BIOCHEMIE des Stoffwechsels ( )

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1 BIEMIE des Stoffwechsels ( ) 6. Einheit Schicksale des Pyruvats

2 Inhaltsverzeichnis Glycolyse 1. Glucosetransport 2. Abfolge der chemischen Umwandlungen der Glucose in Pyruvat (10 Reaktionen) 3. Mechanismen der einzelnen Reaktionen 4. Thermodynamik und Regulation 5. Einschleusen von Galactose, Mannose, Fructose und Glycerin in die Glykolyse 6. Schicksale des Pyruvats

3 GLUSE 2 ADP + 2 P i 2 AD + Fructose-1,6-bisphosphat 2 ATP 2 AD 2 Pyruvat Anaerobe homolactische Fermentation Aerobe xidation (Mitochondrien) Anaerobe alkoholische Gärung

4 Das in der Glycolyse gebildete Pyruvat muss weiter umgesetzt werden, damit die Glycolyse weiterlaufen kann. Wichtig ist, dass das bei der xidation des Glycerinaldehyd-3-phosphats reduzierte AD + regeneriert wird. eben der aeroben ption (itratzyklus und Atmungskette) gibt es mehrere anaerobe ptionen, z.b.: Reduktion von Pyruvat zu Lactat durch Lactat-Dehydrogenase. Viele rganismen haben sich dafür entschieden. Selbst der humane Skelettmuskel bedient sich dieser Strategie, wenn die Sauerstoffversorgung nicht mehr ausreicht. Ökonomisch ist die homolactische Fermentation sehr bedeutend, (z.b. Rolle von Bakterien in der Käse- und Joghurtherstellung mittels Fermentation von Lactose der Milch).

5 efen und einige andere rganismen bilden bei anaerobem Zuckerabbau Ethanol und 2 anstelle von Lactat (alkoholische Fermentation). Im Gegensatz zu fakultativen Anaerobiern wie E. coli, die für eine unbegrenzte Zeit anaerob wachsen können, können efen nur einige Generationen lang in völliger Abwesenheit von Sauerstoff existieren, da sie molekularen Sauerstoff für die Synthese von Membrankomponenten benötigen. eterolactische Bakterien produzieren neben Lactat auch Ethanol. Andere Bakterien (Propionsäure-Bakterien) wiederum wandeln Pyruvat reduktiv in Propionat um (erstellung des Schweizer Käse). Andere fermentative Produkte sind beispielsweise Butyrat (ranzige Butter), Aceton oder Isopropanol. In allen Fällen wird AD durch Transfer von Elektronen auf einen organischen Akzeptor reoxidiert (= Definition der Fermentation).

6 1. omolactische Fermentation 2. Alkoholische Fermentation 3. Aerobe xidation omolactische Fermentation Ein häufiger Mechanismus der anaeroben Reoxidation von AD mittels Pyruvat ist die Reduktion der arbonyl-gruppe des Pyruvats. Die Lactatbildung aus Pyruvat ist thermodynamisch begünstigt, sodass (selbst unter aeroben Bedingungen) Lactat akkumuliert.

7 2 P 3 2- P P P 3 1,3- BPG Glycerinaldehyd- 3-phosphat AD + AD + + Lactat 3 - Lactat- Dehydrogenase 3 - Pyruvat

8 Glycolyse 11. Reaktion: Lactat-Dehydrogenase Pyruvat + AD + + L-Lactat + AD + Enzym: ofaktor: Pyruvat xidoreductase Lactat-Dehydrogenase (E ) Tetramer: 4 35 kda (Kaninchenmuskel) AD L-Lactat

9 Pyruvat R 5 6 S R 2 AD L-Lactat R 2 AD +

10 Lactat-Dehydrogenase, LD, arbeitet absolut stereospezifisch: Übertragung des pro-r-wasserstoffs (A-Seite) am (4)-des AD auf die re-seite des (2) des Pyruvats unter Bildung von L- (oder S-)Lactat. Vergleich mit Glycerinaldehyd-3-P-Dehydrogenase, GAP-D, zeigt, dass bei GAP-D die ydridübertragung auf die andere Seite (B- Seite) des icotinamid-ringes erfolgt! Überlagerung von Proteingebundenem AD + in LD und GAP-D zeigt Verdrehung des jeweiligen icotinamid-ringes um 180 AD + in LD AD + in GAP- D

11 Rossmann Falte: Typisches Faltungsmotiv in AD + bindenden Dehydrogenasen. Besteht aus zwei strukturell ähnlichen Domänen: (a) icotinamid-bindende Domäne (gelb) und (b) Adeninbindende Domäne (rot)

12 Monomer Ausrichtung des Pyruvats durch Arg171 und is195 Lactat- Dehydrogenase

13 R 3 2 is AD + 2 Arg ydridübertragung vom (4) des AD auf (2) des Pyruvats Gleichzeitige Übertragung eines Protons von der Imidazolium-Einheit des is-195 3

14 Lactat-Dehydrogenase (Monomer) AD + Pyruvat

15 Pyruvat + AD + + L-Lactat + AD + G = -25,2 kj/mol; K eq (25 ) = 2, G = -14,8 kj/mol Säugetiere: 2 Arten von Untereinheiten: M und (Aminosäuresequenzen stimmen zu 75% überein; achweis in SDS-PAGE) Fünf tetramere Isoenzyme (ybridformen): M 4, M 3, M 2 2, M 3, 4 (M und werden durch unterschiedliche Gene codiert, die durch Genduplikation entstanden sind). Aerobes Gewebe (erzmuskel): Überwiegend Expression der -Form ( 4, M 3 ); emmung dieser Isoformen durch Pyruvat um Verschwendung dieser potentiell sehr energiereichen Kohlenstoffquelle zu verhindern. Im aeroben Gewebe soll Pyruvat in den itrat-zyklus eingeschleust werden! Diese Isoformen haben zudem einen geringen K M -Wert für Lactat. Vorhandenes Lactat wird bevorzugt zu Pyruvat oxidiert.

16 Anaerobes Gewebe (Skelettmuskel, Leber): Das aktive Muskelgewebe ist anaerob und ist auf die Glycolyse als ATP- Produzent angewiesen! Es bildet eine erhebliche Menge an Pyruvat (und Alanin, siehe unten). ier darf die Lactat-Dehydrogenase durch Pyruvat nicht gehemmt werden, da sich sonst der Vorrat an AD + vermindern würde und der glycolytische Reaktionsweg wäre unterbrochen! Tatsächlich hat das aktive Muskelgewebe erhöhte Pyruvat-Spiegel und wandelt Pyruvat bereitwillig in Lactat um. Im anaeroben Gewebe überwiegt die M-Form (M 4, M 3 ); diese Isoformen arbeiten optimal unter anaeroben Bedingungen und werden durch Pyruvat nicht gehemmt. Der K M -Wert für Lactat ist hoch. Pyruvat wird bevorzugt zu Lactat reduziert, das freigesetzt wird.

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18 2 Typen von Skelettmuskeln: A. TYP 1 (LAGSAME FASER): Aerobes Gewebe. Langsam, stetig sich kontrahierende Muskeln (Beispiel: erzmuskel); enthält viele Mitochondrien ( rote Mukselfasern siehe Aufbau der Elektronentransportkette und Vorkommen von ytochromen) und viel Myoglobin (Sauerstoffspeicher). Aerobes Gewebe produziert ATP über oxidative Phosphorylierung. Die Stärke dieser Muskelfasern sind oftmalige Kontraktionen mit jeweils geringer Kraftentwicklung und mit möglichst vollständiger aerober Energiebereitstellung und somit geringer Ermüdung. B. TYP 2 (SELLE FASER): Anaerobes Gewebe. Beispiel: Skelettmuskeln für kurzzeitige schnelle Leistung (kräftige, schnelle Kontraktion). wenige Mitochondrien ( weiße Muskelfasern ) und Myoglobin. ATP wird hauptsächlich über die Glycolyse mit anschließender Lactatbildung erzeugt. Anaerobe Glykolyse: ATP-Produktion 100mal schneller als bei oxidativer Phosphorylierung.

19 Muskelkater (Muskelermüdung, Muskelschmerz) ist KEIE Lactatanhäufung, sondern Akkumulation der durch Glycolyse erzeugten Säure: Glucose + 2 ADP + 2 P i 2 Lactat + 2 ATP Muskeln können ihre Arbeitsleistung auch bei hoher Lactatkonzentration aufrechterhalten, wenn der p-wert konstant gehalten wird ( das Fleisch eines gehetzten Tieres schmeckt durch Lactat- Akkumulierung in den Muskeln sauer). Bilanz der Reaktionsfolge Glucose Lactat: Glucose + 2 ADP + 2 P i 2 Lactat + 2 ATP vgl. xidative Phosphorylierung: 38 ATP/Glucose (bei Annahme 3 ATP pro AD) Pasteur: efe benötigt bei anaerobem Wachstum wesentlich mehr Zucker als bei aerobem Wachstum (Pasteureffekt).

20 Die Lactatbildung ist im Stoffwechsel ein totes Gleis. Das Lactat muss in Pyruvat zurückverwandelt werden, bevor es metabolisiert werden kann. Es ist zu beachten, dass die Umwandlung von Glucose in Lactat keine etto-xidations-reduktions-reaktion darstellt. Die Lactat-Bildung bringt Zeitgewinn und verlagert einen Teil des Stoffwechsels von der Muskulatur zur Leber. Wie? Die Plasmamembran der meisten Zellen ist für Lactat und Pyruvat hochpermeabel. Beide Substanzen diffundieren aus dem aktiven Skelettmuskel in das Blut und werden zur Leber transportiert. Im Muskel wird aufgrund des hohen AD/AD + -Verhältnisses aus Pyruvat Lactat gebildet, das ins Blut abgegeben wird. In der Leber jedoch ist das AD/AD + -Verhältnis im ytosol niedrig und somit die Lactat-xidation zu Pyruvat begünstigt. Das gebildete Pyruvat wird in der Leber in der sog. Gluconeogenese zu Glucose umgewandelt, die über das Blut wieder zur Skelettmuskulatur gelangen kann (ori-zyklus).

21 Leber Blut Muskel Glucose Glucose Glycogen ATP + GDP+ P i ADP + P i GLUEGEESE ATP, GTP Lactat GLYGELYSE GLYLYSE ATP Lactat RI-ZYKLUS

22 Bei der Muskelkontraktion und in Erythrocyten entstehen aus Pyruvat neben Lactat auch Alanin durch Transaminierung. Wiederum läuft in der Leber die umgekehrte Reaktion ab. eben Lactat ist Alanin das wichtigste Rohmaterial für die Gluconeogenese. Alanin-Aminotransferase, die in Säugetiergeweben reichlich vorkommt, katalysiert die Übertragung der Aminogruppe des Alanins auf -Ketoglutarat: Alanin + -Ketoglutarat Pyruvat + Glutamat In der Leber, wo in Säugetieren hauptsächlich der Aminosäure- Abbau stattfindet, wird Alanin in Pyruvat umgewandelt, das dann in der Gluconeogenese verwendet werden kann.

23 1. omolactische Fermentation 2. Alkoholische Fermentation Alkoholische Gärung In efe wird AD + unter anaeroben Bedingungen durch die Umwandlung von Pyruvat in Ethanol und 2 regeneriert ( erstellung alkoholischer Getränke bzw. Aufgehen des efeteigs). Ethanol und 2 werden in efezellen durch zwei Reaktionen erzeugt.

24 2-2 P 3 P P 3 2 P 3 2-1,3-BPG Glycerinaldehyd- 3-phosphat AD + AD Pyruvat 2 Ethanol 3 Alkohol- Dehydrogenase 3 Pyruvat- Decarboxylase Acetaldehyd

25 efe Pyruvat-Decarboxylase Pyruvat Acetaldehyd + 2 Enzym: ofaktor: Pyruvat Lyase Pyruvat-Decarboxylase (E ) efe Thiaminpyrophosphat Acetaldehyd

26 3 2-3 Decarboxylierung von Pyruvat unter Bildung von Acetaldehyd und 2. Enzym: oenzym: Pyruvat-Decarboxylase (kommt bei Tieren und Menschen nicht vor!). Thiaminpyrophosphat (TPP). äufigstes oenzym bei -Ketocarbonsäure- Decarboxylierungen

27 Thiaminpyrophosphat Pyrimidin- Derivat S P P saures Proton Der Thiazoliumring bildet die katalytisch aktive funktionelle Gruppe der Pyruvat-Decarboxylase. Im Menschen findet man dieses oenzym u.a. in der Pyruvat-Dehydrogenase oder in der -Ketoglutarat-Dehydrogenase.

28 Thiaminpyrophosphat saures Proton Dipolares arbanion (YLID): aktive Form des oenzyms (Funktion als Elektronensenke) Stabilisierung durch pos. geladenes quarternäres Stickstoffatom

29 - R R Bei der Decarboxylierung einer -Ketocarbonsäure würde im Übergangszustand eine negative Ladung am verbleibenden arbonylkohlenstoff entstehen, was aber einem sehr instabilen Zustand entsprechen würde. Der Übergangszustand kann aber durch Delokalisierung der negativen Ladung innerhalb einer Elektronensenke (=TPP) stabilisiert werden.

30 3 R' 3 R' R 3 S - + R 3 S - ucleophiler Angriff der Ylidform des TPP am arbonylkohlenstoff des Pyruvats und in der Folge Austritt des 2 unter Bildung eines resonanzstabilisierten arbanions.

31 3 R' 2 3 R' R 3 S - R 3 S 3 R' R S Resonanzstabilisiertes arbanion 3

32 3 R' 3 R' + R S R S 3 3 Resonanzstabilisiertes arbanion Protonierung des arbanions ydroxyethyl-tpp 3 R' R' R 3 S Eliminierung des TPP-Ylids und Produktfreisetzung R S TPP (Ylid)

33 Pyruvat-Decarboxylase aus efe TPP TPP

34 efe, Mensch Alkohol-Dehydrogenase Acetaldehyd + AD + + Ethanol + AD + Enzym: xidoreductase Alkohol-Dehydrogenase (E ) efe (Tetramer), Mensch: Leber (Dimer) ofaktoren: AD, Zn 2+ Acetaldehyd Ethanol

35 AD AD + 3 Alkohol- Dehydrogenase 3 efe: Mensch: AD ( yeast -AD, YAD): Tetramer Leber-AD. Alkohol-Quelle: a) zugeführt ( ahrung ) b) von Darmflora (anaerob) produziert Dimer: ohe omologie zwischen YAD und humaner AD, Zn 2+ -abhängige Reaktion

36 umaner Stoffwechsel: Primäre Alkohole, insbesondere Ethanol, werden in zwei Schritten in der Leber metabolisiert: Alkohol-Dehydrogenase (AD): Ethanol + AD + Acetaldehyd + AD + + Aldehyd-Dehydrogenase (ALD): Acetaldehyd + AD + Acetat + AD + + Thiokinase: Acetat + oa + ATP Acetyl-oA + AMP + PP i Alkohol und Aldehyd, jedoch nicht das Acetat sind giftig. Letzteres kann z.b. als Acetyl-oA im itrat-yclus verwertet werden. Die Alkohol-Dehydrogenase ist ein Zink-Protein, während die Aldehyd-Dehydrogenase ein Molybdän-Eisen-Flavoprotein ist.

37 Katalytisches Zink von außen nicht sichtbar Das katalytische Zink-Ion sitzt in einer etwa 20 Å tiefen Tasche in der Verbindungsstelle von zwei Domänen. In dieser Tasche befinden sich auch Substrat und oenzym- Bindungsstellen. grün: AD +

38 Zink ist für die Bindung des Alkohols nötig, nicht jedoch für die Bindung des oenzyms AD +, das an der anderen Domäne bindet. Die redoxaktive Position des icotinamid-rings des ofaktors AD + ist mit einem Pfeil gekennzeichnet. ys is Zn 2+ ys 3 Zn S S

39 3 S Zn S Das elektropositive Zink-Ion, Zn 2+, fördert die Deprotonierung des Substrats unter Bildung von koordiniertem R -, Ethanolat. Funktion des Zink-Ions als Lewis-Säure (= Elektronenmangelverbindung) Die Bindung des oenzyms AD + an AD ist mit einer Konformationsänderung des Proteins von einer offenen zu einer geschlossenen Form verbunden (induced fit: Drehung der beiden Domänen um etwa 10 ). Das oenzym wird dadurch für die ydrid- Ionen-Übertragung vom -Kohlenstoffatom des Alkohols auf den icotinamidring richtig positioniert. ach der Elektronenübertragung dissoziieren Produkt und AD rasch ab.

40 Schematische Darstellung des AD + -bindenden Bereichs in der AD der Leber.

41 ydrid-übertragung vom zinkgebunden Ethanolat-Ion auf AD + unter Bildung von Acetaldehyd und AD

42 umane ADs oxidieren verschiedenartige kurzkettige primäre und auch sekundäre aliphatische Alkohole (mit sehr unterschiedlichen Reaktionsgeschwindigkeiten). Es gibt verschiedene AD-Isoformen unterschiedlicher Reaktivität. Methanol wird auch (relativ langsam) umgesetzt und damit zu toxischem(!) Formaldehyd oxidiert. Bei Methanol-Vergiftungen versucht man diese Reaktion durch Ethanolgaben zu unterdrücken! Andere Alkohole wie n-propanol oder n-butanol werden zwar rasch zum entsprechenden Aldehyd oxidiert, jedoch nur langsam weiteroxidiert ( unangehme physiologische ebenreaktionen). Bei der Ethanol-xidation entstehender Acetaldehyd ruft Kater - ähnliche Syndrome hervor. Das für die xidation verantwortliche Enzym Aldehyd-Dehydrogenase kann - genetisch bedingt ineffizient arbeiten (häufig bei stasiaten) Ansteigen des Acetaldehyd-Spiegels.

43 Alkoholtherapie: Durch Verabreichung des Schwermetallkomplexierenden Tetraethylthiuramdisulfids (Disulfiram, Antabus ) wird das Metalloenzym Aldehyd-xidase inaktiviert. ohe Aldehyd- Konzentrationen werden dabei also bewußt zur Erzeugung von unangenehmen ebenwirkungen eingesetzt. Unterschiedliche AD-Verfügbarkeit wird dafür verantwortlich gemacht, dass Ethanol an Missbildungen und Krebsentstehung beteiligt sein kann. Frauen verfügen z.b. im Gastro-Intestinalbereich über weniger AD, sodass bei gleichem Alkoholkonsum mehr in die Blutbahn und in das zentrale ervensystem gelangen kann. Warum schädigt Alkohol die Leber? Sowohl AD als auch ALD produzieren in der Leber AD, das akkumuliert und die xidation von Lactat zu Pyruvat (und somit die Gluconeogenese) hemmt. Folge ypoglykämie und Lactatacidose! Der Überschuss an AD hemmt auch die Fettsäureoxidation. Folge: Fettleber.

44 1. omolactische Fermentation 2. Alkoholische Fermentation 3. Aerobe xidation Aerobe xidation Im Zuge der aeroben xidation werden Reduktionsäquivalente (AD, FAD 2 ) letztendlich in der Atmungskette der Mitochondrien oxidiert. eben dem in der Glycolyse anfallenden AD, entstehen weitere Reduktionsäquivalente im itronensäure- yclus. Die Pyruvat-Dehydrogenase verbindet die Stoffwechselwege der Glycolyse und des itronensäure-yclus. Acetylgruppen treten als Acetyl-oA, das gemeinsame Produkt des Kohlenhydrat-, Fettsäure- und Aminosäureabbaus, in den itronensäure-yclus ein. Im Kohlenhydrat-Stoffwechsel katalysiert die Pyruvat- Dehydrogenase die Umwandlung von Pyruvat in Acetyl-oA.

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46 Glucose Pyruvat Acetyl-oA TA- yclus Glycolyse Pyruvat -D Aerobe ption: xidation von AD in der Atmungskette der Mitochondrien. In diesem Fall unterliegt das Pyruvat der enzymatischen Decarboxylierung unter Bildung von Acetyl-oA, das in den sog. itronensäure-yclus (Tricarbonsäure- yclus; TA-yclus; Krebs-yclus) eingeschleust wird. Dort wird Acetyl-oA oxidativ formal zu 2 abgebaut. Der TA-Zyklus ist verantwortlich für den größten Teil der Kohlenhydrat-, Fettsäureund Aminosäureoxidation. eben seiner herausragenden Rolle im katabolen Stoffwechsel, stellt der itronensäurezyklus aber auch zahlreiche Zwischenstufen für Biosynthesen zur Verfügung (amphibolische atur des itronensäure-yclus).

47 Acetyl-oA Elektronentransport xidative Phosphorylierung TA- yclus Matrix Im itronensäure-yclus werden die (u.a. durch Pyruvat- Dehydrogenase) gebildeten Acetyl-oA-Einheiten formal zu 2 oxidiert. ettoreaktion: 3 AD + + FAD + GDP + Acetyl-oA + P i AD + FAD 2 + GTP + oa Die gebildeten Reduktionsäquivalente werden anschließend in der Atmungskette mittels molekularem Sauerstoff reoxidiert..

48 Äußere Membran ristae Innere Membran Matrix Intermembranraum Mitochondriale Matrix: enthält (u.a.) Enzyme des itronensäure- yclus sowie den Multienzymkomplex Pyruvat-Dehydrogenase (Rinderherz: 8400 kda), der aus Pyruvat Acetyl-oA synthetisiert.

49 Wie gelangt das Endprodukt der Glycolyse, Pyruvat, in die mitochondriale Matrix? Es gibt mehrere mitochondriale Transportsysteme für Ionen und geladene Metaboliten: Der Eintritt von ADP in die Mitochondrien ist mit dem Austritt von ATP über eine sog. ATP-ADP-Translocase gekoppelt Der Phosphat-arrier arbeit in Abstimmung mit der ATP- ADP-Translocase und vermittelt den elektroneutralen Austausch von P i und -. Der Dicarboxylat-arrier befördert Malat, Fumarat und Succinat im Austausch gegen P i aus dem Mitochondrium. Der Tricarboxylat-arrier befördert itrat und ein Proton im Austausch gegen Malat.

50 Der Pyruvat-arrier befördert entweder im Austausch gegen - (Pyruvat/ - -Antiport) oder zusammen mit + (Pyruvat/ + -Symport) Pyruvat vom ytosol in die Mitochondrien. Diesen mitochondrialen arriern liegt ein gemeinsames Strukturmotiv zugrunde. Sie bestehen aus drei ähnlichen, jeweils etwa hundert Reste umfassenden Einheiten mit jeweils 2 Transmembran-elices: Matrix Innere Membran ytosol 3 + -

51 Pyruvat-Dehydrogenase Pyruvat + oa + AD + Acetyl-oA AD Enzym: ofaktoren: E (xidoreductase) TPP, oa, FAD, AD + und Liponamid Multienzymkomplex (Rinderherz: 8400 kda): Pyruvat-Dehydrogenase (E 1 ): Dihydrolipoyl-Transacetylase (E 2 ): 30 E Tetramere 60 E 2 -Monomere (Kern des Komplexes) Dihydrolipoyl-Dehydrogenase (E 3 ): 6 E 3 -Dimere Multienzymkomplexe: hohe katalytische Effizienz durch geringere Distanzen für Edukte und Intermediate, weniger ebenreaktionen und besser koordinierte Kontrolle.

52 Pyruvat-Dehydrogenase

53 Modell der Pyruvat- Dehydrogenase: Dihydrolipoyl- Transacetylase (E 2 )- Kern Pyruvat- Dehydrogenase (E 1, gelb) Dihydrolipoyl- Dehydrogenase (E 3 )

54 A Elektronenmikroskopische Aufnahme des Pyruvat-D-Komplexes aus E. coli (A) und des Dihydrolipoyl-Transacetylase (E 2 )- Kerns (B). B

55 oenzyme und prosthetische Gruppen der Pyruvat-Dehydrogenase ofaktor Einordnung Funktion Thiaminpyrophosphat, TPP An E 1 gebunden Pyruvatdecarboxylierung Liponsäure kovalent an E 2 Übernimmt gebunden ydroxyethyl- arbanion von TPP oenzym A (oa) Substrat für E 2 Übernimmt die Acetylgruppe vom Liponamid Flavinadenindinucleotid An E 3 gebunden Wird durch Liponamid reduziert AD + Substrat für E 3 Durch FAD 2 reduziert

56 Pyruvat-Dehydrogenase ist eines der kompliziertesten Enzyme, da es zahlreiche ofaktoren benötigt, die aus vitaminischen Vorstufen synthetisiert werden. Die Vitamine werden aus der ahrung aufgenommen. Vitamine B sind wasserlöslich! Vitamine in rot sind für die Funktionalität der Pyruvat-D essentiell: Vitamin Thiamin (Vitamin B 1 ) Riboflavin (Vitamin B 2 ) ofaktor Thiaminpyrophosphat FAD iacin (Vitamin B 3 ) AD + Pantothenat (Vitamin B 5 ) Pyridoxin (Vitamin B 6 ) Vitamin B 12 oenzym A Pyridoxalphosphat (siehe Glykogen- und Aminosäurestoffwechsel) obalamin (Fettsäurestoffwechsel)

57 Thiaminpyrophosphat saures Proton Dipolares arbanion (YLID): aktive Form des oenzyms (Funktion als Elektronensenke) Stabilisierung durch pos. geladenes quarternäres Stickstoffatom

58 Thiaminpyrophosphat ist an vielen Decarboxylierungsreaktionen als ofaktor beteiligt. Es leitet sich vom Thiamin ab, das als Vitamin B 1, das vom Menschen weder synthetisiert noch in ausreichender Menge gespeichert werden kann, mit der ahrung aufgenommen werden muss. Ein Mangel führt beim Menschen zu einer lebensgefährlichen Erkrankung, der Beriberi, bei der es zu neurologischen Ausfällen kommt (das ervensystem verlässt sich im Wesentlichen auf Glucose als Brennstoff!; d.h. sein Energiestoffwechsel kommt zum Erliegen): Schmerzen, Lähmungen, Atrophie (Muskelschwund) der Extremitäten, Ödeme (Flüssigkeitsansammlungen in Geweben und Körperhöhlen). Beriberi tritt typischerweise in Ländern des rients auf, in denen Reis auptnahrungsmittel ist. Der Reis wird poliert, wobei seine groben, aber thiaminhaltigen Schichten entfernt werden.

59 Wie wird Thiamin in Thiaminpyrophosphat im menschlichen Körper umgewandelt? Thiamin wird in der Leber in die Pyrophosphatform übergeführt und in der iere dephosphoryliert (Ausscheidung). Im Mitochondrium der Leber erfolgt die Umwandlung von Thiamin zu Thiaminpyrophosphat (TPP) durch die Thiamin-Kinase: Thiamin + ATP TPP +AMP eben seiner Funktion als ofaktor in Decarboxylierungsreaktionen (Pyruvat-Dehydrogenase, -Ketoglutarat-Dehydrogenase), fungiert TPP als Überträger von 2 -Einheiten in Transketolasen (siehe Pentosephosphat-yclus).

60 3 S ADP 3 Acetyl-oA Acetyl-oA + 2 oa + Acetat G = -31,5 kj/mol Die Bildung der Thioesterbindung konserviert die Freie Enthalpie des Pyruvats in der Pyruvat-D-Reaktion.

61 ysteamin Pantothensäure-Rest Acetylgruppe Adenosin-3 - phosphat Pantothensäure kann vom Menschen nicht synthetisiert werden. Pantothenat ist das wasserlösliche Vitamin B 5! Mangelerkrankungen sind sehr selten. Acetyl-oenzym A (Acetyl-oA)

62 Wie wird Pantothenat in oenzym A im menschlichen Körper umgewandelt? 3 Pantothenat ATP Pantothenat-Kinase ADP 3 P Phosphopantothenat

63 3 P ATP + ystein Phosphopantothenoylcystein -Synthase ADP + P i 3 - P S

64 3 - P S Phosphopantothenoylcystein-Decarboxylase 2 3 P 2 3 Dephospho-oA- Pyrophosphorylase 2 2 ATP PP i 2 S 3 Adenosin P P S

65 3 Adenosin P P S Dephospho- oa-kinase ATP ADP Phosphorylierung

66 S S Liponamid 2 2 ( 2 ) e - Liponsäure kovalent über Amidbindung an Lysin im aktiven Zentrum des Enzyms gebunden S S Dihydroliponamid ( 2 ) 4 Liponsäure (6,8-Dithiooctansäure) ist kein Vitamin, kann vom Menschen endogen synthetisiert werden

67 Flavinadenindinukleotid (FAD) 2 D-Ribitol 2 P P 2 Adenosin -diphosphat Isoalloxazinring

68 Der Mensch kann die Isoalloxazin-Komponente der Flavine nicht synthetisieren. Muss in Form des Vitamins B 2 (Riboflavin) aufgenommen werden. 2 D-Ribitol (stammt vom Alkohol des Zuckers D- Ribose) Isoalloxazin Riboflavin (Der Ausdruck Flavin ist synonym mit dem Isoalloxazinring)

69 Wie entstehen die ofaktoren FM und FAD aus dem Vitamin Riboflavin? 2 2 P 2 ATP ADP Flavokinase 3 Riboflavin Riboflavinmononucleotid, FM

70 2 P ATP 3 2 FAD-Pyrophosphorylase PP i 2 3 Flavinmononucleotid, FM 2 P P Flavinadenindinucleotid, FAD 3

71 Struktur von icotinamidadenindinucleotid (AD + ) 2 icotinamid (ein Pyridinderivat) D-Ribose 2 P P Adenosindiphosphat

72 icotinamid (synonym iacinamid) oder das arbonsäure-analogon icotinsäure (iacin) sind Vitaminvorstufen (Vitamin B 3 ) für das oenzym AD + oder ADP +. AD 2 icotinamid (iacinamid) icotinsäure (iacin) Der Mensch kann icotinamid auch aus dem Tryptophan- Abbauprodukt hinolinat synthetisieren. Bei Mangelernährung ist dieser Weg aber nicht aktiv, weil Tryptophan in der Proteinbiosynthese benötigt wird.

73 Wie entstehen die ofaktoren AD + und ADP + aus den Vitaminen iacin bzw. iacinamid? icotinat (iacin) - P - PRPP PP i icotinatmononucleotid - PRPP ist 5-Phosporibosyl- 1-pyrophosphat - 2 icotinamid (iacinamid) - P - PRPP PP i 2 2 icotinat- Phosphoribosyltransferase icotinamid- Phosphoribosyltransferase icotinamidmononucleotid

74 PRPP ist die aktivierte Form von Ribosephosphat. eben der Biosynthese von AD(P) + aus dem Vitamin B 3, ist 5-Phosphoribosyl-1-pyrophosphat auch eine Schlüsselsubstanz bei der Biosynthese von Purin und Pyrimidinnucleotiden und bei der Synthese von istidin.

75 2 ATP PP i 2 - P - AD + - Pyrophosphorylase Ribose P i P i AD + icotinamidmononucleotid - P - icotinatmononucleotid Ribose ATP PP i AD + - Pyrophosphorylase Ribose P i P i Ribose Adenin icotinatadenindinucleotid Adenin

76 icotinat-adenindinucleotid ATP + AMP ADP + + PP i + Glutamin Glutamat Ribose P i AD + -Synthase (Ligase) Ribose P i AD + P i P i Ribose Adenin Ribose Adenin AD + -Kinase: AD + + ATP ADP + + ADP

77 2 Struktur von icotinamidadenindinucleotidphosphat (ADP + ) 4 P P P Die reaktive Gruppierung (= 4-Position des icotinamid) ist bei AD + und ADP + ident.

78 Modell der Pyruvat- Dehydrogenase: Dihydrolipoyl- Transacetylase (E 2 )- Kern Pyruvat- Dehydrogenase (E 1, gelb) Dihydrolipoyl- Dehydrogenase (E 3 ) Pyruvat + oa + AD + Acetyl-oA AD

79 oenzyme und prosthetische Gruppen der Pyruvat-Dehydrogenase ofaktor Einordnung Funktion Thiaminpyrophosphat, TPP An E 1 gebunden Pyruvatdecarboxylierung Liponsäure kovalent an E 2 Übernimmt gebunden ydroxyethyl- arbanion von TPP oenzym A (oa) Substrat für E 2 Übernimmt die Acetylgruppe vom Liponamid Flavinadenindinucleotid An E 3 gebunden Wird durch Liponamid reduziert AD + Substrat für E 3 Durch FAD 2 reduziert

80 Die Funktion des ofaktors Thiaminpyrophosphat in E 1 von Pyruvat-D ist analog jener in Pyruvat-Decarboxylase von efe: 3 R' TPP-E 1 3 R' R S + R S Pyruvat 3 Bindung der - Ketocarbonsäure an die Ylid-Form des TPP

81 3 R' 2 3 R' R S R S ydroxyethyl-tpp-e 1 Pyruvat-Dehydrogenase (E 1 ): Decarboxylierung von Pyruvat unter Bildung von ydroxyethyl-tpp Anschließend wird die 2 -Einheit an E 2 weitergegeben. ydroxyethyl-tpp wird durch Liponamid-E 2 oxidiert:

82 Jede rote Kugel stellt ein Trimer aus drei E 2 -Untereinheiten dar Struktur des Transacetylasekerns (E 2 ) Jede Untereinheit besteht aus drei Domänen: einer Liponamid- Bindungsdomäne, einer kleinen Domäne zur Wechselwirkung mit E 3 und einer großen katalytischen Transacetylasedomäne

83 3 R' + 3 R' R S R S 3 3 S S Liponamid-E 2 S S E 2 E 2 Angriff des ydroxyethyl-arbanions am Liponamiddisulfid

84 3 R' 3 R' R S Eliminierung des TPP R S 3 S S E 2 3 S S E 2 Bildung von Acetyl-dihydrolipoylamid-E 2

85 oa S Acetyl-oA oa S 3 3 S S S E 2 S E 2 Acetyl-dihydrolipoylamid-E 2 Dihydrolipoylamid-E 2 Dihydrolipoyl-Transacetylase (E 2 ) überträgt schließlich die Acetylgruppe auf oa unter Bildung von Acetyl-oA und Dihydroliponamid-E 2.

86 14 Å Der Lipoyllysyl-Arm von E 2 vermittelt im Multienzym-Komplex Pyruvat- Dehydrogenase zwischen E 1 und E 3. Auch innerhalb der Lipoyl-Gruppen von E 2 werden Austauschreaktionen beobachtet: Lipoyllysyl-Arm (voll ausgestreckt)

87 Der Reaktionszyklus von Pyruvat-Dehydrogenase wird schließlich vollendet, wenn durch die Dihydrolipoyl-Dehydrogenase (E 3 ) Liponamid regeneriert wird: xidiertes Enzym enthält reaktive Disulfidgruppe und FAD: Reoxidation von Dihydrolipoylamid durch Disulfidaustauschreaktion. xidation des Lipoylamids bei gleichzeitiger Reduktion des reaktiven Disulfids von E 3. FAD S S E 3 (oxidiert) S S E 2 S S FAD S S E 3 (reduziert) E 2

88 Reduziertes E 3 wird durch AD + reoxidiert: 1. Reoxidation der Sulfhydrylgruppen durch FAD 2. Reoxidation des FAD 2 durch AD + FAD S S E 3 (reduziert) FAD 2 S S AD + AD + + FAD S S E 3 (oxidiert)

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90 Überblick: Pyruvat-Dehydrogenase Multienzymkomplex Dihydrolipoyl- Dehydrogenase (E 3 ) Pyruvat- Dehydrogenase (E 1 ) Dihydrolipoyl- Transacetylase (E 2 ) Pyruvat + oa + AD + Acetyl-oA AD

91 Regulation der Pyruvat-Dehydrogenase Der Multienzymkomplex Pyruvat-Dehydrogenase reguliert den Eintritt von aus Kohlenhydraten stammenden Acetyleinheiten in den itronensäure-yclus. Die Decarboxylierung von Pyruvat durch E 1 ist irreversibel (= exergonischer Schritt im Gesamtzyklus: G etwa 30 kj/mol) und stellt daher wieder einen Regulationspunkt dar. Glucose kann auch aus Pyruvat entstehen (siehe Gluconeogenese, siehe Einheit 9). In tierischen Zellen ist jedoch die Bildung von Acetyl-oA aus Pyruvat ein irreversibler Schritt des Stoffwechsels und daher können tierische Zellen Acetyl-oA nicht in Glucose umwandeln. Die oxidative Phosphorylierung von Pyruvat zu Acetyl-oA bedeutet für die Kohlenstoffe der Glucose zwei mögliche Schicksale: a) xidation zu 2 im itrat-yclus b) Einbau in Lipide

92 Glucose Glycolyse Gluconeogenese Pyruvat itrat-yclus Acetyl-oA Fettsäureoxidation bzw. -synthese 2 Lipide

93 Drei regulatorische Systeme: 1. Produkthemmung durch AD und Acetyl-oA ohe Konzentrationen an Reaktionsprodukten (AD, Acetyl-oA) hemmen die Pyruvat-Dehydrogenase. 2. Kovalente Modifikation durch Phosphorylierung/ Dephosphorylierung der Untereinheit E 1 Bei Eukaryoten ist kovalente Modifikation das wichtigste Mittel der Regulation. Die Phosphorylierung der Pyruvat- Dehydrogenase durch eine spezifische Kinase schaltet die Aktivität des Komplexes ab. Die Inaktivierung wird durch eine spezifische Phosphatase wieder aufgehoben. 3. Das ormon Insulin induziert die Synthese von Pyruvat- Dehydrogenase (auch von Glucokinase, Phosphofructokinase und Pyruvatkinase; siehe Einheit 9)

94 1. Produkthemmung durch AD und Acetyl-oA Konkurrenz von AD und Acetyl-oA mit AD + und oa um Bindungsstellen am Enzym Große Verhältnisse [AD]/[AD + ] und [Acetyl-oA]/[oA] bewirken, dass E 2 in der acetylierten Form bleibt. E 1 kann die ydroxyethylgruppe nicht abgeben. TPP bleibt in der ydroxyethyl-form. AD und Acetyl-oA treiben somit die Transacetylase (E 2 ) und die Dihydrolipoyl- Dehydrogenase (E 3 ) rückwärts.

95 AD + 2 ydroxy- ethyl- TPP Liponamid E 3 AD E 1 E 2 Dihydroliponamid Pyruvat TPP Acetyldihydro- Acetyl-oA liponamid oa Produkthemmung: AD und/oder Acetyl-oA konkurrieren in den Reaktionen 3 und 5 mit AD + und oa. Die von E 2 und E 3 katalysierten reversiblen Reaktionen werden durch Produkthemmung rückwärts getrieben.

96 2. Kovalente Modifikation durch Phosphorylierung/ Dephosphorylierung der Untereinheit E 1 ur in eukaryotischen Enzymkomplexen. Phosphorylierung durch Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase und Dephosphorylierung durch Pyruvat-Dehydrogenase- Phosphatase (am Dihydrolipoyl-Transacetylase-Kern gebunden) Kinase: Phosphatase: Inaktivierung von E 1 durch Phosphorylierung eines Serin-Restes (Phosphorylierung nicht von camp abhängig). Kinase selbst durch AD und Acetyl-oA aktiviert ydrolyse des Phosphoserin-Restes aktiviert Komplex

97 Aktivatoren Mg 2+ a 2+ P i E 1 - (aktiv) ATP Aktivatoren Acetyl-oA AD Pyruvat-D- Phosphatase Pyruvat- D-Kinase Inhibitoren 2 E 1 -P 3 2- (inaktiv) ADP Pyruvat, ADP, a 2+, Mg 2+ Kovalente Modifikation

98 Quecksilber- und Arsenverbindungen sind giftig! Warum? Beide Metalle haben eine hohe Affinität zu (benachbarten) Sulfhydrylgruppen, so auch zu den reduzierten Dihydrolipoylgruppen der Pyruvat-Dehydrogenase. Die Bindung von Quecksilber oder Arsenit (As 3 3- ) hemmt das Enzym und führt zu Erkrankungen des Zentralnervensystems! Für das ervensystem und Gehirn ist Glucose die wichtigste Energiequelle. Wird daher ein Schlüsselenzym wie die Pyruvat- Dehydrogenase inhibiert, kommt der Energiestoffwechsel des ervensystems praktisch zum Erliegen. utmacherkrankheit : Früher wurde Quecksilbernitrat als Weichmacher tierischer Felle verwendet! Ähnliche Probleme hatten frühe Fotografen, die dampfförmiges Quecksilber bei der Daguerrotypie verwendeten.

99 Arsenit (As 3 3- ), bildet kovalente Verbindungen mit Sulfhydrylgruppen, z.b. mit Dihydrolipoylamid (= zweizähniger Ligand) Entgiftung mit Sulfhydrylreagenzien Gilt auch für methylierte Arsenverbindungen: As R R' S S R R As R' S S R 2

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