Leitlinien zur Ringversuchs-Validierung von qualitativen real-time PCR Methoden

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1 Leitlinien zur Ringversuchs-Validierung von qualitativen real-time PCR Methoden Untertitel (max. zwei Zeilen) BVL, 1. März 2016 Seite 1 von 18

2 Vorwort Die 64 LFGB Arbeitsgruppe Entwicklung von Methoden zur Identifizierung von mit Hilfe gentechnischer Verfahren hergestellter Lebensmittel hat in einer Unterarbeitsgruppe Leitlinien für die zukünftige Durchführung von Validierungen von qualitativen real-time PCR Methoden im Einzellabor und im Ringversuch erarbeitet. Mit diesen Leitlinien wird beabsichtigt, dass die von der 64 LFGB Arbeitsgruppe erarbeiteten real-time PCR Methoden die Leistungskriterien erfüllen können, die auf europäischer Ebene (ENGL, CEN) und auf internationaler Ebene (ISO, Codex) festgelegt sind [1] [2]. Ein weiteres Ziel ist es, die neu erarbeiteten Ansätze zur Methodenvalidierung in andere rele-vante Gremien (ENGL, CEN/ISO) einzubringen, um die Festlegung von minimal erforderli-chen Leistungskriterien in diesem Bereich aktiv mitzugestalten. Die in diesem Dokument dargestellte Vorgehensweise stellt eine Empfehlung dar, die sich in der Praxis bewährt hat. Alternative Vorgehensweisen sind möglich, wenn belegt werden kann, dass die im Dokument genannten Leistungskriterien erreicht werden. Die Unterarbeitsgruppe Validierung von real-time PCR Methoden wurde von Dr. Lutz Grohmann geleitet. Mitarbeiter der Arbeitsgruppe waren Hermann Broll, Emilie Dagand, Dr. Sabine Hildebrandt, Dr. Peter Hübert, Dr. Heiko Kiesecker, Dr. Kathrin Lieske, Dr. Dietrich Mäde, Dr. Joachim Mankertz, Dr. Ralf Reiting, Dr. Manuela Schulze, Brigitte Speck, Dr. Stef-fen Uhlig, Dr. Daniela Wahler, Hans-Ulrich Waiblinger, Dr. Karl Woll und Katrin Zur. BVL, 1. März 2016 Seite 2 von 18

3 Inhaltsverzeichnis 1 Anwendungsbereich Leistungsmerkmale Falsch-positiv Rate / falsch-negativ Rate Robustheit Detektionswahrscheinlichkeit (POD) Präzisionsdaten für Proben (optional) Anhang 1 - Hinweise zur Durchführung des Ringversuchs A. Ringversuchsproben und Standard DNA B. Reagenzien C. Dokumentation und Auswertung Literatur Impressum BVL, 1. März 2016 Seite 3 von 18

4 1 Anwendungsbereich Diese Leitlinien zielen darauf ab, die Leistungsmerkmale zu beschreiben, die bei der Ringversuchs- Validierung von qualitativen real-time PCR Methoden zu berücksichtigen sind. Die ermittelten Validierungsdaten sollen helfen zu entscheiden, ob eine betreffende Methode in die Amtliche Methodensammlung des BVL aufgenommen werden kann. 2 Leistungsmerkmale Zentrales Kriterium für die Ringversuchs-Validierung einer qualitativen real-time PCR Methode ist die Bestimmung der falsch-positiv Rate und der falsch-negativ Rate. Durch die Verwendung unterschiedlicher real-time PCR Geräte können aus dem Ringversuch zusätzliche Informationen zur Robustheit der Methode erhalten werden. Auf Grundlage eines mathematisch-statistischen Modells für die Validierung der Detektionswahrscheinlichkeit (Probability of Detection POD) von qualitativen PCR Methoden [3] können bei entsprechender Ringversuchsplanung außerdem Daten für folgende Leistungsmerkmale ermittelt werden: Laborstandardabweichung σ Mittlere Amplifikationswahrscheinlichkeit λ Laborübergreifender Steigungsparameter b der POD-Kurve Laborübergreifende LOD 95% A n m e r k u n g: Die Bestimmung der Nachweisgrenze (LOD 95%) ist grundsätzlich Aufgabe der Einzellabor-Validierung. 2.1 Falsch-positiv Rate / falsch-negativ Rate Definitionen: Die falsch-positiv Rate ist ein Maß für die Wahrscheinlichkeit, dass eine bekanntlich negative Untersuchungsprobe durch die Methode als positiv klassifiziert wird. Die falsch-negativ Rate ist ein Maß für die Wahrscheinlichkeit, dass eine bekanntlich positive Untersuchungsprobe durch die Methode als negativ klassifiziert wird [2]. Durchführung: Zur Bestimmung der falsch-positiv Rate und falsch-negativ Rate einer qualitativen real-time PCR Methode kommen als Proben folgende Materialien in Frage: DNA-Lösungen (in der Regel aus Referenzmaterial extrahiert) Probenmaterialien (Referenzmaterial oder Probenmaterial, aus dem noch die DNA extrahiert werden muss) In der Regel werden im Ringversuch DNA-Lösungen als Proben verwendet. Sofern die Zielsequenz überwiegend in Material nur einer Matrix nachzuweisen ist und für diese Matrix kein im Ringversuch validiertes Extraktionsverfahren verfügbar ist, kann das Einbeziehen der DNA-Extraktion in den Ringversuch sinnvoll sein. BVL, 1. März 2016 Seite 4 von 18

5 Zur Untersuchung im Ringversuch erhält jeder Teilnehmer kodierte positive Proben in einem Pool von kodierten negativen Proben. Die positiven Proben enthalten definierte Mengen der Zielsequenz. Negative Proben enthalten nur nicht gentechnisch veränderte Taxon-spezifische Pflanzen-DNA bzw. Negativmaterial der Matrix. a) Ringversuch mit DNA-Lösungen DNA wird von einem an der Vorbereitung des Ringversuchs beteiligten Labor aus dem Probenmaterial extrahiert und vorab auf Amplifizierbarkeit und Inhibition getestet. Details hierzu sind in anderen Dokumenten ausführlich beschrieben [1] [4]. Positive Proben sollten im Ringversuch mindestens das Zweifache der in der Einzellabor-Validierung als Nachweisgrenze ermittelten Kopienzahl (jedoch nicht weniger als 20 Kopien der Zielsequenz) pro Reaktion enthalten. Die Proben sind mit bis zu 100 ng pro 25 µl PCR-Reaktion einer geeigneten DNA als Hintergrund herzustellen. b) Ringversuch mit Probenmaterialien Werden im Ringversuch Probenmaterialien verwendet, aus denen die DNA zu extrahieren ist, muss den Teilnehmern die Möglichkeit gegeben werden, die Leistung der DNA-Extraktionsmethode zu überprüfen. Dazu kann es sinnvoll sein, dass die Teilnehmer zusätzlich eine Probe zur positiven Extraktionskontrolle (P) erhalten. Anhand dieser Probe sind die Extraktionsmethode und die vom teilnehmenden Labor selbst bereitzustellenden Extraktionsreagenzien zu überprüfen. Dazu wird die DNA aus P in einem PCR-Lauf zusammen mit einer PCR-Kontrolle, die eine zur Verfügung gestellte Positiv-DNA enthält, jeweils in Duplikaten analysiert und die mittleren Ct-Werte verglichen. Hierbei sollte der mittlere Ct-Wert für die DNA aus P den mittleren Ct der Positivkontrolle um nicht mehr als 1 überschreiten (Beispiel: Ct-Wert Positivkontrolle = 23 Ct-Wert DNA aus P beträgt maximal 24). Dies gilt sowohl für die Zielsequenz-PCR als auch für die Taxon-spezifische PCR. Darüber hinaus wird empfohlen eine Inhibitionskontrolle durchzuführen [1] [4]. Bei Screening-Verfahren kann es sinnvoll sein, Proben aus mehr als einer Untersuchungs-relevanten Spezies (z. B. Mais und Soja) in den Pool der Ringversuchsproben einzubeziehen. Den Teilnehmern werden die Reagenzien zur Durchführung der PCR (Oligonukleotide, PCR Mastermix) zur Verfügung gestellt, um sicherzustellen, dass unterschiedliche und nicht auf deren Eignung überprüfte PCR-Reagenzien keinen Einfluss auf die Ergebnisse haben. Um die in der Tabelle 1 dargestellte Vorgehensweise im Ringversuch zu realisieren, sollte die Anzahl der Teilnehmer erfahrungsgemäß 12 sein. Jeder Teilnehmer erhält mindestens 6 positive und 6 negative Proben, die vorher kodiert wurden. Die Proben werden von den Teilnehmern in der PCR in einer Einfachbestimmung gemessen. Somit stehen aus jedem Labor für positive bzw. negative DNA-Proben mindestens jeweils 6 Ergebnisse zur Auswertung zur Verfügung. BVL, 1. März 2016 Seite 5 von 18

6 Tabelle 1: Beispiel eines Ringversuchsdesigns bei Verwendung von Probenmaterialien, bei denen die Zielsequenz in mehreren Spezies vorkommt Art der Proben Menge der Zielsequenz in der PCR Beispiele für die Kopienzahl der Zielsequenz Anzahl Proben je Teilnehmer Erforderliche Anzahl Labore (mit auswertbaren Ergebnissen) DNA Spezies 1 2 x LOD95% DNA Spezies 2 2 x LOD95% DNA Spezies DNA Spezies A n m e r k u n g: Es kann sinnvoll sein, eine weitere Konzentrationsstufe der Zielsequenz im Ringversuch zu testen (z. B. bei 3 x LOD 95%). Auswertung: Auf Grundlage der auswertbaren Ergebnisse ist die falsch-positiv bzw. falsch-negativ Rate auf folgende Weise zu berechnen: % = % = Leistungskriterien: Es dürfen nicht mehr als 5 % falsch-negative bzw. falsch-positive Ergebnisse auftreten. Falsch-positive Befunde über 5 % sollten abgeklärt und fallweise bewertet werden. Die Methodenschrift sollte hierzu Hinweise für die Anwender geben. A n m e r k u n g: Vermeintlich falsch-positive Ergebnissen können zum Beispiel bei Screening-Verfahren auftreten, bei denen genetische Elemente nachgewiesen werden, die natürlicherweise vorkommen. Im Anhang 1 werden weitere Hinweise zur Durchführung des Ringversuchs, zur Herstellung von Ringversuchsproben und zur Dokumentation und Auswertung gegeben. 2.2 Robustheit Definition: Maß für die Belastbarkeit einer Methode durch kleine, zufällige Veränderungen in der Umgebung oder in den Durchführungsbedingungen. Zur Bestimmung der Robustheit werden empirische Daten zur Bewertung der Methode hinsichtlich kleiner, absichtlicher Änderungen der Durchführungsbedingungen ermittelt. BVL, 1. März 2016 Seite 6 von 18

7 Durchführung: Im Ringversuch wird die Auswirkung unterschiedlicher real-time PCR Geräte erfasst. Leistungskriterien: Die Methode muss auch bei diesen Änderungen die erwarteten Ergebnisse liefern und zu keinen erkennbaren Unterschieden bei Verwendung von unterschiedlichen Geräten führen. A n m e r k u n g: Die Überprüfung der Robustheit erfolgt in erster Linie durch die Einzellabor-Validierung. 2.3 Detektionswahrscheinlichkeit (POD) Auf Grundlage eines mathematisch-statistischen Modells für die Validierung der Detektions-wahrscheinlichkeit (Probability of Detection POD) von qualitativen PCR Methoden [3] können bei entsprechender Ringversuchsplanung Daten für folgende Leistungsmerkmale ermittelt werden: Laborstandardabweichung σ Mittlere Amplifikationswahrscheinlichkeit λ Laborübergreifender Steigungsparameter b der POD-Kurve Laborübergreifende LOD 95% Definitionen: Die Detektionswahrscheinlichkeit (POD) beschreibt die Wahrscheinlichkeit, mit der bei vorgegebener Kopienzahl der Zielsequenz in einer PCR eine Amplifikation erhalten werden kann. Hierbei wird die mittlere Kopienzahl der Zielsequenz, bei der die Detektionswahrscheinlichkeit bei 0,95 liegt, als Nachweisgrenze oder LOD95% bezeichnet. Die Laborstandardabweichung σ charakterisiert die Streuung der logarithmierten laborspezifischen Werte für die LOD95%. Die mittlere Amplifikationswahrscheinlichkeit λ beschreibt die Wahrscheinlichkeit, mit der für eine zufällig ausgewählte Kopie der Zielsequenz in der PCR eine Amplifikation erhalten werden kann. Der laborübergreifende Steigungsparameter b der POD-Kurve beschreibt die Abweichung von der idealen POD-Kurve (b = 1). Die ideale POD-Kurve ergibt sich aus der Annahme, dass die mittlere Amplifikationswahrscheinlichkeit von der Kopienzahl der Zielsequenz unabhängig ist. Die laborübergreifende LOD95% entspricht der LOD95% eines theoretischen Medianlabors, d. h. eines Labors, dessen Sensitivität dem Median der theoretischen Verteilung der laborspezifischen Sensitivitäten entspricht. Durchführung: Um für die verschiedenen Leistungsmerkmale der POD geeignete Daten zu ermitteln, erhalten die Labore eine Standard-DNA mit berechneter Kopienzahl für die betreffende Zielsequenz (siehe Anhang 1 des Dokuments mit den Leitlinien zur Einzellabor-Validierung). BVL, 1. März 2016 Seite 7 von 18

8 Die Standard-DNA wird zur Herstellung einer Verdünnungsreihe der betreffenden Zielsequenz verwendet. Die Verdünnungen werden mit einer Pufferlösung hergestellt, die nicht-ziel-dna in einheitlicher Konzentration enthält. Hierzu wird die Standard-DNA (genomische DNA, Plasmid-DNA oder Amplikon- DNA) mit ausreichend Hintergrund-DNA ergänzt und dadurch für die PCR stabilisiert (Tabelle 2). Die Verdünnungsstufen 1 bis 4 werden in drei PCR-Replikaten und von Verdünnungsstufe 5 an in mindestens sechs PCR Replikaten pro PCR-Lauf untersucht. Die angegebene Anzahl der Replikate und der Verdünnungsstufen ist minimal notwendig, um eine ausreichende statistische Sicherheit für die LOD95% und für die zugehörigen Präzisionsdaten zu erreichen [3]. Im Anhang 1 werden weitere Hinweise zur Durchführung des Ringversuchs und zur Herstellung der Standard-DNA gegeben. Tabelle 2: Beispielhaftes Schema zur Herstellung der Verdünnungsreihe Verdünnungs- stufe Herstellung (Beispiel) Kopienzahl der Zielsequenz (in 5µl) Anzahl der PCR-Replikate 1 DNA-Stammlösung mit 0,2xTE* verdünnen µl (500 Kopien/µl) + 40 µl 0,2xTE* µl (100 Kopien/µl) + 80 µl 0,2xTE* µl (20 Kopien/µl) + 50 µl 0,2xTE* µl (10 Kopien/µl) + 60 µl 0,2xTE* µl (4 Kopien/µl) + 50 µl 0,2xTE* µl (2 Kopien/µl) + 50 µl 0,2xTE* µl (1 Kopien/µl) + 60 µl 0,2xTE* µl (0,4 Kopien/µl) + 50 µl 0,2xTE* µl (0,02 Kopien/µl) + 90 µl 0,2xTE* 0,1 6 *enthält Hintergrund-DNA (z.b. 20 ng/µl Lachssperma-DNA in 0,2 x TE-Puffer) Auswertung: Für jedes Labor werden anhand der Standardkurve (2500 bis 50 Kopien) die Werte für die Steigung und das Bestimmtheitsmaß der Kalibrierfunktion berechnet und tabellarisch dargestellt (Tabelle 3). Die abgegebenen Ergebnisse der Labore sind auf Abweichungen und Ausreißer zu überprüfen (Plausibilitätsprüfung und Ausreißertests, z.b. nach Grubbs für die laborspezifischen Werte für die Steigung, die aus der Kalibrierfunktion berechnet wurde, sowie für das Bestimmtheitsmaß). Als Anhaltspunkt für eine gute PCR-Effizienz gilt eine Steigung der Kalibrierfunktion von ca. -3,1 bis ca. -3,6. Das Bestimmtheitsmaß sollte mindestens 0,98 betragen. Die DNA-Verdünnungen im Bereich von 20 bis 0,1 Kopien/pro PCR-Ansatz dienen der Validierung der POD-Leistungsmerkmale. Hierzu werden die qualitativen PCR-Ergebnisse (positive und negative Resultate) für die 6 Verdünnungsstufen herangezogen und dargestellt (Tabelle 4). BVL, 1. März 2016 Seite 8 von 18

9 Tabelle 3 Beispiel für die Auswertung der Standardkurven der Teilnehmer eines Ringversuchs [5] Pubi-cry PCR Methode Labor PCR Gerät Steigung [s] Bestimmtheitsmaß [R²] PCR- Effizienz [%] A ABI B Bio-rad CFX C MX3000p D ABI 7500Fast E ABI F ABI G Roche LC H ABI I Rotorgene J ABI K ABI 7900HT L ABI M ABI N ABI O ABI 7500Fast P ABI 7900HT Q ABI Tabelle 4 Beispiel einer qualitativen Auswertung der Ergebnisse aus 17 Laboren [3] Labor Nr. Nominale Kopienzahl der Zielsequenz in der PCR BVL, 1. März 2016 Seite 9 von 18

10 Auf Grundlage der qualitativen Daten können die laborspezifischen POD-Kurven und daraus der laborübergreifende Steigungsparameter b berechnet werden. Es sind Plausibilitätsprüfungen und Ausreißertests, z.b. nach Grubbs, für die laborspezifischen POD-Kurven, die Amplifikationswahrscheinlichkeit λ und den laborübergreifenden Steigungsparameter b durchzuführen. A n m e r k u n g: Der Wert für den Steigungsparameter sollte im Bereich 0,65 < b 2 liegen, um sinnvoll interpretierbare POD-Kurven zu gewährleisten. Der angegebene Bereich basiert auf den Bedingungen, dass die LOD 95% nicht größer 20 Kopien beträgt und gleichzeitig die Amplifikationswahrscheinlichkeit im gesamten Bereich von 0,1 bis 100 Kopien nicht größer als 1 ist. In der Abbildung 1 sind die laborspezifischen POD-Kurven dargestellt, die in einem Ringversuch auf Basis des laborübergreifenden Steigungsparameters b berechnet wurden [3]. Abbildung 1 Beispiel für laborspezifische POD-Kurven mit einem laborübergreifenden Steigungsparameter b = 1,29 [3] Aus der Auswertung der POD-Kurven aller Labore können anschließend die Werte für die anderen Leistungsmerkmale errechnet werden [3]. Ein Beispiel für die Auswertung wird in der Tabelle 5 gegeben. Tabelle 5 Beispiel für die statistische Auswertung der POD Leistungsmerkmale für die real-time PCR Methode zum Nachweis von Pubi-cry [5]. Die berechneten Werte für die mittlere Amplifikationswahrscheinlichkeit (λ0) und das zugehörige 95 % Konfidenzintervall, den laborübergreifenden Steigungsparameter b der POD Kurve, die Laborstandardabweichung (σl) und die LOD95% (in Kopien der Zielsequenz) für das theoretische Medianlabor bei POD = 0,95 werden angegeben. Parameter Wert [Pubi-cry PCR] Anzahl teilnehmende Labore 17 Anzahl PCR Replikate je Konzentrationsstufe 6 mittlere Amplifikationswahrscheinlichkeit! 0,77 POD Kurve 95 % Konfidenzintervall für! 0,60 0,98 Laborübergreifende Steigung " 1,19 Laborübergreifende Standardabweichung # $ 0,31 LOD 95% [in Kopien] Theoretisches Medianlabor 3,1 BVL, 1. März 2016 Seite 10 von 18

11 Sofern für den Steigungsparameter b keine statistisch signifikante Abweichung zum Wert von 1 festgestellt werden kann, wird für die Berechnung der anderen POD Leistungsmerkmale ein Wert von b = 1 zugrunde gelegt. Eine Steigung von b = <1 deutet auf eine Inhibition der Amplifikation bereits im Bereich weniger Kopien hin. Ein Wert von λ = >1 deutet darauf hin, dass die tatsächliche Kopienzahl der Verdünnungsreihe höher ist als der nominale (vorher berechnete) Wert. Die ermittelten Werte für die Labor-übergreifende POD Kurve mit zugehörigen Vorhersagebereichen sowie die jeweiligen Detektionsraten für die unterschiedlichen Konzentrationen der Zielsequenz können in einer grafischen Abbildung dargestellt werden (Abbildung 2). Abbildung 2 (A) Laborübergreifende POD-Kurve (LPOD) mit zugehörigem 95%-Vorhersagebereich (dunkelgrau) und 90%-Vorhersagebereich (hellgrau) für die relative Detektionsrate (ROD). Die Rauten mit den Zahlen geben die Verteilung der qualitativen PCR-Ergebnisse von 17 Laboren wieder (Anzahl der Labore und entsprechendes Verhältnis positiver PCR Ergebnisse zu den 6 Replikaten, siehe Tabelle 4). (B) LPOD-Kurve unter idealen Bedingungen (λ = 1 und b = 1; gestrichelte Linie) im Vergleich zur berechneten LPOD-Kurve (zugehörigem 95%-Vorhersagebereich dunkelgrau unterlegt). BVL, 1. März 2016 Seite 11 von 18

12 Leistungskriterien: Das oberes 95 % Vorhersagelimit für die laborspezifischen LOD95% Werte sollte maximal 20 Kopien der Zielsequenz betragen. Im Regelfall unterliegt die LOD95% deutlichen laborspezifischen Schwankungen. Daher erfolgt die Prüfung anhand des Verhältnisses der Ergebnisse zwischen dem 5% Wert und dem 95 % Wert. Dieses Verhältnis sollte den Wert von 5 nicht überschreiten. Beispiel: Liegt die LOD95% bei 5 % aller Labore unterhalb von 4 Kopien, bei 90 % aller Labore im Bereich 4 und 20 Kopien, und bei den übrigen 5 % aller Labore oberhalb von 20 Kopien, so liegt das Verhältnis bei einem Wert von 5. A n m e r k u n g: Bei einem Wert von 5 für das Verhältnis des unteren und des oberen Vorhersagelimits der laborspezifischen LOD 95% beträgt die mittlere Amplifikationswahrscheinlichkeit λ0, etwa 15 % (ein Schätzwert, der zunächst durch Berechnung des Mittelwerts für die LOD 95% entsprechend der Verteilung der LOD 95% Werte für 3 Kopien als 5% Quantil und 15 Kopien als 95% Quantil gebildet und anschließend in Bezug auf die Poisson-Verteilung abgeleitet wird: λ x LOD 95% = 2,996). Die laborübergreifende Standardabweichung σl beschreibt in logarithmierter Form, wie stark sich die POD-Kurven der einzelnen Labore voneinander unterscheiden. Ein Wert von σl = 1 sollte nicht überschritten werden. A n m e r k u n g: Bei einem größerem Wert für σ L übersteigt die LOD 95% (des theoretischen Medianlabors ) die Grenze von 20 Kopien und das 95%-Schwankungsverhältnis der maximalen LOD 95% zur minimalen LOD 95% den Wert 50. Mit anderen Worten, ein Wert von σ L 1 bedeutet, dass das Verfahren eine sehr schlechte mittlere Sensitivität aufweist und zum anderen extrem große Empfindlichkeitsschwankungen zwischen den Laboren zu erwarten sind. BVL, 1. März 2016 Seite 12 von 18

13 2.4 Präzisionsdaten für Proben (optional) Mittels der mitgeführten Standardkurven können für die Proben die Kopienzahlen berechnet werden. Des Weiteren können Präzisionsdaten für die statistischen Kenngrößen (Mittelwert, Wiederhol- und Vergleichsstandardabweichung etc). gemäß DIN ISO errechnet werden (Tabelle 6). Im Rahmen der Ermittlung dieser Präzisionsdaten ist es erforderlich, mögliche Ausreißerdatensätze zu identifizieren und zu eliminieren. Tabelle 6 Beispiel für statistische Präzisionsdaten (gemäß ISO ) aus der Ringversuchsvalidierung der cry1ab/ac Methode [5]. Die Poisson-Standardabweichung s und die erweiterte Messunsicherheit* U (Erweiterungsfaktor 2) sind angegeben. Material für Proben DNA Anzahl Labore Verhältnis pos. Tests/ gesamt Tests Mittelwert ± U* Berechnete Kopien/µl SD r SD R s RSD R [%] 0.05 % Bt63 Reis 17 34/34 0,8 ± 0,2 0,3 0,4 0,9 46,9 KeFeng6 Reis 17 34/34 5,3 ± 0,6 0,9 1,4 2,3 26, % Bt11 Mais 17 34/34 11,0 ± 0,9 1,7 2,2 3,3 20,2 KeFeng6-positive Reis Nudeln (RASFF ) 17 32/34 0,4 ± 0,1 0,2 0,2 0,6 58,0 GM-positive Basmati rice (RASFF ) 17 34/34 1,6 ± 0,2 0,5 0,6 1,3 34,7 *Die erweiterte Messunsicherheit entspricht dem zweifachen Standardfehler des Mittelwertes. BVL, 1. März 2016 Seite 13 von 18

14 Anhang 1 - Hinweise zur Durchführung des Ringversuchs A. Ringversuchsproben und Standard DNA DNA-Lösungen, welche die Zielsequenz enthalten Besonders geeignet ist Referenz-DNA oder Referenzmaterial, dessen GVO-Anteil zertifiziert und hinsichtlich der Zielsequenz möglichst gut charakterisiert ist, z.b. hinsichtlich der Kopienzahl und der Zygotie. DNA-Lösungen, welche die Zielsequenz nicht enthalten Verwendet werden kann Referenz-DNA oder Referenzmaterial, das den jeweiligen GVO nicht enthält und z.b. den isogenen Linien entspricht. Zu beachten ist, dass die Zertifizierung solcher Materialien nur den angegebenen GVO-Gehalt betrifft und z. B. Verunreinigungen mit anderen GVO im Spurenbereich (< 0,1 %) noch möglich sind. Daher kann es vorteilhaft sein, zur Herstellung von Negativ-DNA-Proben vegetatives Pflanzenmaterial von Einzelpflanzen derselben Spezies zu verwenden, welche die Zielsequenz nachweislich nicht enthalten. In der Regel wird pro im Ringversuch untersuchter Spezies ein nicht-gv-material untersucht. Wird Hintergrund-DNA verwendet, muss diese auf Inhibition getestet werden. Standard DNA Die Standard-DNA kann aus genomischer DNA, Plasmid-DNA oder Amplikon-DNA hergestellt werden. Es ist ausreichend Standard DNA bereitzustellen, damit die in Tabelle 2 dargestellte Verdünnungsreihe mit mindestens 4 Stufen hergestellt werden kann. Idealerweise wird so viel Volumen hergestellt, dass jedes Teilnehmerlabor in der Lage ist, ggf. die Herstellung der Verdünnungsreihe zu wiederholen. Für die Herstellung der Verdünnungsreihe ist die Pufferlösung mit Hintergrund-DNA (mindestens 20 ng/µl einer nicht-ziel-dna, z.b. Lachssperma DNA) bereitzustellen. B. Reagenzien Die Menge der von zentraler Stelle versendeten Reagenzien ist so zu bemessen, dass eine Wiederholung der PCR-Messungen möglich ist (z. B. für Fälle von Geräteausfall oder offensichtlicher Fehler bei der Durchführung). Sofern zur DNA-Extraktion oder Reinigung kommerzielle Kits verwendet werden, werden diese zentral beschafft und an die Ringversuchsteilnehmer versendet. Weitere Reagenzien zur DNA-Extraktion (z. B. Puffer, RNasen, Proteinasen, Amylasen etc.) werden gegebenenfalls durch die Ringversuchsteilnehmer beschafft. Primer, Sonden und Mastermix werden zentral beschafft und direkt an die Teilnehmer versendet. Die Reagenzien sind zusammen mit einem Original-Probensatz vor deren Verwendung im Ringversuch von einem Labor, das nicht Ringversuchsteilnehmer ist, zu überprüfen. Erst nach erfolgreicher Überprüfung wird mit dem Ringversuch offiziell begonnen. BVL, 1. März 2016 Seite 14 von 18

15 C. Dokumentation und Auswertung Protokolliert werden die folgende Daten und Ergebnisse: DNA-Extraktion (sofern einbezogen) Tatsächliche Einwaage und eventuelle Abweichungen von dem Ringversuchsprotokoll Zahl der durchgeführten Extraktionen pro kodierter Probe (Standard = 1) Konzentrationen der extrahierten Proben DNA (mit Angabe der Methode zur Konzentrationsbestimmung) Real-time PCR Gerät und Geräteeinstellungen (Threshold, Baseline) Zahl der PCR-Replikate pro DNA-Extrakt für die kodierten Proben (Standard = 1) eventuelle Abweichungen von der Ringversuchsvorschrift Ct-Werte für die DNA-Verdünnungsreihe und für die kodierte Proben Ergebnisse für die Amplifikations-Reagenzienkontrolle (NTC) sowie ggf. für die Negativ-Extraktionskontrolle Den Teilnehmern wird vom Ringversuchsveranstalter ein Tabellenblatt zur Verfügung gestellt, mit dem aus den Daten mittels linearer Regression der Standardreihe die Steigung und das Bestimmtheitsmaß berechnet werden. Hierfür werden die Ct-Werte der Verdünnungsstufen gegen die logarithmierten Mengen als Kopienzahl pro Ansatz aufgetragen. Für jedes Labor werden die Resultate nach Dekodierung den einzelnen Ringversuchsproben (bzw. den DNA-Extrakten) und definierten Mengenstufen zugeordnet und jeweils separat ausgewertet. Die abgegebenen Ergebnisse der Labore sind auf Abweichungen zu überprüfen. Berechnet werden folgende Daten: Pro Labor (Spalten): Anzahl/Anteil der positiven Reaktionen pro 6-fache Blindprobe (z. B. 6 von 6) Anzahl/Anteil positiver Reaktionen für alle Verdünnungsstufen der DNA-Standardlösung unterhalb 50 Kopien Zusammenfassung für alle Labore: Tabelle C-1: Beispiel für eine Tabelle zur Ringversuchsauswertung hinsichtlich der falsch-positiv / falsch-negativ Rate Anzahl teilnehmender Laboratorien 10 Anzahl Labore, die Ergebnisse übermittelten 10 Anzahl Proben je Laboratorium 12 Anzahl angenommener Ergebnisse 120 Anzahl Proben, die die Zielsequenz enthielten 60 Anzahl Proben, die keine Zielsequenz enthielten 60 Falsch-positive Ergebnisse (Rate in %) 0 (0 %) Falsch-negative Ergebnisse (Rate in %) 0 (0 %) BVL, 1. März 2016 Seite 15 von 18

16 Weitere Auswertung (optional) Weitere Daten zur Leistungsbeschreibung des PCR-Verfahrens können aus folgenden Ergebnissen ermittelt werden (siehe auch Anhang D im Dokument Leitlinien zur Einzellabor-Validierung ): 6-fache Blindproben Mittelwert Ct und berechnete Kopienzahl (ggf. pro DNA-Extrakt) Mittelwert Ct und Kopienzahl aller identischen DNA-Extrakte bzw. die identischen DNA-Proben Standardabweichung für die Kopienzahl aller unter Wiederholbedingungen durchgeführten identischen DNA-Extrakte bzw. für die identischen DNA-Proben, absolut und bezogen auf den Mittelwert (Wiederholstandardabweichung, sr) Verdünnungsreihe Mittelwert Ct und Mittelwert Kopienzahl pro Verdünnungsstufe der Verdünnungsreihen (sofern alle Reaktionen der Verdünnungsstufe positiv sind) Standardabweichung Kopienzahl der unter Wiederholbedingungen durchgeführten Untersuchung einer Verdünnungsstufe, absolut und bezogen auf den Mittelwert (Wiederholstandardabweichung, sr) (nur sofern alle Reaktionen der jeweiligen Verdünnungsstufe positiv sind). BVL, 1. März 2016 Seite 16 von 18

17 Literatur [1] European Network of GMO Laboratories (2015). Definition of Minimum Per-formance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing. Report Application 20_10_2015.pdf [2] Guidelines on Performance Criteria and Validation of Methods for Detection, Identification and Quantification of Specific DNA Sequences and Specific Proteins in Foods. Codex Alimentarius AC/GL [3] Uhlig S, Frost K, Colson B, Simon K, Mäde D, Reiting R, Gowik P, Grohmann L (2015) Validation of qualitative PCR methods on the basis of mathematical-statistical modelling of the probability of detection. Accred Qual Assur 20: [4] Verification of real time PCR methods for GMO testing when implementing collaborative validated methods. Guidance document from the European Network of GMO Laboratories (ENGL) DOI: /87679 [5] Grohmann L, Reiting R, Mäde D, Uhlig S, Simon K, Frost K, Randhawa GJ, Zur K (2015) Collaborative trial validation of cry1ab/ac and Pub-cry TaqMan-based real-time PCR assays for detection of DNA derived from genetically modified Bt plant products. Accred Qual Assur 20: BVL, 1. März 2016 Seite 17 von 18

18 Impressum 2016 Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL) Herausgeber: Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL) Bundesallee Braunschweig ViSdP: Frau N. Banspach (BVL, Pressestelle) Titelbild: Pressestelle / BVL BVL, 1. März 2016 Seite 18 von 18