Phänotypische Charakterisierung von Patienten mit hypertropher Kardiomyopathie und Varianten im β-mhc-gen und α- Tropomyosin-Gen

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1 Aus der Klinik Innere Medizin, Kardiologie, Charité, Campus Virchow Klinik, Medizinische Fakultät der Humboldt-Universität zu Berlin In Kooperation mit dem Deutschen Herzzentrum Berlin DISSERTATION Phänotypische Charakterisierung von Patienten mit hypertropher Kardiomyopathie und Varianten im β-mhc-gen und α- Tropomyosin-Gen Zur Erlangung des akademischen Grades Doctor medicinae (Dr. med.) vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité der Humboldt-Universität zu Berlin von Monika Heydenreich aus Bochum, 2001

2 Dekan: Prof. Dr. Dr. h. c. R. Felix Gutachter: 1. Prof. Dr. med. V. Regitz-Zagrosek 2. Prof. Dr. med. Osterziel 3. PD Dr. med. Kaab eingereicht: Datum der Promotion:

3 Zusammenfassung Die hypertrophe Kardiomyopathie ist eine autosomal dominant vererbte Herzmuskelerkrankung. Es kommt zu einer asymmetrischen Hypertrophie insbesondere des Herzmuskels. Symptome sind unspezifisch und reichen von Dyspnoe bis hin zu Synkopen. Gelegentlich ist der plötzliche Herztod die erste Manifestation der Erkrankung. Molekulargenetische Untersuchung des Genomes dieser Patienten zeigten, dass diese Patienten Mutationen im Proteinen des Sarkomers aufwiesen. Hierunter fällt das β-mhc- Gen und α-tropomysin-gen. Wir untersuchten 45 nicht miteinanderverwandte Patienten auf Mutationen im β-mhc- Gen und im α-tropomysin-gen. Folgende molekulargenetische Untersuchungen wurden angewendet: Polymerase-Ketten-Reaktion, Single-Strand-Polymorphismus-Anlyse und Sequenzierung. Bei 6 Patienten (13%) fanden wir eine Mutation im β-myosin-gen. Kein Patient hatte eine Mutation im α-tropomyosin-gen. In der Literatur wird eine Mutation im β-mhc-gen in bis zu 35% und im α-tropomyosin-gen in bis zu 3% der Fälle angenommen. Unsere Patienten hatten die Mutationen: Exon 13 Arg403Trp und Val411Ile, Exon 19 Arg719Trp, Exon 20 Ile736Thr, Exon 21 Leu796Phe und Exon 23 Cys905Phe. Die Mutationen Arg403Trp und Arg719Trp waren vorher bereits bekannt. Die Mutationen, Ile736Thr, Val411Ile, Leu796Phe und Cys905Phe wurden in der Form von uns erstmals ermittelt. Offensichtlich besitzen unsere Patienten überdurchschnittlich häufiger Mutationen in anderen Genen, die in dieser Studie nicht untersucht wurden. Der Phänotyp der Krankheit der HCM war bei unserem Patientenkollektiv sehr heterogen, und es ließen sich keine signifikanten Unterscheidungen feststellen. So haben wir uns darauf beschränkt, bei den 6 Patienten mit Mutationen nur nach den von Burn et al. (1997) aufgestellten Risikofaktoren zu suchen, die einen plötzlichen Herztod herbeiführen können, und haben sie danach in Patienten mit einem höheren oder niedrigeren Risiko eingestuft. Kriterien für ein erhöhtes Risiko, einen plötzlichen Herztod zu erleiden, wurden von Patienten mit den Mutationen: Exon 13 Arg403Trp, Exon 13 Val411Ile, Exon 19 Arg719Trp, Exon 20 Ile736Thr und Exon 21 Leu796Phe erfüllt. Mutationen an diesen Positionen sind auch in der Literatur mit einem erhöhten Risiko für einen plötzlichen Herztod assoziiert worden. Der Patient mit der Mutation im Exon 23 Cys905Phe wies wenige Risikofaktoren auf und unterscheidet sich somit nicht von den in der Literatur beschriebenen Patienten. Wir konnten dies mit unseren Ergebnissen bestätigen.

4 Abstract Hypertrophic Cardiomyopathy is disease of the cardiac muscle which results in an asymmetric hypertrophy especially of the interventricularseptum of the heart.. It is transmitted in an autosomal dominant way. The symptoms are unspecific reaching from dyspnoe to syncopes. Sometimes the sudden death is the first manifestation of the disease. Molekular genetic researches showed that in the patients genes Mutations in proteins of the sarkomer were detectable. Two of them are α-tropomyosin and β-myosin Heavy Chain. We examined 45 unrelated Patient of the existence of Mutations in α-tropomyosin and β- Myosin Heavy Chain. We used following Examinations: PCR, SSCP, Sequencing. A mutation in the β-myosin Heavy Chain were found in 6 Patients (13%), non in α- Tropomyosin. Generally mutations are expected in 35% in β-myosin Heavy Chain and 3% in α- Tropomyosin. Our patients seem to have mutations in genes we did not examine in this study. We detected Mutations in: Exon 13 Arg403Trp and Val411Ile, Exon 19 Arg719Trp, Exon 20 Ile736Thr, Exon 21 Leu796Phe und Exon 23 Cys905Phe. Mutation Arg 403Trp and Arg719Trp have been known in this form before, the others were new. As the phenotypes of our patients were heterogenous and not significantly to be distinguished we looked for risk factors for sudden death as described by Burn et al within our group of patients with mutations. Five Persons showed risk factors as discribed: Exon 13 Arg403Trp and Val411Ile, Exon 19 Arg719Trp, Exon 20 Ile736Thr, Exon 21 Leu796Phe. The person with the mutation Exon 23 Cys905Phe showed no risk factors for sudden death. Our results correlate with those of earlier studies. The patient with the mutation Exon 23 Cys905Phe was classified as a low risk patient while the other mutations correlate with a further high risk. Schlagwörter: Hypertrophe Kardiomyopathie, β-mhc-gen, α-tropomyosin, Genetik Keywords: Hypertrophic cardiomyopathy, β-mhc, α-tropomyosin, genetics

5 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Phänotyp der hypertrophen Kardiomyopathie Häufigkeit der HCM in der Bevölkerung Pathophysiologie, Diagnostik und Therapie Genetik der HCM Molekulare Pathomechanismen Häufigkeit der HCM bei Patienten ohne nachweisbare FHCM Einfluß modifizierender Gene Fragestellung 10 2 Methoden Auswahl der Patienten Anamnese Methoden zur Diagnose der hypertrophen Kardiomyopathie Echokardiographie Perkutane transluminale Angiographie Datenbank der 45 Patienten Statistik Deskriptive Statistik Hardy-Weinberg-Gesetz Analytische Statistik Materialien Geräte Chemikalien Enzyme und Längenstandards 20

6 2.6.4 Sonstiges Synthetische Oligonukleotide (Primer) Isolierung und Aufarbeitung menschlicher genomischer DNA Polymerase-Kettenreaktion von genomischer DNA SSCP-Analyse Klonierung und Sequenzierung Klonierung des PCR-Produktes Hitze-Schock-Transformation kompetenter Zellen Minipräparation von Plasmid DNA Sequenzierung der DNA Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus-Analyse 34 3 Resultate Auswertung der klinischen Befunde des Patientenkollektivs mit HCM Patientenkollektiv Familienanamnese Symptome Echokardiographie Elektrokardiographie Medikamentöse Therapie Mutationen im β-mhc-gen Klinische Parameter bei Patienten mit Mutationen im β-mhc-gen Exon 13 - Arg403Trp bei Lab-Nr Exon 13 - Val411Ile bei Lab-Nr Exon 19 - Arg719Trp bei Lab-Nr Exon 20 - Ile736Thr bei Lab-Nr Exon 21 - Leu 796-Phe bei Lab-Nr Exon 23 - Cys905Phe bei Lab-Nr. 4 54

7 3.3.7 Zusammenfassender Vergleich der 6 Patienten mit und der 39 Patienten ohne Mutation im β-mhc-gen Untersuchungen im α-tropomyosin-gen Zusammenhang von ACE-D/I-Polymorphismus und hypertropher Kardiomyopathie und ACE-D/I-Polymorphismus und Rhythmusstörungen bei Patienten mit HCM ACE-D/I-Polymorphismus und Allelfrequenz bei HCM-Patienten ACE-D/I-Polymorphismus und Arrhythmien der Klasse Lown 4b bei HCM-Patienten ACE-D/I-Polymorphismus und alle Formen von Rhythmusstörungen bei HCM-Patienten 63 4 Diskussion Sensitivität der SSCP-Analyse für den Nachweis von Mutationen Auswirkungen der Mutationen im β-mhc-gen und α-tropomyosin- Gen durch molekularbiologische Krankheitsmechanismen Mutationen im β-mhc-gen Mutationen im α-tropomyosin-gen Problematik der Prognose des Krankheitsverlaufes Zusammenhänge zwischen klinischen Parametern von Patienten und Mutationen im β-mhc-gen Zusammenhang der klinischen Parameter von HCM-Patienten und Mutationen im α-tropomyosin-gen Bedeutung der Genotypisierung für die Diagnostik der HCM Zusammenhang von ACE-D/I-Polymorphismus und HCM und ACE- D/I-Polymorphismus und Rhythmusstörungen 89 5 Zusammenfassung 92

8 1 1 Einleitung 1.1 Phänotyp der hypertrophen Kardiomyopathie Kardiomyopathien wurden 1995 von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) als primäre Erkrankungen des Herzmuskels definiert, die mit einer kardialen Funktionsstörung einhergehen. Nach hämodynamischen Kriterien unterscheidet man dilatative, hypertrophe, restriktive, arrhythmogene rechtsventrikuläre und nichtklassifizierbare Kardiomyopathien. Die hypertrophe Kardiomyopathie (HCM), die hier untersucht wird, zeichnet sich durch eine Hypertrophie der Ventrikelmuskulatur aus, die meist asymmetrisch ist und insbesondere das Kammerseptum betrifft (Richardson et al. 1995). Dabei kann es während der Ventrikelsystole zu einer Obstruktion des Ausflußtraktes des linken, des rechten oder beider Ventrikel kommen. Gelegentlich sind die Patienten mit HCM beschwerdefrei, häufiger finden sich jedoch Symptome, die auf die Krankheit hinweisen wie Dyspnoe, Leistungsminderung, Müdigkeit, Angina-Pectoris-Anfälle, ventrikuläre Arrhythmien bis hin zu ventrikulären Tachykardien mit Schwindel und Synkopen. Allerdings führt nicht selten erst der plötzliche Herztod zur ersten Manifestation der Krankheit. Das Manifestationsalter reicht von der frühen Kindheit bis zum siebten Lebensjahrzehnt (Schwarz et al. 1995). Die jährliche Mortalität der an hypertropher Kardiomyopathie Erkrankten liegt bei ca. 1% (Maron et al. 1987, Spirito et al. 1994/1997). Das Risiko eines plötzlichen Herztodes wird bei HCM-Patienten auf 3% pro Jahr geschätzt. Man vermutet, daß die plötzlichen Todesfälle durch Rhythmusstörungen ausgelöst werden. 1.2 Häufigkeit der HCM in der Bevölkerung In einer 1989 von Codd et al. veröffentlichten Arbeit wird von einer Inzidenz von 2,5/ Personen pro Jahr in dem untersuchten Gebiet in Minnesota, USA berichtet. Es wird eine Häufigkeit von 1 : 5000 angenommen. Als Prävalenz wird von

9 2 19,7/ Personen pro Jahr gesprochen. In jener Studie wurden hauptsächlich Patienten mit einem schweren Krankheitsbild berücksichtigt, d.h. diejenigen, die sich in einem kardiologischen Zentrum vorgestellt hatten. Werden dagegen, wie es in einem Bevölkerungsscreening geschieht, auch leichtere und asymptomatische Fälle der Krankheit mit eingeschlossen, erhöht sich die Prävalenz der HCM auf etwa 1 : 500 (Spirito et al. 1989, Maron et al. 1995). Damit gehört die hypertrophe Kardiomyopathie zu den häufigsten autosomal dominant vererblichen Gesundheitsrisiken. 1.3 Pathophysiologie, Diagnostik und Therapie Das wesentliche morphologische Merkmal der Erkrankung ist die Hypertrophie vor allem des Myokards mit Einzelzellhypertrophie und Bindegewebsvermehrung (Schwartz et al. 1995). Der zugrundeliegende pathophysiologische Mechanismus ist nicht eine systolische, sondern eine diastolische Funktionsstörung, die durch eine eingeschränkte Dehnbarkeit des hypertrophierten Muskels erzeugt wird. Diese Störung führt trotz eines hyperdynamen linken Ventrikels zu einem erhöhten diastolischen Füllungsdruck, der sich retrograd in die Vorhöfe, Lungenstrombahn bzw. in das zentrale Venensystem fortsetzt (Harrison et al. 1996). Der Nachweis und die Lokalisation einer myokardialen Hypertrophie können mit Hilfe der Echokardiographie erfolgen. Sie ist als nicht-invasive Untersuchungsmethode die Methode der Wahl. Asymmetrische Hypertrophien des Septums und der Hinterwand können zuverlässig erkannt und beurteilt werden. Eine Septumdicke größer als 13 mm gilt als krankheitsverdächtig. Das Verhältnis von Septum- zu Hinterwanddicke kann errechnet und zur Bestätigung der HCM herangezogen werden. Ein Quotient größer als 1,3 gilt bei Fehlen anderer Ursachen der Hypertrophie als pathologisch (Maron et al. 1981).

10 3 Patienten, die an einer Hypertonie leiden, weisen im Gegensatz zu HCM-Patienten eine symmetrische Hypertrophie des linken Ventrikels auf. Werte größer 20 mm für das IVS werden nicht erreicht, ebenso findet man nur selten eine Septum/Hinterwandratio größer 1,5 (Schwartz et al. 1995, Masuda et al. 2000). In der zweidimensionalen Echokardiographie können das kleine endsystolische Ventrikelcavum und das hyperdyname Ejectionsverhalten dargestellt werden. Die M- Mode-Untersuchung gibt vor allem die Dynamik des Herzmuskels wieder. Die systolische Vorwärtsbewegung des vorderen Mitralsegels (SAM) ist ein Hinweis auf eine Ausflussbahnobstruktion. Durch eine Doppler-Echokardiographie können sowohl eine funktionelle Obstruktion erkannt als auch ein intrakavitärer Druckgradient gemessen und gegebenenfalls eine Mitralinsuffizienz ausgeschlossen werden (Maron et al. 1981, McKenna et al. 1988). Ein Viertel der Patienten mit HCM zeigt einen Ausstromgradienten, der auf eine Obstruktion hinweist. Die Radionuklidventrikulographie mit Thallium-201 kann den Nachweis eines Myokardperfusionsdefekts auch bei asymptomatischen Patienten erbringen. Die perkutane transluminale Angiographie und die Druckmessung ermöglichen eine detailierte Darstellung des Cavums, des linken und rechten Ventrikels und des Kontraktions- und Relaxationsablaufes. Die Ventrikelhöhle ist bei der hypertrophen Kardiomyopathie in der Angiographie endsystolisch eng. Die Auswurffraktion ist 70-80% hoch (Norm 55-75%). Die Füllungsdrücke in den Herzabschnitten werden gemessen, um einen möglichen intrakardialen Druckgradienten zu erfassen, und die vorderen Herzkranzarterien werden dargestellt, um eine koronare Herzkrankheit auszuschließen. Diese invasive Untersuchungsmethode ist zur Diagnosestellung meist nicht notwendig und wird nur bei strenger Indikation durchgeführt, z.b. zum Ausschluß einer koronaren Herzkrankheit und anderer zusätzlicher Herzerkrankungen. Eine sichere Diagnose durch das Elektrokardiogramm ist nicht möglich, da Zeichen der linksventrikulären Hypertrophie, die bei einer HCM im EKG auftreten, nicht spezifisch für die HCM sind, sondern auch bei anderen Erkrankungen auftreten können. Ebenso kann eine pathologische Q-Zacke in den rechts- und linkspräkordialen Ableitungen

11 4 sowohl bei der HCM als auch beim Myokardinfarkt beobachtet werden. Etwa 85% der HCM-Patienten weisen pathologische Veränderungen im Ruhe-EKG auf. Nach ventrikulären Tachykardien, die auf einen zunehmend schwerwiegenden Verlauf vieler Herzerkrankungen wie auch der HCM hinweisen (McKenna et al. 1989), wird im Langzeit-24h-EKG gesucht. Je nach Zustand des Patienten führt man zunächst eine konservative Therapie durch. Die Patienten sollen schwere körperliche Belastungen vermeiden. Beim Auftreten von Vorhofflimmern wird eine Antikoagulantientherapie eingesetzt und in Abhängigkeit von der Vorhofgröße wird versucht, einen Sinusrhythmus zu erlangen. Die medikamentöse Therapie der HCM stützt sich auf den Einsatz von β-blockern und Kalziumantagonisten, die die Belastungsfähigkeit von Patienten mit HCM steigern. Relativ günstige Erfahrungen liegen mit Kalziumantagonisten vom Verapamiltyp vor. Die noch nicht etablierte Therapie mit DDD-Schrittmachern stimuliert das Ventrikelseptum, so daß es sich kurz vor der übrigen Kammermuskulatur kontrahiert. Dies soll zu einer günstigeren Ejektionsdynamik führen. Ein relativ großer Teil der Patienten spricht auf eine medikamentöse Therapie an. Selten muß die septale Myotomie-Myektomie durchgeführt werden. Hierbei wird entweder transaortal oder transventrikulär ein Teil des hypertrophierten Ventrikel-Septums entfernt. Diese Operation bewirkt eine symptomatische Verbesserung der Patienten, die Mortalität liegt jedoch bei 5% (Harrison et al. 1996). Alternativ kann heute eine transarterielle Okklusion eines Septalastes mit Instillation von reinem Alkohol (TASH) zur Verbesserung der Klinik des Patienten führen (Faber et al. 1998). 1.4 Genetik der HCM In den 60er Jahren wurde vermehrt von Großfamilien berichtet, in denen diese Krankheit gehäuft auftrat (Hollmann et al. 1960, Pare et al. 1962). Seither wird ein Gendefekt als Ursache dieser Krankheit in Betracht gezogen. Seit 1987 (Maron et al.) wird von einer familiären hypertrophen Kardiomyopathie (FHC) gesprochen, wenn bei einem Patienten mit primärer myokardialer Hypertrophie mit Hilfe der Familienanamnese mindestens ein weiteres betroffenes Familienmitglied identifiziert

12 5 werden kann. Die Penetranz, die die Tendenz zur Ausprägung von typischen Symptomen bei genetischen Merkmalsträgern bezeichnet, ist bei jungen Patienten inkomplett, erreicht jedoch mit zunehmendem Alter der Patienten nahezu 100%. Der Erbgang der HCM ist in den meisten Fällen autosomal dominant. Neben der familiären Form kann eine hypertrophe Kardiomyopathie auch sporadisch auftreten. Dies soll bei bis zu 44% der Fälle mit HCM auftreten (Maron et al. 1984, Watkins et al. 1992, Greve et al. 1994). Zum Zeitpunkt der Untersuchung im Jahre 1996 waren Mutationen in vier verschiedenen Genen als Krankheitsverursacher identifiziert (β-mhc, Troponin T, MyBP-C, α-tm). Im Gen der schweren Kette des β-myosins (β-mhc) waren 20 verschiedene Mutationen bekannt und daher wurde das Gen als Hauptverursacher der Krankheit anerkannt. Inzwischen konnten mit Hilfe von Kandidatengenen und Kopplungsanalysen in Familien insgesamt zehn Gene ermittelt werden, die die HCM hervorrufen, von denen zwei Gene erst vor kurzem ermittelt wurden, das α-aktin (Morgensen et al. 1999) und das Titin (Satoh et al. 1999). Bei sieben veränderten Proteinen (β-mhc, Troponin T, MyBP-C, α-tm, Troponin I, ELC, RLC) handelt es sich um Proteine mit myokardialer Motorfunktion oder um Proteine, die diese Funktionen kontrollieren. Somit kann die HCM heute als eine Krankheit des Sarkomers definiert werden (Thierfelder et al. 1996, Vosberg et al. 1998). Proteine, die bei Mutationen zur Ausprägung der HCM führen, haben unterschiedliche Eigenschaften und Aufgaben im funktionellen Apparat des Herzmuskels. Einige haben eher eine enzymatische und krafterzeugende Aufgabe (β-mhc), andere spielen eine strukturelle Rolle (MyBP-C) und wiederum andere übernehmen eine regulatorische Rolle (Troponin I, T und α-tropomyosin) im funktionellen Apparat. Trotzdem führen sie alle zu dem Hauptmerkmal der HCM, der Hypertrophie des linksventrikulären Myokards. Jarcho et al fanden die ersten die HCM verursachenden Gendefekte im Gen der schweren Kette des β-myosins (β-mhc) auf dem Chromosom 14q1. Das β-myosin- Gen gehört zu einer Multigenfamilie für die schwere Kette der Skelett- und

13 6 Herzmuskelmyosine auf den Chromosomen 17 und 14. Die auf dem Chromosom 14 lokalisierten kardialen Myosingene vom Typ α und β werden im Herzen differentiell exprimiert, α-myosin in der Vorhof- und β-myosin in der Kammermuskulatur (Saez et al. 1987, Epp et al. 1993, Jaenicke et al. 1990, Liew et al. 1990). Mutationen im β- MHC-Gen sind die häufigste Ursache der HCM (ca. 35%). Das β-myosin-gen besteht aus einer N-terminalen Kopf- und einer C-terminalen Schwanzregion. Die meisten Mutationen befinden sich im Bereich des Kopfes oder im Übergang von Kopf- zu Schwanzregion, jedoch selten im Schwanzbereich. Zur Zeit sind über 50 verschiedene Mutationen im β-mhc-gen detektiert, das sind etwa 50% aller Mutationen, die bisher für die HCM verantwortlich gemacht werden. Es handelt sich hierbei um Punktmutationen mit Basenaustausch (Vosberg et al. 1998, Redwood et al. 1999). Bereits 1993 berichteten Thierfelder et al. über Familien mit Mutationen in dem α- Tropomyosin-Gen auf dem Chromosom 15q2. Hierbei handelt es sich um ein dimeres langgestrecktes Protein, das mit Aktinfilamenten Komplexe bildet. Das Gen besteht aus mindestens 9 Exons. Bisher sind 3 verschiedene missense mutations beschrieben worden; man erwartet in circa 3% eine der bisher beschriebenen Mutationen in diesem Gen (Vosberg et al.1998). Ebenfalls im Jahr 1993 berichteten Watkins et al. von krankheitsverursachenden Mutationen im kardialen Troponin T auf Chromosom 1q3. Troponin T ist eine Untereinheit des heterotrimeren Troponinkomplexes, der in den Sarkomeren an Aktinfilamente gebunden ist. Es tritt in Wechselwirkung mit Tropomyosin und kontrolliert so die Reaktion zwischen Aktin und Myosin in Abhängigkeit von Calzium. In diesem Gen sind 11 Mutationen bekannt. Das sind 11% aller bisher beschriebenen Mutationen (Thierfelder et al. 1994, Moolman et al. 1997). Bei den Mutationen handelt es sich überwiegend um missense mutations, die zum Aminosäureaustausch führen. In manchen Fällen gibt es Insertionen und Deletionen sowie Punktmutationen an Spleiß-Donor- bzw. Akzeptorpositionen. Durch Mutationen an diesen Positionen kommt es zu aberrantem Spleißen (Vosberg et al. 1998, Redwood et al. 1999). Auf dem Chromosom 11 liegt das kardiale Myosin-Bindungs-Protein-C (MyBP-C) (Watkins et al. 1995, Bonne et al. 1995). Mit seinem C-Terminus bindet sich das

14 7 Myosin-Bindungs-Protein-C an die C-terminale Region der schweren Myosinketten und an Titin. Seine Funktion ist nicht restlos geklärt. Bisher sind 25 Mutationen beschrieben worden (25% aller bisher beschriebenen Mutationen in den Genen für HCM), wobei auch seltene Mutationen wie Veränderungen von Spleißsignalsequenzen und Insertion bzw. Deletion im Gen gesehen wurden. Die erwartete Synthese von grob fehlerhaften und erheblich verkürzten Myosin-Bindungs-Proteinen blieb jedoch aus. Statt dessen war die Anzahl funktionstüchtiger Proteine geringer als normal. Man nimmt an, daß diese Veränderung in der Literatur als Haploinsuffizienz bezeichnet zur Entstehung der Krankheit führt (Vosberg et al. 1998, Redwood et al. 1999). Auf Chromosom 3 befindet sich das Gen für die leichte Myosinkette vom Typ ELC (essential light chain), und auf Chromosom 12 liegt das Gen für die leichte Myosinkette vom Typ RLC (regulatoric light chain) (Poetter et al. 1996). Beide leichten Myosinketten binden sich gemeinsam an die schweren Ketten des β-myosins in einer α- helikalen Region am C-Terminus der S1 Domäne. Sie spielen eine wichtige Rolle für die Kontraktion des Herzmuskels. Bisher sind drei Punktmutationen im RLC-Gen und zwei im ELC-Gen identifiziert worden. Insgesamt kommen Mutationen in diesen Genen mit einer Häufigkeit von 2-4% vor (Vosberg et al. 1998). Mutationen werden außerdem auf dem Chromosom 19 in dem kardialen Troponin I Gen beschrieben (Kimura et al. 1997). Bei dem Troponin I Gen handelt es sich um eine Untereinheit des Tropomyosinkomplexes. Bisher sind 6 Mutationen beschrieben worden, bei denen es sich um 4 Punktmutationen sowie eine Kodondeletion handelte. Ca. 7% der bisher beschriebenen Mutationen befinden sich in diesem Gen (Vosberg et al. 1998). Jüngste Berichte beschreiben das α-aktin (Morgensen et al. 1999) und das Titin (Satoh et al. 1999) als krankheitsverursachende Gene. Bei einer Familie mit HCM und Wolf-Parkinson-Syndrom konnte ein positiver Kopplungsbefund auf dem Chromosom 7 nachgewiesen werden. Das der Erkrankung

15 zugrundeliegende Gen konnte allerdings bislang noch nicht identifiziert werden (MacRae et al. 1995) Molekulare Pathomechanismen Auch wenn verschiedene Gene und Mutationen als Verursacher der HCM identifiziert worden sind, so sind die Zusammenhänge zwischen der Mutation und der Ausprägung der Krankheit bei den Patienten noch unklar. Die heutige Meinung ist, daß die Hypertrophie des Myokards aus einem Kontraktionsdefizit resultiert, das durch die im Mikroskop sichtbare Disarray der Myofibrillen entsteht. Die Kraftübertragung wird gestört durch die Disarray als Folge der fehlerhaften Zusammensetzung des Sarkomers. Allerdings unterscheiden sich die molekularen Krankeitsmechanismen in den einzelnen Gendefekten. Durch die Gefügestörung des Myokards sollte man Unterschiede in der Ausprägung der Hypertrophie erklären können. Die Gefügestörung und die Hypertrophie sind für die linksventrikuläre Füllungsbehinderung und für die Arrhythmien ursächlich verantwortlich zu machen. Sie beeinflussen wesentlich den klinischen Verlauf, das Erkrankungsalter und die Penetranz bei der HCM. Sind die Gendefekte im einzelnen bekannt, könnte der Verlauf der Erkrankung prognostiziert werden. 1.6 Häufigkeit der HCM bei Patienten ohne nachweisbare FHCM Annahmen zur Häufigkeit der unterschiedlichen Gendefekte stützen sich bisher nur auf die Zahl der aufgefundenen Familien. Bei Familienscreening ist der Krankheitsnachweis unabhängig vom Schweregrad der Krankheit. In Familienuntersuchungen werden die ca. 50% sporadisch auftretenden Fälle nicht berücksichtigt. Im Gegensatz zu vielen bisher veröffentlichten Untersuchungen zur FHC sind unverwandte HCM- Patientenkollektive wenig untersucht worden. Demzufolge bleibt unklar, welche

16 Genmutationen den Krankheitsbildern dieser Patienten zugrunde liegen, die klinisch auffällig geworden sind Einfluß modifizierender Gene Neben den krankheitsverursachenden Mutationen finden sich in den HCM verursachenden Genen zahlreichen Polymorphismen. Wenn in einer menschlichen Population für einen Lokus mehr als eine Variante (ein Allel) mit einer Häufigkeit von über 0,01 nachweisbar ist, wird dieses Phänomen als Polymorphismus bezeichnet. Polymorphismen können mit Funktionveränderungen und damit mit Erkrankungen assoziiert sein, entweder weil sie selbst zu einer funktionellen Veränderung im Gen führen oder mit funktionellen Varianten gekoppelt sind. Aufgrund ihrer Häufigkeit kommen Polymorphismen jedoch nicht als Ursache seltener Erkrankungen in Betracht. Seltene Varianten werden als Mutationen bezeichnet die als Verursacher monogener Erkrankungen in Betracht kommen (Strachnan et al. 1994). Polymorphismen in HCM verursachenden Genen wurden bislang nicht systematisch untersucht. In jüngster Zeit konnte gezeigt werden, daß das klinische Bild auch in Familien mit identischen Genmutationen unterschiedlich ist. Dies wird auf den modifizierenden Einfluß der Umwelt und den anderer Gene, die mit Hypertrophie und zellulärer Organisation zusammenhängen, zurückgeführt. Insbesondere das ACE-Gen, das Wachstumsprozesse beeinflußt, wurde als modifizierendes Gen postuliert. Die erhöhte Serumkonzentration von ACE wird mit mehreren kardiovaskulären Erkrankungen in Verbindung gebracht. Rigat et al. untersuchten 1990 den Polymorphismus des Angiotensin-I-Converting-Enzym-Gens. Mit dem D-Allel fanden sie einen Marker, der mit einem erhöhten Serumspiegel von ACE im Blut korreliert. Der Polymorphismus besteht aus einer Insertion bzw. Deletion eines 287bp DNA Fragmentes untersuchten Marian et al. ein Kollektiv von 100 Patienten mit hypertropher Kardiomyopathie. Sie verglichen diese Gruppe mit einer Gruppe gesunder Patienten

17 10 und fanden bei HCM-Patienten einen häufigeren D/D-Genotyp, der vor allem in Familien mit einem hohen Risiko für einen plötzlichen Herztod nachgewiesen wurde. Yoneyga et al. (1995) kamen zu ähnlichen Ergebnissen. Auch Osterziel et al. (1996) bestätigten die Assoziation zwischen ventrikulärer Tachykardie und D/D-Genotyp. Rhythmusstörungen und insbesondere die ventrikulären Rhythmusstörungen stellen ein erhöhtes Risiko für den Patienten dar, einen plötzlichen Herztod zu erleiden. Das Risiko wäre leichter erkennbar, wenn ein erhöhtes D-Allel einen Marker darstellen würde. Dann könnte das D-Allel als risikoerhöhender Faktor bei der Diagnostik der HCM eingesetzt werden. 1.8 Fragestellung Wir haben in der vorliegenden Arbeit untersucht, wie häufig Varianten im β-myosin- Gen und α-tropomyosin-gen in dem unverwandten Patientengut eines tertiären Referenzzentrums auftreten, wie die entsprechenden Patienten klinisch und phänotypisch charakterisiert sind und ob sich eine Beziehung zwischen Genotypisierung und Phänotypisierung zeigen läßt. Außerdem sollte der Frage nachgegangen werden, ob das D-Allel des ACE-D/I-Gens bei unseren HCM-Patienten bzw. HCM-Patienten mit Rythmusstörungen häufiger als bei einer gesunden Vergleichsgruppe nachzuweisen war und sich somit ein modifizierender Einfluß des ACE-D/I-Genotyps erkennen läßt. Die genauere Kenntnis der Beziehung zwischen Genotyp und Klinik bei Patienten mit hypertropher Kardiomyopathie könnte es erlauben, eine Risikostratifizierung von Patienten mit HCM anhand genetischer Parameter durchzuführen. Diese würde gestatten, das Risiko für einen plötzlichen Herztod besser abschätzen und eine die Prognose verbessernde Therapie gezielter einsetzen zu können.

18 11 2 Methoden 2.1 Auswahl der Patienten Aus dem Patientengut des Deutschen Herzzentrums Berlin wurde konsekutiv den 60 Patienten mit HCM, die von 1990 bis 1996 diagnostiziert wurden, eine Untersuchung auf Bestimmung des Genotyps vorgeschlagen. Die Patienten wurden über den Ablauf der Untersuchung aufgeklärt und gaben schriftlich ihr Einverständnis zur Genotypisierung und detaillierten Erfassung des Phänotypes. Über 80% der Patienten erklärten sich zur Untersuchung bereit. Den Patienten wurde jeweils 5ml Blut für die Genotypisierung abgenommen. Die klinische Diagnose erfolgte nach international anerkannten Methoden (Maron et al. 1981, McKenna et al. 1988). 45 Patienten mit hypertropher Kardiomyopathie im Alter von Jahren konnten eingeschlossen werden. Von allen Patienten wurden mit der Erfassung des Phänotyps die Daten folgender Untersuchungen aufgenommen: Ruhe-EKG, 24h-EKG, Echokardiographie in 2D-Mode und Dopplerechokardiographie, Herzkatheter- und Angiographieuntersuchungen. Die Krankheit war bei allen Patienten echokardiographisch diagnostiziert und zusätzlich bei 31 Patienten (67,4%) mittels Herzkatheter bestätigt. Als Kriterium für die Aufnahme in das Untersuchungskollektiv waren eine Interventrikularseptumdicke (IVS) von mehr als 13 mm und eine Septum/Hinterwandratio von mehr als 1,3 ausschlaggebend. In unklaren Fällen bewiesen die Befunde der Herzkatheteruntersuchungen das Vorliegen der Krankheit. Klinische Befunde, Elektrokardiogramme und in 30 Fällen Langzeit- Elektrokardiogramme dieser Patienten wurden systematisch analysiert. Da sich 5 Patienten einer Muskelteilresektion hatten unterziehen müssen und sich damit ihre Septumdicke fast normalisiert hatte, wurden sie in die statistische Auswertung der Echokardiographie-Daten (Mittelwerte und Standardabweichung von IVS, HW, IVS/HW, LVEDD, LVESD, FS) nicht einbezogen. Die Ethikkommission der Medizinischen Fakultät Charité, Campus Virchow Klinik hat die Untersuchung genehmigt.

19 Anamnese In der detaillierten Anamnese wurden die Patienten nach Symptomen der Krankheit (Dyspnoe, AP-Symptomatik, Präsynkopen und Synkopen), der Einnahme von Medikamenten und insbesondere dem eventuellen Vorkommen der hypertrophen Kardiomyopathie in ihren Familien befragt. 2.3 Methoden zur Diagnose der hypertrophen Kardiomyopathie Echokardiographie Mit der nicht-invasiven Methode der Echokardiographie wurde die hypertrophe Kardiomyopathie ambulant diagnostiziert. Kardiologen wandten bei unseren Patienten die 2-Dimensionale- und Doppler- Echokardiographie an. Folgende Schnitte wurden standardgemäß durchgeführt: parasternale lange Achse, parasternale kurze Achse in Höhe der Aortenklappe, der Mitralklappe und der Papillarsehnen und der apikale zweiund vier- Kammerblick. Es wurden die Dicke des Interventrikularseptums und der Hinterwand des linken Ventrikels, der linksventrikuläre endsystolische und enddiastolische Druck und die Verkürzungsfraktion bestimmt Perkutane transluminale Angiographie Die perkutane transluminale Angiographie (PTA) ist eine invasive Untersuchungsmethode. Die Indikation zur Untersuchung muß streng gestellt werden, ist aber oft nach Zusatzfragen indiziert. Es wurde die Einführung des Katheters nach der Seldinger Technik durchgeführt (Seldinger-Nadel PG 160 bzw. 205). Zugangsweg ist die Arteria femoralis. Nach Lokalanästesie wird die Arterie punktiert. Sodann wird durch die liegende Nadel ein Führungsdraht mit einer flexiblen Spitze in die Arterie eingefügt. Die Nadel wird entfernt und über den liegenden Mandrin wird ein Oedman-

20 13 Katheter aufgezogen und in das Gefäß eingeführt. Der Mandrin wird entfernt. Unter Bildverstärkerfernsehkontrolle wird die Spitze des Katheters an die Stelle des Gefäßsystems oder des Herzens gebracht, an der das Kontrastmittel injiziert werden soll. Bei dem Oedman-Katheter tritt das Kontrastmittel üblicherweise durch seitliche Perforationen aus, um durch den Drüsenstrahl die Gefäßwand nicht zu verletzen. Als Kontrastmittel werden trijodierte, wasserlösliche Mittel wie z. B. Angiographin (Schering AG) und Conray (Byk-Gulden) verwendet, da diese bei hoher Kontrastmitteldichte sehr rasch durch die Nieren ausgeschieden werden und kaum toxische Reaktion zeigen. 31 unserer Patienten wurden mit der PTA untersucht. Folgende Parameter wurden in die Auswertung einbezogen: Linksventrikuläres endsystolisches und enddiastoliches Volumen, linksventrikuläre Ejektionsfraktion, enddiastolicher Druck, pulmonalarterieller Druck, aortaler Druck in der Systole. 2.4 Datenbank der 45 Patienten Zur Erfassung und Auswertung unserer Patienten haben wir eine Datenbank erstellt. Als klinische Daten wurden aufgenommen: Stammdaten (Alter, Geschlecht, Alter bei Diagnosestellung, Familienanamnese, Symptome), Elektrokardiogramm Daten ( Rhythmus, LVH, HF, VES, SVES, Couplets) Echokardiographische Daten ( LVEDD, LVESD, IVS, HW, FS) Herzkatheterdaten (LVEDV, LVEF, EDP, PAP, AoPS) medikamentöse Therapie, Muskelresektion, implantierbarer Kardioverter Folgende Informationen genetischer Daten jeder Probe wurden erfaßt: Standort der DNA die Qualität und Quantität der DNA die Genotypisierung

21 14 Folgende Genotypisierungsdaten sind vorhanden: ACE: I/D Polymorphismus α-tropomyosin /β-mhc Komplettes Mutationsscreening in allen Exons und Exon-Intron- Übergängen PDB-GeEx-Software Die Datenbanken unserer Patienten wurden mit der PDB-GeEx-Software erstellt Programmstruktur Das Programm dient der Erfassung der erhobenen Forschungsdaten und gliedert sich in zwei Programmteile. Der erste Programmteil dient der täglichen Dateneingabe sowie der direkten und schnellen Einsicht in die Daten eines Patienten oder einer Probe. Dieser Programmteil wurde als Intranetanwendung plattformunabhängig realisiert. Der zweite Programmteil ermöglicht den Import größerer Datenmengen und bietet die Möglichkeit, einen Befundbericht zu drucken. Diese Funktionen wurden mit einem Visual Basic V6.0 Programm erstellt. Als Datenbank dient MS Access 97. Systemanforderungen Die Systemanforderungen müssen in Hardware, Software und Internet den neuesten Anforderungen genügen. Datenbankaufbau Das Programm verwendet zwei Datenbanken. Die eine Datenbank enthält Userdaten. Mit dieser können durch entsprechende Modifikationen einzelne Bereiche vor unerlaubtem Zugriff gesichert werden. Die zweite Datenbank beinhaltet die Patienten-Daten. Die einzelnen Tabellen der Patienten-Datenbank sind durch Schlüsselfelder miteinander verbunden und hierarchisch gegliedert.

22 15 Datenimport Der Import umfaßt fünf verschiedene Importdateien: HK-Import, Echoimport, Stammdaten-Import, EKG-Import, Therapie-Import. Alle Importtabellen sind mittels einer intern vom Programm vergebenden PIN an die Datenbank angebunden. Jede beliebige Kombination von Parametern (klinische Daten, Genotypen, Probeeigenschaften) kann abfragt werden. 2.5 Statistik Deskriptive Statistik Zur Charakterisierung des Patientengutes wurden der Mittelwert und die Standardabweichung folgender echokardiologischer Ableitungen ermittelt: die Größen der Interventrikularsepten und der Hinterwände sowie der Quotient aus beiden Werten, des linksventrikulären endsystolischen- und enddiastolischen Druckes und der Verkürzungsfraktion der Patienten. Mittelwert Das arithmetische Mittel ist definiert als Summe aller Meßwerte, dividiert durch deren Anzahl. x n i= = 1 n x i

23 16 Standardabweichung Die mittlere Abweichung vom Mittelwert bezeichnet man als Standardabweichung. s = n i= 1 ( xi x) n Hardy-Weinberg-Gesetz Zur Analyse der Verteilung des ACE-Polymorphismus in unseren Patienten mit HCM wurde das Hardy-Weinberg-Gesetz angewendet. Das Hardy-Weinberg-Gesetz drückt die Beziehung zwischen Allelfrequenzen und Frequenzen der Genotypen in einer stabilen homogenen Population aus. Daraus können Mutationsraten ermittelt und die Häufigkeit von Genträgern errechnet werden. Die Voraussetzung ist, daß beide Gene einer Person unabhängig voneinander und nach dem Zufallsprinzip im Erbgut vorkommen können. Sind D und I die einzigen Allele an einem Lokus, so gilt p+q = 1, sind noch andere Allele und Genotypen vorhanden, gilt p+q < 1 (Strachnan et al. 1994). Die beobachteten absoluten Häufigkeiten lassen sich aus den Untersuchungsergebnissen ablesen: Anzahl der jeweiligen Allele Die relativen Häufigkeiten können daraus wie folgt errechnet werden: relative Häufigkeit (Allelfrequenz) p q = p Allele q Allele = alleallele alleallele Aus den Allelfrequenzen lassen sich die Erwartungshäufigkeiten für die einzelnen Genotypen mit folgender Formel: p²+2pq+q² = 1 bestimmen. Für den ACE- Polymorphismus ergibt sich daraus: DD = p², DI = 2pq, und II = q². Die errechneten erwarteten Häufigkeiten werden wie folgt ermittelt: Erwartungshäufigkeiten x Anzahl der Individuen

24 Analytische Statistik Mit Hilfe des χ² Testes kann allgemein ermittelt werden, ob sich beobachtete Werte (B) von (unter der Hypothese H 0 ) erwarteten Werten (E) signifikant unterscheiden. Der Testwert für die Anwendung des χ²-test und der Freiheitsgrad werden folgendermaßen ermittelt: n ( E B)² Testwert: E i= 1 Freiheitsgrad: f = n-1 In Statistiktabellen für den χ²-test ermittelt man durch den Vergleich von Freiheitsgrad und Testwert die Irrtumswahrscheinlichkeiten (α). Signifikant ist ein Wert zwischen 0,05 und 0,001 (Sachs et al. 1999).

25 Materialien Geräte Autoklav Brutschrank Elektophoresekammern Varioklav Typ 500, H+P Labortechnik, München Heraeus Instruments UT 20, Berlin GNA 200, Pharmacia LKB, Freiburg Horizon 58, Gibco BRL, Eggenstein Multigel-Long, Biometra, Göttingen Geldokumentationsanlage Geltrockner Laborwaage Magnetrührer Mikrowelle PCR-Gerät ph-meter Photometer Schüttelinkubator Schüttler Sequenzierer TI; BioDoc H ; BioDoc CCD-Camera, Biometra, Göttingen Geldryer Model 583; VaporTrap; Vacuum Pump, Bio-Rad; Richmond, USA Typ , Sartorius, Göttingen MR 3001 K, Heidolph, München Micromat, AEG Gene Amp PCR System 9600, Perkin Elmer, Weiterstadt Delta 320, Mettler Lumat LB 9501, Berthold, Bad Wildbad Model 3033, GFL, Burgwedel SM 25, Bühler, Tübingen ABI Prism 377 DNA-Sequenzierer, Perkin Elmer, Weiterstadt Spannungsgeräte Elektrophoresis Power Supply EPS 200, Pharmacia Biotech, Freiburg Sterile Werkbank Vortex Mixer Wasserbad Zentrifuge Lamin Air HBB 2448, Heraeus, Berlin Reax 2000, Heidolph, München Typ WB 7, Memmert, Schwabach Centrifuge 5417 C, Eppendorf, Hamburg

26 Chemikalien Es wurden nach Möglichkeit Chemikalien mit der Qualitätsbezeichnung p.a. verwendet. Amresco, Ohio Biozym, Hameln Bohrender, Mannheim Braun, Melsungen Gibco BRL, Eggenstein Acryl- 40 Solution, Bis- 2 Solution Agarose universal dntps (Desoxy-Nukleotidtriphosphate) Aqua ad injectabilia LBAgar (lennox L Agar), S.O.C. Medium ulta Pure Merck, Darmstadt Borsäure, Essigsäure, Ethanol, Natriumbicarbonat, Salpetersäure, Silbernitrat, Tris Base [(Trishydroxymethyl)- Aminomethan], Tritriplex III Ethylendinitrilotetraessigsäure, Dinatriumsalz- Dihydrat) Pharmacia, Freiburg Ficoll 400 Sigma- Chemie, Taufkirchen Ampicillin, Bromphenolblau, 5-Bromo-4- Chloro-3-Indolyl β-d-galactopyranosid, DMSO (Dimethylsulfoxid), Ethidiumbromid, Formaldehyd, N,N- Dimethylformamid, Temed (N,N,N,N- Tetramethylethylenediamin), X- Gal

27 Enzyme und Längenstandards Biolabs, Schwalbach/Ts Gibco BRL, Eggenstein MBI Fermentas, Vilnius BstNI, BstYI, DraI, NlaIII, SspI, AflII 50Bp DNA Ladder, 100Bp DNA Ladder, Taq-DNA-Polymerase, Taq- DNA Polymerase (recombinant) 100Bp DNA Ladder, BseNI, HinfI Sonstiges Filterpapier Gelfilter Kits Kompetente Zellen Vektor Whatman 3MM GF/C Filter Whatman Nr , Maidstone, England Sephacryl S-200 von Pharmacia Biotech, Freiburg Quiagen-tip 20 von Quiagen, Hilden PRISM DNA Sequencing Kit Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction von ABI Perkin-Elmer, Weiterstadt Quiagen Plasmid Mini Kit von Quiagen, Hilden SureClone Ligation Kit von Pharmacia Biotech, Freiburg Epicurian Coli XL1-Blue Competent Cells von Stratagene puc18 Vektor von Pharmacia Biotech, Freiburg

28 Synthetische Oligonukleotide (Primer) Tab. 1: Synthetische Oligonukleotide (Primer) zum Nachweis des ACE-Polymorphismus Intron Sequenz Größe Annealing- Temperatur Intron GCTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT TAGACCTCCACGACCCCTGCAT bp oder 781 bp 60 C Tab. 2: Synthetische Oligonukleotide (Primer) zur Amplifikation des α-tropomyosin-gens Exon Sequenz Annealing-Temperatur Exon CCG GAA TTC TGC TGC AGG CCC AGG CCC C GGT GCC AGG CTC GAG TCC CG 3 Exon TCC CTG TAC CCC CTG GCC AA CGC GGA TCC GGG AAG CAG TGT GAG CGT GC 3 Exon CCC AGC CAT TTC CTG AAG CTA CCA CCA CCA GGA AAG GCA GCT GCA AAA G 3 Exon GGC CAC AGC AGT GCA GTG TGC ATT T GGC TGT CCT GAA GGC CAC TGC T 3 Exon CCA TGC CCT TCT GTT ACA CAA AGC TGC CAG AAG GTC ATG CTG TTT AGT C 3 Exon TTG GCT TGT CTC CCA CCC TT GGC CTC TTT TGA GCA GCT CTT AAA AG 3 Exon GAG TAG ATT GAG CAG CAG CTT GAC A ATG AAA AGG CCT GAC CGG TTC CAT G 3 Exon CCC TAT GTT TGT AGC TAC AGG AAA C AGT GCA AAG GAG CGT ATC AAT GTG G 3 Exon TCT GCC TTC CAC TTC CTG GT CAA GGA GGC ATG GTG GTG AGT TTA 3 62 C 66 C 66 C 66 C 56 C 58 C 58 C 62 C 58 C

29 Tab. 3: Synthetische Oligonukleotide (Primer) zur Amplifikation des β-mhc-gens 22 Exon Sequenz Position Größe Annealing- Temperatur 1 5 -TGC TGC CCC ATA TAT ACA GC `-GCA TGA AGT CCT GCA TGA AG `-AAG CAG GAA GGT GGG ACT GGT `-GCT CTA ATG CCC AGT CTT AC `-CCA GGG AGG GAA GGG AAG A TGT ACA GGT GGC CAG GGT GGA AAC CCT CTT GAG GAA GGA GG TGG ATG GAG CAA GAA CAG AG CTC TAA CTC CCA AAA TCA CC TAT CCC AGT TCC CTT CAG GAA CAC GAG AGC ATC CTG TGC A_ CTG GGA TCA GGG AGA TTC TG GGT CTC CAG TAG TAT TGT TC TCT TCT CCC TCC CTT CTG CG TGT ACC GCA GAA GGG AGG G GGT GAG CTT AGG CTG AGC CT TTT CCT TGT GCC CAA ACC CT AGT TGG TCT CAG TCG GTG GC GCT TGT GTC CCC TAA CCA TGT CCT CAC TGC CAA TCC TCC C AGG GAT CTC ACT TAC CCA TC CCA AGA ATC CCT GCC TCC CAC CCA GCA GTC ATC TCT TTA CC ATG CCA GTC TCC CTA CTA CCC T CCT GCT CAA TAT GGG TCT CTC AAT GTG GGA GCG AGT GAG TG

30 23 Exon Sequenz Position Größe Annealing- Temperatur CCA CTC ACA CCC ACT TTC TG CAA GGG CTC GGA TCC TTC AG a 5 -CCT GTG TGA AGG CTC AG CGG CAT AGT GGA TCA GGG AG b 5 -TGT TTG ACA ACC ACC TGG GC CTG GCT CAG AAC CTT GGC AGA CCT ACC TCC CCA CAC TAG TG GCC AAG TTG GCT GGG GCT GTG TC TC CTG CAT CTC TTT CTG GC TAG GGA GAT GTC CTA GGA GG CTC ACA GAC TCC TCC TAC TT ATC CCA TTC CCA TCA GG CAG CAG AGC AGA TCA CTG CAG AGC GGA GTC AAT GGA AAA GAG ATG GC CCATCT CTT TCC CTC GTA CC AAC CAG CCT GGG CCT CAA GAG AA ACC TCA GGT AGG AAG GAG GC TGT GGG AAG TGA AGG CAG AGC CCT GCA AGA ATG G AGG ACC T AGA CCC GGG CTG GAG CCA AA

31 2.7 Isolierung und Aufarbeitung menschlicher genomischer DNA 24 Hochmolekulare menschliche DNA wurde aus kernhaltigen Leukozyten isoliert, die von eingefrorenem oder frischem Blut stammten, dem EDTA als Antikoagulanz zugesetzt war (Miller et al. 1988). Die Bestimmung der Konzentration und Reinheit der isolierten DNA erfolgte anschließend durch spektrometrische Messung bei 260 nm und 280 nm. 2.8 Polymerase-Kettenreaktion von genomischer DNA Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine durch Mullis et al. (1987) eingeführte Methode. Ein beliebiger Abschnitt eines Gens kann durch die PCR, ein System aufeinander folgender DNA-Synthesen, enzymatisch vervielfältigt werden. So entstehen etwa 10 5 Kopien der DNA-Ziel-Sequenz (Strachnan et al. 1994). Es können Fragmente von 100 bp (Basenpaare) bis auf über 10 kb vermehrt werden. (Cheng et al. 1994). Dafür werden zwei Oligonukleotide (Primer) benötigt, die an komplementäre Sequenzen der DNA binden und den zu amplifizierenden Teil der DNA jeweils vom 5 - Ende zum 3 -Ende einrahmen. Der Vorwärts- (forward-) Primer wird komplementär zur Sequenz am 3 -Ende des Gegensinnstranges (antisense strand) und der Rückwärts- (reverse-) Primer komplementär zur Sequenz am 5 -Ende des Sinn-Stranges (sense strand) ausgewählt. Weiterhin benötigt man eine ausreichende Menge Desoxynukleosidtriphosphate (dntps) und eine hitzebeständige DNA-Polymerase, in diesem Fall die Taq- (Terminus aquaticus) Polymerase. Die entstandenen Amplifikate können für die verschiedenen Methoden des Mutationsnachweises eingesetzt werden.

32 25 Ein PCR-Standardansatz mit einem Gesamtvolumen von 25µl enthält folgende Reagentien: 2,5 µl PCR-Puffer 4 µl dntps (je 200M von ATP, CTP, GTP, TTP) 0,2 µl Taq-Polymerase ( 1U/µl) 3 µl DNA (20ng/ ml) 3 µl Forward-Primer (10 pmol/µl) 3 µl Reverse-Primer (10 pmol/µl) ad 25 µl Aqua inject. Die isolierte DNA der Patienten wurde als Template für die PCR verwendet. Die Primer lassen sich aus den vorangegangenen Tab. 1, 2 und 3 entnehmen. Die PCR wurde dann in dem Thermozykler Perkin Elmer Gene Amp 9600 nach folgendem Standardprotokoll durchgeführt: I 5 min 94 C initialer Denaturierungsschritt II 20 sec 94 C Denaturierung 20 sec (Tabelle) Primer-Annealing in 35 Zyklen 20 sec 72 C Primer-Verlängerung III 5 min 72 C finaler Verlängerungsschritt Die PCR-Produkte wurden anschließend in einer Gibco BRL Horizon 58 Elektophorese-kammer auf ihre Fragmentlänge geprüft. Es wurde ein 2%iges Agarosegel (20ml) mit 2 µl Ethidiumbromid (10mg/µl) in 1fach TBE (0,1M Tris Base; 0,1M Borsäure; 0,002M Tritriplex III) verwendet.

33 26 Jeweils 4 µl des PCR-Produktes gemischt mit 2 µl Agaroseladepuffer (5fach TBE; 20% Ficoll 400; Bromphenolblau (0,1%ige Lsg.); Aqua dest.) wurden auf das Gel aufgetragen und mit einer Spannung von 100V elektrophoretisch aufgetrennt. Als Längenstandard diente ein 100 bp DNA Leiter. Die mit Ethidiumbromid gefärbte DNA wurde auf einem Transluminator unter UV-Licht sichtbar gemacht und das Ergebnis mittels einer Videodokumentationsanlage der Firma Biometra, Göttingen aufgezeichnet. 2.9 SSCP-Analyse Zur Suche nach Mutationen wurde die SSCP-Analyse (single-strand-conformationalpolymorphism) durchgeführt. Bei dieser Methode werden die PCR Fragmente durch Hitze denaturiert, und anschließend werden die einzelsträngigen DNA-Fragmente unter nicht denaturierenden Bedingungen elektrophoretisch aufgetrennt (Abb.2). Es werden schon Unterschiede in der DNA von nur einer Base erkannt. Bei einer Mutation ändert sich die Laufgeschwindigkeit des Amplifikates im Gel (Orita et al. 1989). Ihr entscheidender Vorteil liegt in der schnellen, einfachen und kostengünstigen Durchführung. Abb. 1 zeigt beispielhaft eine SSCP-Analyse der DNA von 6 Patienten ohne Vorkommen einer Variante. Abb. 1: SSCP-Analyse der DNA von 6 Patienten ohne Vorkommen einer Variante.

34 27 4 µl des PCR-Amplifikates wurden mit 6 µl eines formamidhaltigen Gelladepuffers (6 Teile Formamid; 1 Teil Agaroseladepuffer) gemischt und dann vor dem Auftragen des PCR-Amplifikates bei 95 C für 5 min denaturiert und anschließend auf Eis gelagert. Bei den benutzten Gelen handelt es sich um 10%ige Polyacrylamid- (PAA-) Gele (Acrylamid : Bisacrylamid 49:1) in 0,5 x TBE Elektrophoresepuffer (0,05M Tris Base; 0,05M Borsäure; 0,001M Tritriplex III; ph 8). Die Polymerisation der Gele geschah mit Zugabe von 0,1% TEMED (N,N,N,N-Tetramethylethylendiamin) und 0,1% APS (Amoniumpersulfat). Die hier verwendeten Gele wurden in einem Glasplattensystem (Größe 110x120x1mm) der Firma Biometra aufbereitet. Zur Durchführung der Elektrophorese wurde die Kammer des Typs Multigel-Long der Firma Biometra, Göttingen benutzt. Die Laufzeit der Gele betrug Stunden bei zwei unterschiedlichen Analysebedingungen, nämlich bei Raumtemperatur und 60V Spannung oder bei 4 C und 70V Spannung. Abb. 2: Schematische Darstellung des Prinzips der SSCP-Analyse (Grompe et al. 1993) Nach Beendigung der Elektrophorese wurden die Gele gefärbt. Die Silberfärbung nach einem Protokoll von Budowle et al. (1991), ein einfaches, kostengünstiges, sensitives

35 28 und schnelles Verfahren zur Sichtbarmachung von DNA-Fragmenten, wurde wie folgt durchgeführt: Fixierung der im Gel befindlichen DNA in 10%igem ETOH für mindestens 5 min Einstellung des ph-wertes in 1%iger HNO 3 für mindestens 2 min Färbung der Gele in 200ml 2%iger AgNO 3 unter Zugabe von 200µl Formaldehyd für min (Anlagerung der Silberionen an die DNA) Entfernen der unspezifisch gebundenen Silberionen durch dreimaliges Waschen in Aqua dest. Entwicklung der Gele in insgesamt 600 ml 30%iger NaCO 3 unter Zugabe von 300 µl Formaldehyd durch dreimaliges Wechseln der Lösung Fixierung der Gele in 10%iger Essigsäure für mindestens 10 min Zur Dokumentation wurden die Gele auf einem Whatman Filter aufgezogen und auf einem Vakuumtrockner bei 80 C 1,5 h getrocknet. Anschließend an die SSCP-Analyse unserer Patienten führten wir unsere SSCP-Analyse mit PCR-Produkten häufig vorkommender Genmutationen durch, die uns von Prof. Vosberg (MP/Bad Neuheim) als Positivkontrollen zur Verfügung gestellt wurden. Alle Varianten wurden in der SSCP-Analyse detektiert und durch die Sequenzierung bestätigt (Tab. 4). Tab. 4: Referenzmutationen bereitgestellt von Prof. Dr. Vosberg, Bad Nauheim Probenbezeichnung M utation N achweis 01/93 Arg143G ln (Ex5) SSC P R T 08/94 Val606M et (Ex 16b) SSC P 4 C 09/95 Arg403G ln (Ex 13) SSC P 4 C 13/95 Ala259G lu (Ex9) SSC P R T + 4 C 14/95 Arg249G ln (Ex9) SSC P R T + 4 C 23/95 G ly214asp (Ex 8) SSC P R T 2 6 /9 5 A rg T rp (E x1 9 ) S S C P R T 32/95 Arg403Trp (Ex13) SSC P R T + 4 C 3 4 /9 5 A rg T rp (E x 1 3 ) S S C P R T + 4 C 07/96 Arg719G ln (Ex19) SSC P R T +4 C 14/96 Arg403G ln (Ex 13) SSC P 4 C