Generelle Mechanismen des Viruseintritts in Wirtszellen

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1 Wiederholung: Generelle Mechanismen des Viruseintritts in Wirtszellen Animalviren Bakteriophagen Pflanzenviren Rezeptor Rezeptor Vektorvermittelt (Insekt) Mechanisch (Verletzung) Nukleinsäure mit Meist nackte Nukleinsäure nackte Nukleinsäure Proteinhülle (Hershey/Chase Experiment) Die Architektur der Viren aus den verschiedenen Reichen belebter Materie spiegelt den äußeren Aufbau fundamentaler zellulärer lä Strukturen Ihrer Wirtszellen wider

2 Die Anheftung (attachment) von Viren an Zielzellen bedingt oft die Wirtsspezifität und den Gewebstropismus Sie erfolgt unabhängig von Stoffwechselleistungen des Wirtes Bindung des Liganden an den Rezeptor geht häufig mit Konformations- Änderungen einher Der Bindung folgt die Penetration (=Zugang zum Cytoplasma) Dieser Schritt ist energieaufwändig, d.h. die Zelle muß Stoffwechsel- Leistungen erbringen Der Zugang des Nukleokapsids ins Zytoplasma erfolgt in den meisten Fällen durch rezeptorvermittelte Endozytose gefolgt von der Fusion Der Virusmembrane mit der Wirtsmembrane Endozytose erfordert (außer des viralen RBP) nur zelluläre Proteine Zur Fusion sind in der Regel virale Fusionsproteine erforderlich

3 ph-induzierte Konformationsänderung von HA

4 Modell der ph-induzierten Konformationsänderung Modell der ph induzierten Konformationsänderung im Zuge des Fusionsprozesses

5 Mechanismus der retroviralen Fusion mit der Plasmamembran

6 Primär-, Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur von Proteinen

7 Virusstruktur: Definitionen I - Untereinheit (subunit, protein subunit): einzelne, kontinuierliche Polypeptidkette (einzelne Bande im denaturierenden SDS-Gel) - Protomere, strukturelle Untereinheiten: Bausteine aus einzelnen oder mehreren verschiedenen Untereinheiten, die zusammen größere Assemblies bilden (z.b. VP0, VP1, VP3 Untereinheiten in Poliovirus) - Capsomer/Morphologische Einheit: Im EM erkennbare Oberflächenstrukturen, die nicht notwendigerweise strukturelle Untereinheiten darstellen (z.b. Spikes bei Adenoviren, Plateaus bei Picornaviren. - Assembly-Einheit (assembly unit): Satz von Untereinheiten oder Protomeren, die als Assembly-Intermediate fungieren (z.b. VPl-Pentamere bei SV40; 14S Pentamere aus VP0, VP1 und VP3 bei Picornaviren)

8 Virusstruktur: Definitionen iti II -Kapsid (capsid, coat): Proteinhülle, die die genomische Nukleinsäure umgibt. - Nukleokapsid (core): Nukleinsäure-Proteinkomplex als distinkte Substruktur innerhalb eines Virions (z.b. Nukleokapsid des Hepatitis B Virus) - Hülle, Virusmembran (envelope): Virusumgebende Lipiddoppelschicht inclusive viraler Glykoproteine.!!! Unterscheide coat und envelope!!! - Virion: Komplettes infektiöses Viruspartikel

9 Virusstruktur: Analysenmethoden, Beispiele 1. Elektronenmikroskopie (EM) 2. Kryoelektronenmikroskopie + rechnergestützte Bildverarbeitung 3. Röntgenstrukturanalyse (X-ray analysis) 4. Mehrdimensionale Kernresonanzspektroskopie (2D-NMR) 1. Elektronenmikroskopie k i (EM): Seit Anfang der 30er Jahre verfügbare Technik. 1939: erste Virusstruktur (Tabak Mosaik Virus, TMV) Auflösung Å (ein Atom ca. 2-3Å; α-helix ca. 10Å) => keine Sekundärstruktur-Elemente/Einzelatome sichtbar aber: Architektur der Partikel und Anordnung der Capsomere erkennbar. Eine Reihe verschiedener elektronenmikroskopischer k i Techniken und Färbemethoden sind entwickelt worden, z.b.: Transmissions EM (hohe Auflösung) Scanning EM (3D-Bilder) Klassische EM liefert 2 Arten von Informationen: a. Absolute Anzahl von Viruspartikel in einer Präparation b. Grundeinsichten in Partikelarchitektur Durch Kombination mit immunologischen Techniken sind spezifische Aussagen möglich: (Immuno-EM)

10 Elektronenmikroskopische Aufnahmen viraler Partikel Negative stain Technik Komplexer nicht-umhüllter T4 Bakteriophage Helikales, nicht umhülltes TMV Partikel Umhülltes Rhabdovirus VSV Nicht-umhülltes ikosaedrisches humanes Rotavirus

11 Elektronenmikroskopische Aufnahme von Hepatitis B Virus Partikeln sphärisches subvirales Partikel Filamentöses, leeres subvirales Partikel Virion (42 nm) Immuno EM mit goldmarkierten Antikörpern gegen ein virales Oberflächenprotein

12 2. Kryoelektronenmikroskopie (Kryo-EM): - Entscheidende Weiterentwicklung der klassischen EM. - Verfahren beruht auf schnellem Einfrieren der Probe in wässriger Lösung unter Verhinderung von Kristallbildung (Vitrifizierung). - Durch Mittelung über hunderte bis tausende gleichartiger g Bilder mittels ausgeklügelter Bildverarbeitungsverfahren lassen sich Virusstrukturen direkt (ohne Färbung) sichtbar machen (s. Bild) - Voraussetzung für erfolgreiche Kryo-EM ist die Gleichartigkeit der Partikel. Auflösung in der Regel Å ( state of the art : 9 Å) => Es lassen sich im besten Fall Sekundärstruktur-Elemente (z. B. alpha-helices direkt sichtbar machen. - Entscheidender Durchbruch 1997 durch die Aufklärung des HBV Kapsides mittels Kryo-EM (Boettcher et al) und zwei Jahre später durch Röntgenstrukturanalyse (Wynne et al.). (Bild)

13 Prinzip der Kryoelektronenmikroskopie

14 Kryo-Elektronenmikroskopische Aufnahme Poliovirus, komplexiert mit einer löslichen Variante seines Rezeptors CD 155

15 Hepatitis B Virus 100 x conc. Aufnahmen freundlicherweise zur Verfügung gestellt von S. Seitz und B. Boettcher EMBL

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17 Erste Rekonstruktion der Struktur von HBV aus Kryoelektronenmikroskopie

18 3. Röntgenstrukturanalyse (X-ray) 3. Röntgenstrukturanalyse von Viruskristallen Voraussetzung ist die kristalline oder parakristalline Form der Probe Erste Proteinstrukturen wurden auf diese Weise ca von Myoglobin und Hämoglobin erhalten (John Kendrew, Max Perutz) Erste Parakristalle bzw. Kristalle von Viren waren 1935 mit Tabak Mosaik Virus (TMV) und 1955 Polivirus: C H N O P 7500 S 2340 erhältlich. Eine Kristallisation ist nicht möglich bei irregulär geformten Partikeln bzw. bei den Partikeln mit einer Membranhülle (HIV, Poxviren ).

19 Prinzip der Röntgenstrukturanalyse

20 Die Röntgenstruktur von Simian Virus 40 (SV40) a. Organisation der VP1 Pentamere b. ß-barrel Topologie eines VP1 Moleküls c. Intepentamerkontakte von VP1

21 Kryoelektronenmikroskopie im Vergleich zu X-ray Core-Dimer aus X-ray Analyse Bildrekonstruktion des HBV Kapsides aus Kryo-EM

22 Anwendung der Röntgenstrukturanalyse auf einzelne g g y virale Strukturen komplexer Viren (z.b. HIV)

23 4. 2D NMR-Spektroskopie p 4. Kernresonanzspektroskopie von löslichen Untereinheiten Prinzipiell ist eine Größenlimitierung bis zu max kda gegeben. Vorteil ist die Strukturbestimmung in Lösung. Voraussetzung: hochkonzentrierte Proteinlösung (10-20 mg/ml)

24 1. Schutz des Genoms vor: Funktionen des Viruskapsids - UV-Licht (Bruch einer ssdna wäre fatal) - Nukleasen (durch lysierte Zellen) - mechanischen Einflüssen (Scherkräfte) 2. Spezifische Genomverpackung Die spezifische Interaktion von Kapsidproteinen mit RNA (z.b. TMV) ermöglicht eine spezifische Verpackung des viralen Erbgutes in das Virion 3. Spezifische Interaktion des Virus mit seiner Wirtszelle z.b. Rezeptorinteraktion von Poliovirus mit CD 155. Teildeterminante der Wirtsspezifität und des Gewebstropismus 4. Interaktion mit dem Immunsystem des Wirtes Strategien des immunescape 5. Regulation der Stabilität des Virus Kapsiddestabilisierung beim Eintritt des Virus zur Genomfreisetzung Kapsiddestabilisierung beim Eintritt des Virus zur Genomfreisetzung Viren sind metastabile dynamisch veränderbare Strukturen die sich noch nicht im thermodynamischen Gleichgewicht befinden (molekulare Maschinen im Gegensatz zu starren Gebilden)

25 Symmetrische Bauprinzipien von Viruskapsiden Grundproblem: Kein einzelnes Protein kann die es kodierende Nukleinsäure verpacken. Molekulargewicht eines Triplets (3x350 Da) einer Aminosäure durchschnittlich 115 Da Lösung: Viele Kopien eines (bzw. weniger verschiedener) Kapsidproteine lagen sich zusammen Genetische Ökonomie (Crick und Watson) Gleiche Bausteine => gleiche Interaktionen => regelmäßige Struktur => Symmetrie Es gibt zwei grundsätzliche Möglichkeiten gleichartige Bausteine mit quasi-identischen Kontakten in größere Struktureinheiten zusammenzufügen: I. helikale Anordnung II. Sphärische (de facto ikosaedrische) Anordnung Bei der dritten in der Natur realisierten Form, der Ausbildung komplexer Strukturen (z.b. T4-Bakteriophagen) sind viele verschiedene Proteinuntereinheiten beteiligt. III. Komplexe Anordnung

26 Beispiele helikaler, sphärischer und komplexer Virusstrukturen SV40 T4 TMV-EM SV40-EM T4-EM Offene Struktur Geschlossene Strukturen

27 Grundüberlegungen g zur Symmetrie Proteine sind chiral (händig), d.h. sie lassen sich nicht mit Ihrem Spiegelbild zur Deckung bringen. Mathematisch bedeutet dies: Sie enthalten keine Symmetrieelemente wie z.b. Rotationsachsen, Spiegelebenen oder Drehspiegelachsen. Als dreidimensionale Strukturen verhalten sie sich unter symmetrischen Gesichtspunkten wie ein F oder eine 9 in einer Ebene. Um chirale Strukturen in einem regelmäßigen, nicht über kovalente Bindungen verknüpftem Gitter symmetrisch anzuordnen müssen sich die Kontakte zwischen den Untereinheiten bzw. Protomeren gleichartig wiederholen Die einfachste Anordnung erfolgt dabei unter Ausnutzung der Rotationssymmetrie ti t i unter Ausbildung eines Zylinders. Eine leichte Verschiebung der Kontakte ermöglicht eine Helix. Beschreibung helikaler Symmetrie: P = p x µ P: Steighöhe µ: Anzahl der UE pro Windung p: Anstieg pro UE

28 Helikale Virusstruktur am Beispiel von Tabakmosaikvirus (TMV) 49 UE Länge: 300 nm (3000 Å) 180 Å Durchmesser 18 nm (180 Å) Mr: 40 MDa 2130 UE eines 158 AS Kapsidproteins RNA: 6400 Nukeotide (3 NT/UE) 16 ⅓ UE pro Windung (Identische Position nach 49 UE) Steighöhe P: 23 Å/Windung p: 1,4 Å/UE

29 Interaktion viraler RNA mit dem TMV Hüllprotein 4 antiparallele alpha Helices Rot: Asp, Glu Blau: Arg, Lys 2 übereinanderliegende UE Konservierte Arg 41, 90, 92 binden Phosphatbackbone der RNA Basen umklammern die LR-Helix der darüber liegenden UE Ring aus 17 UE

30 Wie erfolgt die spezifische Verpackung von TVM-RNA? Übersicht der Interaktion dreier NT mit der benachbarten LR-Helix Interaktion eines Guaninrestes an Position 1 mit Arg 122 und Asp 115 der LR Helix H-Brücke zu Arg 122 H-Brücke Bü zu Asp 115 => Ein Guanin an Position 1 zeigt die größtmögliche Anzahl stabilisierenderwechselwirkungen

31 Der origin of assembly (OAS) bei TMV bildet eine stem-loop Struktur mit Guaninresten an jeder 3. Position 5000 nt 1000 nt 5 3 OAS OAS dient als spezifisches Verpackungssignal für TMV RNA

32 Assembly von TMV erfolgt durch Nukleation durch OAS und anschließender Elongation durch vorgeformte disks a. Insertion des hairpinloop p in die Protohelix b. Intercalation der RNA zwischen zwei Protohelices c. Elongation durch sukzessiven Einbau von Protohelices CP ohne RNA bildet verschiedene disk und helikale Formen (self-assembly)

33 Ikosaedrische Symmetrie Die zweite grundsätzliche Möglichkeit gleichartige Bausteine mit quasiidentischen Kontakten in größere Struktureinheiten einzufügen ist die sphärische Anordnung Aus theoretischen Überlegungen heraus kommen dabei nur kubische Raumgruppen in Betracht, d.h. Tetraeder (4 dreieckige Flächen), Würfel (6 viereckige Flächen), Oktaeder (8 dreieckige Flächen), Dodecaeder (12 pentagonale Flächen), Ikosaeder (20 dreickige Flächen) Von diesen theoretischen Möglichkeiten ist bei Viren nur die ikosaedrische Symmetrie realisiert. Dabei ist es ökonomischer eine größere Anzahl identischer kleiner Untereinheiten anzuordnen als eine kleinere Anzahl größerer Untereinheiten Fünfzählige Symmetrieachse Vorteile ikosaedrischer Symmetrie Zweizählige Symmetrieachse Dreizählige Symmetrieachse Nahe an Kugelform, großes Volumen pro Oberfläche Relativ kleine Verformung von penta- auf hexagonal Größtmögliche Anzahl von Flächen in definierter geometrischer Relation

34 Ikosaedrische Anordnung viraler Strukturproteine Da Proteine chiral, also nicht symmetrisch (und schon gar nicht dreieckig) sind, muss jedes trigonale Flächenelement aus mindestens drei Untereinheiten aufgebaut sein. Die Mindestanzahl an Untereinheiten beträgt demgemäß 3 x 20 = 60 Die Dies wird in seltenen Fällen beobachtet (z.b. STNV oder φx174) Problem der Verpackungsökonomie: 60 UE von je ca. 20 kda ergäben ein Partikel mit einem Durchmesser von nm. Dies erlaubt es nur extrem kleine Genome zu verpacken. Im EM findet man Kapside mit Durchmessern von nm die aus UE bestehen. Wie ist das möglich? Unter Beibehaltung des Prinzips absolut gleichwertiger Wechselwirkungen der Untereinheiten untereinander gar nicht!!! Der Trick besteht in der Einführung lokaler hexagonaler Elemente unter Ausnutzung der Flexibilität der Untereinheiten it Die Wechselwirkungen an den lokalen 6 zähligen Symmetrieachsen unterscheiden sich von denen an der 5 zähligen Symmetrieachse. Wir finden quasi eine verzerrte Version der Wechselwirkung vor.

35 Ikosaedrische und ikosadeltaedrische Symmetrie bei viralen Strukturen Ikosaeder Ikosadeltaeder Lokale 3/6 zählige Symmetrieachse

36 Eine eight-stranded anti-parallel-ß-barrell (ESAB) Struktur kennzeichnet die Grundbausteine von Kapsidproteinen des Polivirus

37 Übersicht über die Schritte des Virusassembly in der Wirtszelle und des Virusaustritts 1. Bildung individueller struktureller Einheiten (Protomere) aus einem oder mehreren viralen Strukturproteinen 2. Zusammenbau des Proteincoats durch sehr unterschiedliche Interaktionen zwischen Struktureinheiten 3. Selektive Verpackung der genomischen Nukleinsäuren sowie anderer essentieller Viruskomponenten 4. Gegebenenfalls Membranumhüllung des Nukleokapsids 5. Freisetzung der Virionen aus der Wirtszelle 6. Gegebenenfalls Maturation des Virus nach Freisetzung

38 Drei unterschiedliche Wege des Zusammenbaus viraler Protomere (struktureller UE) aus subunits 1. Assembly aus individuellen Polypeptidketten -Getrennte Translation viraler Proteine die für die Protomerenbildung erforderlich sind -Spontane Protomerenbildung bei genügend hoher Konzentration der Edukte. -Der Prozess kann einstufig (SV 40) oder zweistufig (Adenovirus) ablaufen -Dieser Weg des Zusammenbaus von Untereinheiten setzt voraus, dass die Untereinheiten getrennt translatiert werden können (DNA-Viren). 2. Assembly aus einem Polyproteinvorläufer -Translation eines Polyproteins von einer mrna mit anschließender Ausbildung einer gefalteten Vorstruktur des Protomers (z.b. Vp0, VP3, VP1 bei Poliovirus). -Proteolytische Prozessierung des gefalteten Polyproteins in die eigentliche 5s Struktureinheit 3. Assembly unter Chaperonebeteiligung Die Ausbildung höher organisierter Struktureinheiten - Die Ausbildung höher organisierter Struktureinheiten erfolgt nur unter Mitwirkung zellulärer chaperone.

39 Beispiele für unterschiedliche Assemblymechanismen Mechanismus Virus Protomer Assoziation individueller Proteinmoleküle Bildung aus Polyproteinvorläufer Hepadnaviren Papovaviren (SV40) Adenovirus (Ad2) Picornavirus (Poliovirus) Retroviren (avian sarcoma virus) C(capsid)-Dimer VP1 Pentamer mit einem Molekül VP2 oder VP3 im Zentrum Protein IV Trimer (fiber), Protein III Pentamer (penton base) bilden Penton Unprozess. 5s Struktureinheit VP0-VP3-VP1 NC, CA, und MA Proteincoat bildet sich aus dem Gag Polyprotein Chaperone unterstütztes Assembly Adenovirus (Ad2) Hexontrimere bilden sich mit Hilfe von L4 100 kda Protein Herpesviren (HSV-1) VP5 Pentamere und Hexamere bilden sich VP22a abhängig

40 Das zytoplasmatische Assembly von Poliovirus Bindung an PVR (Kapsidöffnung, RNA-Freisetzung) Polyproteinsynthese (VPg-Entfernung, Ribosomenbindung bi an IRES Element) Polyproteinprozessierung (P1:Struktur; P2, P3: Proteasen und RdRP) Bildung der 5s Struktureinheiten (selfassembly mit nachfolgender Proteolyse) Bildung von 14s Pentameren Reversible Bildung von 75s Prokapsiden RNA-Enkapsidierung und Virionbildung

41 Freisetzung viraler Partikel Freisetzung nicht-umhüllter Viren (z.b. Poliovirus) erfolgt häufig unter Zerstörung und Tod der Wirtszelle (cytopathischer Effekt der Virusinfektion ohne Beteiligung des Immunsystems) Oft sind im Vorfeld spezifische Effekte (e.g. Zerstörung der Integrität der Intermediärfilamente durch virale Proteine) synergistisch beteiligt. Assemblierung und Freisetzung an der Plasmamembrane: komplexer Prozess, der die Induktion von Membrankurvaturen, atu e Fusion etc. durch virale Strukturproteine tu e beinhaltet. Die Details dieser Prozesse (z.b. treibende Energie für das membrane bending, oder das Ablösen des viralen Partikels) sind bislang nur teilweise entschlüsselt. Assemblierung und Freisetzung an intrazellulären Membranen: Retention viraler Glyoproteine an der ER Membrane bedingt das budding in interne Kompartimente des sekretorischen pathways Beispiel: Hepadnaviruses

42 Retrovirusassembly an der inneren Zytoplasmamembrane 1. Synthese des Gag-Polyproteins 2. Assoziation von Gag-Polyprotein mit Plasmamembrane 3. Assoziation von viraler Protease, RT und Integrase mit Gag 4. Bindung von 2 genomen viraler RNA via Verpackungsignal 5. Fusion der Membrane um den budding Partikel 6. Maturation durch proteolytische Prozessierung von Gag

43 Schematischer Aufbau von HIV

44 Maturation von HIV erfolgt durch proteolytische Prozessierung nach der Virussekretion

45 Mechanismen der Ausbreitung von Pflanzenviren Spezifisches Problem bei Pflanzenviren: Undurchdringliche Zellwand. Eintritt von Viren in die Pflanzenzelle erfolgt durch Verletzung, d.h. - Es findet keine spezifische Erkennung des Wirts statt (Planzenviren nutzen keine Virusrezeptoren) - Pflanzenviren codieren keine Hüllproteine, die am Import und Export beteiligt sind. 1. Ausbreitung über Samen Äußerliche Kontamination von Samen mit Virionen. Infektion des Embryos, bzw. einzelner Setzlinge. 2. Vegetative Verbreitung durch Pfropfung Pfropfung stellt eine billige und effiziente Methode der Vermehrung von Pflanzen dar und bildet gleichzeitig ideale Voraussetzungen für die vom Menschen bedingte Verbreitung von Viren. Überschreitung von Speziesgrenzen. 3. Natürliche Verbreitung durch Vektoren Bakterien: z.b. Agrobakterium tumefaciens (auch als Vektor für die Erzeugung g transgener Pflanzen geeignet). g Pilze, Nematoden, Arthropoden (Insekten, Blattläuse, Heuhüpfer, Käfer..), Arachniden (Milben...) 4. Mechanische Wege der Verbreitung von Viren hauptsächliche Methode für experimentelle Infektionen (Einreiben von Viruspartikel in Blätter) natürlicherweise durch starke Winde, Regen. Zwei Formen der vektorvermittelten Verbreitung können unterschieden werden: a. Nicht propagative Übertragung von Viren durch Insekten: Das Insekt ist ausschließlich Träger des Virus. b. Propagative Übertragung: Vektor vermehrt sich im Insekt, was zu einer Virusamplifikation führt (z.b. Rhabdoviren).

46 Symptome pflanzlicher Virusinfektionen -Zunächst lokale Nekrosen, danach erfolgt vektorunabhängige Ausbreitung a.) von Zelle zu Zelle b.) long distance über das Gefäßsystem der Pflanze (systemisch). - Ausbreitungsprozeß ist effektiv und führt über Plasmodemata: Plasmodemata (Cytoplasmabrücken) sind natürliche Verbindungen zwischen Pflanzenzellen. Symplasma. Struktur: pro Plasmodesmum aus Zellproteinen gebildete Einzelkanäle von ca. 1,5 nm Durchmesser. Ausschlußgrenze: etwa 1000 Da. Funktion: Versorgung mit Aminosäuren, Kohlehydraten, Salzen. Signaltransduktion.