Celera Abschluß der Rohdatensammlung "Bermuda" Regeln Pressekonferenz Clinton & Blair Mai 1996 Februar 2001 Venter/Smith/Hood BAC-End-Sequenzierung BACs, Sequenzen, ein STC/5kb bis 1999 April 1998 Venter/Hunkapiller genomweite "shotgun"-bis ABI3700 á 1000 Seq/Tag 1. Jahr: Drosophila, 2./3. Jahr: Mensch Publikationen der Rohfassung Nature/IHGSC & Science/Celera April Jahre Doppel-Helix Watson & Crick Oktober 1998 Oktober 2004 NIH/DOE: 5-Jahresplan zur Fertigstellung bis 2003 abschließende Genom-Publikation Rohfassung zum Ende 2001, vollständig fertig bis 2003 Nature
6 Sequenzierung des Human-Genoms Phasen Selbstverpflichtung zur Datenfreigabe Privatwirtschaftliche Konkurrenz Sequenz (Mb) 5000 Rohfassungssequenzen finale Sequenzen 1000 Phasen: Pilot-Phase Produktion Jul 04 Jan 04 Jul 03 Jan 03 Jul 02 Jan 02 Jul 01 Jan 01 Jul 00 Jan 00 Jul 99 Jan 99 Jul 98 Jan 98 Jul 97 Jan 97 Jul 96 Jan 96 0 Fertigstellung Pressekonferenzen: 26. Juni 2000 Abschluß der Produktionsphase 12. Februar April Oktobr 2004 Veröffentlichung der ersten Analyse Veröffentlichung zum Fertigstellen Abschluss der Sequenzierung
7 Sequenzierung des Human-Genoms Beiträge der Teilnehmer May 2000 March 2005 Human Sequence % January X 8 IHGSC (2001), Nature 409: 860
8 Fertigstellen des Human-Genoms Beiträge der nationalen Genomprojekte 62,3% 25,1% 5,5% USA GB Japan 2,7% Frankreich 2,5% Deutschl 1,0% China
9 Sequenzierung des Human-Genoms Publikationen der Rohfassung 2001 Internationales akademisches Konsortium Privates Unternehmen Celera
10 Schrotschuß-Strategien hierarchisch vs. gesamt-genomisch Teile Puzzle Teile
11 Human Genome Working Draft versions February 2001 Academic Private Initial Sequencing & Analysis The Sequence of 2.72 Gb Sequenced Bases 2.65 Gb 1,000 Clone gaps 54, ,000 Sequence gaps 116, Gaps 170,000 overall coverage: quality of unfinished data : 94% < 1 error/10kb in 91% human population heterogeneity: variation between two individuals: 1 SNP/kb 1 SNP/10kb
12 Analyse der Human-Genom-Rohfassung Besonderheiten Gene erwartet Ackerschmalwand , Fadenwurm , Fruchtfliege komplexere Transkription 60% aller Gene; mrnas/gen: Chr22=2,6, Chr19=3,2 Fadenwurm: 22% aller Gene; 1,3 mrnas/gen komplexere Proteinarchitektur ungleichmäßige Genverteilung 25% des Genoms sind "genlose Wüste" Gegensatz zu Ackerschmalwand, Fadenwurm, Fruchtfliege 50% repetitive Sequenzen Ackerschmalwand 11%, Fadenwurm 7%, Fruchtfliege 3% "fossiles Archiv" der genomischen Evolution dramatische Reduktion der Akkumulation in den letzten 50 MioJ SINEs als Symbionten von Genen (Chr19=57%) keine Neuen Domänen, "Auflaufen" (accretion) zusätzlicher Domänen an den Gen-Enden Mutationsraten Frau:Mann 1:2 Gentransfer von Prokaryonten ungleichmäßige SNP-Verteilung 233 Gene mit Ähnlichkeit nur zu Prokaryonten davon 133 bei Prokaryoten weit verbreitet Vergleich X und Y Chr 63% aller 5kb-Fragmente enthalten SNP(s) interindividueller Unterschied 0.01% IHSC (2001), Nature 409: 860
13 Fertigstellen des Human-Genoms Nature, 21. Oktober 2004
14 Human Genome Final version October 2004 Academic Initial Seq Private Finishing the euchromatic sequence The Sequence of 2.72 Gb 2.85 Gb Sequenced Bases 2.65 Gb 1, Clone gaps 54, , Sequence gaps 116, Gaps 170,000 near-complete sequence: extremely high quality: 99% of euchromatin < 1 error/100kb
15 Analyse des fast vollständigen Human-Genoms Besonderheiten fast vollständige Sequenz 2,85 Mb, 99% des Euchromatins Gene erwartet genreich, fast alle Lebensprozesse Pflanze , Wurm ,Fliege nur noch 341 Lücken verbesserte Gen-Vorhersagen 33 heterochromatisch (Centromere) 308 euchromatisch (28 Mb), 50% mit segmentalen Duplikationen 58% aller Gene der Rohfassung waren fehlerbehaftet neue & verlässliche Analysen extrem hohe Genauigkeit % ein Fehler auf Bausteine Pseudogene neue entstandene Gene Geruchsrezeptoren, Immunität, Schwangerschaft 37 kürzlich gestorbene Gene 10 Geruchsrezeptoren
16 Segmental Duplications Problems of the human reference sequence ~50% of the 273 interior euchromatic gaps located in segmentally duplicated regions
17 Segmental Duplication Definition genomic regions >1kb with nt identity >90% Human genome 5.3% segmentally duplicated 87% of all segmental duplications >50 kb
18 Segmental Tandem Duplications Assembly problems allele 1 id. 99% locus A locus B id. 99% allele 2 alignment locus A locus B locus A
19 Segmental Tandem Duplications Assembly problems allele 1 id. 99% locus A locus B id. 99% allele 2 alignment locus A locus B locus A locus B
20 Segmental Tandem Duplications Assembly problems allele 1 id. 99% locus A locus B id. 99% allele 2 alignment locus A locus B locus A locus B gap
21 DEF cluster at 8p23.1 hg16: Mb chr 8 DEF b1 gap gap DEF b3 gap DEF a gap Repeat clusters DEF b2 360 kb DEF b4 DEF b5 p B1 B B B B1 A6 A4 B A110T110 1A0 3 A5 B B nb n = B1 B1 B1 B DEF b6 additional copies B B 08 09p 1 B B1 Taudien et al., BMC Genomics 5:92 (2004)
22 Genomic variability of 8p23.1 DEF locus Hypothetical organisation Taudien et al., BMC Genomics 5:92 (2004)
23 Defensine (DEF) Multiple Funktionen Immunität & Krebs genetische Assoziation mit CED 2007, Psoriasis 2008, Prostata-Karzinom 2008 Yang et al., Cell. Mol. Life Sci. 58,
24 Complex phenotypes / diseases Structural variations Chr kb inversion polymorphism & female fertility and recombination rates in humans Nat Genet 37:129 (2005) CCL3L1 copy number & AIDS susceptibility in humans Science 307:1434 (2005) FCGR3 copy number & glomerulonephritis in humans and rats Nature 439:851 (2006)
25 Segmental duplications Complex SNP-related variations DEF cluster on 8p23.1: ~6/kb in dbsnp /temporarily Fredman et al., Nat Genet 36, 861 (2004)
26 Copy number variation (CNV) Detection by DNA microarrays Mio data points comparative hybridization vs. a reference Lee et al., Nat Genet Suppl 39:s48 (2007)
27 Completing the map of human genetic variation Mapping structural variations Eichler et al., Nature 447:161 (2007)
28 Humangenom-Dynamik Zusammenfassung Chromosom A Chromosom B Inversion InDel Allel-Variation Kombination
29 Humangenom-Dynamik Patchwork people? News Feature, Nature 437:1084 (2005)
30 Genetische Variation Zusammenfassung Genomes of any two individuals in the human population differ more at the structural level than at the nucleotide sequence level. Differences between individuals CNV: >4 Mb >1/800 bp > 0.12 % SNP: 2.5 Mb 1/1,200 bp 0.08 % Sebat, Nat Gen Suppl 39:s3 2007
31 Gene und Krankheit monogene - polygene - multifaktorielle Erkrankungen Relatives Erkrankungsrisiko für Geschwister (λs) 750 Mukoviszidose We used to think our fate was in our stars. Now we know, in large measure, our fate is in our genes James Watson, chronisch-entzündliche Darmerkrankungen multiple Sklerose 20 Schizophrenie 10 Psoriasis Diabetes Typ I 5 Asthma 2,5 Bluthochdruck
32 Krankheitsgene klassische Positionsklonierung WWW. Kopplungsanalyse Physische Kartierung in betroffenen Familien der Region Identifikation aller Gene Mutationsanalyse von Kandidatengenen in Betroffenen und Kontrollen
33 Polygene Erkrankungen CED: Chromosom 10, DLG5 1. initiale Kopplungsanalyse mit Mikrosatelliten 2. Feinkartierung mit weiteren Mikrosatelliten 3. Feinstkartierung mit SNPs 4. Assoziation mit SNPs im DLG5 5. Identifizierung von 2 proteinverändernden SNPs
34 Krankheitsgene Aufklärungsrate Anzahl identifizierter Krankheitsgene
35 GenomWeite AssoziationsStudien GWAS Mathew. Nat Rev Genet 9:9 2008
36 GWAS prerequisites High-throughput array-based genotyping Affymetrix Human SNP Array 6.0 >1.8 million markers 906,600 SNPs 946,000 for CNVs Illumina Human 660W-Quad BeadChip 2.6 million markers / four samples 550,000 tag SNPs 100,000 for CNVs 5,000 common CNVs
37 Genetic variation Terminology Haplotype = set/region physically linked polymorphism chromosomes major haplotypes 21 SNPs kb * * *...AGCTT...CCAAA...TCACC......AGGTT...CCAAA...TCACC......AGGTT...CCAAA...TCGCC......AGGTT...CCGAA...TCGCC... TGATTGTTACAACACTTTACC AGGTCGCTCGAAAATCTAACC AGGCTATTCGAGAGCCTAGGT AAGTTACCCGGGAGCCCAGCC
38 GWAS prerequisites Haplotype maps TIHC. Nature 449:
39 GWAS prerequisites HapMap Project 270 individuals from 4 geographically diverse populations: YRI Africans: 30 trios (Yoruba in Ibadan, Nigeria) CEU European: 30 trios of northern/western ancestry (Utah, US; CEPH collection) CHB Chinese: 45 unrelated Han individuals (Beijing, China) JPT Japanese: 45 unrelated individuals (Tokyo, Japan) 3.1 million human SNPs genotyped ~25 35% of common SNP variation in the populations surveyed TIHC. Nature 449:
40 GWAS prerequisites Haplotype blocks Olsson et al. Arthritis Res & Ther 9:r
41 GWAS prerequisites Haplotype blocks Africans Europeans Asians TIHC. Nature 437:
42 Genetic variation Terminology Haplotype = set/region physically linked polymorphism chromosomes major haplotypes 21 SNPs kb tag SNPs * * *...AGCTT...CCAAA...TCACC......AGGTT...CCAAA...TCACC......AGGTT...CCAAA...TCGCC......AGGTT...CCGAA...TCGCC... TGATTGTTACAACACTTTACC AGGTCGCTCGAAAATCTAACC AGGCTATTCGAGAGCCTAGGT AAGTTACCCGGGAGCCCAGCC T/C A/G TA CA TG CG tag haplotypes
43 GWAS prerequisites HapMap Project Conclusions HapMap is estimated to capture the 65-75% untyped common SNPs with a likelihood of 90-96% depending on population. Current generation of commercial genome-wide genotyping products captures 3.1 million HapMap SNPs with 80% in African and up to 95% in non-african populations. TIHC. Nature 449:
44 GWAS prerequisites Large, well-phenotyped study groups WTCCC Wellcome Trust Case Control Consortium (GB) 17,000 samples 2,000 from each of seven diseases type 1 diabetes, type 2 diabetes, coronary heart disease, hypertension, bipolar disorder, rheumatoid arthritis, Crohn's disease 3,000 controls also from England, Scotland and Wales KORA Kooperative Gesundheitsforschung in der Region Augsburg 20,000 samples since 1985 coronary heart disease POPGEN Schleswig- holstein Biobank für eine Medizin der Zukunft since 2003 aiming at 30,000 controls + study groups for: aging 3,000 centenarians diseases inflammation, heart, cancer, nervous system
45 GWAS Schema Mathew. Nat Rev Genet 9:9 2008
46 GWAS Alternative designs Kruglyak. Nat Rev Genet 9:
47 GWAS Statistical design & follow-up Kronenberg. Exp Geront 43:
48 GWAS Current stage carried-out GWAS: 180 within last 12 month: 100 Identified many novel genes involved in complex diseases. Some genes are associated with several phenotypes.
49 DNA-Microarray-(Chip)Technologie Genotypisierung & Expressionsanalyse Genomische DNA Hybridisierung mrna cdna-synthese reverse Transkription Vervielfältigung (PCR) Markierung cdna Fragmente Analyse Vervielfältigung (PCR) Markierung Fragmente
50 DNA-Microarray-(Chip)Technologie Genexpression in Diagnostik & Therapie Patientenprobe sonde sonde sonde sonde sonde sonde Patientenmuster 06 sonde sonde sonde sonde sonde sonde sonde sonde sonde sonde sonde sonde sonde sonde sonde sonde sonde sonde sonde sonde sonde sonde sonde sonde sonde sonde sonde sonde sonde sonde 51 gesund Krankheit A Krankheit B Krankheit C Mustervergleich Diagnose Identifizierung von Zielgenen für Therapie, Verlaufskontrolle
51 Pharmakogenetik Problem Therapieerfolg Therapie, ohne Erfolg keine Therapie Nebenwirkungen oder andere Form
52 Pharmakogenetik Mechanismen variabler Arzneimittelwirkungen spricht an spricht nicht an spricht nicht an oder toxische Nebenwirkungen Gen im Wirkmechanismus des Arzneimittels Gen im Transport Arzneimittelmetabolismus Rezeptor
53 Pharmakogenetik Zytochrom P450 AmpliChip von Roche CYP2D6 Bestimmung der Allele von 2 Zytochrom P450 Genen MR Debrisoquine/4-Hydroxydebrisoquine erforderliche Dosis Nortriptylin (mg/tag) Berechnung der individuellen optimalen Arzneimitteldosis
54 Individualisierte Medizin Nutzen & Risiken Pharmaka für Subpopulationen (Genotypen) optimale Dosis - geringe Nebenwirkungen Einengung der Pharmamärkte Benachteiligung von Trägern seltener Genotypen
55 HGP: Was bleibt zu tun? Grundlagenforschung Funktionsanalyse aller Gene Identifizierung von Krankheitsgenen Vergleichende [Epi-]Genomik zwischen Spezies Sequenzierung von weiteren Modell-Genomen zwischen Populationen Variabilität - Internationales Projekt HGDiversityP zwischen Individuen Variabilität - Internationales Projekt HapMap zwischen Zellen/Geweben Bedeutung der 5. Base mc für Differenzierung & Krankheiten-Human Epigenom Project Technologieentwicklung Sequenzierung & Typisierung
56 HGP: Was bleibt zu tun? Anwendungsforschung Testentwicklung & Validierung genbezogen krankheitsbezogen genomweit Technologietransfer Sequenzierung & Typisierung in der ärztlichen & klinischen Routine
57 HGP: Was bleibt zu tun? Gesellschaftlicher Rahmen & Konsens Recht auf Nichtwissen Recht auf Nichtinformiertheit Recht auf Wissen, dessen Datenschutz und Finanzierung Verhinderung genetischer Fremdbestimmung
58 Ausblick Nature 21. Oktober 2004
59 Genetische Säuger-Autobahn Perspektiven Mouse Human M. musculus H. sapiens Rat R. norvegicus Pig Rhesus S. scofa M. mulatta Cimpanzee P. troglodytes
60 genome.fli-leibniz.de Teaching
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