Praktikum Medizinische Mikrobiologie für Zahnmediziner

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1 Praktikum Medizinische Mikrobiologie für Zahnmediziner Friedrich Loeffler Institut für Medizinische Mikrobiologie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald (Direktor: Prof. Dr. med. Ivo Steinmetz) Sommersemester 2012 Terminplan : Uhr Kurstag : Uhr Kurstag : Uhr Kurstag : Uhr Kurstag : Uhr Abschluss-Klausur (MC)

2 2 Praktikumsordnung Das Praktikum besteht aus seminaristischer Einführung in die vorgegebenen Themen und zugehörigen praktischen Übungen. Dazu wird eine Anwesenheitskontrolle durchgeführt. Regeln für den Ablauf des Praktikums: 1. Während des Praktikums ist das Tragen von weißen Schutzkitteln Pflicht. Diese werden dem Kursteilnehmer vom Institut zur Verfügung gestellt. Nach Beendigung jeder Übung werden sie am zugewiesenen Ort aufbewahrt. Nach Abschluss des gesamten Kurses werden die Kittel gewaschen. 2. Rauchen, Essen und Trinken sind im Praktikumsraum streng untersagt. Infektionsgefahr! 3. Entstandene Kontaminationen von Personen (Mund, Gesicht, Augen oder Hände) bzw. Kontaminationen von Sachen (Kleidung oder Arbeitsplatz) nicht verheimlichen, sondern sofort melden, damit geeignete Maßnahmen (Desinfektion und Erste Hilfe ) ergriffen werden können. 4. Nach Beendigung der Arbeiten sind die Arbeitsplätze aufgeräumt zu verlassen. Die zur Verfügung gestellten Geräte, insbesondere die Mikroskope, und die Materialien sind pfleglich zu behandeln. Für fahrlässige Beschädigungen hat der Verursacher finanziell aufzukommen. 5. Bei Bedarf, aber immer vor Verlassen des Praktikumsraumes sind die Hände gründlich zu desinfizieren. Dazu lässt man etwa 3 ml Desinfektionsmittel aus den Spendern neben der Wascheinheit im Kurssaal in die Handfläche laufen. Anschließend erfolgt eine Einwirkzeit über 30 Sekunden. Während dieser Zeit werden im Wechsel Handfläche und Handrücken der beiden Hände, Finger und Fingerkuppen mit dem Desinfektionsmittel eingerieben. Grundausrüstung auf den Arbeitsplätzen: - Mikroskop mit 3 Objektiven. Objektiv Achromat 100/1,25 Oil darf nur mit Immersionsöl benutzt werden. Nach Gebrauch Objektive mit weichem Lappen reinigen! Achten Sie bitte darauf, dass die übrigen Objektive nicht mit Immersionsöl verschmutzt werden. - Immersionsöl - Objektträger und Deckgläschen - physiologische NaCl-Lösung (0,9%) in Ampullen - Impfösen (für Einmalgebrauch: zur Entsorgung sofort nach Gebrauch in die gelben Abfallbehälter geben) - Pinzette - Filterpapier zum Trocknen der Präparate - Bleistift - Glasschreiber - Gefäße zum Entsorgen infizierter Materialien einschließlich gebrauchter Präparate. Die Färbebank mit den benötigten Utensilien befindet sich über einer Abflusswanne. Bitte nur an den bezeichneten Plätzen Färbungen ausführen! Der Direktor Greifswald, November

3 KURSTAG Bearbeiten einer Bakterien-Bouillon Jede Arbeitsgruppe (AG) impft Material aus einer Bouillon auf Blutagar aus: Dazu wird mit einer grünen Impföse (1µl) ein fraktionierter 3-Ösenausstrich vorgenommen. Die Kulturen werden bei 37 C inkubiert; Auswertung am Kurstag Differenzierung von grampositiven Kokken (s. auch Anhang) Vergleichen Sie in den vorliegenden Grampräparaten die Mikromorphologie von Staphylokokken und Streptokokken. 2.1 Staphylokokken Beurteilen Sie die Koloniemorphologie und das Hämolyseverhalten der vorbereiteten Reinkulturen von Staphylococcus aureus und S. epidermidis. Führen Sie bei beiden Kulturen den Katalase- und Plasmakoagulase-Test durch. Werten Sie außerdem die Novobiocin-Empfindlichkeit der Koagulase negativen Staphylokokken auf den vorbereiteten Platten aus. S. aureus Spezies S. epidermidis Haemolyse Katalase Plasmakoagulase Novobiocin- Empfindlichkeit - S.saprophyticus- Gruppe Kolonie- Farbe 2.2 Streptokokken Die Einteilung von Streptokokken erfolgt aufgrund ihres Hämolysevermögens sowie der gruppenspezifischen Kohlenhydrat-Antigene der Zellwand (C-Substanz). Beurteilen Sie die vorbereiteten Streptokokken-Kulturen nach ihrem Hämolyseverhalten. Was bedeuten α, ß und γ- Hämolyse? Hämolyse-Typ Merkmal Gruppe Stamm-Nr. α-hämolyse Abbau des Hämoglobins (Vergrünung) vergrünende Streptokokken Pneumokokken Enterokokken ß-Hämolyse Erythrozyten sind vollständig pyogene Streptokokken keine Hämolyse ( γ-hämolyse ) lysiert (klarer Hof) kein Hämolysehof nicht-hämolysierende Streptokokken 3

4 4 2.3 Enterokokken Beurteilen Sie das Wachstum und Koloniemorphologie von Enterococcus faecalis und Enterococcus faecium auf Blut- und Tellurit-Agar. Führen Sie außerdem den Katalase-Test durch. Spezies Katalase Merkmale auf Blutagar (Hämolyse, Geruch) E. faecalis Wachstum auf Tellurit-Agar E. faecium 3. Meningitiserreger 3.1 Streptococcus pneumoniae Beurteilen Sie die Morphologie von Streptococcus pneumoniae. Welche Auffälligkeit stellen Sie im Vergleich zu den oralen vergrünenden Streptokokken fest? Werten Sie den Optochin-Test zur Differenzierung von S. pneumoniae aus. Mikroskopieren Sie das Fertigpräparat von Streptococcus pneumoniae. 3.2 Neisseria meningitidis Beurteilen Sie das Gramverhalten und die Mikro-Morphologie von N. meningitidis im vorgefertigten Präparat sowie die Koloniemorphologie auf Blutagar. Wo kommt der Erreger physiologischerweise vor? Wie findet die Übertragung statt? 3.3 Haemophilus influenza Beurteilen Sie das Gramverhalten und die Mikro-Morphologie von H. influenza im vorgefertigten Präparat sowie die Koloniemorphologie auf Blutagar. Welche charakteristischen Wachstumseigenschaften zeichnen den Erreger aus? Wo kommt der Erreger physiologischerweise vor? Wie findet die Übertragung statt? 4. Desinfektionsverfahren 4.1 Händedesinfektionsversuch Vergleichen Sie verschiedene Möglichkeiten zur Keimreduktion (waschen mit Wasser, desinfizieren mit alkoholhaltiger Lösung). Legen Sie die Fingerkuppen der rechten Hand nach folgendem Schema auf eine Petrischale mit Nähr-Agar: a) Auflegen der Tageshand *vor, *nach dem Reinigen / Desinfizieren. b) Kontaminieren der Fingerkuppen mit Bakterien aus einer Kultur von E. coli. Auflegen der Fingerkuppe auf den Nährboden *vor, *nach dem Reinigen / Desinfizieren Inkubation: 24 h 37 C und Auswertung im Kurstag 2. 4

5 5 4.2 Nachweis desinfizierender Wirkung von H 2 O 2 Reiben Sie einige Kolonien der vorbereiteten Blutplatte in ein Röhrchen mit 5 ml NaCl-Lösung und stellen Sie die optische Dichte auf McFarland 1 ein. Geben Sie mit einer blauen Impföse jeweils 10 µl in die vorbereiteten Röhrchen mit verschiedenen Konzentrationen H 2 O 2 bzw. reiner NaCl-Lösung. Nach der vorgegebenen Einwirkzeit entnehmen Sie mit einer grünen Impföse 1µl Flüssigkeit aus jedem Röhrchen und beimpfen damit 1/4 einer Blutplatte. Beschriften Sie Ihre Platten mit der Konzentration und der Einwirkzeit (Schema s. Arbeitsplatz). Inkubation: 24 h 37 C und Auswertung im Kurs Resistenztestung mittels Agardiffusionstest Beimpfen Sie mit einem Wattetupfer eine Platte Mueller-Hinton-Agar mit verschiedenen Testkeimen (vorbereitete Nährboullion). Notieren Sie den zu testenden Keim auf ihrer Platte. Anschließend werden die Testblättchen aufgebracht. Inkubation: 24 h 37 C und Auswertung im Kurstag 2. 5

6 6 Zu 1.: Auswerten der Bakterien-Bouillon KURSTAG 2 Beurteilen Sie Morphologie, Farbe und Größe der angewachsenen Bakterien. Führen Sie zusätzlich verschiedene biochemische Tests (Katalse etc.) durch, um die Keime zu identifizieren. Zu 4.: Auswertung Desinfektionsversuche 4.1 Händedesinfektion Beurteilen Sie die Anzahl der Bakterienkolonien vor und nach der Desinfektion bzw. Waschen der Hände. Wovon hängt die Wirksamkeit bei Desinfektionsmaßnahmen ab? 4.2 H 2 O 2 Desinfektion - Auswertung Beurteilen Sie die Desinfektionswirkung von H 2 O 2 anhand des Wachstums der Testkeime. Konzentration Einwirkzeit 1 min 5 min 0 % (Kontrolle) 1,5 % 3 % 5 % Zu 5.: Resistenztestung mittels Agardiffusionstest Auswertung der Resistenzbestimmung (Erläuterung s. Anhang) Keim sensibel (s) Bewertungskriterien (mm Durchmesser) intermediär sensibel (i) resistent (r) Penicillin (P); 10 I.E Ampicillin/Sulbactam (SAM) µg Cefuroxim (CXM); 30µg Gentamicin (GM); 10µg Ciprofloxacin (CIP); 5µg Imipenem (IMP);10µg gemessener Hemmhof Durchmesser (mm) Bewertung 6

7 7 6. Gramnegative Stäbchen: Enterobacteriaceae und Non-Fermenter 6.1 Kulturelle Anzucht und Beurteilung verschiedener gramnegativer Stäbchen Beurteilen Sie die gewachsenen Kulturen von E. coli, Klebsiella, Proteus mirabilis und Pseudomonas aeruginosa auf Blutagar und MacConkey-Agar. Welche biochemische Leistung zeigen rote und gelbe Kolonien auf MacConkey-Agar an? Welche Bedeutung hat dies für die Beurteilung der gewachsenen Keime? 6.2 Oxidase-Test zur Differenzierung gramnegativer Stäbchen Testen Sie die Ihnen vorliegenden gramnegativen Stäbchen auf das Vorhandensein der Cytochrom- Oxidase mittels Oxidase-Teststreifen. Welche Rolle spielt dieser Test für die Differenzierung gramnegativer Stäbchen? 6.3 Speziesdifferenzierung bei gramnegativen Stäbchen Zur Unterscheidung von gramnegativen Stäbchen auf Speziesebene werden unterschiedliche Testsysteme wie beispielsweise eine sog. Bunte Reihe oder API-Teststreifen verwendet. Differenzieren Sie die Ihnen vorgegebenen Keime mit Hilfe der Bunten Reihe. (s. Anhang) 7. Untersuchung der Karies-Aktivität durch quantitative Bestimmung der Lactobacillus-Keimzahlen im Speichel Durchführung des Tests: - Lassen Sie etwas Kauspeichel in eine Petrischale fließen µl Speichel in 1800 µl NaCl-Lösung verdünnen (1:10). - Von dieser Suspension jeweils 500 µl und 1000 µl in eine neue Petrischale pipettieren ml flüssigen und auf 45 C abgekühlten Rogosa-Agar zugießen und durch Schwenken der Petrischale mischen. Fest werden lassen. - Auswertung erfolgt im Kurstag Abnahme und Untersuchung von Material aus der Mundhöhle 8.1 Rachenabstrich Kulturelle Anlage eines Rachenabstriches Entnehmen Sie sich gegenseitig mit Abstrichtupfer Material aus dem Rachenraum und streichen dieses auf Blutagar fraktioniert aus. Die Inkubation erfolgt mikroaerophil (5% CO 2 ) bei 37 C. Auswertung im Kurs Mikroskopieren eines Rachenabstriches Entnehmen Sie mit einem zweiten sterilen Tupfer ausreichend Material aus dem Rachenraum und bringen Sie es auf einen Objektträger, auf dem Sie einen Tropfen NaCl-Lösung vorgelegt haben. Anschließend lufttrocknen und fixieren. Färben Sie den Abstrich nach GRAM und mikroskopieren Sie das Präparat. Welche Strukturen erkennen Sie? 7

8 8 8.2 Zungen-Abstrich Entnehmen Sie sich mit einem Tupfer gegenseitig einen Abstrich vom hinteren Zungengrund (möglichst ohne die Uvula zu berühren) und fertigen Sie ein Präparat an. Beschriften Sie dieses und lassen Sie es auf dem Arbeitsplatz liegen (Gramfärbung durch Kurs-MTA). Auswertung im Kurstag Gingiva-Abstrich Entnehmen Sie sich gegenseitig jeweils zwei Abstriche an der Gingiva, dabei möglichst weit hinten in der Mundhöhle (evt. an der Zahntasche) Material entnehmen. 1. Abstrich: auf Colombia-Blutagar ausstreichen. Bebrütung erfolgt aerob. 2. Abstrich: auf Schaedler-Blutagar ausstreichen: Bebrütung erfolgt anaerob. Inkubation erfolgt bei 37 C für mehrere Tage. Auswertung in Kurstag 3. 8

9 9 KURSTAG 3 Zu 7. Auswertung des Lactobacillus-Nachweises / Karies Aktivität Werten Sie die Rogosa-Platten von Kurstag 2 wie folgt aus: - Zählen Sie die im Agar wachsenden Kolonien und berechnen Sie die Keimzahl pro 1 ml Speichel o Bei 0,5 ml Speichel: x * 2 * 10 o Bei 1 ml Speichel: x * 10 = Keimzahl pro ml Speichel - Bewerten Sie das Kariesrisiko (nach Loesche) o Geringes Kariesrisiko: 0-5 * 10³ o Erhöhtes Kariesrisiko: 8*10³ - 2*10 5 Eigener Wert: Bewertung: Zu 8. Auswertung und Beurteilung der Materialien aus der Mundhöhle Zu 8.1 Rachenabstrich Beschreiben Sie die unterschiedlichen Morphologien der angewachsenen Kolonien und führen Sie ggf. verschiedene Tests zur Differenzierung und Identifizierung durch. Zu 8.2 Zungenabstrich Mikroskopieren Sie Ihr fertig gefärbtes Präparat aus Kurstag 2. Beurteilen Sie die Morphologie zur Differenzierung der Bakterien auch unter Hinzuziehen der oben angegebenen Tabelle. Siehe auch Kurstag 1. Mikroskopieren Sie anschließend das vorgegebene Grampräparat eines Patienten mit Mundsoor und beschreiben Sie die morphologischen Unterschiede zu den o.a. Präparaten. Zu 8.3 Gingiva-Abstrich Unterschiede zwischen aerober und anaerober Bebrütung Beurteilen Sie die unter aeroben und anaeroben Bedingungen kultivierten Gingiva-Abstriche. Beschreiben und vergleichen Sie die unter den unterschiedlichen Bedingungen gewachsenen Kolonien. 9. Kultivierung und Differenzierung von Anaerobiern 9.1 Diagnostische Verfahren Demonstration und Erläuterung unterschiedlicher Bebrütungs-Verfahren zur Anzucht von Anaerobiern. - Gas-Pak - Anaerobiertöpfe - Anaerobier-Werkbank 9

10 Nicht-Sporenbildende Anaerobier Mikroskopieren Sie die vorgefertigten Präparate ausgewählter anaerober Bakterien (Bacteroides fragilis, Fusobacterium nucleatum, Actinomyces israeli, Lactobacillus acidophilus). Beurteilen Sie das Gramverhalten und die Morphologie zur Differenzierung der Bakterien unter Hinzuziehen der folgenden Tabelle. Spezies und Gramverhalten Mikromorphologie Vorkommen Propionibacterium (+) keulenartig verdickt bzw. Enden zugespitzt, Haut, Schleimhaut Darm X- und Y-förmige Aneinanderlagerung Actinomyces (+) oft stark verzweigt Mundhöhle, Nebenhöhlen, Erdboden Bifido-bacterium (+) Verzweigungen und keulenartige Zahntaschen, Magen, Darm, Verdickungen, Lactobacillus (+) gerade Stäbchen unterschiedlich in der Länge, Mundhöhle, Vagina aber nie in der Breite, häufig in Ketten Fusobacterium (-) F. nucleatum: spindelförmig zugespitzte lange Mundhöhle, Darm, Urogenitaltrakt Stäbchen, andere Fusobacterien z.t. kurze, plumpe Stäbchen Bacteroides (-) kurze, an den Enden abgerundete Stäbchen Mundhöhle, Darm, Urogenitaltrakt, Vagina 9.3 Sporenbildende Anaerobier Beschreiben bzw. beurteilen Sie die Makro- und Mikromorphologie der folgenden Sporenbildner. Beachten Sie besonders die unterschiedliche Lokalisation der Sporen Spezies Clostridium botulinum (P4) Bacillus subtilis (P5) Clostridium perfringens (P6) Clostridium tetani (P7) Clostridium difficile (P8) Wachstum Wachstum Makromorphologie aerob anaerob Mikromorphologie (Grampräparat) 10. Demonstration ausgewählter Erreger 10.1 Mykobakterien Mikroskopieren Sie die vorbereiteten Präparate von Mycobacterium tuberculosis (Ziehl-Neelsen- Färbung). Welche Bedeutung hat der mikroskopische Nachweis säurefester Stäbchen im Originalmaterial? Was bedeutet säurefest? Demonstration von Kulturen. Kulturröhrchen nicht öffnen! 10.2 Corynebakterien Mikroskopieren Sie die vorbereiteten Präparate von Corynebacterium diphtheriae (Neisser-Färbung), beachten Sie besonders die Polkörperchen. Wo kommen Corynebakterien normalerweise vor? Welches schwere Krankheitsbild können Sie auslösen? 10

11 Mykologie 11.1 Candida albicans Betrachten und beschreiben Sie die Kulturmorphologie der vorgegebenen Mikroorganismen auf Blutagar. Mikroskopieren Sie die vorgefertigten Präparate und vergleichen Sie Morphologie und Größenverhältnisse der Mikroorganismen Differenzierung von Hefestämmen Beschreiben Sie das Wachstum der vorgegebenen Sprosspilz-Stämme auf Sabouraud-Agar. Identifizieren Sie diese Stämme mittels der Mikromorphologie auf Reisagar (s. Anhang). Spezies Sabouraud-Agar Reisagar Stamm- Nr. Candida albicans Chlamydosporen Candida glabrata kleine Sprosszellen, kein Pseudomyzel Candida krusei langgezogene Sprosszellen mit Pseudomyzel Candida parapsilosis sternförmiges Pseudomyzel Candida tropicalis langes Pseudomyzel Vergleichen Sie die Makromorphologie der Sprosspilz-Stämme auf Sabouraud-Agar und CHROMagar. Spezies Koloniemorphologie auf CHROMagar Stamm-Nr. Candida albicans grün, matt glänzend, Candida glabrata rosa, matt glänzend Candida krusei rosa, flach, rauh, unregelmäßiger heller Rand Candida parapsilosis hellrosa, rauh Candida tropicalis blau, matt glänzend 11.3 Aspergillus Machen Sie sich mit der typischen Kulturmorphologie von Aspergillus vertraut. Welche durch Aspergillus verursachte Krankheiten kennen Sie und wo kommt der Erreger im Allgemeinen vor? 11

12 KURSTAG 4 12 Virologie 12. Direkter Virus-Nachweis Nachweis von Virusbestandteilen: Antigennachweis Virusanzucht Nachweis von Virus-Nukleinsäure 12.1 Nachweis virusspezifischer Antigene: Quantitative Virusbestimmung mittels Hämagglutinationstest Erstellen Sie eine Virusverdünnungsreihe (log Basis 2, Schema s. Anhang). Auswertung Die höchste Virusverdünnung, bei der eine Hämagglutination erkennbar ist, ist als eine hämagglutinierende Einheit festgelegt(1he). Hämagglutination (Erythrozyten vernetzt) keine Hämagglutination (Erythrozyten knopfförmig sedimentiert) Welche Verdünnung der Virussuspension entspricht in der Analyse einer hämagglutinierenden Einheit? Welche Verdünnung muss eingesetzt werden um 4 hämagglutinierende Einheiten zu haben? 4 HE werden bei der Durchführung des Hämagglutinations-Hemmtestes eingesetzt zur quantitativen Bestimmung von Antikörpern (s. Aufgabe 14.1) 12.2 Virusanzucht in der Zellkultur Es wurden unterschiedliche Zelltypen ausgesät und mit 100µl der jeweiligen Virus-verdünnung (10-1 bis 10-7 ) beimpft, anschließend bei 37 C 4 Tage inkubiert Well 1 bis 7: Zellen mit Virus infiziert Well 8: Zellen nicht infiziert (Zellkontrolle) Mikroskopieren Sie die Ihnen bereitgestellte virusinfizierte Zellkultur (Objektträger mit Azeton fixiert) mit kleiner Vergrößerung, kein Öl verwenden. Welcher Zelltyp liegt in der oberen bzw unteren Verdünnungsreihe vor? a) epitheloid oder b) fibroblastoid Bestimmen Sie den Virustiter über den zytopathischen Effekt (Endpunkt: Zellkulturareal, in dem noch ein zytopathischer Effekt im Vergleich zur Kontrolle zu beobachten ist) 12

13 13 Zelltyp Zellkontrolle 12.3 Nachweis viraler Nukleinsäuren mittels PCR-Techniken Qualitativer Nachweis viraler Nukleinsäuren Methodik: klassische PCR Werten Sie die vorgegebenen Gel-Bilder aus. Ordnen Sie den einzelnen Lauf-Spuren den jeweiligen Erreger zu. Nachweis von PCR-Produkten (Amplifikate) mittels Gel-Elektrophorese Amplifikat-Größe bp Entero-V bp HSV bp Adeno-V bp HBV Slot 1: Marker 2: 3: 4: 5: 6: 7: 8: Marker Quantitativer Nachweis viraler Nukleinsäuren Methodik: real time PCR Werten Sie die vorgegebenen Real-time PCR Protokolle aus. Die Kontrollen sind auf ~ Kopien/ml eingestellt. Wie hoch ist die Viruslast der positiv gemessenen Proben (die Differenz von 4 Ct- Werten entspricht etwa dem Faktor 10). Ct (threshold cycle) = Zyklus, bei dem die Fluoreszenzintensität die Basislinie erstmalig übersteigt 13

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15 Indirekter Virus-Nachweis Indirekter Nachweis von Virus-Infektionen erfolgt mittels Antikörperbestimmungen - Hämagglutinationshemmtest (HHT) - ELISA - Immunoblot 13.1 Hämagglutinationshemmtest Quantitative Antikörper-Bestimmung durch Hemmung der Hämagglutination. Definieren Sie den Antikörpertiter gegen Rötelnviren der vorgegebenen Seren und bewerten Sie die Seren in Bezug auf den Immunstatus (siehe dazu Informationen im Anhang). Serum 1 Serum 2 HHT-Titer Bewertung Welche Aussage können Sie treffen, wenn es sich bei den Seren um Proben einer Patientin handelt, die im Abstand von ca. 14 Tagen entnommen wurden? Welche Konsequenzen hätte dieser Befund bei bestehender Schwangerschaft? 13.2 Antikörper-Bestimmung mittels ELISA Werten Sie von den vorgegebenen Proben den ELISA-Test für HCV aus. Zum Nachweis einer HCV-Infektion mittels virusspezifischer Antikörper erfolgt zunächst ein ELISAbasiertes Screening. Reaktive Proben werden mittels Immunoblot weiter analysiert. Bei welchen Proben muss ein Bestätigungstest in Form eines Immunoblots durchgeführt werden? Ergebnis nk co pk Pat.1 Pat. 2 Pat. 3 Pat. 4 Pat. 5 IBL (j/n) Zur Diagnostik von Infektionskrankheiten mittels serologischer Verfahren müssen häufig verschiedene Untersuchungsmethoden und/oder Parameter kombiniert werden (Bsp: Infektion mit den Hepatitis-Viren B bzw. C) 15

16 Immunoblot zum Nachweis von Antikörpern Werten Sie das Bandenmuster der Immunoblots für die Seren aus, die im HCV-Screening Assay (ELISA) reaktiv waren. Welche Aussagen können Sie für die einzelnen Patienten treffen? Westernblot HCV (INNO-LIA TM ) Nr Strep C1 C2 E2 NS3 NS4 NS5 Interpr. 01 Positivkontrolle 15 Negativkontrolle

17 Diagnostik einer Infektion mit Hepatitis B Virus mittels serologischer Parameter Der Verlauf einer HBV-Infektion ist sehr variabel. Man unterscheidet akute entzündliche Formen die mit einer Leberschädigung einhergehen und in manchen Fällen zur Ausbildung eines hepatozellulären Karzinoms führen können. HBV-Infektionen verlaufen aber auch oft chronisch und persistieren über längere Zeiträume. Die virologisch-serologische Diagnostik der HBV-Infektionen ist wegen der Vielzahl der verfügbaren Laborparameter sowie der unterschiedlichen Verlaufsformen sehr komplex und erfolgt deshalb in der Regel als Stufendiagnostik. Werten Sie die vorgegebenen serologischen Profile einer HBV-Infektion aus in Bezug auf: Zeitdauer der Infektion und damit Infektionsphase inkl. akut bzw. chronisch (s. Anhang) Infektiosität HBV- DNA HBs-Ag anti-hbs anti- HBc-IgM anti- HBc-IgG HBe-Ag anti-hbe Bewertung (+) (+)

18 Anhang: Färbeverfahren für Bakterien Übersichtsfärbung (Methylenblaufärbung): 1. Objektträger putzen Tropfen Kochsalz-Lösung aufbringen. 3. Bakterienhaltiges Material im Tropfen verreiben (Vorsicht! Nicht zu viel Material einsetzen) 4. Lufttrocknen (Die Präparate müssen völlig trocken sein). 5. Fixieren: 5mal durch die Gasflamme ziehen (bakterienhaltige Fläche nach oben). 6. Loeffler`s Methylenblaulösung, 2 Min. (Objektträger vollständig bedecken). 7. Mit Wasser spülen. 8. Zwischen Fließpapier trocknen. Gramfärbung: wie Übersichtsfärbung. 6. Gentianaviolett-Phenol-Lösung, 1 Min. 7. Mit Wasser spülen. 8. Lugol`sche Lösung (Jod-Kaliumjodid), 1 Min. 9. Mit Wasser spülen % Ethanol (Küvette): schwenken, bis keine Farbwolken mehr herausgelöst werden. 11. Mit Wasser spülen 12. Fuchsin-Phenol-Lösung, 10 Sek. 13. Wie Übersichtsfärbung Färbung nach Neisser: Wie Übersichtsfärbung 6. Neisser I, 25 Sek. 7. Farbstoff abgießen und Objektträger zwischen Fließpapier trocknen. 8. Neisser II, 15 Sek. 9. Wie 7. (nicht spülen!) Färbung nach Ziehl-Neelsen (säurefeste Stäbchen): Wie Übersichtsfärbung. 6. Karbol-Fuchsin-Lösung: Objektträger vollständig bedecken, 3mal bis zur Dampfbildung erhitzen. 7. Mit Wasser abspülen. 8. Salzsäure-Alkohol: bis keine Farbwolken mehr herausgelöst werden. 9. Mit Wasser spülen. 10. Loeffler`s Methylenblau-Lösung, 1 Min. 11. Mit Wasser spülen. 12. Zwischen Fließpapier trocknen. A

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20 Differenzierung grampositiver Kokken Katalase-Nachweis Das eisenporphyrinhaltige Enzym Katalase wird von den meisten oxidasepositiven aeroben und fakutativ anaeroben Spezies gebildet. STREPTOKOKKEN bilden keine Katalase. Katalase wandelt im Energiestoffwechsel gebildetes Wasserstoffperoxid in Wasser und molekularen Sauerstoff um. 2H 2 O 2 --> 2H 2 O + O Koagulase-Nachweis: Differenzierung von Staphylococus aureus und Koagulase-negativen Staphylokokken (KNS) Freie Koagulase (extrazelluläres Enzym) bindet an Prothrombin und aktiviert die Entstehung von Fibrin aus Fibrinogen. Clumping Faktor (zellwandgebundenes Protein) = Fibrinogenrezeptor Latexpartikel sind mit Fibrinogen und IgG beladen Fibrinausfällung durch Koagulase und Clumping factor Protein A von Staph. aureus bindet an den Fc Teil von Immunglobulinen, welche dann nicht mehr an den Fc-Rezeptor von Phagozyten binden Ausserdem sind die Latexpartikel mit spezifischen Antikörpern gegen Kapsel-polysaccharide von Staph. aureus beladen. Durch diese Mehrfachbeladung besteht die Möglichkeit, alle Staph. aureus Stämme zu erfassen. Hämolyse: Die Zerstörung der Erythrozyten der Blutplatten und die Zersetzung des Hämoglobins führen zu Veränderungen, die als Hämolyse bezeichnet werden. Hämolyse ist ein wichtiges diagnostisches Merkmal, vor allem für Streptokokken und Staphylococcus aureus -Hämolyse nur partielle Hämolyse, Grünfärbung durch biliverdinähnl. Substanzen Ursache: Reduktion des Hämoglobins ß-Hämolyse klarer, durchsichtiger Hof um die Kolonien Ursache: Zerstörung der Erythrozyten (Hämolysine) ( - Hämolyse) anhämolytische Keime -> keine Veränderung des Hofes um die Kolonien

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22 Selektive Anzucht und Differenzierung gramnegativer Stäbchen Selektivmedium: Wachstum von Mikroorganismen, die besondere Eigenschaften aufweisen Bsp.: Medien, die mit Antibiotika angereichert sind es wachsen nur die Mikroorganismen, die gegen das verwendete Antibiotikum resistent sind Differentialmedium: Wachstum von verschiedenen Mikroorganismen mit unterschiedlicher Koloniemorphologie erlaubt eine Differenzierung Differenzierung mit XLD-Agar XLD-Agar: enthält Xylose, Lactose und Saccharose, Thiosulfat, Eisen-(III)-Salz, Phenolrot (Indikator) - Abbau von Xylose, Lactose und Saccharose wird durch einen Farbumschlag des Indikators Phenolrot von rot nach gelb angezeigt - Thiosulfat und Eisen-(III)-Salz zeigen Schwefelwasserstoffbildung an durch Ausfällung schwarzen Eisensulfids in den Kolonien. - Abbau von Lysin ist erkennbar an der purpurroten Farbe um die Kolonie infolge Erhöhung des ph-wertes. Salmonellen und Shigellen wachsen transparent, da diese pathogenen Keime weder Xylose, Laktose noch Saccharose spalten. E. coli, Klebsiella pneumoniae und andere apathogene Darmbakterien, die diese Zucker spalten können, wachsen als gelbe Kolonien. Salmonella-Kolonien sind häufig an dem zentralen, tiefschwarzen Punkt zu erkennen, der die Eisensulfidbildung anzeigt. Differenzierung mit MacConkey II-Agar MacConkey-Agar: - enthält Gallensalze und Kristallviolett (Selektivmedium) Wachstum von gram-positiven Bakterien wird weitgehend verhindert Wachstum verschiedener gramnegative Darmbakterien wird gefördert - enthält Laktose als C-Quelle und Neutralrot als ph-indikator (Differentialmedium) Laktose fermentierende (vergärende) Bakterien werden über den Farbumschlag von Neutralrot identifiziert (Kolonien laktosepositiver Bakterien färben sich rot; Kolonien laktosenegativer Organismen bleiben farblos). Die Cytochrom-Oxidase-Reaktion dient dem Nachweis von Cytochromen aus der Atmungskette, die Sauerstoff als terminalen Elektronenakzeptor im Energiestoffwechsel verwenden. Cytochrome ermöglichen den Eintritt von atmosphärischem Sauerstoff in den Zellstoffwechsel, indem sie durch molekularen Sauerstoff oxydiert werden. In der Zelle erfolgt die enzymatische Reduktion der Cytochrome. Künstliche Substrate (z.b. N,N-Dimethyl-1,4-diaminobenzol) bewirken die Reduktion des Cytochromoxidase-Systems (die Substrate werden folglich oxydiert). Diese Substrate erscheinen in Abhängigkeit vom Reduktions-/Oxidations-zustand farblos bzw. gefärbt. Differenzierung gramnegativer Stäbchen (Bunte Reihe) Kohlenhydratspaltung Abbau von Kohlenhydraten (Glucose, Lactose, Rhamnose) Säure (18 24 h) Indikator: Bromthymolblau Farbumschlag blaugrün (negativ) zu gelb/orange (positiv) Citrat-Abbau C-Quelle: Citrat, N-Quelle: Ammoniumsalz (Grundlage für Energie- + Baustoffwechsel) Alkalisierung Indikator: Bromthymolblau Farbumschlag grün (negativ) zu blau (positiv) E

23 H2S-Bildung - aus Eiweißkörpern bzw. S-haltigen Aminosäuren (insbes. Cystein) - aus S-haltigen, (an)organischen Zusätzen [(Thio-)Sulfaten, Sulfiten, Cystein] Indikator: Metallsalz (insbes. Ferrochlorid + Bleiacetat) Sulfid (schwarzer Niederschlag) Urease-Nachweis / Indol-Bildung Indikator: Phenolrot (durch Säurebildung aus Glucose-Abbau gelb = negativ) - Urease: Harnstoff Ammoniak + CO2 positiv (rotviolett) - Indol: Eiweißabbau (Tryptophan) Indol (Nachweis mit Kovacs Reagenz, roter Ring) - Beweglichkeit: Wachstum außerhalb des Impfstichs (wolkenartige Trübung) im Agar Ornithin-Dekarboxylierung L-Ornithin (L-Lysin u.a) [ph niedrig] Amine + CO2 (ph-anstieg) Indikator: Bromkresolpurpur Farbumschlag von farblos/gelblich (negativ) zu violett (positiv) Tabelle: Bunte Reihe (Biochemische Differenzierung): Glukose Laktose Ammonium- Zitrat H 2 S Urease / Indol Ornithin Rhamnose Spezies: negativ grün grün grün hell hell hell grün Urease: positiv orange orange blau schwarz pink violett orange Indol: roter Ring E. coli / + d d Enterobacter cloacae + d / Klebsiella pneumoniae (+) / Klebsiella oxytoca (+) / Citrobacter spp. + (+) / - d + Proteus mirabilis + - d + + / Proteus vulgaris + - d + + / Morganella morganii / Providencia rettgeri / + - d Serratia marcescens / Salmonella spp / - (+) + Pseudomonas aeruginosa / Eigenes Isolat - = negativ + = positiv (+) = positiv, langsame Spaltung d = kann sowohl + als auch sein, verschiedene biochemische Typen F

24 Biochemische Reaktionen Nachweis Beispiele Enzyme der Atmungskette Cytochromoxidase; Katalase; Nitratreduktase Verwertung von Kohlenhydraten Zucker, Zuckeralkohol-, Glykosid-Verstoffwechslung (Assimilation und Fermentation) (Säurebildung) unter aeroben und anaeroben Bedingungen Abbau von organische Säuren Citratverwertung Enzyme des Proteinstoffwechsels Bildung von Schwefelwasserstoff; Abbau von Tryptophan (Indolbildung) Desaminasen und Spaltung von Aminosäuren (Ornithin, Lysin); Ureasebildung Decarboxylasen weitere Enzyme Plasmakoagulase; Hämolysine (Pathogenitätsfaktoren) Erläuterung zu den getesteten Antibiotika Penicillin G Zellwandwirksames Antibiotikum : vor allem wirksam gegen grampositive Bakterien (eingeschränktes Wirkspektrum) Ampicillin/Sulbactam Inhibitorgeschütztes Aminopenicillin: Durch Hemmung bestimmter ß-Lactamasen Verbreiterung des Wirkungsspektrums z. B. auf Penicillin G- resistente Staph. aureus-stämme, Enterobakterien und andere gramnegative Keime. Keine Pseudomonas- Wirksamkeit Cefuroxim Cephalosporin der 2. Generation: weitgehend ß-Lactamase- stabil, resistent sind Enterokokken und Pseudomonas Gentamicin Aminoglykosid: Gute Wirksamkeit gegenüber Pseudomonas, Staphylokokken und Enterobakterien. Relativ unempfindlich sind Streptokokken und Enterokokken. Ciprofloxacin Gyrasehemmer: Breitspektrumantibiotikum, Wirksamkeit auf grampositive und gramnegative Keime einschliesslich Pseudomonas. Imipenem Carbapenem: Breites Wirkungsspektrum auf grampositive und gramnegative Erreger einschliesslich Pseudomonas Standort Mundhöhle Der Standort Mundhöhle ist geprägt durch eine Vielzahl aerober und vor allem anaerober Mikroorganismen. Zahlreiche Mikrostandorte sind zu unterscheiden: Zungenoberfläche: aerober Standort, bevorzugter Siedlungsort der Hefepilze, insbesondere C.albicans und anderer Candida-Spezies. Klinisches Bild ist der Mundsoor. Wangenschleimhaut: vermindertes Haftvermögen, rel. Keimarmut (überwiegend Streptokokken). Plaque: Akkumulation von Bakterien auf dem Zahnschmelz, bakterielles Haften von Streptococcus sanguis und Streptococcus mutans. G

25 Die extrazellulären Polysaccharide von S. mutans sind besonders haftfähig. In der Besiedlung folgen Actinomyces viscosus und Lactobacillus spp. Ihre Quantität kann als Maß der Kariesaktivität herangezogen werden. Mit zunehmendem Alter der Plaque sind mehr gramnegative obligate Anaerobier wie Prevotella spp., Prophyromonas spp., Fusobacterium spp. und Veillonella spp. zu finden. Im Endstadium findet man viele Spirochaeten. Zu unterscheiden sind supra- und subgingivale Plaques. Orale Infektionen Erreger, Leitkeime Karies a) Zahnschmelzkaries Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Lactobacillus spec. b) Wurzelkaries Streptococcus mutans, Actinomyces viscosus, Lactobacillus spec. Gingivitis akute necrotische (ulcerative) Gingivitis Periodontitis Adenoviren, HSV-1,2, VZV Plaque-Flora (bes. Streptococcus mutans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Fusobacterium spp.), Candida spp. EBV, CMV, HHV-6, HSV-1,2 mit Ulcus Plaque-Flora (Streptococcus mutans, Prevotella spp., Prophyromonas spp., Fusobacterium spp., Veillonella spp, Spirochaeten) Candida spp. EBV, CMV Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Neisseria spec. Abszesse Staphylococcus aureus, Actinomyces israelii, A. naeslundii, Streptokokken (selten), Prevotella melaninogenica, Prevotella intermedia, Fusobacterium necrophorum, F. nucleatum, Peptostreptococcus spp. Candida spp. (zervikofaziale Aktinomykose) selten. H

26 Pseudomyzelbildung ausgewählter Candida-Spezies auf Reis-Agar Candida albicans Candida glabrata Candida krusei Candida parapsilosis Candida tropicalis Spezies Chromagar (Makromorphologie) Reisagar (Mikromorphologie) C. albicans grün, matt glänzend, halbkugelig Chlamydosporen C. glabrata rosa, glänzend, rel. flach kleine Hefezellen, kein Pseudomycel C. tropicalis blau, matt glänzend, halbkugelig langes Pseudomycel, Blastokonidien auch aus den Zellen heraus C. krusei rosa z.t. mit weißem Rand, flach, rau, matt langgezogene Hefezellen, Wirtelbildung C. parapsilosis weißlich-beige, Oberfläche gefurcht, matt glänzend z.t. langes Pseudomycel, Blastokonidien nur zwischen den Zellen I

27 Virusanzucht in der Zellkultur Prinzip: Viren als obligate Zellparasiten verändern (z. T. virusspezifisch) die Morphologie der Wirtszellen (CPE = cytopathogener Effekt) Ausgehend von einer Verdünnungsreihe der ursprünglichen Virussuspension kann die vorhandene Virusmenge als Titer abgelesen werden. Als Endpunkt wird die Verdünnungsstufe bewertet, in der noch ein zytopathogener Effekt im Vergleich zur Kontrolle zu beobachten ist Qualitativer Nachweis von Virusnukleinsäure Prinzip: Amplifikation eines spezifischen DNA-Abschnittes von Viren (bei RNA-Viren ist vorherige Umschreibung in c- DNA erforderlich). 1. Reaktionsansatz: Aqua dest, dntp-mix (jeweils datp, dctp, dgtp, dttp), 10x Taq-Reaktionspuffer, Primer 1, Primer 2, Taq-DNA-Polymerase (= 1 Einheit) DNA bzw. cdna 2. Amplifikationsschritte im Thermocycler: Denaturierung, Annaeling, DNA-Synthese (25-50 Zyklen) 3. Nachweis der Amplifikate Amplifikat (in Probenpufferauf Agarose-Gel (mit Ethidiumbromid) auftragen Elektrophorese Auswerten unter UV-Licht (Beurteilung erfolgt über die Banden-Laufweite) Quantitativer Nachweis von Virusnukleinsäure (real time PCR) In der real-time PCR kommen zusätzlich zum klassischen Reaktionsansatz Detektionssysteme (hier fluorogene Sonden) bereits während der PCR zum Einsatz. Diese Kombination im one-tube Verfahren ermöglicht die simultane Amplifikation und Detektion. Über Kontroll-Material mit definierter Kopienzahl wird eine Standardkurve erstellt. Durch Abgleich des Messwertes der Probe mit dieser Standardkurve kann die Kopienzahl des Erregers im Ausgangsmaterial bestimmt werden. D.h. in einem Ansatz ist neben der Detektion auch eine Bestimmung der Viruslast (Quantifizierung) aus positiv gemessenen Proben ohne weitere möglich. Hämagglutinationstest (Virusnachweis) Prinzip: Viren, die auf der Oberfläche Antigene mit hämagglutinierenden Eigenschaften besitzen (Influenzavirus, Rötelnvirus, Adenovirus), führen zu einer Vernetzung von Erythrozyten. Ansatz: - 50 µl PBS (isotone phosphatgepufferte Kochsalzlösung) pro Well in eine Querreihe der Mikrotiterplatte vorlegen (insgesamt 12 Wells) - 50 µl Virusantigen (AG) in die erste Vertiefung geben, mischen - 50 µl in die zweite Vertiefung, überpipettieren u.s.w bis Well µl Erythrozytensuspension (ER) in jede der 12 Vertiefungen - mischen durch leichtes Klopfen an die Platte - Inkubation ca 1 Std. bei Raumtemperatur Auswertung: Die höchste Virusverdünnung, bei der eine Hämagglutination erkennbar ist, ist als eine hämagglutinierende Einheit festgelegt.(1he) Hämagglutinationstest (Antikörpernachweis) Prinzip: Erythrozyten werden mit Antigen des jeweiligen Erregers sensibilisiert. Enthält ein Serum Antikörper gegen diesen Erreger, agglutinieren die Erythrozyten. Über eine Serumverdünnungsreihe kann die Antikörpermenge als Titer abgelesen werden. Der Titer ist der reziproke Wert der höchsten Serumverdünnung, bei der die Hämagglutination noch verhindert wird (je größer die Antikörperkonzentration, desto mehr Verdünnungsschritte sind notwendig, desto höher ist der Titer) J

28 Hämagglutinationshemmtest (Quantitative Antikörper-Bestimmung durch Hemmung der Hämagglutination) Prinzip: Die Auseinandersetzung des Wirtsorganismus mit den entsprechenden Viren führt im Verlauf der Infektion zur Antikörperbildung, die das Virus-Hämagglutinin neutralisieren. Im Wirt kommt es zur Blockade der Adhärenz der Viren an Zielzellen, in vitro Blockade der Hämagglutination. Durchführung: - Serumverdünnungsreihe auf der Basis 2 herstellen - 50 µl Virus-Antigen (AG) mit einer definierten Virusmenge (4 HE) zugeben - Inkubation über Nacht bei 4 C bzw 1 h bei Raumtemperatur - Zugabe von 50 µl einer gleichmäßig suspendierten Erythrozytensuspension (ER) - Inkubation 1 h bei Raumtemperatur, Auswertung Bewertung Röteln-Basisdiagnostik HHT 1 : 32 sichere Immunität 1 : 16 Kontrolle mit alternativem Test < 1 : 8 kein Immunschutz ELISA 30 IU/ml in der Regel Immunität Immunstatus: Infektion: Frische Infektion: Einzelprobe mindestens 2 Proben 4facher Titeranstieg ELISA (Antigennachweis) Prinzip: Monoklonale Antikörper reagieren mit spezifischen Antigenen aus Patienten-Proben. Nach Zugabe Enzym-markierter spezifischer Antikörper wird ein Sandwich-Komplex aus immobilisierten Antikörpern Virusantigen enzymmarkierten Antikörper gebildet. Ein farbloses Substrat wird bei spezifischer Bindung durch das Enzym in einen Farbkomplex umgewandelt und die Reaktion über Messung der Optischen Dichte oder visuell ausgewertet. ELISA (Antikörper-Nachweis) Testprinzip: Im Humanserum vorhandene Antikörper bildet mit dem auf der Mikrotiter-platte fixierten Erreger-Antigen einen Immunkomplex. Mit diesem Komplex verbindet sich ein enzymmarkierter sekundärer Antikörper = [(anti-human) Ziege-Meerrettich Peroxidase Konjugat]. Nach Zugabe von Substratlösung wird durch die Enzymaktivität (Peroxidase) ein blauer Farbstoff entwickelt, der durch Zugabe der Stopplösung nach gelb umschlägt. Die Quantifizierung erfolgt über Abgleich der Optischen Dichte der Probe mit den Werten der eingesetzten Standards. Immunoblot zum Nachweis / Differenzierung von Antikörpern (spezifisch gegen einzelne Proteine) Testprinzip: Im Serum vorhandenen erregerspezifischen Antikörper binden an membran-gebundene Erreger-Antigene und bilden Immunkomplexe. Daran bindet ein sekundäres enzymmarkiertes Anti- Human-Immunglobulin, durch Substratumsatz (s. ELISA) werden die Reaktionen sichtbar und so die entsprechenden Antikörpersubgruppen nachgewiesen. - Die Besonderheit jedes Immunoblots liegt in der Art und Menge der an die Membran gebundenen Antigene. - Typischerweise werden Erregerproteine in einer Polyacrylamid-Elektrophorese nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt und anschließend im Elektro-Blot-Verfahren auf Nitrocellulose- Membranen übertragen. Neue Verfahren nutzen rekombinant gewonnene Antigene, die auf die Nitrocellulosestreifen aufgetragen werden. K

29 Diagnostische Marker einer Hepatitis-B-Infektion Marker Definition Bedeutung HBsAg Oberflächenprotein akute oder chronische Hep. B-Infektion, frühester Marker HBeAg ins Blut sez., teils mit HBcAg ident. Virusprodukt Infektionsmarker, Hinweis auf hohe Infektiosität HBV-DNA DNA des Virus direkter Virusnachweis (Infektiosität) -> Viruslast Anti-HBs AK gegen HBsAg abgelaufene Hep. B-Infektion in Verbindung mit Anti- HBc, Immunität einziger AK nach Hep. B-Impfung Anti-HBc AK gegen HBcAg (IgG, IgM) Durchseuchungsmarker, pos. nach HBV-Kontakt (akute, chron., abgelaufene Hep.B) Anti-HBc-IgM IgM-AK gegen HBcAg in hohen Titern beweisend für akute Hep. B-Infektion Anti-HBe AK gegen HBeAg löst HBeAg ab, spricht für geringere oder fehlende Infektiosität L