Diagnostik im Schweinebestand - was Landwirte wissen müssen -

Transkript

1 Diagnostik im Schweinebestand - was Landwirte wissen müssen - Dr. Tilman Kühn synlab.vet Labor Leipzig

2 Untersuchungsstrategien z.b. PRRS Symptom Probenmaterial Probenentnahme Untersuchungart nach Klinik Spätabort Abortmaterial sofort PCR Blutprobe Sau 2-3 Wochen nach Abort ELISA totgeborene Ferkel Ferkel sofort PCR lebensschwache Ferkel Blutprobe Ferkel sofort PCR Blutprobe Sau 2-3 Wochen nach Abort ELISA Nabelschnurblut Ferkel sofort ELISA Umrauschen Blutprobe Sau 2-3 Wochen nach Umrauschen ELISA Husten Blutprobe sofort PCR Husten Blutprobe 3 Wochen nach Beginn des Hustens ELISA Impfkontrolle Blutprobe kontinuierlich ELISA Statuskontrolle Blutprobe kontinuierlich ELISA

3 Multiple Infektionen Influenza PCMV PRCV PRRSV PCV-2 Pseudorabies APP Sc. suis Mycoplasmen Chlamydia Bordetella Salmonellen Immungenetik Umwelt

4 Enzyme-linked Immunosorbent Assay Diagnostik Grundlagen ELISA

5 Diagnostik Grundlagen ELISA

6 Diagnostik Grundlagen ELISA Immunglobulin A IgA wird auf allen Schleimhäuten der Atemwege, der Augen, des Magen-Darm-Trakts und des Urogenitaltrakts gebildet.sezerniertes IgA kommt in Form von Dimeren vor. Immunglobulin D IgD wird zusammen mit IgM als B-Zell Rezeptor (BCR) auf reifen, naiven (antigenunerfahrenen) B-Zellen membranständig coexprimiert. IgD ist nur in geringen Mengen in sezernierter Form im Blut vorhanden. Immunglobulin E IgE vermittelt den Schutz vor Parasiten, wie z. B. Würmern. Nahezu alles IgE ist membrangebunden, im Blut ist es praktisch nicht vorhanden. Immunglobulin Y IgY ist beim Geflügel das funktionelle Äquivalent zu IgG und ähnelt diesem in seiner Struktur. Es ist in hohen Konzentrationen in Hühnereiern zu finden. Immunglobulin W IgW besitzt einige Eigenschaften eines hypothetischen Ur-Immunglobulins und ist bisher nur bei ursprünglichen Fischen und Reptilien nachgewiesen.

7 Diagnostik Grundlagen ELISA Immunglobulin M IgM ist die erste Klasse von Antikörpern, die bei Erst-Kontakt mit Antigenen gebildet wird und zeigt die akute Infektionsphase einer Krankheit an. IgM ist ein Pentamer (Multimer) aus fünf Untereinheiten. Immunglobulin G IgG wird erst in einer verzögerten Abwehrphase (2-3 Wochen) gebildet und bleibt lange erhalten. Der Nachweis zeigt eine durchgemachte Infektion oder eine Impfung an.

8 ELISA Diagnostik Grundlagen ELISA Welche Aussagen sind aus einer Antikörperreaktion ablesbar? - Bestand ist geimpft aber Titerhöhe hat nichts mit Schutz zu tun! - Bestand ist infiziert aber auch Infektionstiter können niedrig sein! Nur regelmäßige Untersuchungen im gleichen Testsystem und gleicher (statistisch sicherer) Stichprobe ergeben eine Aussagekraft. Bestände mit aktiver Virusbelastung zeigen immer auch steigende Titerbewegungen, statische Impfbestände nicht.

9 Darstellung von Clostridium perfringens Diagnostik Grundlagen Bakteriologische Kultur

10 Darstellung von virushaltigen Zellen Diagnostik Grundlagen Der Test zeigt im mikroskopischen Bild mit Virusmaterial beladene Gewebszellen nach spezifischer Anfärbung mit fluoreszierendem Konjugat IFT

11 Viren enthalten keinen Zellkern, sondern nur DNA oder RNA. Ziel der PCR ist, bekannte und für eine Virusart spezifische Abschnitte zu erkennen und sichtbar zu machen. Diagnostik Grundlagen DNA oder RNA gewinnen PCR Polymerase Chain Reaction Fragmente erzeugen und Abschnitte kopieren

12 Diagnostik Grundlagen PCR Der DNA-Doppelstrang trennt sich bei Temperaturen von rund 95 C in seine Einzelstränge auf. Polymerase Chain Reaction Primer binden an jeden der beiden Einzelstränge und zwar an genau den Stellen, an denen die Kopie der DNA beginnen soll.

13 Diagnostik Grundlagen PCR Polymerase Chain Reaction DNA-Abschnitte amplifizieren (verfielfältigen)

14 DNA-Abschnitte auftrennen und detektieren Diagnostik Grundlagen PCR Polymerase Chain Reaction

15 Diagnostik Grundlagen real time PCR Cycle Threshold für Schwellenwert-Zyklus, der den Zyklus beschreibt, an dem die Fluoreszenz erstmalig signifikant über die Hintergrund-Fluoreszenz ansteigt.

16 PCR Welche Aussagen sind aus dem Antigennachweis (z.b. PRRSV) ablesbar? Bestand ist infiziert Bestand ist geimpft Nachweis EU-Feldvirus Nachweis sog. HF- (HP-)-Stämme Nachweis sog. vagabundierender US-Stämme Nachweis EU-Impfstamm (sog. DV-PCR) Nachweis US-Impfstamm Die Nachweismöglichkeit aus dem Blut ist zeitlich begrenzt (Virämiephase). Die Nachweismöglichkeit aus anderen Körpersekreten ist länger möglich aber technisch schwierig. Die real-time (q-) PCR hat eine höhere Sensitivität.

17 PCR / Sequenzierung Welche Aussagen sind aus der Sequenzierung ablesbar? - ausschließlich epidemiologische Zusammenhänge - Sequenzabweichungen sind kein Marker zur Beurteilung der Impfstoffwirksamkeit

18 Stichprobenplanung Der Stichprobenumfang wird häufig unter dem Aspekt der Kostenreduzierung kalkuliert. Die daraus entstehenden Probleme sind: Wieviel Information geht verloren? Welche Risiken bringt eine zu kleine Probenzahl?

19 Konzepte der Stichprobenplanung Die Stichprobenplanung beruht auf den Annahmen: Die Ähnlichkeit unter den Elementen einer Population ist so, dass eine bestimmte Anzahl von ihnen die Charakteristika der gesamten Population korrekt repräsentiert. Die Diskrepanzen zwischen den Werten der Populationsvariablen (Parameter) und den Werten der gleichen Variablen aus der Stichprobe (statistisch) sind minimiert, weil einige der Messungen den Wert der Parameter unterschätzen, während andere ihn überschätzen. Wenn die Stichprobe richtig gewonnen wurde (sog. repräsentative Stichprobe), so gleichen sich die Variationen dieser Parameter aus und Stichprobenmessungen führen zu Bewertungen, die jener der Population nahe kommen.

20 Charakteristika einer guten Stichprobe 1.Prazision: Ist die Übereinstimmung der Ergebnisse aus der Stichprobe und der entsprechenden Ergebnisse, die in der gesamten Population gemessen werden würden. Die Präzision ist die Maßeinheit des Probenziehungs-Fehlers. Je kleiner der Probenziehungs-Fehler, umso größer die Präzision der Stichprobe.

21 Charakteristika einer guten Stichprobe 2.Effizienz: Die vergleichende Messung zwischen verschiedenen Probenziehungs- Projekten. Eine Stichprobenplanung ist unter spezifischen Bedingungen effizienter, als andere, wenn sie verlässlichere und wirtschaftlichere Ergebnisse mit der gleichen Präzision oder einer höheren Präzision zu gleichen Kosten liefert. Eine Stichprobe muss präzise und effizient sein.

22 Charakteristika einer guten Stichprobe 3.Genauigkeit: Ist der Grad an Abwesenheit von nicht bei der Probenziehung entstandenen Fehlern in der Stichprobe. Eine Stichprobe wird als genau erachtet, wenn die überschätzten und unterschätzten Messungen sich unter den Komponenten der Stichprobe untereinander ausgleichen.

23 Charakteristika einer guten Stichprobe Die Strategie in der Stichprobenplanung muss zusätzlich auch das Ziel der Untersuchung berücksichtigen: z.b. Krankheitserkennung oder Bestimmung der Prävalenz.

24 Stichprobengröße Monitoring bei geimpften Tieren Stichprobengröße n = log (Irrtumswahrscheinlichkeit) log (1- Prävalenz) Beispiel: Größe der Stichprobe in einer Population 1000 Tiere mit 10% geschätzter Prävalenz und 95% Konfidenz (Vertrauen)? n = log0,05 log (1-0,10) n = 28!!! Bei einer Prävalenz von 10 % hat man erst mit einem Minimum von 28 überprüften Tieren die Chance, mit einem Vertrauensbereich von 95% mindestens ein infiziertes Tier zu entdecken.

25 Stichprobengröße Stichprobengröße zur Erkennung einer Krankheit bei verschiedenen Vertrauensund Prävalenzniveaus. (Population 1000 Tiere) Vertrauen Prävalenz 5% 10% 15% 99% % % % % %

26 Stichprobengröße entsprechend der Populationsgröße, um eine Infektion mit 95% Vertrauen bei einer Prävalenz von 10% zu erkennen und Verlust an Detektionsvertrauen, wenn die Anzahl der Proben auf 10 reduziert wird. Populations- empfohlene Vertrauen reduzierte reduziertes größe Probenanzahl Probenanzahl Vertrauen % 10 50% % 10 44% % 10 43% % 10 42% % 10 41% % 10 41% % 10 41% % 10 40% % 10 40% % 10 40%

27 Zusammenfassung Probenplanung Die Grundlagen der Stichprobenziehung sollten bekannt sein, bevor ein Monitoring- Programm etabliert wird. Die Kalkulation der Stichprobengröße sollte stets mit statistischen Tabellen vorgenommen werden. Kostensenkung durch Reduktion der Probenzahl führt zu einem Verlust an Information und zu einer potentiellen Fehlinterpretation der Ergebnisse Die Verwendung von 23 Proben (zwischen 29 und 19) für geimpfte Tiere, die zu 95% Vertrauen bei der Krankheitserkennung mit 10 15% Prävalenz führt, ist äußerst empfehlenswert.

28 Diagnostische Problemfelder PRRS Mycoplasma hyopneumoniae APP PCV-2

29 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! synlab.vet Labor Leipzig Deutscher Platz 5b Leipzig Telefon: 0341 /