Molekulare Diagnostik. Ralf Lichtinghagen, Klinische Chemie

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1 Molekulare Diagnostik Ralf Lichtinghagen, Klinische Chemie

2 Gliederung Methodische Grundlagen der DNA-Analytik Anwendungen der molekularen Diagnostik: Assoziation von DNA-Polymorphismen mit Krankheiten oder Krankheitsrisiken Pharmakogenetik Tumordiagnostik auf Grundlage von molekularbiologischen Methoden

3 Untersuchung von DNA Southern-Blot (Gensondentechik) Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-PCR Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung DNA-Sequenzierung DNA-Chips

4 Southern Blot

5 Southern Blot: Anwendungen Bsp: Sichelzellanämie Restriktionsenzym Mst II..CCTNAGG.. β-globingen..cctgagg.. Mutation..CCTGTGG..

6 Polymerase Chain Reaction (PCR) cycle 1 cycle 2 94 C 1min 72 C 1min 94 C 1min 72 C 1min 55 C 1min 55 C 1min denaturation annealing elongation DNA-Template, Primer (sense, antisense) Nukleotide, Puffer, Mg 2+, thermostabile DNA-Polymerase Temperaturen und Zeiten beispielhaft

7 Bedeutung der PCR-Effizienz E [%] Ausbeute [%] *) ,8 80 0,1 75 0,02 N = N 0 x E n, (E von 0-2) Effizienz (E) der Reaktion wichtig (oft 70-80%) 70 0,002 *) nach 30 Zyklen

8 Protein-Polymorphismus in einer Population Ursache: Akkumulation verschiedener Mutationen (Genpolymorphismen) im Genpool einer Population

9 Die Phänotyp-Verteilung in einer Population hängt von der Art der zugrunde liegenden Mutation ab SNP: single nucleotide polymorphisms Mehrere Millionen SNPs / Genom Coding SNPs: 3-5%

10 Mutationstypen Drei Zygotiezustände: Wildtyp, heterozygot, homozygot

11 Ermittlung eines Genotyps durch die Analyse einer bekannten Mutation RFLP (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus)-PCR (Häufigkeit des Einsatzes etwa 25%) Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung (Häufigkeit des Einsatzes etwa 50%) Genchip-Analyse zur gleichzeitigen Erfassung vieler unterschiedlicher Mutationen kommerziell bedingt erhältlich (z.b. CYP450-Array mit 33 versch. Mutationen)

12 Ausstattung für RFLP-PCR

13 RFLP-PCR Ermittlung der Punktmutation (C/T) bei Nukleotid 677 im MTHFR-Gen (Methylentetrahydrofolsäure-Reduktase) Bedeutung für den VitB 12 /Folsäure-Stoffwechsel (Artheroskleroserisiko über Einfluss auf Homocystein-Konzentration im Serum) HE N N N N N HO HE N M bp Amplifikation des DNA Bereiches DNA-Fragment von 198 bp Verdauung der DNA mit Hinf I Wildtyp (N): 198 bp Homozyg. Mutation (HO): 175 bp Heterozyg. Mutation (HE): bp

14 Real-Time-PCR Bsp.: Glaskapillar-Thermocycler

15 Real-Time-PCR Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen Hybridisierungssonden Methode geeignet zur Quantifizierung von PCR-Produkten Messung eines zunehmenden Fluoreszenzsignals während der laufenden PCR. Beginn des Signalanstiegs ist das Maß für die Ausgangskonzentration des betreffenden DNA-Bereiches. Methode geeignet zur Mutationsanalyse Nach der abgeschlossenen PCR wird das Schmelzverhalten der FRET- Sonden geprüft. Mutation und Wildtyp haben aufgrund von Basen- Fehlpaarungen verschiedene Schmelzpunkte. Mutation

16 Genotypisierung mittels Schmelzkurvenanalyse HE WT Schmelzkurve C Schmelzpunkt ca. 58 C HO HO Schmelzpunkt ca. 66 C WT In diesem Beispiel: FRET-Sonden haben eine exakte Übereinstimmung mit der Wildtyp-Sequenz HE 1. Ableitung -d[fluoreszenz]/dt

17 Genotypisierung mittels Sequenzierung der betroffenen Genregion Erforderlich bei: Aufspüren unbekannter Mutationen zahlreiche Polymorphismen/Gen Nukleotid 677 im MTHFR-Gen GAT GAT GAA ATC GG GAT GAT GAA ATC GA G A AA T C G A T G A T Enzymatische Reaktion (DNA-Polymerase): G klassische Autoradiographie Einbau von Didesoxynukleotiden (ddntp) in 4 getrennten Reaktionen (G, A, T, C), Statistisch verteilte Strangabbrüche, Fragmente elektrophoretisch getrennt, Einbau markierter dntp (datp) Autoradiographie ( 32 P), Fluoreszenzlabel

18 Assoziation von DNA-Polymorphismen Increasing role of environment and stochastic factors mit Krankheiten oder Krankheitsrisiken G6PD deficiency Hemochromatosis Acute intermittent porphyria α 1 -Antitrypsin ZZ Phenylketonuria Sickle-cell anemia Cystic fibrosis Huntington disease Duchenne dystrophy Tay Sachs Type I diabetes mellitus Apo E-2/E-2 hyperlipoproteinämie Increasing role of genotype at other loci

19 Häufig untersuchte Gene (Beispiele) Alpha-1-Antitrypsin Angiotensin converting enzyme (ACE) Apolipoprotein B100 Apolipoprotein E Faktor II-Leiden (Prothrombin) Faktor V-Leiden HFE (HLA-H) HLA (Klasse I und Klasse II, zur Typisierung) Laktase (Laktosetoleranzstörung) MTHFR Mukoviszidose UDP-Glucuronosyltransferase (Gilbert-Meulengracht)

20 Angiotensin-converting enzyme (ACE) Insertions (I) / Deletions (D) Polymorphismus im ACE-Gen Häufigkeit II ID DD U/l Referenzintervalle (Genotyp-abhängig) ACE Genotyp DD (ca. 25%) ACE Genotyp DI (ca. 50%) ACE Genotyp II (ca. 25%) U/l U/l 7-33 U/l Klinische Bedeutung: Labordiagnostik der Sarkoidose: S-ACE als Surrogatmarker erhöht (Polymorphismus beeinflusst Serumkonz.) Gendefekt: Risikofaktor kardiovaskulärer Erkrankungen??

21 α 1 -Antitrypsinmangel α 1 -Antitrypsin: Akute-Phase-Protein aus Hepatozyten, Aktivitätshemmung von Serinproteasen (PMN-Elastase) >40 Allele Wildtyp (PiM), Mangelallele: 7% Prävalenz Wichtige klinisch relevante Mangelallele: PiZ, PiS, PiNull Risiko korreliert mit vermind. Antitryp.-Konz. high risk: PiZZ, PiZNull, PiNullNull increased risk : PiSZ Erkrankungen der Leber (Kindesalter): Sekretionsstörung in Hepatozyten bei PiZZ Lungenemphysem (Erwachsenenalter): Folge einer nicht inhibierten PMN-Elastase- Aktivität

22 Hereditäre Hämochromatose (HH) Prävalenz in Mitteleuropa: 1:400, häufigste autos. rez. Erbkrankheit Manifestationsalter: Jahre, Hepatomegalie, Leberzirrhose, D. mellitus, dunkle Hautpigmentierung Mutationen im HFE-Gen (Typ 1-Hämochromatose) Cys 282Tyr (C282Y) homozygot bei ca % der HH- Patienten, Compound-Heterozygotie mit His63Asp (H63D) bei 3-8% der HH-Patienten (Prävalenz dieses H63D-Polymorphismus: 13%) Typ 2-Hämochromatose (Hepcidin, Hämojuvelin): seltene juvenile Form, vor 30. Lebensjahr manifest, geht mit schwerer Kardiomyopathie und Hypogonadismus einher. Typ 3: (Transferrinrezeptor 2) Typ 4: (basolateraler Eisencarrier Ferroportin 1)

23 Diagnoseweg bei V.a. hereditäre Hämochromatose Klinische Hinweise und Transferrinsättigung >60% und S-Ferritin > ng/l Gen-Test: Cys282Tyr-Mutation, gegebenenfalls His63Glu _ + Gentest negativ, aber klin. Verdacht, bzw. zur Bestimmung des Ausmaßes des Leberschadens Hämochromatose gesichert Leberbiopsie mit quantitativer Messung des Lebereisengehaltes + Aderlasstherapie

24 Fettstoffwechsel Lipoproteinstoffwechsel maßgeblich durch Zelloberflächenrezeptoren mitbestimmt LDL-Rezeptor bindet neben ApoB 100 auch Apo E Funktion: Regulation der Cholesterinkonzentration Cholesterinlieferung für zell. Bedarf, Hormonsynthese Familiäre Hypercholesterinämie: LDL-Rez.defekte: ApoB 100 : >100 bislang bekannte Mutationen (DNA-Sequenzierung) häufigste Mutation: G10699A (Arg3500Gln) Frequenz: 1 auf 700 Kaukasier bei Heterozygotie erhöhtes S-LDL-Cholesterin, gestörte Bindung an LDL-Rezeptor, Risiko kardiovaskulärer Erkrankungen

25 ApoE: Aber: Fettstoffwechsel Hyperlipoproteinämie Typ III: ApoE 2 -Homozygotie ist Voraussetzung zur Ausprägung dieser Fettstoffwechselstörung Nur ein kleiner Teil der Homozygoten erkrankt!!! Ansonsten korreliert das Allel E 2 mit niedrigeren Cholesterinspiegeln. ApoE-Allele: E 2, E 3 und E 4 durch Mutat. C112R und R158C Isoformen: E 2/2 (1%), E 3/3 (55%), E 4/4, E 2/3, E 2/4, E 3/4 (26%) Rezeptorbindung E 2 bindet nicht, Aktivierung des hepat. LDL-Rezeptors E 4 -Partikel bewirken das Gegenteil, E 4 ist somit potentiell artherogen, E 2 protektiv Assoziation mit (late onset) M. Alzheimer für E 4

26 Faktor V: Thrombophiliediagnostik G1691A (Arg506Gln), autosom. dominant (nach Entdeckungsort Faktor V/Leiden genannt) Effekt : verlangsamte Spaltung durch aktiviertes Protein C (APC-Resistenz) Prävalenz: 1:20 für heterozygoten Defekt Weitverbreitester Risikofaktor für venöse Thrombosen Heterozygotie: ca. fünf- bis zehnfache Erhöhung des Thromboserisikos gegenüber der Normalbevölkerung Homozygotie: Risiko ca. 100fach erhöht Weitere Risikofaktoren (z.b. Kombinationsdefekte, Nikotinkonsum, Einnahme oraler Kontrazeptiva) können das Thromboserisiko zusätzlich erheblich erhöhen. (zusätzlich Ausschluss von Prothrombin-Genmutation, Antithrombin III-, Protein C-, Protein S-Mangel).

27 Pharmakogenetik PM: poor metabolizer IM: intermediate metabolizer EM: extensive metabolizer UM: ultrafast metabolizer Beschäftigt sich mit den hereditären Grundlagen der Unterschiede in einer Population bezüglich dem Response auf ein Arzneimittel. DNA-Sequenzen variieren leicht von Individuum zu Individuum zahlreiche Polymorphismen Genetische und damit häufig auch Unterschiede in Proteinzusammensetzungen verursachen daher bei gleicher Medikation verschiedene systemische Konzentrationsniveaus. Insgesamt abhängig von Aufnahme, Absorption, Metabolismus (Phase I und Phase II Biotransformationsreaktionen), Clearance und Exkretion

28 Pharmakogenetik Enzym Häufigkeit Medikamente Probleme Cytochrom P450 CYP2D6 3-10% viele (Antidepressiva Meist verstärkte CYP2C19 2-5% Neuroleptika, Beta-Blocker...) Wirkung CYP1A2 12% N-Acetyltransferase NAT2 50% Isoniazid, Sulfapyridin Überempfindlich- Dapson, Koffein, Hydralazin keitsreaktionen Thiopurinmethyltransf. TPMT 0,3% Azathioprin, Mercaptopurin Leukopenie Dihydropyrimidin-Dehydr. 5% (Het.) 5-Fluoruracil (DPD, DPYD) verstärkte Wirkung Glukose-6-Phos.-Dehydr. 1% Sulfonamide, Primaquin Hämolyse Serum-Cholinesterase 0,04% Succinylcholin Apnoe Ca-Transport im ER 0,005% Inhalationsanästhetika Maligne Hyperthermie

29 Pharmakogenetik: Cytochrom P450-Isoenzyme Die Cytochrom P450-Isoenzyme sind Hämoproteine, die im katalytischen Zentrum Eisen als Zentralatom enthalten. Als Monooxygenasen katalysieren sie den Metabolismus von zahlreichen exogenen und endogenen Substraten und werden durch CO stark gehemmt. Das UV-Absorptionsmaximum des Kohlenmonoxid-Hämkomplexes liegt bei 450 nm. CYP : erste Zahl (z.b. 3): folgender Buchstabe (A, B, C, D, E) : letzte Zahl (z.b. 4) : steht für ein CYP-Gen Bezeichnung der Genfamilie Bezeichnung der Unterfamilie steht für das individuelle Gen Wichtig für Arzneistoffmetabolismus: CYP3A4, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C8, CYP2C19, CYP1A2, CYP2E1 CYP3A4 stellt mit ca. 30% die Hauptmenge der CYP-Isoenzyme in der Leber dar und wird auch in den Epithelzellen des Dünndarms exprimiert.

30 Pharmakogenetik: z.b. CYP 2D6 CYP2D6*3 ( extensive (rapid) Metabolizer ). CYP2D6*3, *4, *5, *6 ( poor (slow) Metabolizer (PM) ) sind in 98% aller Fälle an einem Verlust der CYP2D6-Aktivität beteiligt. Zwei Mangelallele müssen allerdings nachgewiesen werden. CYP2D6*4, *10, *41 ( intermediate Metabolizer ) in Verbindung mit einem Poor- Metabolizer-Allel. Genduplikationen führen zu Ultrafast Metabolizer.

31 Betroffene Pharmaka: Antidepressiva (s.o.) (z.b. Amitriptylin), Neuroleptika (z.b. Haloperidol), Antiarrhythmika (z.b. Propafeno Siehe (alte)mhh-homepage/mhh-internes/ CYP-Interaktionen sowie (auf Link Pharmakogenetik (pdf) klicken)

32 Pharmakogenetik: z.b. CYP 2D6 inpatient treatment days CYP-abhängige Schwierigkeiten bei der medikamentösen Therapie psychiatrischer Patienten spiegeln sich sogar in der stationären Behandlungsdauer wider. 0 N = non-polymorphism polymorphism EM PM/IM Höhere Behandlungskosten

33 Mutationsnachweise in der molekulargenetischen Tumordiagnostik Keimbahnmutationen somatische Mutationen

34 Tumordiagnostik Nachweis von Keimbahn-Mutationen Familiäre Disposition bei Krebserkrankungen: Hereditäre Tumoren: ca. 2% aller Krebserkrankungen Hinweise auf erbliche Disposition für Tumoren: Familie Zwei oder mehr Verwandte ersten Grades mit demselben Tumor Zwei oder mehr Verwandte mit seltenen Tumoren Evtl. drei oder mehr Tumoren in typischer Assoziation (z.b. Mamma und Ovar) Patient Multiple Tumoren in einem Organ oder in typischer Assoziation Assoziation von Tumoren mit anderen genetischen Auffälligkeiten oder kongenitalen Defekten Tumoren an ungewöhnlichem Ort oder in frühen Lebensjahren

35 Tumordiagnostik Nachweis von Keimbahn-Mutationen Erkrankung Gen Fam. Retinoblastom rb Fam adenomatöse Polyposis (FAP) apc Heredit. kolorektale Karzinome o. Polyposis mlh 1 Fam. Brust-/Ovarialkrebs brca 1 Fam. Brustkrebs brca 2 Li Fraumeni Syndrom p53 Multiple endokrine Neoplasie (MEN) Typ1 men 1 (menin) Fam. Medulläres Schilddrüsenkarzinom MEN Typ 2A und 2B ret Fam. Melanom p16 Neurofibromatose Typ 1 nfl 1 Neurofibromatose Typ 2 nfl 2 Gorlin Sydrom, Basalzellkarzinom ptch Von Hippel-Lindau Syndrom vhl Fam. Wilms-Tumor wt 1

36 Tumordiagnostik Nachweis von Keimbahn-Mutationen Diagnostische und präventive Maßnahmen, die den Nachweis einer genetischen Tumordisposition rechtfertigen: Maßnahme Koloskopie bei HNPCC und FAP Ausschluss eines Risikos bei Mitgliedern von HNPCC- und FAP- Familien Präventive Diagnostik Vermeidung invasiver diagnost. Maßnahmen bei Ausschluss einer disponierenden Mutation Beispiele Präventive therapeutische Maßnahmen Thyreodetektomie bei Patienten aus MEN Typ II-Familien HNPCC: Hereditäres nicht-polypöses kolorektales Karzinom FAP: Familiäre adenomatöse Polyposis Coli MEN: Multiple endokrine Neoplasie

37 Tumordiagnostik II Nachweis von somatischen Mutationen Genetische Instabilität in malignen Tumoren: Entweder kausal für Tumorgenese verantwortlich, und/oder für Tumorprogression verantwortlich! Wichtige Gene: p53, k-ras Mutationsanalyse zur Früherkennung von Tumoren. Tumorzellnachweise in Körperflüssigkeiten und Stuhl. Problem: Vielzahl möglicher Mutationen, Nachweis eines mutierten Allels unter einem Überschuss von Wildtyp-Allelen. Tumoren: z.b. Kolon-Karzinom, Pankreas-Karzinom

38 Tumordiagnostik II Nachweis von somatischen Mutationen p53 Am häufigsten mutiertes Tumorgen (Tumorsuppressorgen kodiert für Transkriptionsfaktor). Mutationen (meist Punktmutationen/missense) fast ausschließlich im Bereich der DNA-bindenden Domäne (Exone 4-8). Mutiertes P53-Protein häufig mit verlängerter Halbwertszeit, immunhistochemisch im Tumorgewebe nachweisbar. Mutationen bzw. zelluläre Akkumulationen korrelieren mit geringerer Überlebenszeit des Patienten. (z.b. Mamma-Ca: unabhängiger prognostischer Parameter)

39 Tumordiagnostik III Nachweis von somatischen Translokationen (Tumorgene an Bruchstellen von Chromosomen) Aus technischen Gründen Nachweis von Chromosomenanomalien in Tumoren hämatopoetischer Zellen leichter. Große Mehrzahl bisher gesicherter Chromosomenanomalien bei Leukämien und Lymphomen. Gen Rearrangement Erkrankung Rearrangements, kodierende Sequenz exprimiert und nicht verändert BCL2 t(14;18)(q32;q21) follikuläres Lymphom Rearrangements, Hybridgene BCR-ABL t(9;22) (q34;q11) CML, B-ALL Philadelphia-Chromosom zytogenetisch bei bis zu 90% der CML nachweisbar!!! Nachweis mittels PCR /RT-PCR mit Primern von beiden Seiten der chromosomalen Bruchstelle.

40 Methylierungsgrad der DNA: (neuerer Trend). DNA von Tumoren ist häufig (spez. in Promorbereichen) hypermethyliert (C 5m C). Nachweis des Methylierungsgrades von ausgewählten Indikatorgenen zum sensitiven Nachweis einer Metastasenbildung. Tumordiagnostik IV Nachweis/Quantifizierung zirkulierender Tumorzellen Nachweis residualer Tumorzellen im peripheren Blut, Knochenmark oder Blutprodukten über Marker (Transkripte, Methylierungsgrad der DNA), welche nicht in hämatopoetischen Zellen vorhanden sind. Target: meist Gene klassischer Tumormarker: z.b. AFP alpha-fetoprotein PSA Prostataspezifisches Antigen CK19 Zytokeratin 19 Nachweis mittels RT-PCR o. quantitativer RT-PCR Nachweisgrenzen: ca. 1 Tumorzelle unter 10 6 Zellen

41 Experimentelle Doktorarbeit Gemeinschaftsprojekt der Abt. Gastroenterologie und der Klinischen Chemie Matrixdegradation bei chronischen Lebererkrankungen Funktionelle Rolle des MMP/TIMP- Systems für die hepatische Regeneration und die Entwicklung chronischer Organschäden an der Leber. Adenovirale hepatische Überexpression von MMPs im Mausmodel. Techniken: Immunoassays, Western-Blot in situ-techniken, (quantitative) RT-PCR, PCR, Genexpression, Genotypanalyse, rekombinante Proteinherstellung in prokaryonten und viralen Expressionssystemen, molecular cloning Kontakt: Prof. Dr. Ralf Lichtinghagen Tel: 3940; Pieper: Bei Interesse an wissenschaftlichem Arbeiten ist ein Info-Gespräch jederzeit möglich November 2006